FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

Carrera de Kinesiología
Laboratorio de bioquímica
Universidad de La Serena

“Propiedades y
espectrofotometría
de proteínas”
Claudia Olivo – Emily Rojas

Resumen
En este informe se dará a conocer qué son las proteínas, cómo se conforman,
clasifican y la importancia que tienen en cada ser viviente, además de sus
estructuras tridimensionales de algunas de estas, con su respectivo punto
isoeléctrico (PI) junto con su correspondiente análisis en la espectrofotometría.
Palabras clave: Proteínas, punto isoeléctrico y espectrofotometría.
Summary
This report will show that proteins are, as they are formed, classified and as they
are important in the living of each living being, will be made known three-
dimensional structures of some of these, with their respective isoelectric point
along with their corresponding analysis in spectrophotometry.
Keywords: proteins, isoelectric point and spectrophotometry.
Introducción
Cuando hablamos de proteínas nos referimos a la base de la vida, es decir, que
existe algo más básico que la célula las cuales la hacen funcionar y le dan
vitalidad a esta, además, la forma en cómo se componen los organismos es de
acuerdo a los aminoácidos y cómo estos se complementan para formar las
principales proteínas necesarias. Para empezar, vale destacar la importancia que
tienen estos enlaces; antiguamente se creía que las funciones de las proteínas
dependían de la forma en la que sus aminoácidos se plegaban y adoptaban una
configuración precisa y rígida (forma de llave y cerradura). A lo largo de los años
se fueron dando casos en los que algunas proteínas no coincidían con esta
estructura, pero solamente se consideraban excepciones a la norma. Hoy en día
se comprueba que también existen proteínas desestructuradas y que
perfectamente cumplen su función, de hecho, ni siquiera se comprueban la
totalidad de proteínas que se pueden llegar a formar y cómo afectará esto a
nuestra vida, siendo éste un claro ejemplo de la evolución del mundo de las
proteínas y cómo se llevarán a cabo dentro del área de la salud.
Como hemos visto, se puede identificar los enlaces, los aminoácidos que
conforman algunas proteínas y hasta de qué forma se unen, pero no solamente
eso, sino que para llegar a saber más a fondo sobre las proteínas, han existido
muchos experimentos para conocer sus particularidades como lo ha sido la
espectrofotometría, que es un método científico utilizado para medir cuánta luz
absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución utilizando la ley de Beer-Lambert. Dentro de
esta experimentación juega un rol muy importante la cuantificación de proteínas;
estos tipos de experimentos se han llevado a cabo con el objetivo de determinar la
concentración de proteínas en una muestra biológica, la cual, se ha convertido en
una técnica de rutina básica cuando, por ejemplo, se aborda un esquema de
purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad
específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades o
para ver qué tipo de aminoácidos contiene, etc. Este experimento se puede
trabajar o basar en tres principales formas: la propiedad intrínseca de las
proteínas, la capacidad de absorción de luz UV y la formación de derivados
químicos o capacidad de unirse a colorantes químicos. En este caso, se trabajó
con la última de ellas que es cuando las proteínas se unen o se tiñen por ciertos
colorantes, esto quiere decir que sí hay presencia de proteínas y fue con el
reactivo de Biuret.
Otro experimento no menos importante y que tiene relación con la caracterización
de proteínas es saber identificar qué tipo de proteína es cuando se encuentra
solamente la secuencia de sus aminoácidos. Más allá de saber el tipo de proteína,
se puede saber además el punto isoeléctrico (PI) de la secuencia o muestra, el
cual, es el pH en el que la disociación de cargas positivas y negativas se iguala, y
la carga eléctrica neta del aminoácido es nula. Esto se calcula identificando el
carboxilo (pH capaz de ionizarse y quedar cargado negativamente soltando un
protón) y el amino (pH puede captar el protón y quedar cargado positivamente),
estos se calculan con la fórmula pH= -log H+ luego con ambos pH se saca el
promedio y así obteniendo el punto isoeléctrico. Al obtener el valor se puede
caracterizar por medio ácido (que su pH está cerca del valor 1) o por medio
alcalino (que su pH esté cerca de 14), siendo 7 el valor medio o neutro. Este
segundo punto tiene bastante relación con la espectrofotometría ya que también
se puede llegar a saber exactamente la espectrofotometría de masas y de UV.

Aminoácidos:
Son las unidades básicas que forman las proteínas, estos se unen a través de un
enlace covalente, los aminoácidos difieren en su grupo R o cadena lateral unida al
carbono alfa. La glicina, el aminoácido más simple presenta un hidrógeno como
grupo R o cadena lateral y la alanina un grupo metilo (-CH3).
Estos se han clasificado basándose en la posibilidad de ser o no sintetizados por
el organismo. Así, se incluyen los aminoácidos esenciales (o indispensables), cuyo
esqueleto hidrocarbonato no se puede sintetizar en el organismo humano y, por
tanto, deben ser ingeridos de forma obligatoria por la dieta para atender a las
necesidades corporales como crecimiento y mantenimiento de estructuras. Los
nueve aminoácidos indispensables son: fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina,
lisina, metionina, treonina, triptófano y valina. Los aminoácidos se combinan por
medios químicos unos con otros enlazando el carbono del grupo carboxilo de una
molécula con el nitrógeno del grupo amino de otra. El enlace covalente que une
dos aminoácidos se denomina enlace peptídico. Cuando dos aminoácidos se
combinan, se forma un dipéptido; una cadena más larga recibe el nombre
polipéptido, una proteína se forma por una o varias cadenas de polipéptidos.
Proteínas:
Son los nutrientes que más funciones cumplen en nuestro organismo. Estas
forman los tejidos, transportan vitaminas y nos defienden de organismos invasores
que nos pueden hacer enfermar. Las proteínas están formadas por aminoácidos
diferentes unidos entre sí. Hay veinte bloques de construcción de aminoácidos
diferentes que se encuentran comúnmente en plantas y animales. Una proteína
típica está
compuesta de 300 o más aminoácidos, y la secuencia con el número específicos
de aminoácidos son únicos para cada proteína. Al igual que el alfabeto, las 'letras'
de aminoácidos se pueden organizar de millones de maneras diferentes para crear
'palabras' y un 'lenguaje' de proteínas completo. Al igual que presentan diferentes
grados y clasificación en su estructura (primaria-secundaria- terciaria-cuaternaria)
“La dieta humana debe contener cantidades adecuadas de estos aminoácidos
nutricionalmente esenciales. Cada día, los riñones filtran más de 50 g de
aminoácidos libres de la sangre renal arterial. Sin embargo, normalmente solo
aparecen rastros de aminoácidos libres en la orina, porque los aminoácidos se
reabsorben casi por completo en el túbulo proximal, conservándose para la
síntesis de proteínas y otras funciones vitales.” (Harper Bioquímica ilustrada
31°Edicion 2019)
El ensayo de biuret, es un método colorimétrico que permite determinar la
concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía. La prueba
de biuret se fundamenta en detectar los enlaces peptídicos, esta se da en medio
alcalino. La muestra debe contener al menos dos enlaces peptídicos para que se
pueda formar un complejo de color violeta-púrpura (positivo a proteínas).
Objetivos generales:
 Trabajar y analizar la espectrofotometría de proteínas.
 Identificar proteínas y sus características.
Objetivos específicos:
 Trabajar con el reactivo de Biuret, analizando los volúmenes y calculando
las concentraciones de masas y la densidad óptica.
 Identificar dos proteínas por sus secuencias de aminoácidos.
 Examinar modelación 3d de las proteínas.
 Determinar y calcular el punto isoeléctrico.
 Representar la espectrofotometría de masas y UV mediante gráficos.
 Comprender la importancia que tiene la espectrofotometría en las proteínas.
Metodología para la espectrofotometría de proteínas
Primero se copió y pegó en Excel la tabla del ensayo de biuret entregada por la
profesora en clases, donde se pide calcular la concentración de los 7 tubos en
experimentación, conociendo los valores de su respectiva densidad óptica junto
con la tabla de formulación donde salían los volúmenes de albúmina, disolvente y
de reactivo biuret.
Resultados
Luego, para calcular la concentración en mg/ml se utilizó la siguiente fórmula:
c1*v1=c2*v2 donde c1= stock de proteína (10 mg/ml), v1= volumen añadido de
proteína, c2= incógnita a experimentar y v2= volumen final (volumen de la proteína
+ disolvente). Se hizo lo mismo para cada uno de los 7 tubos.
De los resultados obtenidos, se construyó el gráfico de dispersión junto con su f(x),
o sea, la ecuación de la recta donde la “y” representa la densidad óptica y la “x” la
concentración de estas. Luego se despeja la ecuación con tal que la x sea la
incógnita y así encontrar los valores de concentración.

Se hace lo mismo anteriormente expuesto con las 3 muestras problemas

entregadas por la profesora. Donde los resultados fueron los siguientes:
Metodología para las secuencias de proteínas
Se utilizan las páginas Swissmodel y Protpi como navegadores en las cuales se
pegan las secuencias de dos proteínas en donde se entregarán datos como la
identidad y antecedentes de la proteína en investigación. Además de una
modelación en 3D de cada cual.
Resultados
La primera secuencia es “malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy
tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn”
Esta proteína se identifica como insulina de cadena simple, presenta 110 aas en
su composición, lo cual quiere decir que es una proteína mediana, se puede
observar su modelación 3D gracias a la página swisssmodel figura1.1

1.1
Esta proteína presenta un punto isoeléctrico de 5.237 respectivamente con carga
neta a pH 7,4 igual a -4.344, estos resultados fueron entregados por el navegador
protpi.
En el siguiente gráfico se representa la espectrofotometría de masas de la
proteína insulina de cadena simple con sus respectivas fórmulas. Donde el eje “y”
representa la abundancia mientras que el eje “x” representa la masa.

La siguiente curva representa la espectrofotometría UV de insulina de cadena

simple.
La segunda secuencia entregada es más larga que la anterior, esto quiere decir
que presenta mayor número de aminoácidos “mhpglwlllv tlclteelaa ageksygkpc
ggqdcsgscq cfpekgargr pgpigiqgpt gpqgftgstg lsglkgergf pgllgpygpk gdkgpmgvpg
flgingipgh pgqpgprgpp gldgcngtqg avgfpgpdgy pgllgppglp gqkgskgdpv lapgsfkgmk
gdpglpgldg itgpqgapgf pgavgpagpp glqgppgppg plgpdgnmgl gfqgekgvkg
dvglpgpagp ppstgelefm gfpkgkkgsk gepgpkgfpg isgppgfpgl gttgekgekg ekgipglpgp
rgpmgsegvq gppgqqgkkg tlgfpglngf qgiegqkgdi glpgpdvfid idgavisgnp gdpgvpglpg
lkgdegiqgl rgpsgvpglp alsgvpgalg pqgfpglkgd qgnpgrttig aaglpgrdgl pgppgppgpp
spefetetlh nkesgfpglr geqgpkgnlg lkgikgdsgf cacdggvpnt gppgepgppg pwgliglpgl
kgargdrgsg gaqgpagapg lvgplgpsgp kgkkgepils tiqgmpgdrg dsgsqgfrgv
igepgkdgvp glpglpglpg dggqgfpgek glpglpgekg hpgppglpgn glpglpgprg lpgdkgkdgl
pgqqglpgsk gitlpciipg sygpsgfpgt pgfpgpkgsr glpgtpgqpg ssgskgepgs pglvhlpelp
gfpgprgekg lpgfpglpgk dglpgmigsp glpgskgatg difgaengap geqglqgltg hkgflgdsgl
pglkgvhgkp gllgpkgerg spgtpgqvgq pgtpgssgpy gikgksglpg apgfpgisgh pgkkgtrgkk
gppgsivkkg lpglkglpgn pglvglkgsp gspgvaglpa lsgpkgekgs vgfvgfpgip glpgisgtrg
lkgipgstgk mgpsgragtp gekgdrgnpg pvgipsprrp msnlwlkgdk gsqgsagsng
fpgprgdkge agrpgppglp gapglpgiik gvsgkpgppg fmgirglpgl kgssgitgfp gmpgesgsqg
irgspglpga sglpglkgdn gqtveisgsp gpkgqpgesg fkgtkgrdgl ignigfpgnk gedgkvgvsg
dvglpgapgf pgvagmrgep glpgssghqg aigplgspgl igpkgfpgfp glhglnglpg tkgthgtpgp
sitgvpgpag lpgpkgekgy pgigigapgk pglrgqkgdr gfpglqgpag lpgapgislp sliagqpgdp
grpgldgerg rpgpagppgp pgpssnqgdt gdpgfpgipg fsglpgelgl kgmrgepgfm
gtpgkvgppg dpgfpgmkgk agargssglq gdpgqtptae avqvppgplg lpgidgipgl
tgdpgaqgpv glqgskglpg ipgkdgpsgl pgppgalgdp glpglqgppg fegapgqqgp
fgmpgmpgqs mrvgytlvkh sqseqvppcp igmsqlwvgy sllfvegqek ahnqdlgfag sclprfstmp
fiycninevc hyarrndksy wlsttapipm mpvsqtqipq yisrcsvcea psqaiavhsq ditipqcplg
wrslwigysf lmhtaagaeg ggqslvspgs cledfratpf iecsgargtc hyfankysfw lttveerqqf
gelpvsetlk agqlhtrvsr cqvcmksl”.
Se denomina como proteína de fusión de dominios no colágenos de colágeno tipo
IV, compuesta por 1678 aas, se observa su modelación 3D en la figura 1.2

1.2
Esta proteína presenta un punto isoeléctrico de 8.965 con carga neta a pH 7,4
igual a +29.316

1.2

La siguiente curva representa la espectrofotometría UV de la proteína no

colágenos de colágeno tipo IV.
Conclusión/ discusión
Para finalizar, vale destacar la importancia que tiene la existencia de proteínas en
nuestro cuerpo, las cuales son estructuras biopoliméricas que sirven como soporte
estructural, catalizadores bioquímicos, hormonas, enzimas, componentes básicos
e iniciadores de la muerte celular. Como dijimos anteriormente, las proteínas son
la base de la vida y son unas de las principales fuentes de estudio en la ciencia
desde 1838 (año en el que se descubrieron) hasta el día de hoy. Muchas
investigaciones nos han ayudado llegar a saber con exactitud qué son las
proteínas como, por ejemplo, que es uno de los primordiales componentes de la
célula, unidad básica de la vida. Un experimento que ayudó a saber de la
existencia de las proteínas y sus componentes fue la creación del primer
espectrofotómetro, que como dijo Bruce Merrifield, ganador del premio Nobel de
Química en 1984, lo consideró como “probablemente el instrumento más
importante jamás desarrollado para el avance de la biociencia” [ CITATION RSi03 \l
2058 ]. Con este instrumento se puede obtener una cuantificación exacta
principalmente del ADN, ARN y proteínas de una muestra, pero también se trabaja
con otros artefactos como lo son algunos reactivos con el objetivo de saber si
dentro de una muestra hay existencia de proteínas, conocer su concentración y su
densidad óptica, los cuales fueron uno de los objetivos de esta investigación.
Se trabajó con 7 tubos que tenían distintas cantidades de albúmina y disolvente, y
todos tenían la misma cantidad del reactivo Biuret en donde se tenía que buscar
los valores de las concentraciones las cuales nos resultaron directamente
proporcionales a los valores de las densidades ópticas y la albúmina, es decir, que
si una sube la otra también, mientras que en todas las muestras el Biuret se
mantenía con la misma cantidad, la cantidad de disolvente (agua) se vio afectada
inversamente proporcional al resto de las cantidades. Esto pasó porque en el caso
de la albúmina, que es la proteína principal de la sangre y que se encuentra en el
plasma de esta, siendo aquel un medio acuoso, se vio afectada al encontrarse con
cada vez menos de agua siendo esto un impulsante para que la concentración de
la muestra (mg/ml) sea de menos, o incluso nula (como en el caso 1). Después de
haber examinado los datos en un gráfico donde se ve la línea simétrica que
demuestra las cantidades, se pudo calcular el f(x), fórmula con la que finalmente
se logra calcular las concentraciones de las tres últimas y principales muestras en
problema. Los resultados de estas no tuvieron ningún orden proporcional con
respecto a las densidades ópticas por el motivo que se calcularon con una fórmula
distinta y un poco más compleja que la del principio. Finalmente se pudo
evidenciar la gran diferencia que existe entre las concentraciones de las muestras
cuando están sometidas a la espectrofotometría y experimentada con el reactivo
Biuret comparada con la densidad óptica que tiene directa relación con la
absorbancia, es decir, cuánta cantidad de luz absorbe un elemento. El otro
experimento consistía en introducir una secuencia de aminoácidos para así
descubrir a que proteína pertenecía, gracias al análisis entregado por las paginas
Swissmodel y Protpi navegadores digitales podemos llegar a conocer su
modelación, por cuantos números de aminoácidos estaba compuesta en total
dicha proteína como su punto isoeléctrico anteriormente descrito y graficas de su
espectrofotometría tanto en masa como en uv. Estas graficas demuestran en una
proteína un espectrómetro de masas los iones que se generan en una cámara de
alto vacío, luego se separan en función de la masa y se determina la abundancia,
La espectrometría de masas es una herramienta analítica muy poderosa y de
aplicación general. Los espectros de masas suministran información sobre la
estructura de especies moleculares complejas, las relaciones isotópicas de los
átomos en las muestras, y la composición cualitativa y cuantitativa de analitos
orgánicos e inorgánicos en muestras complejas. mientras que en la gráfica de la
espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración. relativa. Finalmente se
imprime un gráfico donde en función de la relación masa/ carga y la cantidad de
iones se indica su porcentaje.

Bibliografía
 El caos ordenado de las proteínas - A. Keith Dunker y Richard W. Kriwacki
 Métodos para la cuantificación de proteínas -
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/27%20METODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACION
%20DE%20PROTEINAS.pdf
 https://www.youtube.com/watch?v=wLgG5aS5BNU&t=376s
 Lehninger, A., Nelson, D., & Cox, M. (2014). Principios de bioquímica.
Barcelona: Omega.
 https://swissmodel.expasy.org
 https://www.protpi.ch
 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32310450/
 https://www.cromtek.cl/2020/09/22/cuantificacion-de-proteinas-con-
espectrofotometria-uv-vis/