seminario de Biología n°1: Dictado por Giusti

Mantenimiento y variabilidad del genoma humano

TEORIAS Y MODELOS
Mecanismos moleculares que permiten explicar cómo es posible que la célula transmita su genoma a las células hijas, o en un
organismo que un individuo, trasmita su genoma a la generación siguiente con un mínimo nro. de cambios. El genoma humano
tiene 3mil millones de pares de bases, y la estabilidad con la que trasmite es asombrosamente alta para un genoma tan grande
¿Cuáles son los mecanismos que permite esa fidelidad de copias?
Y de manera complementaria, en aquellos casos que ocurren lo grandes cambio, ¿cuáles son los mecanismos por los cuales
ocurre?
La biología molecular es una rama de la biología, que estudia el modo que el genoma controla la fisiología humana.
Paper 1953 Watson y Crick donde interpretaron experimentos de otros autores y realizan una propuesta de un modelo de la
estructura de ADN y lo unen en un modelo integrador
Se sabía que existía una información llamada genética, que esa información que se trasmitía de célula a células hijas, y de un
individuo a la generación siguiente. También se sabía que esa información genética determinaba el número de aminoácidos de
las proteínas, pero se desconocía la molécula que lo realizaba, creían que eran las propias proteínas que creían que tenían esa
información. Del ADN se sospechaba que era una molécula de bastante gran tamaño e inerte y la función era desconocida. Se
sabía que poseían nucleótidos unidos entre sí, pero se desconocía la estructura. Se creía era una estructura de 3 cadenas,
donde los grupos fosfatos unían a la base nitrogenadas y donde los grupos fosfatos estaban en el centro y las bases miraban
hacia afuera. NO existía un modelo de complementariedad de bases.
En experimentos previos al modelo de Watson Y Crick, utilizaron un experimento de Chargaff donde sabía que la cantidad de
timina era parecida a la cantidad de adenina, siendo también que la concentración de citocina siempre era similar a la cantidad
de guanina, en una muestra de ADN.
Esta relación de 1:1, usaron para la complementariedad de bases.
La estructura de doble hélice, en la que las bases hidrogenadas miran hacia el centro, se obtuvo de una difracción de rayos X,
en una muestra cristalizada. Crick fue el intérprete de la imagen y Wilkins que era el dueño del laboratorio. Franklin era la
científica que aisló los cristales de ADN y generó las imágenes.
“Hemos notado que apareamiento especifico de las bases de nuestro modelo, sugiere posible copiado para el material
genético”
Si el ADN tiene 2 hebras complementarias, la información de una de las hebras determina la secuencia de bases de la otra
hebra. Dado que existe complementariedad de bases. Una hebra sería el molde de la otra hebra complementaria.
Demostró que la teoría tenía gran valor heurístico. Y permitió nuevos experimentos que demostraron la certeza del nuevo
modelo planteado.
Heurístico= una teoría ayuda a generar estrategias para diseñar nuevos experimentos. Obtiene un valor orientador.
Luego se realizaron nuevos experimentos para demostrar la manera de replicación del ADN.

Modelos propuestos para explicar la replicación del ADN

Se diseñaron 3 propuestas de modelos.
1. Modelo de Replicación conservativa: luego de una rueda de replicación, la nueva hebra estaría compuesta por 2 hebras
nueva conservando la hebra parental por 2 hebra viejas.

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2. Modelo Dispersiva: donde al cabo de la primera replicación las 2 hebras hija contendrían fragmentos de las hebras
viejas y nuevas entremezcladas.
3. Modelo Semiconservativo: en el cual, cada molécula tendría una hebra nueva y una hebra vieja (parental).

Experimentos de Meelson y Stahl: pusieron a prueba el modelo de replicación.

Usaron como modelo biológico al genoma de la bacteria de la Escheriquia Coli. En donde la bacteria se replica y debe también
replicar su genoma.
Pusieron a punto una metodología, que les permitiera distinguir los momentos diferentes en la replicación del genoma. Para
ello manipularon el medio liquido donde iban a crecer y proliferar las bacterias del experimento.
● A uno le agregaron a todos los componentes que tuvieran nitrógeno, tuvieran una variante pesada. Ósea un isotopo
pesado de Nitrógeno (15)
● A otro le agregaron una variante liviana de Nitrógeno.
Al replicar el genoma se utilizan N del medio para realizar la replicación, por lo que la bacteria al cabo de un tiempo tendrá en
su genoma ya replicado N que incorporo del medio en que se encuentre. Entonces hicieron que ciertas bacterias replicaran su
genoma en el medio que tiene la variante liviana, y a otras en la variante pesada, para así tener genomas con los 2 distintos
isotopos de Nitrógeno.
Luego se imaginaron un modo de separar, físicamente las hebras que contuvieran la variante pesada, de las que contuvieran
la variante liviana de Nitrógeno. Para ello, lisaron a las bacterias en una solución de ClCe a 6M. En esa solución se encuentran
fragmentos del genoma de las bacterias que crecieron en los 2 medios diferentes mezclados en una única solución.
Y luego de centrifugar por un largo tiempo y por altas velocidades, se obtendrá debido a la fuerza gravitatoria de la
centrifugación que los iones de ClCe quedando en el fondo se encontrará la parte más concentrada que la de arriba que
estará menos concentrada. Este gradiente de concentración se verá reflejando también en el gradiente de densidad. Por lo
cual, la parte que este más concentrada también serán más densa, desde el punto de vista de las propiedades del líquido. En
tanto las que estén menos concentradas con ClCe, serán menos densas.
Se puede visualizar, agregando una determinada solución e iluminando con luz ultravioleta una imagen con 2 bandas negra
que representan las posiciones donde se colocan las moléculas del genoma liviano y del genoma pesado.
Inicialmente hicieron crecer a las bacterias, varios ciclos bacterianos en una solución con nitrógeno pesado, para que el total
del genoma este marcado con el nitrógeno pesado. Luego las hicieron crecer en un medio liviano. Durante un tiempo
determinado, controlando el dicho tiempo. Y se van tomando muestras de ese medio liviano y analizando su composición.
Teniendo en cuenta que el tiempo de replicación de un ciclo bacteriano durante entre 20-30 min.
Pudieron observar a lo largo de diferentes tiempos de replicación, 3 tubos que contenían 3 pesos posibles: pesado, liviano y
uno semipesado.
Se pudieron observar al cabo de una generación donde se las hizo crecer en un medio pesado que existía un único tipo de
ADN: semipesado. Comparado con las distintas teorías, se esperaban diferentes tipos de ADN. Comparado con la teoría
Conservativa que esperaba 2 tipos de ADN, uno pesado y uno liviano, por lo que se descartó a esta teoría que no ocurrió lo
que predecía. Comparado con la siguiente teoría Dispersiva, la cual predice que tiene fragmentos de ambas hebras hijas y
parental, por lo que su peso será semipesado. Lo cual podría a llegar a ser verdadero este modelo. Comparando con la última
teoría Semiconservativa, la cual predice que cada molécula de ADN posee una hebra parental y una hija, lo cual su peso será
semipesado. Esta teoría también podría ser cierta en dicho experimento.
Al cabo de 2 generaciones, y se pudieron observaron 2 tipos de pesos de ADN, liviano y semipesado. Comparando con las
teorías Dispersiva, decía que se obtenía un solo peso del ADN, en cambio en la semiconservativa, se obtenían 2 peso de ADN,
por lo que se pudo demostrar que esta teoría era la verdadera.

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Mecanismo molecular de la replicación en células eucariotas
Concepto de orígenes de replicación, se descubrieron como secuencias especificas de ADN que se posicionaban la
maquinaria proteica que luego iba a ejecutar los primeros pasos de la replicación.
Se sospechaba que no podría existir un único origen de replicación no podía ser compatible con los tiempos de replicación y
con el gran tamaño del ADN, para ello tardaría semanas en completar la replicación del total del genoma, siendo que en
medios de cultivos la replicación dura aproximadamente 24hs.Se descubrieron entonces, múltiples orígenes de replicación.
En las últimas investigaciones sugieren que son alrededor de 30-50 mil orígenes de replicación por cada célula humana.
La activación efectiva de la replicación que comienza en los orígenes de replicación es un proceso que se da en 2 fases:
Licenciamiento de los orígenes de replicación: que implica el contacto inicial, el reclutamiento de zonas específicas del ADN
de un conjunto de proteínas que van a dar para que comience el proceso de replicación del ADN. En el ciclo celular, este
proceso ocurre en G1, anterior a la replicación del genoma nuclear (durante la fase S). El primer contacto con los orígenes de
replicación es el complejo, llamado ORC (Complejo de Reconocimiento de los Orígenes). Este complejo a su vez permite el
reclutamiento de otras proteínas. Una de ellas son las Helicasas, de la familia MCM, son las responsables de abrir/romper la
doble hélice y exponer las bases que sirven como molde para enlaces de unión peptídicas. Estas helicasas se localizan antes
de que ocurra la replicación en la fase G1, por lo que permanecen inactivas, y necesitan de una señal especifica de la célula
para activarse.
Activación de los orígenes al comienzo de la fase S: en donde las helicasas se van a activar y van a abrir la doble hélice para
que comience la replicación genómica. Generando 2 horquillas de replicación bidireccionales en las hebras del ADN. El
mecanismo por el cual se activan las helicasas, se denomina fosforilación, que depende de un grupo de enzimas, llamadas
quinasas, que fosforilan a las helicasas y activan así el inicio de la replicación. Fosfatasas son aquellas que remueven los
grupos fosfato de las enzimas y las vuelven inactivas.

Flexibilidad de los orígenes de replicación.

En los mamíferos, en la etapa del ciclo celular de G1, lo orígenes se licencian, pero no todos los que se licencian en esta fase
van a ser activados, se activan 1 de cada 3 orígenes de replicación. También difieren de un tipo celular a otro, los que se
activan. Se desconoce porque se activan ciertos orígenes de replicación y no otros, se sospecha que dependería con el grado
de condensación de la cromatina o la actividad transcripcional de una región del genoma y esto estaría vinculado con la
activación de ciertos orígenes de replicación.
Las burbujas de replicación crecen de manera bidireccional, en direcciones opuestas. Donde las polimerasas son las que se
pegan al ADN y lo polimerizan; y las helicasas son las encargadas de romper la doble hélice para que las polimerasas puedan
realizar su actividad.
Se sabe que, por cada ciclo celular, la replicación del ADN se da una única vez. Pero surgió de manera experimental la
pregunta ¿qué impide a la célula que no replique más de una vez el ADN, siendo que tiene todas las proteínas necesarias
para la replicación? O ¿Qué impide que un origen de replicación no se active luego de hacer ocurrido la replicación, y genere
una nueva replicación del ADN?
El mecanismo por la que la célula, replica su ADN, una única vez por ciclo celular se debe a que depende de la familia de las
proteínas MCM.
Las quinasas activan a las helicasas, fosforilándola y luego éstas se pegan a los orígenes de replicación. Cuando se produce el
inicio de la replicación, las proteínas accesorias al complejo ORC, se despegan de los orígenes de replicación y son degradadas
por moléculas activadas en el ciclo S de la célula. O sea que una vez que el inicio de la replicación se produjo en un origen de
replicación, las helicasas no pueden volver a unirse ya que las proteínas accesorias que las uniones fueron degradadas,
evitando así que en un mismo sitio se produzca más de una replicación. Si este fenómeno fallara estaríamos en una situación
llamada, re-replicación, generando así una amplificación del genoma en ese sitio que fallo este mecanismo de control. Este
fenómeno de re-replicación, en mamíferos en general no es fisiológico.

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Existen otras proteínas cooperativas de las helicasas que mantienen abiertas las burbujas de replicación, ya que ambas
hebras tenderán a reunirse espontáneamente por medio de puente de hidrogeno, son las Proteínas de Unión a la Simple
Cadena de ADN, como SSB-proteína/RPA.
Otras proteínas: topoisomerasas I, producen cortes que permite aliviar la tensión del sobregiramiento de la doble hélice,
evita el superenrollamiento.
Existen componentes centrales, que realizan la replicación del ADN, que son las ADN polimerasas, descubiertas en el año
1952. Solo copian al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para continuar la replicación.
Tenemos al menos 14 tipos de ADN polimerasas.
Existió un experimento de Kornberg, en el cual, encontrar las enzimas que realizan la síntesis del ADN. Aislaba bacterias rotas
para encontrar una enzima que tuviera la función de ADN polimerasas, agregando nucleótidos marcados. Fallando varias
veces hasta que agrego producto para ayudar a la formación del producto, por lo que encontró una gran actividad en uno de
los tubos, lo que no sabía es que las ADN polimerasas solo copian al ADN, pero no lo generan de novo.
Las ADN polimerasas solo copian al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para continuar la
replicación. Nuestro genoma codifica al menos para 14 tipos de estas enzimas. α – β - δ- γ - ε. Y otras más. Solo un subgrupo
participa en la replicación del ADN, como la α- δ y ε. La ADN polimerasa γ participa en la replicación del ADN mitocondrial. La
ADN polimerasa β participa de la reparación del genoma nuclear.
Condiciones para la replicación:
● Sustratos: son aquellos que desaparecen o se consumen para obtener un producto.
● Requerimientos: son aquello que ayudan a obtener el producto, como la hebra molde de ADN.
Sustratos:
o dNTP´s: Nucleótidos + un grupo de 3 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base nitrogenada (adenina, citosina,
guanina, o timina)

ACLARACION:
o Desoxirribonucleótidos difosfatos: Nucleótidos + un grupo de 2 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base
nitrogenada.
o Desoxirribonucleósidos: base nitrogenada trifosfato + un azúcar desoxirribosa + un grupo de 3 fosfatos.

Requerimientos
o Molde de ADN de cadena simple, es esencial, ya que la ADN Polimerasas no generan ADN de novo.
o Molde de ARN, para polimerizar los extremos, que utilizan las Retrotranscriptasas.
o Cada extremo es diferente, están polarizadas.
Extremo 5´fosfato, un grupo fosfato unido al C5 de la desoxirribosa.
Un extremo 3´Oh, posee un OH libre unido al C3. Es donde comenzará la polimerización y desde se podrá desde ahí.
Este será el punto de entrada de la ADN polimerasa. SE dice que se polimeriza el extremo 3´
Las cadenas se caracterizan por tener dirección antiparalela, ya que en los extremos opuestos tendrán las mismas
características que en un mismo sitio de acoplamiento. Por eso también es que se unen, por medio de uniones
complementarias.
Existen un concepto, llamado procesividad: se le atribuye a las ADN polimerasas y significa que tiene la capacidad de
mantenerse unido al ADN por mucho tiempo y poder así replicar mucho más desoxirribonucleótidos. Una de las proteínas
con mejor procesividad es la PCNA.

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 o Los PCNA son factores de procesividad que tienen la capacidad de acercarse al ADN, y retener cercano a él a las ADN
polimerasas α y δ, para que no se despeguen. PCNA significa antígeno nuclear de células proliferativas. En la fase S se
encuentra en alta concentración. Se usan como indicador del grado de un tumor, ya que indica que ciertas células se
encuentran en proliferación y ello determina que si hay una excesiva concentración de esta molécula significará que
el tumor está en crecimiento.
o Teniendo en cuenta que las ADN polimerasas que no sintetizan de novo. Sino que sintetizan a partir de un molde que
lo sintetizan las primasas. Las primasas son ARN polimerasas que se encargan de crear un pequeño molde de ARN o
cebadores o primers para que las ADN polimerasas comienzan a replicar el ADN. Tienen la capacidad de sintetizar de
novo, perdiendo la fidelidad a la hebra molde.
El avance de las ADN polimerasas se da siempre en sentido 3´-5´, y de ahí surge un inconveniente ¿cómo sintetizan a la hebra
que va de 5´-3´, si se da en sentido opuesto al avance de la horquilla de replicación? Se creía que existía una polimerasa que
sintetizaba a partir del extremo 5´ fosfato, aunque esa teoría resulta ser falsa.
Se sabe ahora, que en realidad hay otro mecanismo de síntesis, con 2 procesos diferentes para las hebras de la doble hélice
del ADN. Uno se da a partir del extremo 3´ OH siguiendo el avance de la horquilla de replicación, y por ende será continua,
que también se denomina Hebra Adelantada, y sólo escindirá un solo primer de ARN. Y otro se da, a partir de una serie de
fragmentos, conocidos como Fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos serán sintetizados en sentido contrario al avance de la
hebra misma, O sea siguen el sentido del avance de la horquilla de replicación. Llamándose hebra Retrasada o discontinua.
La ADN Polimerasa α, tiene en su estructura subunidades adheridas de Primasa, que generar el primer a partir del cual
comienza la replicación. Luego la ADN polimerasa α en sí misma va a ser quien elongue ese primer, alrededor de 50-100
nucleótidos serán los que sintetice.

▪ En la hebra Adelantada, la ADN polimerasa ε será la que finalice la síntesis de esta hebra.
▪ En la hebra Retrasada, la ADN polimerasa δ, finaliza la síntesis de la hebra.

Simultáneamente está ocurriendo la síntesis de histonas y la formación de nucleosomas, es decir la cromatina se está
formando a eucromatina a medida que va ocurriendo la replicación del ADN.
Problema en la replicación en el extremo 3´de los cromosomas
En los extremos, es decir en los telómeros, se encuentran secuencias no codificantes o secuencias repetitivas. Existe una
secuencia repetitiva en mamíferos TTAGGG, se llama secuencia telomérica y es característica de los telómeros.
Lo que sucede en cada replicación es que, en cada síntesis de los telómeros, se va acortando una pequeña porción en cada
división celular hasta llegar al punto de que la secuencia es demasiado corta que provoca que la célula no pueda dividirse y
entre en el proceso de apoptosis. Es señal de senescencia celular. Este acortamiento telomérico no se hereda en la próxima
generación, ya que lo que se transmite en la siguiente generación depende de las células sexuales y la senescencia telomérica
ocurre a nivel de las células somáticas.
Los telómeros pueden replicarse en ciertos tipos celulares por una maquinaria especial que no dependen de las ADN
polimerasas, sino a una enzima denominada telomerasa. La telomerasa es una ribonucleoproteína, es decir tiene un
componente proteico y un componente de ARN y tiene actividad de retrotranscriptasa. Las retrotranscriptasas pueden
sintetizar ADN utilizando ARN como molde. El molde de ARN que utiliza es un pequeño fragmento que está contenido en la
enzima misma. Entonces, la telomerasa puede elongar los extremos de los telómeros utilizando el pequeño molde que ella
misma posee.

Mantenimiento del ADN nuclear

❖ Los mecanismos de reparación para el mantenimiento del ADN nuclear.

❖ Se sabe que las ADN polimerasas poseen un alto grado de fidelidad, por lo cual se debe conocer cuáles son las fallas que
llevan a la reparación del ADN.
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 ⮚ Errores al momento de la replicación
⮚ Errores o daños que se ocurren, en un momento diferente de la replicación.

Existe una distinción en los tipos de errores, dependiendo de si ocurre en una de las cadenas, o sea errores de simple cadena,
donde podrá utilizar “como guía” a la otra hebra por complementariedad de bases. Y errores que ocurren en ambas cadenas,
llamados también errores de doble cadena.
Errores en la replicación
Por deformación de la doble hélice, las polimerasas pueden cometer errores en la polimerización de un nucleótido que no
sea complementario con su molde. Por lo que este nucleótido tenderá a despegarse y no formará los puentes de hidrógeno
con la hebra complementaria. Este mal apareamiento puede ser detectado por la ADN polimerasa misma si es que se
encuentra en esta región del ADN. Varias ADN polimerasas tienen una actividad enzimática de reconocer un mal
apareamiento y escindir/clivar/remover ese mal apareamiento, realizando en el sentido contrario a la síntesis de 5´-3´.
Mecanismo como Profreading o lectura de prueba. Este sería el primer mecanismo de reparación del ADN.
La ADN polimerasa α que sintetiza una pequeña cantidad de ADN, no posee esta actividad de profreading, en cambio
aquellas polimerasas que sintetizan una enorme cantidad como las ADN polimerasas δ y ε, si poseen la actividad de
profreading.
En los casos que hubo mal apareamientos o mismatches y donde la ADN polimerasa no detecto a tiempo y continuo la
polimerización del ADN, quedando así dicho error, existe otro mecanismo de corrección.
1) Sistema de reparación de mal apareamiento de bases o REBA:
1- Detecta el error: El mal apareamiento producirá una deformación tridimensional de la doble hélice, y donde un
conjunto de proteínas que monitorean a la doble hélice reconociendo esta deformación y uniéndose
fuertemente.
2- Reconoce cuál es la hebra molde y cuál es la hebra nueva, así podrá remover el nucleótido correcto, pero tiene
cierto tiempo para hacerlo, ya que pasado un tiempo luego de la replicación se produce una metilación.
Se dice entonces que este sistema es post replicativo temprano.

2) Sistema de reparación por escisión de bases o REBA:

Daños que ocurren espontáneamente y que se dan en cualquier momento del ciclo celular. Como, por ejemplo;
algunos nucleótidos pueden perder sus bases nitrogenadas, como las purinas y este fenómeno se lo conoce como
despurinación, otro ejemplo donde muchos nucleótidos pierden grupos aminos y se convierten en bases
nitrogenadas que no son naturales del ADN. En el caso de una citosina que pierde su grupo amino la convierte en
uracilo. Fenómeno llamado desaminación.
Este sistema debe actuar antes que ocurra la próxima replicación ya que si no lo hace se introducirá un error en la
nueva replicación.
1- Detectan las bases nitrogenadas que no son naturales del ADN. Como por ejemplo Uracilo o aquellas que hayan
perdido la base nitrogenada.
2- Luego remueven las bases no naturales del ADN, quedando un “hueco”, que es rellenado por la ADN polimerasa
β.
Este sistema no depende de si es la hebra molde o la hebra nueva.

3) Sistema de reparación por escisión de nucleótidos o REN:

Por la exposición de los rayos UV puede generar un daño, provoca la formación de dímeros de pirimidinas. Es decir,
cuando existen 2 pirimidinas cercanas entre sí forma los enlaces covalentes entre ellas. Esto provoca una
deformación particular. Por lo que si no se repara a tiempo la ADN Polimerasa no podrá sintetizar y se producirá una
ruptura, no reconocerá esa unión. Este sistema tampoco no depende de si es la hebra molde o la hebra nueva.
1- Detecta la unión de dímeros de pirimidinas.
2- Remueven ese fragmento.
3- Las ADN polimerasa δ y ε participan de la reparación del fragmento dañado.

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Cuando la se produce roturas de doble cadena. Si este daño no es reparado, la célula activa una serie de
señalizaciones que activan la muerte celular programada. Existen 2 mecanismos por los que pueden repararse:
● Sistema de unión de extremos no homólogos: donde une a 2 fragmentos que se han roto y pudiendo
introducir algunas mutaciones.
● Recombinación homologa: utiliza la información de una de las hebras homologas que tenga alta identidad
con la hebra que se rompió. Este sistema tiene alta fidelidad de copiado.

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Seminario de Biología n°2: Dictado por Giusti
Ciclo celular
Características:
● Organismos vivos con un sistema autónomo de la replicación del genoma.
● 2 eventos claves en el ciclo celular:
o Una célula debe replicar su genoma antes de dividirse, y existen mecanismos de fidelidad dado por:
▪ Estructura del ADN
▪ Fidelidad de las polimerasas en la replicación
▪ Mecanismos de reparación. Dando como resultado unas 3 mutaciones en un genoma de 3 mil millones
de pares de bases.
▪ Si la célula “madre” no expresa la enzima telomerasa, las células hijas sufrirán un acortamiento de los
telómeros, al cabo de un determinado número de replicaciones no podrán dividirse más y entrarán a
un proceso denominado senescencia celular.
o Segregación de cromosomas replicados en las células hijas.

Se analizarán 2 aspectos:
● Concepto de la proliferación celular en organismo multicelulares, poseen altas restricciones y pueden eliminar la
arquitectura funcional. La proliferación celular está restringida a ciertos tipos celulares.
● Mecanismos moleculares que controlan el avance del ciclo celular

Proliferación en el contexto de un organismo multicelular

Los tejidos poseen células con diversos tipos de diferenciaciones anatómicas y funcionales que las caracteriza que van a
alcanzar por un proceso de diferenciación celular. La diferenciación implica una regulación génica de cada una de esas células.
Existe también una organización particular de esas células que caracteriza a determinado tejido, es decir a la forma que en se
organizan para interactuar entre sí.
En tejidos adultos, solo un subgrupo retiene la capacidad proliferativa, manteniéndose en un equilibrio entre células que
están en proliferación y otro grupo que sufrirán apoptosis. Esta apoptosis no siempre se debe a daño celular, sino que está
determinado genéticamente, hay señales que pueden inducir activamente la muerte celular programada y esto ha
evolucionado para permitir en el tiempo la funcionalidad de los tejidos, eliminado células que podrían obstruir esa
arquitectura precisa.
En los tejidos adulto el proceso de proliferación no se da para un crecimiento, sino para mantención, ya que las células viejas
son eliminadas y reemplazada por células nuevas.
Existen distintos mecanismos por los cuales los tejidos sufren proliferación. Por ejemplo, en aquellos que tienen una alta tasa
de renovación, como en el epitelio intestinal. Epitelio simple que recubre la luz que da el intestino. Existen distintos grupos de
células, en donde algunas llegaron a su máxima diferenciación como células absortivas, o las células caliciformes que secretan
mucus. Pero también existe un subgrupo que permanecen en un estado indiferenciado, que conservan la capacidad
proliferativa y serán las células madres de ese tejido.

Concepto de célula madre:

● Mantienen capacidad proliferativa
● Estado pobre de diferenciación
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 ● Capacidad de autorrenovación, es decir que al menos una célula hija mantiene las mismas características que la
célula progenitora, el mismo rasgo de potencialidad.
O sea, la célula progenitora en su división producirá una célula madre con sus mismas características y una célula hija
que luego se diferenciará por ejemplo en una célula absortiva.

Otros tejidos tienen una estrategia similar, poseen un subgrupo de células madres, pero tienen una tasa de renovación muy
baja. Es un ejemplo de un tejido muy diferenciado como el tejido muscular esqueléticas. Sus células están muy diferenciadas,
por lo que no se dividen, pero se pueden encontrar entremezcladas entre las fibras musculares, en la periferia a las células
satélites son células madres con una limitada capacidad proliferativa inducidas por una ruptura muscular.
Existe una excepción: Las células que forman el parénquima del hígado, los hepatocitos son células diferenciadas pero que
conservan la capacidad proliferativa inducidas por un daño o una remoción de una porción del tejido, y pueden reingresar en
el ciclo celular y culminar en una división celular.
Existe en el organismo que la capacidad de proliferación es casi nula y se encuentra en el músculo estriado cardíaco. Implica
que un daño en ese tejido no puede ser regenerado. Y ello implica un grave problema para ese tejido.
Otro tejido con casi nula proliferación es el tejido nervioso, pero cumple una función, como la preservación de la memoria, si
el tejido nervioso estuviera generándose todo el tiempo, la función de la memoria no podría existir porque ésta depende de
un circuito estable, de la permanencia en el tiempo de las mismas neuronas y de sus conexiones. En los últimos años se ha
descubierto que existen regiones muy localizadas del cerebro que mantienen la capacidad neurogénesis, pero se duda de la
relevancia que existen en individuos adultos.

Estudio descriptivo de la proliferación

Para estos estudios se usan líneas celulares inmortalizadas, células aisladas que pueden ser de algún animal o de seres
humanos, en el caso de una muestra tomada por una biopsia en humanos, se trata de células tumorales por lo que se dicen
que son inmortalidad replicativa, ya que expresan en todas sus células la enzima telomerasa y por ende no tendrán un
número limitado de divisiones celulares antes de entrar en senescencia celular.
Esto permite que en un medio de cultivo y agregando nutrientes puedan mantener en una estufa de cultivo de 7°C en
condiciones de CO2 controladas a las células proliferando en una placa de Petri. Se puede medir la capacidad proliferativa en
el tiempo colocando un número relativamente bajo de células y así se puede analizar el grado de confluencia, es decir, en que
proporción pueden cubrir la superficie de la placa a lo largo del tiempo. Y medir el tiempo en que una línea celular llega al
grado de confluencia y será directamente proporcional a la velocidad que una línea celular puede atravesar el ciclo celular.
Otra forma es la citometría de flujo, implica generar a partir de la disociación de tejidos o de levantamiento y disociación de
células que están creciendo en un medio de cultivo, generar una suspensión de células; células que no estén en el fondo de la
placa o que no están adheridas entre sí, por conexiones o matriz extracelular. Esa suspensión se pasa al citómetro, y que
posee un conducto tan delgado que solo deja pasar una célula por vez, y se pueden pretratar a las células con una tinción que
se intercala en las bases del ADN y que emite fluorescencia con una determinada luz de cierta longitud de onda. La cantidad
de fluorescencia que emita cada una de ellas dependerá de la cantidad de ADN que contengan cada una. El citómetro de flujo
podrá medir entonces, la fluorescencia de cada una de esas células y podrá analizar estadísticamente el perfil de la línea
celular estudiada.
Esto se verá reflejado en un eje de coordenadas cartesiano. Donde, por ejemplo, se mostrarán 2 picos uno de menor tamaño
que el otro, y también picos de tamaños intermedios que estos. En el cual, el pico de mayor tamaño representara las células
que ya atravesaron la fase S, es decir que pueden estar en la fase G2. Y el de menor tamaño representara a las células que no
han comenzado la fase S. y los picos intermedios, representan los estadios intermedios de la fase S, es decir, que están en
diferentes pasos de la mitosis.
Otro estudio, que se realiza en un tejido es analizar el índice mitótico, mide la proporción de células que están en mitosis en
cierto tejido en un momento dado y que se cuantifica en relación con las células que están haciendo mitosis sobre el número
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de células totales. Esto se realiza a partir de cortes histológicos teñidos con la técnica de rutina. Este método es importante,
ya que en un tumor el índice mitótico representa el grado de agresividad.
Se sabe que los tumores tienen una fase exponencial y luego una fase estacionaría, aunque siempre depende de cada tipo de
tumor. La fase estacionaria implica que el tumor ha crecido demasiado y ha acabado sus nutrientes. Esto se conoce como
descripción gompertziano:
● El crecimiento tumoral radica en función del tamaño del tumor.
● La fracción de crecimiento tumoral disminuye al aumentar el volumen del tumor.

Mecanismos moleculares que controlan el ciclo celular

Hatwell estudio a la levadura de cerveza, un hongo unicelular, pudo identificar algunos genes con función de regulación la
progresión del ciclo celular. Podía observar directamente el proceso del ciclo celular bajo el microscopio teniendo una
gemación significa que está a punto de replicarse. Podía identificar células puntuales que tenían problemas de proliferación. Y
podía inducir problemas en el genoma, que es haploide, cada gen está en única copia. Por lo que al haber un gen mutado
habrá una manifestación fenotípica. Logro identificar los genes que denominó Genes CDC (ciclo de división celular), estas
células mutantes tenían problemas proliferativos, entonces estos genes deben de estar codificando para productos proteicos
que son esenciales en el control del ciclo celular. De modo tal que una mutación en las proteínas codificadas por esos genes
detiene en puntos específicos de ese ciclo celular.
El paso del tiempo no implica que la célula pase de una fase a la otra, sino que depende de otros mecanismos. Se dice que
deben atravesar cambios drásticos para pasar ciertas fases del ciclo celular, llamadas transiciones reguladas. Los cambios
drásticos, se creía que dependía de factores que activaran o desactivaran para pasar de una fase a la otra.
● Una de las transiciones reguladas, son los llamados Puntos de Restricción, que se da en fines de G1 y principios de la
fase S. Es un punto muy difícil para célula atravesar esa transición.
● Otra transición, G2 a la fase M
● Mitad meiosis, de la anafase a la metafase.
Estos procesos de cambios drásticos están mediados por mecanismos de fosforilación, que realizan las enzimas Quinasas
obteniendo el fosfato de la molécula de ATP. Proceso que ocurre postraduccional de las proteínas La fosforilación son una de
las modificaciones que pueden sufrir las proteínas que pueden tener un efecto dramático sobre su estabilidad o su actividad,
por ejemplo, una proteína que se encuentra en un estado inactivo, luego de la fosforilación, este grupo fosfato añade un
cambio conformacional en la estructura tridimensional y volverla activa. También puede darse el caso contrario. Otro
ejemplo, es donde una proteína es sujeta a degradación constante y una fosforilación la vuelve inaccesible a la maquinaria de
degradación y permitir su acumulación en el tiempo. La característica principal de la fosforilación se debe a la enorme
rapidez. La fosforilación es un proceso reversible, por lo que, si las quinasas añaden grupos fosfatos, existen otras enzimas
que los remueven y son las fosfatasas. Cabe destacar que la fosforilación se da en residuos de serina, treonina y tiroxina,
dado que no cualquiera puede hacer este grupo con cargas negativas.
Existen quinasas que regulan procesos que permiten los cambios drásticos a lo largo del ciclo celular, que se denominan
Cdk-Ciclinas (quinasas dependientes de ciclinas. Su estructura funciona es un heterodímero, un complejo de 2 polipéptidos
diferentes unidos por uniones no covalentes. De esas 2 subunidades, una es la que tiene la actividad catalítica, la Cdk es la
que es capaz de unir covalentemente el fosfato del ATP al residuo de treonina, tiroxina o serina, es la que tiene la capacidad
de fosforilación. La otra, la ciclina, es la subunidad regulatoria, regula que la subunidad Cdk adquiera la estructura
tridimensional adecuada para ser funcional.
Hay 4 familias principales, y su nombre lo adquieren del momento del ciclo celular que regulan:
● G1-Cdk
● G1/S-Cdk
● S-Cdk
● M-Cdk

10
Paul nurse, fue el que descubrió por primera vez la actividad de las Cdk, como los productores del avance del ciclo celular,
también se dio cuenta que los genes que codificaban para estas ciclinas eran los mismos genes que describió Hatwell no solo
estaban en las células de las levaduras, sino que se encontraban en todas las células eucariotas.
Otro grupo de investigación descubrió en experimentos a la hoy conocida M-Cdk, que promueve la segregación de los
cromosomas y denominaron Factor Promotor de la maduración, luego se descubrió que ambos eran la misma molécula.
Utilizaron ovocitos de rana miden entre 1-3mm, se podía inyectar “cosas” a los ovocitos por su gran tamaño. Las ranas tienen
la capacidad de producir y almacenar grandes cantidades de ovocitos que quedan almacenados en G2, en la profase I. Si se
inducía por inyección hormonal de progesterona, entrarían a la fase M lo ovocitos. Tomaron citoplasma que entro a la mitosis
y se los inyectaron a otros que no fueron inyectados, también entraban en mitosis. Por lo que concluyeron que se debía a
moléculas que se encontraban en el citoplasma lo que inducia el cambio de fase.

¿Cómo se regula la actividad de las Cdk?

Se debe a la estructura misma, y se debe a las ciclinas. Aunque no siempre se encuentran presentes, se encuentran en
momento precisos en gran cantidad y luego disminuyen. Varía dependiendo de que fase se encuentre la célula y por ende se
incrementaran las ciclinas de la fase siguiente para regular dicho cambio de fase. También están reguladas por el sistema
ubiquitina-proteasoma, permite que ciertas proteínas se degraden de manera muy rápida e implica que esa proteína debe
unirse de manera covalente con una molécula muy pequeña que es la ubiquitina, si se añaden cadenas de ubiquitina a lo
largo de ciertas proteínas proceso llamado ubiquitinación, conducirán al mecanismo de degradación por medio del
proteasoma.
Tim Hunt fue quien descubrió y describió de las ciclinas.

Transición regulatoria de anafase a metafase.

En anafase ocurre la separación de las cromátides hermanas, que se debe a la ruptura de las cohexinas que lo mantiene
unidas a lo largo del cromosoma a las cromátides hermanas, aparte del centrómero. Separasa es la que lleva a la separación
de las cohexinas, pero se encuentra unida a la securina y para que la separa realice su actividad, se necesita que la securina
sea degradada previamente.
El complejo promotor de la anafase (APC) induce la ubiquitinación de la securina, su degradación en el proteasoma y la
liberación de la separasa. El AP es un complejo activo formado por 2 subunidades, el complejo promotor de la anafase que se
al complejo Cdc-20.
Cdc-20 se va a acumular cuando se encuentre activa la ciclina que activa la Fase M. El Cdc-20 es fosforilado y así activado, por
la M-Cdk.
APC también ubiquitina a la M-Cdk, o sea que existe un feed back negativo, porque rápidamente disminuye la cantidad de
ciclinas de la fase M.
Existen también una manera de activar este sistema de una manera máxima, que es fosforilando las Cdk-ciclinas, por medio
de otras proteínas.
Existen proteínas inhibitorias se unen al complejo Cdk-ciclinas e impiden que se unan a su sustrato, son ejemplo:
● p 27
● p 21
● p 16
● p 53
también ellas pueden estar a procesos de regulación, por lo que si son ubiquitinadas liberarán al complejo Cdk-ciclinas y éstas
podrán unirse a su sustrato.

11
Puntos de control
Señalizaciones intracelulares que se activa en aquellos momentos en que la célula no ha replicado la totalidad de su genoma
o cuando hay daños en el ADN.
p 53 es una proteína inhibitoria muy importante, ya que detiene el ciclo celular, inducido por daños en la doble cadena de
ADN. Se encuentra sometida a degradaciones constantes. Si se fosforila puede acumularse y así regular el ciclo. Un factor de
transcripción, p 21 cumple la función de inhibir a Cdk-ciclina que induce la transición de G1-S.

¿Cuáles son los requisitos que se necesita para pasar el Punto de restricción?
Se necesitan ciertos factores mitógenos, no necesariamente necesitaran de nutrientes para pasar este punto.
El rol de los mitógenos o factores de crecimiento
Mitógenos y factores de crecimiento, no son sinónimos, sin embargo, algunos factores de crecimiento actúan como
mitógeno, aunque tengan otras funciones involucradas en otros procesos.
Son ejemplos:
● FGF
● EGF
● PDFG
● Eritropoyetina
● Interleuquinas
Son pequeños péptidos, segregados por un tejido que actúan sobre receptores de la superficie de las células de una
población competente. Y que produce una cascada de activación intracelular, que median diferentes fosforilaciones.
La unión del mitógeno con su receptor que induce la vía de activación intracelular suele terminar con activación de
factores de transcripción de determinadas proteínas que van a inducir que se expresen determinados genes en el
genoma. Uno de los genes que suele ser transcripto como respuesta a la inducción de un mitógeno es un gen, que a su
vez es un factor de transcripción Myc. Una vez que se transcriba y traduzca es te gen se formará la proteína Myc, que
actúa en el promotor de otros genes produciendo a su vez inducirá una segunda oleada de transcripción y traducción.
El gen Myc puede activar 3 genes:
● Ciclina D, que activa a G1-Cdk- ciclina, la ciclina G1 no está desde el comienzo, sino que, debe sintetizarse en la
célula y comienza a hacerlo cuando recibe una señal mitogénica que inició una vía de señalización intracelular
que activa Myc y promueve la síntesis de esta ciclina.
● Se transcribe una subunidad regulatoria que va a degradar a aquella proteína p27 que le ponía un freno a la
ciclina G1. El mitógeno induce a la síntesis de las proteínas que participan en la degradación de las señales
inhibitorias. De modo tal, que libera la actividad no solo de las ciclinas características de G1, sino también de las
que participan de G1/S.
● Ambas ciclinas, fosforilan muchos sustratos, entre ellos el Rb, la proteína del Retinoblastoma, tiene una función
inhibitoria de la proliferación, dado que secuestra al factor de transcripción que va a inducir la síntesis de las
ciclinas características de los complejos S-Cdk ciclina.
El control que tiene un organismo multicelular dependerá de la disponibilidad de los mitógenos, si ellos no se encuentran
presenten no podrán atravesar el punto de restricción por más nutrientes que posean.

12
Para entender el abordaje de los procesos patológicos que caracterizan a las células tumorales donde la proliferación ha
perdido el control regulatorio, se clasificaron a los genes del genoma según el fenotipo que se quiera analizar. Se los dividió
en 2 grupos
● A un grupo de genes que favorecen la proliferación celular, es decir tienen un efecto positivo, como por ejemplos
los genes que codifican para las ciclinas, las quinasas dependientes de ciclinas, los genes que codifican para lo
mitógenos y sus receptores. Se los llama Protooncogenes. Si ocurriera una mutación en estos genes promovería
la progresión aun si tener la señalización de un mitógeno, y entonces este gen mutado se pasa a llamar Oncogen.
● El otro grupo será aquellos genes que detienen el ciclo celular, como, por ejemplo, p27, Rb, p53, proteínas que
ponen un freno. Son los genes denominados Genes supresores de tumores.

13
Seminario n° 3 de biología celular por el Dr. Giusti
Regulación de la expresión génica I

Conceptos básicos:
1) Diferenciación celular: 2 tipos celulares del mismo organismo, por ejemplo, una neurona y un hepatocito, el genoma de
ambas es exactamente el mismo. No todo el genoma está siendo expresado. Se hicieron experimentos para saber que
transcriptos están siendo expresados en los diferentes tipos celulares. Los genes se pueden agrupar en 3 grandes grupos:
a) Algunos genes que son específicos en tipos neuronales
b) Otros solo en hepatocitos
c) En ambos tipos, genes de mantenimiento o housekeeping
2) Mecanismos moleculares que permiten la diferenciación celular. Pueden expresar genes a partir de estímulos que antes
no se expresaban, como por ejemplo la prolactina en las células de la glándula mamaria en respuesta a estímulos
hormonales.
Existen 30.000 genes. De esos genes, no todos codifican para proteínas

⮚ 21.000 codifican para proteínas.

⮚ 9.000 codifican ARN no codificantes:
▪ snARNs (ARNs pequeños nucleares)
▪ sonARNs (ARNs pequeños nucleorales)
▪ microARNS

La expresión de los genes comienza a partir de la transcripción de esos genes por parte de la ADN polimerasa, con la
transcripción de los genes, algunos de los transcriptos primarios necesitan una modificación como el splicing. Y exportados
del compartimiento nuclear al compartimiento citoplasmático y puede o no ser traducido.
Todos los procesos de la célula son regulados. Aunque se concentran en si se van o no a transcribirse.
Regulaciones
A. Regulación pre-transcripcional: procesos que regulan antes de la transcripción modificando el grado de compactación
de la cromatina llamado control pre-transcripcional.
B. Regulación de la transcripción: procesos que regulan el inicio de la transcripción.

Regulación pre-transcripcional o regulación epigenética

Epigenésis: “por encima de los genes” Conceptos
Una transformación química que puede afectar al ADN o a la cromatina pero que no afecta el orden de las bases.
● En biología molecular: mecanismos moleculares algunos de ellos heredados que proveen información regulatoria al
genoma sin alterar la secuencia de nucleótidos del ADN.
● En biología del desarrollo del desarrollo: aquel mecanismo que no es genético. Un evento epigenético que impulso a
un mecanismo de desarrollo.
El genoma está asociado a proteínas, histonas, que forma así la cromatina. En la célula se encuentra en estados más laxos. En
diferentes células habrá diferentes grados de compactación o de laxitud permitiendo que acceda la maquinaria
transcripcional.

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El nucleosoma es el primer grado de compactación. Obtenido de imágenes de microscopio y de datos químicos, formado por
dímeros de histonas: 2*H2A, 2*H2B, 2*H3, 2*H4. H1
Técnicas de cristalografía de moléculas por Rx pueden purificar las moléculas, una vez que atraviesan los rx en las moléculas y
reconstruir la disposición de las moléculas.
Características de las histonas:
● Son proteínas muy conservadas. Conservan su estructura en el tiempo.
● Cada aminoácido cumple una función específica. Poseen entre 103-115 aminoácidos.
● Las H2A poseen una alta concentración de aminoácidos básicos que el resto de las histonas, poseen una cadena
positiva: Lisina (K), Arginina (R).
● Le otorgan una carga neta positiva a las histonas, y esto otorga a las histonas asociarse al ADN que es un poli anión,
con alta afinidad.
● Estructura de las histonas, son polipéptidos poseen ciertos dominios con alfa hélices y le permite plegarse, que se
llaman Pliegues Histónicos permite la asociación de histonas, también llamado “apretón de manos”.
● Se forman dímeros de histonas de la asociación de H2A-H2B y H3-H4.
● Los extremos N-terminales carecen de las estructuras de alfa hélice y protruyen hacia afuera de los dímeros, y son el
asiento de modificaciones químicas que permiten la compactación de la cromatina.
Modificaciones químicas de los extremos N-terminales de las histonas
Las acetilaciones y las metilaciones ocurren en el mimo tipo de residuos, ocurren en las lisinas (R) poseen un resto de un
grupo de 4 carbonos que presenta un extremo amino que le confiere la carga positiva, y las fosforilaciones ocurren en los
residuos de serinas (K).

⮚ Acetilaciones: agrega un grupo de acetilo, consiste en un grupo de 2 carbonos (COHN-CH3) a la amina de la lisina,
cancela la carga positiva. Una histona acetilada tendrá una menor afinidad por el ADN, entonces a mayor grado de
acetilación menor grado compactación, mayor grado de transcripción.
⮚ Metilaciones: también ocurren en el nitrógeno de la lisina. Agrega un grupo metilo (CH3). No modifica la carga. Una
lisina metilada no puede ser simultáneamente acetilada, o sea no puede ser modificada para la descompactación de
la cromatina.
⮚ Fosforilaciones: son menos frecuente. Aumentan la carga negativa, pierde la afinidad por el ADN, por lo cual a mayor
grado de fosforilación menor grado de compactación.
Son modificaciones dinámicas. Hay enzimas que pueden producir que la remoción de estos grupos. En el caso de la
acetilación, las enzimas responsables son la desacetilasas de histonas. En la metilación son las metiltranferasas, y en la
fosforilación son las catalasas.
Las desacetilasas (HDAC) luego de remover el grupo acetilo, desfavorecen la expresión génica. Le quita la carga negativa, y
que la histona con carga positiva y tendrá más afinidad por el ADN entonces habrá mayor grado de compactación.

Heterocromatina facultativa: puede estar o no compactada. En distintos tipos celulares o en un mismo tipo celular en
distintos tiempos reaccionan a distintos estímulos.
Heterocromatina constitutiva: siempre está en forma heterocromatinizada. Hay regiones del genoma siempre están
hetocromatinizada, son regiones pobres en contenido génico, como los telómeros.

Los complejos remodeladores de la cromatina

Son mecanismos que regulan la compactación de la cromatina, complejos enzimáticos que utilizan la energía para generar
movimiento en los nucleosomas que se generar debido a la hidrolisis del ATP.
15
Efectos:

⮚ Pueden desplazar un nucleosoma de una región a una región adyacente, ese movimiento que un promotor
escondido quede levemente expuesto para que se active la transcripción.
⮚ Pueden remover, de una región determinada del genoma, un nucleosoma y dejar una región sin asociación de
nucleosomas en esa región del genoma.
Ambas favorecen la expresión génica.
⮚ Pueden sustituir los nucleosomas con las histonas clásicas por nucleosomas con histonas menos comunes. Variantes
de H3, llamada H3.3 que tiene terminaciones aminoacídicas, la cual le confiere menor grado de afinidad por el ADN y
por ende habrá menor grado de compactación y la caracteriza por un alto grado de expresión génica. Hay otra
variante de H3, con un mayor grado de afinidad al ADN, llamada CENP-A, característica de regiones de
heterocromatina constitutiva y centroméricas.

Metilación del ADN.

Características:

▪ Ocurre en algunos residuos de citocinas, es una modificación epigenética.

▪ La citocina tiene que estar yuxtapuesta con una guanina, esa guanina tiene que estar 3´con respecto con la citocina.
▪ Se generan islas de CPG: regiones donde se encuentra la asociación de guanina-citocina, donde las citocinas están
metiladas y por lo general están asociados a promotores. De la sigla, la letra P, significa el grupo fosfato que une a la
guanina con la citocina y hace referencia de la posición de la mima.
▪ No cambia las secuencias de bases. Pero cambia la conformación tridimensional.
▪ La metilación deriva en el silenciamiento génica, ya que la Polimerasa II no puede ser adherirse al sitio de unión para
comenzar la transcripción.
▪ Ese cambio que se genera se forma una afinidad de enzimas, desacetilasas de histonas, esto genera que las histonas
se adhieran al ADN y por ende se compacte, y de ese modo se silencie la expresión génica.
▪ Las modificaciones de las histonas, algunas de ellas pueden ser transmitidas a las células hijas, aunque no hay
evidencia de todas las que lo producen, solo se sabe que existen 2 tipos, por ejemplo, la trimetilación de la enzima 27
y la trimetilación de la enzima 9 de la histona H3, se sabe que son transmisibles a las células hijas.

Regulación de la transcripción
Existen 3 tipos de ARN polimerasas, tipo I, II, y III. Transcriben distintos tipos clases de genomas.

⮚ La ARN polimerasa I, transcribe ARN ribosomal.

⮚ La ARN polimerasa II transcribe todos los ARN mensajeros cuyo producto final es una proteína.
⮚ La ARN polimerasa II transcribe el ARNt, y ARN pequeños.

También existe una ARN polimerasa mitocondrial.

Características de la ARN polimerasa II,
o Es un complejo de polipéptidos de 2 subunidades. La subunidad 1 posee la función enzimática, un extremo carboxi
terminal, extremo CTD compuesto por 7 aminoácidos.
o Por si sola no es capaz de reconocer los promotores, no tiene afinidad por la secuencia del ADN.

16
 o Existe un conjunto de 5 proteínas son imprescindibles, los llamados Factores Basales de la Transcripción (TF2T), que
permiten que la ARN polimerasa reconozca a los promotores. Están presenten siempre, no son específicos. Si falta
uno la transcripción no se produce

¿Cómo reconocen los factores basales de la transcripción a los promotores? Los promotores son doble cadena de ADN,
entonces como es que hace una proteína para reconocer la secuencia si está el promotor arrollado sobre sí mismo.
La doble hélice sufre diferentes modificaciones estructurales que son detectadas por proteínas. Existen diferentes familias de
proteínas que reconocen las estructuras especificas están las llamadas Dedos de Zinc existe un átomo de zinc y que favorece
la configuración tridimensional precisa.
También se encuentran las cremalleras de leucinas, son muchas de las proteínas que interactúan con el ADN y que poseen
homeodominios, son sectores polipeptídicos que pueden interaccionar con el ADN.
Se dice que cuando todos los factores basales de transcripción están posicionados y no ocurre la transcripción, se dice que
ese complejo esta inactivo.
La forma activa de la ARN polimerasa II, se fosforila el extremo carboxi terminal.

Existen elementos del genoma, secuencias regulatorias: Potenciadores (enhancers) o silenciadores (silencers). Se posicionan
un conjunto de proteínas que interactúan con lo silenciadores o potenciadores, son los llamados Factores de Transcripción
Específicos. Las proteínas que participan son diferentes, es decir varían de un gen a otro a diferencia de los factores basales
de la transcripción que siempre son las 5 mismas proteínas.
Se dice que un factor de transcripción es aquel que interactúa directamente con el ADN, y aquel que no se use de manera
directa se llama correguladores, se unen a otras proteínas. Aunque ambos tienes una actividad regulatoria sobre la activación
de un gen.
Entonces:
Los promotores son secuencias del ADN, que se le pueden unir los factores de transcripción y que, a su vez, a estos últimos se
les puede unir los correguladores.

Secuencias Potenciadores: activan /ayudan a la transcripción mediante diferentes proteínas.

Los silenciadores por su parte inhiben la transcripción.
Tienen su efecto rio abajo o rio arriba con diferencias de muchos o pocos pares de bases, y esto se debe a que la molécula de
ADN puede doblarse y así interactuar con la secuencia potenciadora
Mediador: complejo esencial en la transcripción, para la acción de un potenciador o de un silenciador, compuesto por más de
30 proteínas, se lo puede pensar como un corregulador que está presente en la transcripción de todos los genes. Su función
condensa las interacciones proteicas de aquellos factores específicos de la transcripción que están unidos a potenciadores o
silenciadores, que a su vez éstos están unidos a los correguladores, que por este fenómeno de acercamiento físico de las
secuencias de ADN que contienen los silenciadores y potenciadores con los promotores. Los mediadores pueden mediar la
interacción de los factores específicos de la transcripción con la ARN polimerasa II. Algunas de esas interacciones van a
favorecer, el inicio de la transcripción y otras interacciones no permitirán el inicio de esta. Serán entonces los factores
específicos que se unen a potenciadores los que produzcan que se inicie la transcripción y contrariamente serán los factores
que se unan a represores los que la inhiban.
El mediador entonces la frecuencia con que la ARN polimerasa II inicia la transcripción.
Ciertas proteínas que tienen la capacidad de condensar la cromatina de manera local
17
Entonces los factores específicos de la transcripción se pueden unir o potenciadores o silenciadores. No pueden unirse a
promotor, sino que le se unen son los factores basales de la transcripción.
¿Que produce esta unión con el factor especifico de la transcripción?
El factor especifico de la transcripción en primer lugar puede reclutar a ese sitio proteínas que participen en la remodelación
de la cromatina, o que sean modificadoras de histonas, el factor de transcripción interactúa con las proteínas y las atrae a ese
punto de unos a otros.
Pueden reclutar, por ejemplo, al complejo remodelador de la cromatina para que elimine de esa zona los nucleosomas o para
que los desplace permitiendo, ahora la unión de los factores basales de la transcripción y la ARN polimerasa II, también
puede reclutar complejos que modifican los extremos N terminales de las cromatinas, como una acetilasas de histonas,
acetilando histonas y favoreciendo la descondensación local y se posicionaran entonces los factores basales de la
transcripción y la ARN polimerasa II.
Por lo cual el punto de inicio de todo este proceso es el posicionamiento de los factores específicos de la transcripción que
van a dirigir la modificación de la cromatina.
También se puede pensar en el ejemplo en el que un factor especifico de la transcripción se une a un represor, y que esas
proteínas recluten complejos remodelares de la cromatina, uniendo los nucleosomas entre sí, o a proteínas modificadores de
histonas que remuevan los grupos acetilos y agreguen grupos metilos.
No hay un factor específico para cada uno de los 30 mil genes existentes en el genoma. No actúan de manera individual, sino
que actúan de manera combinatoria, actúan en conjunto, y es la combinación particular de cada conjunto lo que lo hace
especifico. Una proteína individual, un factor especifico de la transcripción puede ser común a varios conjuntos de iniciación
de transcripción de un gen, pero el conjunto se vuelve específico para cada gen.
Puede regular varios genes, pero con un número limitado de proteínas.
Existen genes que regulan a los factores específicos de la transcripción, llamados Genes Maestros. Son ejemplos, en
embriología los genes HOX!!!!! Son genes que funcionan como factores de específicos de la transcripción.
Como conclusión: en la regulación de la expresión génica, los factores específicos de la transcripción tienen un rol
fundamental, reclutando la maquinaria de la transcripción por medio de mediadores, y correguladores, a su vez los factores
de la transcripción pueden ser regulados, y están activos o inactivos.

18
Seminario 4 de biología celular por el Dr. Giusti
Regulación de la expresión génica II
Un fenómeno que surge de la regulación de la expresión génica es que haya diferentes tipos celulares que a pesar de
compartir el mismo genoma expresen distinto subconjuntos de genes
Otros niveles de la expresión génica
Los transcriptos que produce la ARN polimerasa II (transcriptos primarios) sufren una serie de cambios que son importantes
para que el transcripto adquiera sus características funcionales finales. Estos procesamientos son esenciales para que el ARN
mensajero pueda ser exportado del núcleo hacia el citosol y para que pueda ser correctamente traducido
Una vez en el citosol la vida media de los ARN esta finamente regulada
Eventualmente si un ARN mensajero es traducido, las proteínas también están sujetas a una regulación respecto de su
estabilidad y de su actividad

Procesamiento de ARNm eucariota

El transcripto primario producido por la ARN polimerasa va a sufrir modificaciones para permitir la funcionalidad. 3 pasos de
procesamiento:
● Modificación en su extremo 5’ (capping). Ocurre apena 20 nucleótidos después de que la ARN polimerasa comienza
a sintetizar el transcripto. Se agrega en este extremo una 7 metilguanosina, se lo denomina cap.

Se une al ARN mensajero un conjunto de proteínas que tiene afinidad por el cap. (complejo de unión del cap.)
Función: evita que el ADN sea degradado por exonucleasas presentes en el exterior celular.
Segundo aspecto que permite la modificación cotranscripcional es el Trasporte del ADN a través de los poros nucleares
● Modificación en su extremo 3’ (clivaje y poliadenilación). La enzima denominada poliA polimerasa, agrega 200
nucleótidos de adenina al extremo del ARN mensajero (Cola poliA)

Función: regula fuertemente la estabilidad de los ARN mensajeros, esta estabilidad va a estar mediada por un conjunto de
proteínas que tienen una alta afinidad por la cola de poliA que se denominan poliA valid tropings.
La pérdida de la cola de poliA hace que en segundos el ADN sea degradado por nucleasas extracelulares
Estos procesamientos se dan al mismo tiempo que la ARN polimerasa está generando el transcripto primario (procesos
cotranscripcionales)
● Proceso de splicing o corte y empalme de exones.

Los genes eucariotas son discontinuos, las regiones que van a participar del fenómeno de la traducción se encuentran
interrumpidas por fragmentos de ADN que van a ser removidos por este proceso
Existen en el genoma ciertas secuencias consenso (conjunto de secuencias que tiene un alto grado de homología) que
determinan los límites de los intrones, estas van a ser reconocidas por la maquinaria enzimática que va a escindir a los
intrones y va a empalmar luego a los exones.
Hay 3 secuencias importantes que determinan que la región sea interpretada para este sistema enzimático como un intrón.
Una de ellas se encuentras en el extremo 5’ del intrón (GU). Segunda secuencia consenso, es interna al intrón y es una
adenina particular. Tercera secuencia se encuentra en el extremo 3’ del intrón.

19
Un error en un único par de bases haría por ejemplo que el transcripto maduro posea un corrimiento en el marco de lectura,
o sea que genere una proteína distinta probablemente no funcional respecto de la codificada originalmente.
Mecanismos del proceso de splicing
De la maquinaria participan grupos de ARN no codificantes llamados ARN pequeños nucleares (snArn). Tienen entre 100 y
200 pares de bases. Suelen adoptar estructuras secundarias muy diversas, espontáneamente forman complementariedad de
bases internas a una misma hebra formando horquillas. En algunos casos los snARN pueden formar apareamiento de bases
con otros snARN.
Estos funcionan acoplados a un conjunto de proteínas accesorias que van a generar ribonucleoproteína pequeñas nucleares.
SnaARN + proteínas accesorias = ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snurnp)
Existen 5 snurps:
o Snurps u1
o Snurps u2
o Snurps U4
o Snurps U5
o Snurps U6

La actividad catalítica enzimática es producida por el mismo ARN. Estos pueden reconocer por apareamiento de bases los
nucleótidos de las secuencias consenso que determinaban los límites de los intrones.
¿Cómo se produce este mecanismo?
Las snurps se unen a las secuencias consenso y forman un complejo de snurps conocido como el espliceosoma.
Las snurps pueden reconocerse entre sí debido a que los snARN pueden formar apareamiento de bases entre ellos.
Estos movimientos se van a caracterizar por dos reacciones de corte y formación de enlaces covalentes (transesterificación)
El primer corte que se produce es en el sitio 5’ que va a clivarse y va a unirse covalentemente a la adenina característica del
punto de ramificación formando una estructura en el intrón similar a un lazo.
La 2º de las reacciones implica la ruptura de extremo 3’ y la unión covalente de los dos exones con precisión de un
nucleótido.
De este modo como subproducto de la reacción del splicing queda en intrón en forma de lazo que rápidamente va a ser
degradado por un conjunto de exonucleasas específicas.
Complejo proteico denominado complejo de unión de exones: se unen en el sitio donde fue producido el splicing
La precisión con la que se realiza el splicing no solo estará garantizada por los apareamientos de los ARN pequeños con las
secuencias consenso de los intrones, sino que otro elemento que favorece la precisión es este fenómeno de splicing
cotranscripcional.
permite aumentar la capacidad codificante del genoma.
Procesamiento por splicing alternativo diferencial: salteo de exones. Un exón va a estar presente como tal y va a estar
ausente en otros tipos celulares. En esos otros tipos celulares la maquinaria de splicing interpreto toda la secuencia como
intrones y la removió.
Otra forma de splicing alternativo implica que los sitios consenso que se encontraban en el extremo 5’ y 3’ no sean utilizados,
pero sean utilizados sitios muy parecidos que se encuentren en la proximidad.
Los mecanismos que existen para explicar este proceso son un conjunto de proteínas que están presentes en distintos tipos
celulares y pueden interactuar con los sitios consenso y están diferencialmente expresadas. Hacen que los sitios consensos
muy débiles que no pueden reclutar proteínas por si mismos puedan luego de esa unión reclutarlas con mayor facilidad, en
20
otras palabras, permitir que una secuencia sea removida cuando en ausencia de esa proteína permanecería en el transcripto
maduro. Esto puede explicar porque en un determinado gen se produce un transcripto y en otro determinado gen un
transcripto diferente.
Hay una secuencia de nucleótidos bastante larga presente entre el extremo 5’ y el codón de iniciación presente en los
mensajeros, estos no van a ser traducidos, se conoce como “extremo 5’ no traducido de los mensajeros”
Todos los nucleótidos presentes luego de codón stop, pero anteriores a la cola poliA presentes en el extremo 3’ tampoco se
traducen
Ambos tienen un roll fundamental en regular la estabilidad de los mensajeros (no van a participar en la codificación de
aminoácidos en las proteínas) pero adquieren información regulatoria respecto de la vida media que van a adquirir los
mensajeros.
Todos los ARN adoptan estructura secundaria y están asociados a un enorme número de proteínas que aseguran su
estabilidad y su exportación al citosol.
TRADUCCION
Una vez en el citosol el ARN mensajero maduro va a interactuar con algunos complejos proteicos muy importantes para su
destino que son; los factores iniciadores de la traducción (EIF), que van a permitir el inicio de la traducción.
Una de estas proteínas va a interactuar directamente con el complejo de proteínas del Cap. (lo reemplazara), en tanto que el
otro complejo va a interactuar con las proteínas de unión a la cola de poliA, y además van a interactuar entre si generando
una estructura cerrada sobre sí misma.
Solo en esta configuración, donde los dos factores de inicio de la traducción se reconocen entre sí, el transcripto maduro
puede comenzar a ser reconocido por los ribosomas para iniciar la traducción.
Esto asegura que transcriptos que han sido correctamente exportados (que conserven sus 2 extremos) puedan ser
correctamente traducidos.
Esta traducción va a comenzar con el transcripto maduro cerrado sobre sí mismo siendo reconocido su extremo 5‘por la
subunidad menor de un ribosoma y va a moverse a lo largo del transcripto hasta llegar el primer codón de inicio de la
traducción.
Cada uno de los mensajeros configurados de esta manera pude ser traducido múltiples veces por los ribosomas generando
en la célula polirribosomas o polisomas. La estructura de estos puede ser evidenciada en imágenes de microscopia
electrónica.
Un transcripto puede tener distintas estabilidades en distintos tipos celulares y por ende general distintas cantidades del
producto.
Bajo ciertas convicciones las células pueden estabilizar ciertos mensajeros y mandar a degradación a otros. Tienen como
característica central ser muy rápidas gracias a estar reguladas por estos mecanismos de la expresión génica.
Usualmente esta regulación de la vida media está dada por secuencias que están presentes en el extremo 3’ no traducido de
los mensajeros, y esas secuencias pueden ser reconocidas por un conjunto de proteínas que pueden favorecer o desfavorecer
la estabilidad de dicho mensajero.
Otro mecanismo de la estabilidad de los mensajeros esta mediado por una familia distinta de ARN no codificantes (microARN)
tienen alrededor de 20 nucleótidos, están codificados por el genoma y son procesados para generar sus formas maduras,
pero representan un mecanismo de acción.
¿Cómo funcionan los microarn? (reguladores negativos)
Suelen unirse a un efector formado por proteínas y actúan guiando al complejo efector por complementariedad de bases a la
secuencia de un determinado mensajero.
una vez que el complejo efector se posiciona sobre un transcripto en particular induce una represión de la traducción, el
desacople de los ribosomas y también induce la degradación del mensajero.

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Estos microarn que pueden producir la regulación fina de estos transcriptos son transcriptos por la ARN polimerasa II. Sufren
dos grandes pasos de procesamiento hasta que adquieren su tamaño final y son ensamblados al citosol en el complejo de
silenciamiento.
Mecanismo de control de calidad de los ARN: degradación del ARNm por secuencias de terminación prematuras (nnd)
Controlar que no haya habido algún error en el procesamiento que afecte la funcionalidad del producto final
Una mutación que genera un codón STOP recibe el nombre de una mutación sin sentido.
lo que va a verificar este mecanismo es que esté presente o no el codón stop, aquellas proteínas que lo tengan van a ser
activamente degradadas
Van a cumplir un roll importante los complejos proteicos de unión de exones, que indicaban los puntos de unión entre dos
exones.
Como funciona: en la primera traducción de este complejo maduro (traducción pionera) los ribosomas van a interactuar por
primera vez con estos complejos y los van a modificar o remover. Cuando son removidos o modificados no disminuyen la
estabilidad del mensajero.
¿qué pasa en la condición patológica?
Donde tenemos una mutación que hay generado además del codón de stop un codón stop prematuro.
El ribosoma una vez que llega al prematuro se va a desensamblar y va a dejar sin traducir el resto del ARNm y por lo tanto no
va a remover ni codificar los complejos de unión de exones posteriores al codón stop prematuro, estos reclutan
endonucleasas que rápidamente degradan el ARN.
es decir que si luego de la traducción pionera no se modifican o remueven, eso va a ser la señal celular para determinar que
debe haber degradación.
¡¡¡NIVEL FINAL DE LA REGULACION DE LA EXPRESION GENICA!!!
El hecho de que exista producción de una proteína no es igual a que exista actividad, y la regulación de que fracción de esa
proteína es activa o no activa en un momento dado puede producirse en un rango temporal muy acotado.
La fosforilación es una modificación que puede cambiar la actividad de la célula en cuestión de segundos.
¿Cómo se produce la degradación de las proteínas?
se produce a través de un sistema enzimático que se conoce como la vía ubiquitina proteosoma.
la ubiquitina es un pequeño péptido que se une covalentemente y conjuga a ciertos sustratos proteicos y constituirse en una
marca celular de degradación. Las enzimas que participan en el reconocimiento y el agregado de ubiquitinas al sustrato se
conocen con el nombre de ubiquitín ligasas.
Esta degradación final se da en unos complejos proteicos denominados proteosomas que reconoce las proteínas
poliubiquitinadas y las degrada activamente
Transcriptos que producen la formación de los ARNt y ARNr
ARNt: están codificados en el genoma. Los transcriptos primarios son más largos en comparación con los transcriptos
maduros que van a ser funcionales.
4 pasos de procesamiento que ocurren en el nucléolo que implican
1. la remoción del clivaje por acción de ciertas enzimas en el extremo 5’.
2. la escisión de una región intrónica cercana a la secuencia que luego va a funcionar como anticodón.
3. la remoción de ciertos nucleótidos en el extremo 3’.
4. la modificación química de algunas bases.

Todos estos pasos están llevados a cabo por enzimas proteicas que están localizadas en el nucléolo (es una zona
bioquímicamente delimitada dentro del núcleo).

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ARNr: los ribosomas están constituidos por una subunidad mayor (60s) y una menor (40s). Cada una de estas subunidades
son enormes ribonucleoproteínas.
La mayor compuesta por 3 ARNr de distinto tamaño (5s, 28s, 5.8s respectivamente) y por casi 50 proteínas
La pequeña: un único ARNr de 18s y poco más de 30 proteínas.
La actividad peptidiltransferasa esta llevada a cabo por un sector de ARNr
¿Cómo se producen los ARNr?
Son los más abundantes de todas las células por la enorme cantidad de ribosomas y son activamente transcriptos. Se
transcriben a partir de 2 precursores, el más grande 45s que en el nucléolo son modificadas químicamente alguna de sus
bases, en tanto que otros fragmentos de este precursor son clivados y degradados. Este precursor 45s se transcribe a partir
de genes que son transcriptos por la ARN polimerasa I. esto es llevado a cabo por un conjunto de ribonucleoproteínas, que
están formadas por un péptido asociado a ARN pequeños nucleolares, y por lo tanto son ribonucleoproteínas pequeñas
nucleares.
Función: modificar químicamente algunas secuencias del precursor y favorecer en algunos casos el corte de secuencias que
no van a estar representadas en las formas maduras.
Se producen cambios químicos que permiten que esto adopten una forma tridimensional necesaria para que ejerzan su
función correctamente en el interior del ribosoma.

El otro precursor, mucho más pequeño codifica directamente para el ARN 5s.
Entonces de los 4 ARNr, 3 derivan del precursor 45s transcriptos por la ARN polimerasa I, y el 4to deriva de un único
transcripto de la ARN polimerasa III.

Un mecanismo que ha permitido compensar el enorme trabajo de las células se ha dado por un fenómeno de amplificación
génica en donde los genes que codifican para los ARNr se han multiplicado dentro de nuestro genoma generando múltiples
copias de los mismos.
Tienen una localización particular, en los brazos pequeños de los cromosomas acrocéntricos.
cuando la cromatina se encuentra descondensada todas estas zonas que poseen las copias interactúan entre sí y se localizan
en una misma región nuclear (el nucléolo).
Podemos pensar al nucléolo como una estructura que tiene una alta actividad bioquímica de procesamiento de ARN y de
generación de ribonucleoproteínas

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Seminario de biología n°5 de Giusti

Técnicas

Las técnicas permites saltos conceptuales, ya que permite a las ciencias biológicas, desarrolle metodologías nuevas y permite
nuevos métodos de medicina, y de investigación.

1. Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia pensada como una única técnica por sus fundamentos,
2. la técnica de fraccionamiento subcelular,
3. la técnica de western-blot y
4. la técnica RT-QPCR que es PCR cuantitativa con retro transcripción.

Objetivo de las técnicas:

● Cuantificar la expresión de proteínas o ARN

● Niveles de expresión en diferentes tejidos
● Determinación su localización
● Si se expresan homogéneamente o no

Para entender esta técnica vamos a hacer algunos pasos previos dado que, necesitamos comprender para entender el
fundamento de estas técnicas como se utilizan los anticuerpos como herramientas de investigación.

Estos anticuerpos también llamados, inmunoglobulinas son proteínas producidas específicamente por un subgrupo de células
del sistema inmune, que participan en un proceso inmunitario conocido como, inmunidad tumoral, inmunidad mediada por
anticuerpos o respuesta inmunitaria adaptativa.

En esta respuesta inmune un grupo de células del sistema inmune los linfocitos B, poseen en su membrana proteínas
denominadas inmunoglobulinas o anticuerpos. Que pueden unirse de manera específica a ciertas macromoléculas que,
pueden estar presentes en bacterias o toxinas, derivadas de bacterias y, este reconocimiento especifico se produce porque
nuestro sistema inmune a lo largo de su maduración ontogenética genera millones de clones diferentes de linfocitos B que,
difieren los unos de los otros levemente en cuál es el motivo que reconocen la superficie molecular de sus anticuerpos de
superficie y en función a esa maduración prácticamente cualquier macromolécula exógena que ingrese a nuestro organismo
será reconocida por un subgrupo particular de linfocitos B que tenga anticuerpos que puedan unirse específicamente a esa
macromolécula extraña que ingreso.

el proceso por el cual se crea esta enorme diversidad de clones depende de un proceso genético denominado recombinación
somática

Pero lo que nos interesa aquí es que una vez que un linfocito B ha reconocido a una proteína exógena por ejemplo, que forma
parte de la pared bacteriana de un patógeno, se diferencia y comienza a proliferar y a producir plasmocitos que no son otra
cosa que una diferenciación de linfocitos B especializados en secretar hacia el plasma aquellas moléculas del anticuerpo que
antes solo estaban localizadas en su membrana y estos anticuerpos ahora solubles cuando reconocen a los patógenos
facilitan su eliminación por otras células del sistema inmune.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas, al tener esta capacidad de reconocer antígenos pueden ser utilizados como una
herramienta de investigación, de nuestro interés clínico

¿Como genero un anticuerpo para estudiar una proteína?

Los anticuerpos o inmunoglobulinas están compuestos por 4 cadenas polipeptídicas,

● 2 cadenas pesadas, internas

● 2 cadenas livianas, externas
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Nota: ambas se componen de regiones C-terminales constantes y de regiones N-terminales variables.

Todos los anticuerpos producidos por un individuo son exactamente idénticos en la región inferior, donde están solo las 2
cadenas largas o pesadas, y a esa región se la denomina fracción cristalizable o región FC de la inmunoglobulina.

La región que es variable de un clon de linfocito B a otro y que permite este reconocimiento especifico, se halla en los otros
extremos de la molécula. En aquellos extremos que están compuestos por el extremo que N-terminal de la cadena pesada y
de la cadena liviana, esta región denominada Región variable es la región que va a permitir el reconocimiento de esa proteína
exógeno que, denominaremos antígeno, algo es un antígeno cuando tiene la propiedad de antígeno cuando puede ser
reconocido por un anticuerpo.

La forma de una inmunoglobulina, se la representa como una Y. Los 2 extremos entonces, es el lugar donde reconoce a los
antígenos

Volvamos a nuestra pregunta: “Como es posible generar anticuerpos que reconozcan específicamente a una proteína?”

El proceso de generación de anticuerpos involucra utilizar el sistema inmune mamíferos que produzcan anticuerpos una vez
que inyectamos a ese animal con la proteína contra la cual queremos producir ese anticuerpo, tradicionalmente se usaban
conejos y ratones, también aves y gallinas.

Se inyecta una proteína que queremos estudiar, entonces reconocerá el sistema inmune a esa proteína de modo que habrá
algunos clones de linfocitos B espontáneamente en el sistema inmune del animal que reconocerán específicamente a la
proteína de interés y comenzaran a proliferar y a generar una diversidad de anticuerpos que permitan reconocer distintos
motivos estructurales que están presentes en la proteína de interés que luego van ser purificados a partir del plasma de este
animal y generar un plasma rico en esos anticuerpos que reconocen a esas proteínas de interés.

Aspectos importantes:

● No es solo un clon que reconocen a la proteína de interés

● Esa proteína de interés contenga distintos sitios estructurales, cada uno de ellos pueden ser reconocidos por distintos
clones de linfocitos B.

Hemos mencionado que no hay probablemente un único clon de linfocitos B que posea anticuerpos que reconozcan a la
proteína que nosotros hemos inyectado sino que esa proteína de interés probablemente tenga distintos sitios estructurales
cada uno de ellos reconocido por distintos linfocitos B y esta particularidad de que una proteína tenga distintas superficies
que puedan sr reconocidas por distintos clones de linfocitos B y por ende generarse una diversidad de anticuerpos que
reconozcan distintos sectores de esta proteína denominamos a estos anticuerpos que hemos purificado como ANTICUERPOS
POLICLONALES porque provienen originalmente de distintos clones de linfocitos B, cada uno de ellos reconociendo una
superficie diferente de la misma proteína.

A cada una de las superficies diferentes de la proteína que fue reconocida por un anticuerpo la denominamos EPITOPES. Una
proteína tendrá distintos epítopos que pueden ser reconocidos por distintos clones de linfocitos B de determinado animal y si
yo utilizo este método de producción tendré una solución de anticuerpos policlonales, todos reconocen la misma proteína,
pero distintos motivos estructurales de la misma proteína.

Sin embargo, también es posible generar anticuerpos que sean monoclonales es decir que reconozcan un único epítope de la
proteína de interés y la generación de anticuerpos policlonales.

Desde el punto de vista técnico es más costoso porque involucra en un primer paso aislar un único clon de linfocitos B de un
animal que fue inmunizado con la proteína de interés y una vez que uno aísla ese único clon debe hacer que ese clon se

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multiplique para generar ese único tipo de anticuerpos producido por ese clon y esto es dificultoso desde el punto de vista
técnico porque las células diferenciadas productoras de anticuerpos, los plasmocitos, suelen tener un número limitado de
divisiones celulares antes de entrar en apoptosis, es decir, si yo aíslo un clon de linfocitos B y simplemente lo dejo en
condiciones de cultivo para que produzca anticuerpos producirá, una pequeña cantidad antes de que todas las células
mueran en el cultivo y la técnica que permitió dar un salto y generar anticuerpos monoclonales se desarrolló a fines de los
años 70.

Dado que faltaban células productoras de anticuerpos, le faltaba un potencial mitótico, se diseñó un experimento para
fusionar a las células productoras de anticuerpos con células tumorales, con células que tienen una capacidad ilimitada de
reproducción debido a las mutaciones que poseen en los genes que regulan el ciclo celular y la fusión experimental de células
tumorales y células formadoras de anticuerpos genera lo que conocemos como HIBRIDOMAS. Es un hibrido celular producto
de la fusión de una célula tumoral y de una célula productora de anticuerpos.

Los hibridomas heredan de las células productoras de anticuerpos esta capacidad para generar anticuerpos específicos y
heredan de las células tumorales su amplio potencial mitótico de modo tal que uno puede conservar a los hibridomas en
condiciones de cultivo por tiempos muy extensos y, cosechar cada tanto del sobrenadante del medio de cultivo los
anticuerpos que están siendo generados que serán anticuerpos, que reconocen un único epítope de la superficie proteica.
Este proceso de formación de anticuerpos monoclonales tuvo un impacto gigantesco en la clínica y en la investigación por las
enormes adscripciones que hoy le damos a los anticuerpos.

Los que desarrollaron esta técnica, y entre ellos estaba un argentino que recibió el premio Nobel, Milstein.

Hoy en día, no hace falta generar cada anticuerpo, sino que existen compañías que venden estos anticuerpos de las
diferentes proteínas que uno quiera investigar. Se consiguen anticuerpo tanto monoclonales como policlonales.

Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Esta técnica utiliza anticuerpo, y toda técnica que tenga el prefijo Inmuno, utilizara anticuerpos.

Se usa para determinar la localización de determinadas proteínas en un tejido o en una fracción subcelular. y pueden
aplicarse dos variantes:

● la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica directa

● la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica indirecta

La técnica más aplicada y la más frecuente la inmunofluorescencia indirecta.

El fundamento:

⮚ utilizar anticuerpos que reconozcan una proteína de interés.

pero para hacer observable ese reconocimiento para poder identificar en qué lugar del tejido o en qué lugar de esa célula, se
ha unido el anticuerpo se le une a la fracción cristalizable del anticuerpo, moléculas de fluoroforos, es decir, moléculas que al
ser iluminadas con una determinada longitud de onda pueden emitir fluorescencia. De modo tal que, si uno observa con un
microscopio de fluorescencia a los cortes histológicos a las células de cultivo sobre las cuales se aplicó el anticuerpo podrá ver
puntos de señales fluorescentes en aquellos lugares en donde el anticuerpo están unido a mi proteína de interés.

Cuando utilizo fluoroforo, la técnica se llama inmunofluorescencia.

Si en la fracción cristalizable en vez de fluoroforos colocamos una enzima capaz de generar un producto coloreado cuando
nosotros le agregamos el sustrato esa variante en la técnica la denominamos Inmunohistoquímica, es decir, la detección

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estará dada porque unimos al anticuerpo un fluoroforo, o porque agregamos una enzima capaz de generar un producto
coloreado una vez que agregamos el sustrato

▪ La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia directa

El fluoroforo estará directamente unida a la Fracción Cristalizable del anticuerpo que reconoce la proteína de interés. A ese
anticuerpo lo llamamos, Anticuerpo Primario y es aquel que reconoce a la proteína de interés.

▪ La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia

Cuando aplicamos la técnica indirecta utilizamos dos clases de anticuerpos:

- Un anticuerpo primario
- Un anticuerpo secundario

El anticuerpo primario, que reconoce nuestra proteína de interés, el anticuerpo primario. Pero en este caso ese anticuerpo
primario no tiene en sí mismo conjugado ni el fluoroforo ni la enzima.

Sino que, utilizaremos un segundo tipo de anticuerpo denominado, anticuerpo secundario que reconoce la fracción
cristalizable del anticuerpo primario que, como son anticuerpos producidos por la misma especie estos anticuerpos
secundarios son simplemente anticuerpos específicos de la especie que reconocen esa fracción.

Es decir, habrá anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos primarios producidos en
ratones, habrá otros anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos producidos en conejos,
etc.

En esta configuración es el anticuerpo secundario quien tiene unidas de manera directa tanto los fluoroforos como las
enzimas que producen el producto coloreado y, la diferencia fundamentalmente es que, a un único anticuerpo primario se
unen varios anticuerpos secundarios y esto, implicara que, por cada proteína de interés, tendré asociados muchos más
fluoroforos que en el caso de la fluorescencia directa. Por cada proteína de interés hay más fluoroforos.

Los anticuerpos secundarios son policlonales, ya que se adhieren a diferentes partes de la Fc del anticuerpo primario.

Nos da mayor sensibilidad, por eso se usa con mucha más frecuencia.

Descripción de una imagen: imagen de una célula, que tiene 2 anticuerpos que reconocen 2 antígenos diferentes de interés;
una era la actina, proteína principal del citoesqueleto, y otro para el citocromo oxidasa 4, proteína que forma parte de la
cadena de transporte de electrones mitocondrial, de localización de las mitocondrias. Se pueden combinar distintos colores
para detectar en simultaneo 2 antígenos de interés. Si el anticuerpo que se une a la actina fue hecho en ratón, el anticuerpo
secundario, reconocerá la Fc de ratón y tendrá unido un fluoroforo rojo, que emita con fluorescencia color rojo. Si en cambio,
al antígeno primario que se une al citocromo, fue hecho en conejo, el anticuerpo secundario se unirá a la Fc contra conejo,
unido con un fluoroforo de color verde. Podre así, distinguir la localización de la actina que forma el citoesqueleto, y también
donde están posicionadas las mitocondrias, utilizando a la enzima como un marcador. Si se quiere visualizar al núcleo de una
célula, se utiliza un producto diferente, se usa un colorante DAPI, que se intercala en la bases del ADN y emite fluorescencia de
color azul.

En biopsias de tumores se utilizan técnicas de inmunohistoquímicas, que nos hablan de la agresividad de ese tumor,
caracterizado por el potencial mitótico, es importante saber cuántas células son mitóticamente activas. Cuantas mayor sea el

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número de células mitóticamente activas, mayor será la agresividad de ese tumor. Esto determina el pronóstico del paciente
y así redirigir la terapia oncológica, por ejemplo.

Inmunohistoquímica

Como se usa para determina la expresión de una determinada proteína de interés en un subconjunto de células en un tejido.

La proteína de interés es, en este ejemplo, Ki-67 que es un proteína que esta expresada en la fase S del ciclo celular
exclusivamente. Aquellas que sean visualizadas, significara que se encuentra en la fase S, y que son mitóticamente activas, o
sea que van a dividirse.

Descripción de una imagen: aquí estamos viendo el tejido, cada pequeño sector es una célula y se ven miles de células en este
tejido. Hay algunas de las células con una coloración pálida, es decir un violeta claro, y otras de color marrón oscuro casi
negro. Las células de coloración marrón son las que son positivas para la proteína de interés. Los de color violeta, tienen una
coloración de que tiñen sus núcleos.

¿Cuál es la diferencia que podemos observar entre la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia?

Es que el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario, que a su vez reconoce Ki-67 no está asociado a un
fluoroforo, sino a una enzima que, al colocar un sustrato incoloro, que produce un producto coloreado que precipita en el
interior de las células. Entonces este color marrón que tiene la célula se debe a la precipitación del producto de reacción de la
enzima del anticuerpo secundario.

¿Como determinarían el índice mitótico de una biopsia de un tumor?

Por ejemplo, contando la cantidad de células de color marrón.

¿Y si tomamos una muestra más grande?

Podría por cantidad de células coloreadas/ células totales

También podría ser células coloreadas/una superficie dada.

Fraccionamiento subcelular

Esta técnica permite purificar/aislar distintos componentes celulares y tenerlos en tubos distintos para poder analizarlos.

Fueron desarrollaron entre los años ´40- ´50, y permitieron un gran avance en la biología celular.

Esta técnica se usa en el contexto de la investigación y en caso muy particulares en el contexto clínico.

Si uno toma una muestra de tejido, y realiza una ruptura mecánica, como por ejemplo con unas cuchillas que giran a altísima
velocidad en una centrifuga, una especie de minipimer en miniatura, uno puede generar una solución, una suspensión de ese
tejido en un medio isotónico. En esa suspensión, se generará una suspensión llamada Homogenato. Tendríamos componente
de diferentes tamaños, núcleo, mitocondrias, ribosomas, el sector soluble: el citosol, y un tipo de partícula, llamada
microsoma, no es una organela propia de la célula, derivan de pequeñas vesículas del retículo endoplásmico y del aparato del
Golgi. Al romperse mecánicamente estas organelas se forman pequeñas vesículas.

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Esta técnica también puede utilizar otros métodos de ruptura mecánica, como por ejemplo sonidación, compresión, pero
todos obtendrán un homogenato en una solución isotónica.

La estrategia de la técnica esta, en la centrifugación ya que va a permitir que precipiten la fondo del tubo, cosa que no ocurre
de manera espontánea. Al aplicar la centrifugación, le permite por medio de la aceleración, es que aumente la fuerza
gravitatoria. Cuanto mayor es la densidad más fácil caerá al aplicar la fuerza gravitatoria.

Entonces se realizará una serie de centrifugaciones cada vez más veloces y por cada vez más tiempo, para que vaya
secuencialmente depositándose en el fondo del tubo, los distintos componentes presentes en la célula. En las primeras
centrifugaciones precipitara los elementos mayor tamaño y más densos, y en las centrifugaciones siguientes, precipitaran los
que tengan menor tamaño y menor densidad.

En cada una de estas centrifugaciones, uno obtiene 2 partes del homogenato:

▪ Aquellos elementos que precipitaron, llamado pelet

▪ Y la suspensión, llamado sobrenadante.

Uno parte de centrifugaciones relativamente bajas. A mil veces por 10minutos. Y obtengo un pelet, que analizare después y
con un sobrenadante. Separo el sobrenadante con una pipeta a otro tubo y lo vuelvo a someter a una nueva centrifugación y
otra vez tendré un pelet con un sobrenadante.

Este es el orden en que voy obteniendo los diferentes elementos celulares por medio de centrifugaciones, cada vez a mayor
velocidad y por mayor tiempo.

1) Núcleo
2) Mitocondrias (peroxisomas y lisosomas, menos frecuentes)
3) Microsomas (Retículo endoplásmico, Golgi, Membrana plasmática)
4) Ribosomas
5) Citosol

Como se evalúa la efectividad del procedimiento de enriquecimiento/pureza de las fracciones subcelulares?

Se elige una enzima especifica que conozca y que tenga una localización subcelular particular, por ejemplo, la citocromo
oxidasa 4 era especifica de las mitocondrias. Si agrego producto de esta enzima en las diferentes fracciones solo debería
actuar en la fracción mitocondrial, dando un producto coloreado, si es que ha funcionado de manera correcta la
centrifugación.

La determinación de una enzima puede ser, o bien por aparición de producto, o bien por desaparición de sustratos.

Estas determinaciones se hacen para ver si no hay contaminación y si el fraccionamiento subcelular fue realizado
correctamente, por ejemplo, si hago la prueba de la enzima citocromo oxidasa con el pelet nuclear y observo una reacción,
diré que hay contaminación de mitocondrias y por ende no fue realizado correctamente.

También pueden observarse estos pelet, en microscopia electrónica y determinar cuáles son las partículas que estaban
presentes.

Descripción de una imagen: Pelet microsomal: ¿notan que hay vesículas que contienen gránulos en la membrana? Son las
vesículas que corresponden al REG, y esos gránulos serán los ribosomas que están presentes y las que no poseen esos
gránulos, serán seguramente los que provienen del REL.

Aplicación experimental: por ejemplo, si uno está estudiando una enfermedad de una disfuncionalidad mitocondrial, uno
podría partir de fracciones subcelulares y determina como esa funcionalidad.
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Western blot o inmunoblot

Otra técnica que utilizara anticuerpos para determinar la presencia o los niveles de expresión de una proteína particular con
un anticuerpo especifico. Sin embargo, esta técnica tiene otros elementos.

⮚ 1ra etapa: todas las proteínas van a ser separadas de acuerdo con su tamaño. Y eso se logra realizando una
electroforesis en gel.

- Electroforesis en gel: utiliza la presencia de un campo eléctrico para permitir la migración de ciertas moléculas,
implica que las única que podrá migrar serán aquellas que tengan una carga electica neta. Osea las que tengan cargas
o bien positivas migrando hacia el polo negativo o bien negativas migrando al polo positivo, aquellas que tengan
carga neutra no podrá migrar.
Lo que primero se hace es tratar a la muestra biológica con un detergente carga eléctrica negativa, llamado SDS, pude
unirse a todas las cadenas polipeptídicas. Tratando a una muestra biológica, como un homogenato o alguna fracción
subcelular, con SDS hará que todas sus proteínas se desnaturalicen, pierdan su estructura terciaria y queden
recubiertas con las moléculas de SDS, es decir que queden rodeadas de cargas negativas. Y esto las hará apropiadas
para que puedan migran hacia el polo positivo.
La migración se da en un soporte, un gel de poliacrilamida. Los geles mirados en un microscopio y están formados
por una enorme cantidad de fibras, parecido a una red de telaraña y esas redes son los componentes de ese gel. Esto
implica las moléculas que van a migran en el gel, deben atravesar pequeños poros formados por estas tramas
formadas por el gel, y esto le impondrá una dificultad mayor para migrar, por esa red porosa, a las moléculas que
sean más grandes porque chocarán más veces con los filamentos del gel, en tanto que las moléculas más pequeñas
tendrán facilitada el pasaje y podrán migrar en determinado tiempo una mayor distancia en el gel. Por ende, las
moléculas más pequeñas migran más rápido, en un determinado tiempo que las de mayor tamaño.

⮚ 2da etapa: no trabajar las moléculas en el gel, ya que el gel es muy frágil.

- Se transfiere, en ese orden, a una membrana más resistente. Esto es lo que le da el nombre de “Blot”, que en ingles
significa transferir. Determinar la presencia o ausencia de la proteína de interés, incubando a esa membrana con
anticuerpos específicos que permitan unirse a mi proteína de interés.
- Utilizando la técnica indirecta, un Anticuerpo 1rio que se una a la proteína de interés y después de lavados para
remover los anticuerpos en excesos y quedando pegado el anticuerpo a la proteína de interés. Se le agrega el
anticuerpo 2rio pegado con una enzima y agregando un sustrato, de o un producto coloreado, que es lo más
frecuente, o una luz y esto se detecta con una cámara o placas fotográficas.

Ejemplos 1: cual es la localización subcelular de la enzima aromatasa?

Uno puede partir de un ovario, de un animal de experimentación, y realiza un fraccionamiento subcelular, donde uno obtiene
el homogenato y a partir de centrifugaciones diferenciales las diferentes fracciones subcelulares. Pero me reserve para de ese
homogenato, no lo use todo en las diferentes fracciones.

Como determinamos donde se encuentra? Se puede hacer un Western blot de cada una de estas fracciones? Imaginemos
que si lo realizamos.

Resultado: las bandas que aparecen se deben a un marcador de peso molecular

o 1er calle: el homogenato, se encuentra marca en el homogenato, ya que es el tejido completo. Se deduce que la
aromatasa está presente. O sea, el tejido ovárico está presente la enzima, si no estuviera presente, entonces tendría
que buscar otro tejido que si expresara la aromatasa.
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 o 2da calle: la fracción citosólica, no hay señal. Significa que no está la aromatasa no es una enzima soluble del citosol.
o 3er calle: la fracción microsomal, una gran señal, pero es de mayor intensidad que el homogenato. Se debe a que
está más concentrado en la fracción microsomal. Al tomar la misma cantidad de muestra. La aromatasa se encuentra
en el REL.

También podemos saber su PM, alrededor de 50 kDa. Puede haber distintas aromatasas de distintos pesos moleculares.

Ejemplo 2: biopsias de 4 tumores de mama de diferentes pacientes.

Se quiere determinar si está presente una proteína de membrana la E-cadherina, es una proteína que permite la unión
célula-célula y la “E”, es porque se expresan específicamente en tejido epitelial.

¿Por qué es importante en biopsias de tumores, la presencia de marcadores de E-cadherinas? Porque es un indicio de la
agresividad del tumor. Y tienen la capacidad de hacer metástasis cuando pierden la expresión de E-cadherinas, ya que les
permite perder la adhesión, las células tumorales de las células circundantes y poder infiltrarse en los vasos sanguíneos. La
pérdida de la expresión de la E-cadherina, es un mal pronóstico, o de un mayor pronóstico de realizar metástasis.

Para cuantificar la cantidad de expresión de esa proteína, se usa esta técnica de Western Blot. Se realiza entonces un
fraccionamiento subcelular, obteniendo un homogenato y corriendo esos homogenatos.

Resultados:

o Calle A:
o Calle B:
o Calle C:
o Calle D: hay ausencia de la expresión de la proteína. Tiene mayor proporción de realizar metástasis.

Comparando la intensidad de las diferentes calles y teniendo en cuenta que, a cuanta mayor intensidad, menos probabilidad
de realizar metástasis, eso implicará que la ausencia de la expresión tendrá más probabilidades de realizar metástasis.

Entonces, en la calle D que hay ausencia seria el peor caso, le sigue el C, con una clara disminución de la intensidad de la
marca.

La intensidad de la marca supone que se extrajo de una misma “cantidad” de tumor, y lo que da una mayor intensidad de
marca no es en realidad que el tumor era más grande. Sino que se parte en los 4 casos con un tumor del mismo tamaño

Se puede realizar 2 tipos de controles para saber si se parte de la misma cantidad de muestra: uno es haciendo una
cuantificación de una proteína, por un medio analítico y realizar luego el western blot. Otro es realizar un western blot de una
proteína estructura, por ejemplo, de la proteína actina, y luego realizar el western blot de la proteína de interés.

Una limitación de las técnicas vistas se debe a que no tengamos buenos anticuerpos que reconozco la proteínas de interés,
no siempre tenemos un anticuerpo que sea especifico y sensible para la proteína que estamos estudiando. Un anticuerpo
puede reconocer un epítope de la proteína de interés, pero puede ser común a otras proteínas, por lo que no será tan
especifico. Pero también puede ser que un anticuerpo que sea especifico a una proteína, pero al ser revelado de no de una
marca, por lo que no será sensible a la proteína de interés.

RT-qPCR: PCR cuantitativa con retrotranscripción.

31
Es la única técnica que permite cuantificar moléculas de ARN. Se puede cuantificar transcriptos virales por medio esta
técnica, como carga viral del HIV, o cuantificar la cantidad de una proteína que se exprese más o menos en comparación con
una célula hepática o una célula nerviosa.

Con la técnica de PCR permitía amplificar múltiples copias de ADN. Se usa una ADN pol Taq (termoestable, solo puede
polimerizar ADN)

Pero esta técnica mide la cantidad de ARN, entonces debemos realizar un paso previo.

⮚ Etapa 1: retrotranscripción.
Se realiza este paso, ya que la ADN pol no puede polimerizar ARN.
Se extrae todo el ARN total, se incuba una enzima retrotranscriptasas, que usan ARN como molde para generar ADN.
Son retrotranscriptasas a partir de virus.
El ADN que se obtiene es C-ADN; ADN complementario porque puede ser complementario al ARN original. Es una
copia de ADN doble cadena de un transcripto, como por ejemplo de un ARNm. Difieren en que en el sitio que había
un Uracilo, habrá ahora una Timina.

⮚ Etapa 2: PCR cuantitativa

Solo amplifica el ADN complementario, que refleja al transcripto de interés que yo quería analizar.
De manera análoga al PCR, donde a pesar de tener todo el ADN solo amplificaba una secuencia específica, aquí
analizaremos los transcriptos primarios que sean de nuestro interés, seleccionando cuales son los primers que van a
utilizarse en esta técnica. De acuerdo con el diseño de los primers, si logro diseñar los primers de modo tal que
tengan complementariedad de secuencias del transcripto que estoy buscando, solo amplificare de todos los
transcripto, solo aquellos que sean del transcripto de interés. El diseño de los primers es lo que le da la especificidad
a la técnica.
Entonces se realiza una amplificación de estos ADN complementarios o transcriptos. Entonces las ADN polimerasas
los pueden usar como molde.
Esta reacción que ocurre en un tubo dentro de un termociclador, con las diferentes variaciones de temperaturas que
permite amplificar al transcrito de interés.
Se le agrega un colorante, suele ser Silver Green, que constituye moléculas que al unirse a ADN doble cadena va a
emitir fluorescencia. Se usa para ver el proceso de amplificación. A diferencia de la PCR que se cuantifica en el último
estadio, esta técnica permite ir cuantificar la amplificación en simultaneo que se va ocurriendo.
Se realiza con un termociclador, asociado con un detector de fluorescencia en cada tubo. Y generar diferentes tipos
de lectura, que nos muestre la fluorescencia en cada uno de los tubos.

Descripción de una imagen: eje de axisas. Donde X es nro de ciclos, es decir, en función del tiempo, y donde Y es fluorescencia
de cada tubos.

o Tubo 1: línea horizontal, no hay producto de amplificación

o Tubo 2: a partir de cierto momento hay un aumento de la fluorescencia, hay producto de amplificación.

Si yo parto de una cantidad mayor de producto, esperare que la ampliación se produzca en ciclos más tempranos. Del mismo
modo, si parto de una menor cantidad, la amplificación se dar en ciclo más tardíos.

Por eso esta técnica se utiliza para la detección de cargas virales, como es el caso de HIV, donde podremos ver que, si el
tratamiento está funcionando, teniendo en cuenta este tipo de cuantificaciones, si hay una disminución o aumento de la
carga viral del paciente.
32
Tecnica contituacion de seminario 5: Habiamos analizado en el seminario anterior que mediante la tecnología del ADN
recombinante era posible en un laboratorio diseñar una determinada secuencia de ADN, donde se puede yuxtaponer
distintos elementos y unirlos entre sí colocándolos en una única secuencia de ADN doble cadena, generando:

Construcciones que contengan a un promotor que sea reconocido por la ARN polimerasa II (transcripción) y luego una
secuencia codificante de un gen de interés, el objetivo será el poder introducir esa secuencia de ADN en el interior de las
células, estas podrán usarla para transcribirla y luego traducirla, generando así un aumento, una sobre expresión de ese gen
de interés.

A su vez estas mismas construcciones pueden diseñarse de modo tal que luego del promotor uno permita la transcripción de
un ARN de interferencia, estos son ARN que luego de ser procesados utilizan la maquinaria endógena de silenciamiento que
utilizan los micro ARN Y permiten entonces silenciar a transcriptos específicos, es decir, se pueden generar herramientas de
pérdida de función como los ARN interferencia, que van a inducir una disminución de la expresión del transcripto, que van a
silenciar y estrategias de ganancia de función, en donde sobre expresamos un gen de interés.

Se analizó también que un desafío era el modo en que se introducen estas secuencias de ADN en el interior las células, ya
que las células espontáneamente no incorporan moléculas de ADN exógenas, para ello existen diferentes mecanismos
técnicos para inducir esta incorporación. Para ello se utilizan vectores de expresión, Un vector de expresión, es aquella
molécula o macromolécula que portará el ADN diseñado por la tecnología de ADN recombinante y que permite su
incorporación por parte de las células. Uno de estos vectores de expresion son los plasmidos (pequeñas moléculas de ADN
circulante, donde se insertan dentro de las secuencias del plasmido las secuencias diseñadas en el laboratorio que pueden
estar destinadas a sobre expresar un gen o a disminuir la expresión de un gen de interés.

Para que las células incorporen estos plasmidos se utilizan diferentes técnicas:

- Una es combinar los plasmidos con una solución de lípidos cationicos que forman micelas, pequeñas vesículas de
estos lípidos cationicos con el plasmido en su interior que se fusionan con la membrana plasmática y que permiten la
incorporación intracelular de ese plasmido.

- Una segunda metodología es someter a las células, por ejemplo, en condiciones de cultivo a un breve pulso eléctrico
que induzcan polos transitorios a su membrana que permita que de manera trancidente, permeabilidad transidente
inducida por el choque eléctrico permita la introducción de los plasmidos.

Sin embargo los plasmidos no son los unicos vectores de expresión. unos muy utilizados son los virus modificados una
interesante estrategia desarrollada por la biologia molescular ya que utiliza una propiedad intrinseca de los virus, los virus
tienen la capacidad de infectar celulas, de unirse con ellas y de inyectar, introducir su propio material genetico, esa capacidad
endogena de los virus es utilizada por esta estrategia que consiste en modificar el genoma viral (pensemos al genoma viral
cmo un segmento por ejemplo de ADN doble cadena que contiene los genes que permiten al virus replicarse en el interior de
las celulas que le confieren infectividad) esta tecnica entonces consiste en reemplazar esas secuencias del genoma viral que
permite la infectividad del virus y remplazarlas por las secuencias que nosotros queremos expresar en las celulas, el virus
entonces infectara a las celulas introduciendo esa molecula de ADN modificada, permitiendo entonces que aquellas
secuencias de ADN diseñadas por el investigador sean expresadas por esas celulas. Un aspecto muy interesante es que no
solo podemos sobre expresar o silenciar proteinas que son el doble de esta celula sino que esta tecnica en principio permite
incluso expresar proteinas, que esa celula jamas expreso o que estan ausentes incluso del genoma de la propia celula, puede
expresar por ejemplo proteinas que provienen de una especie distinta, como el codigo genetico es universal esos transcriptos
33
podran ser efectivamente traducidos por celulas eucariotas por mas que ese gen no sea endogeno y un ejemplo muy
importante en terminos de investigacion es el uso de proteinas fluorecentes.

En los año 70 se descubrio que una medusa produce endogenamente una proteina que al ser iluminada con una determinada
longitud de onda 395 nanometros emite fluoresencia verde a esa proteina se la denomina: Proteina GFP, se puede diseñar
mediante la tecnologia del ADN recombinante un segmento de ADN que contenga un promotor, reconocido por la ARN
polimerasa II y la secuencia de GFP y puede introducirla, por ejemplo, si lo hacemos en un plasmido, podemos introducirla
por electroporacion en un grupo de celulas y las celulas sintetizaran GFP, si uno aplica esta metodologia puede tener por
ejemplo, lineas celulares transfectadas por un plasmido que codifica GFP y podemos visualizar a las celulas fluorescentes bajo
el microscopio de fluoresencia sin necesidad de ser por ejemplo una inmunofluesencia contra una proteina especifica, dado
que esta GFP que hemos sobre expresado inunda todo el citoplasma de las celulas en las que transfectamos.

*Aquí en la imagen de la derecha vemos una neurona proveniente de un cultivo primario de neuronas de raton, los cultivos
primarios a diferencia de las lineas celulares son celulas que se extraen directamente de los animales de experimentacion y
se onen en cultivo, las neuronas por ejemplo como ustedes saben no se dividen y para estudiar neuronas en condiciones de
cultivo tienen que extraeerse directamente sus precursores de animales de experimentación y ponerse en condiciones de
cultivo pero no replicaran y no podemos entonces mantenerlas en cultivo de manera indefinida, noten que transfectar una
neurona con GFP nos permite por ejemplo analizar la compleja morfologia neuronal sin necesidad de realizar ninguna otra
tinción, por ejemplo, uno podria estudiar el efecto de distintos farmacos sobre las dendritas este es un parametro que nos
podria hablar por ejemplo de un impacto negativo de esa droga sobre el desarrollo neuronal y esto lo podemos hacer, captar
la compleja morfologia neuronal simplemente transfectando GFP en las celulas, otra aplicación muy interesante de estas
proteinas es que podemos generar proteinas de fusion entre GFP y una proteina que endogenamente sea sintetizada por las
celulas. Entendemos por proteina de fusion simplemente a generar una secuencia codificante que contenga el gen de GFP
directamente unida a la secuencia de una proteina de interes. Cuando esta nueva secuencia se traduce se generara un petido
que va a estar copuesto pr GFP unido a nuestra proteina de ineres, esta capacidad que tenemos a traves de esta tecnologia
de ADN recombinante de sintetizar dos proteinas unidas entre si es lo que conocemos como PRODUCCION DE PROTEINAS DE
FUSION y una de las mas interesantes es cuando fusionamos nuestra proteina de interes a una proteina fluorescente como
GFP esta fusion es interesante porque dijimos que GFP es una proteina citosolica que inunda todo el citoplasma pero cuando
nosotros generamos una fusion entre GFP y una proteina de interes suele dominar en la localizacion intracelular la
localizacion que tiene nuestra proteina de interes y la

Fluorescencia en el interior de la celula adquirira el patron que le da la proteina endogena que utilizamos para fusionar GFP.
Aquí estamos viendo un ejemplo donde fusionamos a la molecula de tubulina alfa uno de los componentes de los
microtubulos del citoesqueleto con la proteina GFP si nosotros transfectamos este constructo por ejemplo este plasmido o si
nos metemos en un virus en una celula, cuando veamos una celula florescente la fluorescencia va a indicar la lcalizacion
intrcelular de la tubulina, vamos a ver un sector de mucha fluorescencia donde los filamentos parecen extenderse desde el
centro hacia la periferoia tambien notamos un sector circular donde la fluorescencia parece menor y esa ausencia de
fluorescencia relativa correspondera al nucleo de la celula. Esto nos demuestra entonces como generar una proteina de
fusion permite responder de otra manera, con otra tecnca a la pregunta sobre la localizacion de una proteina. En el
seminario anterior nosotros podiamos responder esta pregunta por ejemplo haciendo una inmunofluorescencia o una
inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo que reconozca esa proteina de interes. Esra metodologia es una metodologia
alternativa y muy importante para aquellos casos en donde no disponemos de buenos anticuerpos para realizar la tecnica
porque recordemos que era una limitacion de las tecnicas basadas en anticuerpos disponer de un anticuerpo que sea a la vez
sensible y especifico. Si nosotros estamos investigando una proteina de interes y no tenemos disponible un anticuerpo
especifico podriamos fusionar nuestra proteina de interes a una proteina fluorescente, trasfectar eso en celulas y obsservar
su localizacion. Si bien desde el punto de vista teorico uno podria pensar si esta fusion con GFP alterara la localizacion
endogena de una proteina y esto se ha comprobado en muchas proteinas y en la mayoria la localizacion no cambia. Si uno
compara la inmunofluorescencia contra esa proteina de interes versus una celula transfectada con esa proteina de fusion con
GFP suele tener patrones comparadores pero hay excepciones por ende es una tecnica que tiene la posibilidad de que la

34
localizacion cambie cuando este fusionado a GFP pero un altisimo numero de ejemplos respalda el uso de estas proteinas de
fusion como una estrategia muy util y adecuada en muchos casos. mediante estudios de mutagenesis donde se tomo la
proteina GFP endogena y se realizaron mutaciones puntuales een su estructura se han generado en los ultimos 20 anos
distintas proteinas fluorescenetes que estan disponibles ademas del uso de GFP: tenemos proteinas fluorescentes azules,
rojas, en genral las mas utilizadas son la proteina fluorescente verde GFP y la proteina fluorescente roja. Un uso mmuy
interesante continuando con esta idea de permitir localizar proteinas generando proteinas de fusion con proteinas
fluorescentes es que esta tecnica puede dar un salto cualitativo respecto de la informacion que nos da cuando hacemos esta
inmuno porque cuando realizamos una inmunohistoquimica o una inmunofluorescencia en un corte o en celulas ese corte y
esas celulas ya estan fijadas, el tejido no posee celulas vivas. Sin embargo un o podría identificar la localización de una
proteína apreciando su dinámica temporal en células vivas porque podemos observar células vivas que estén expresando
proteínas de fusión con proteínas fluorescentes.

SEMINARIO 6: La traduccion de los transcriptos siempre comienza en el citosol, habiamos estudiado como los transcriptos
maduros eran exportados al citosol y alli podian ser reconocidos por la subunidad pequeña del ribosoma y cuando esta
encontrara el codon de inicio de la traduccion podia acoplarse a la subunidad grande. Este proceso que marca el inicio de la
traduccion siempre ocurre en el citosol sin embargo n todas las proteinas tienen una localizacion citosolica, hay algunas
proteinas que siempre las encontramos por ejemplo en la membrana plasmatica, otras proteinas que son exclusivas de las
mitocondrias, hay otras proteinas que son solo nucleares, hay otras proteinas que estan en el aparato de golgi, otras que
estan en los lisosomas. ¿Cómo “saben” las moleculas cual es su localizacion intracelular y como alcanzan esa localizacion
intracelular sobre todo cuales son los mecanismos moleculares que permiten esta serie de procesos? Porque entender estos
mecanismos ademas de entender esta situacion fisiologica nos permitira comprender algunas situaciones patologicas que se
producen por la alteraciom, disfuncion de estos mecanismos de localización proteica. Para responder a esta prehunta
tenemos que aludir a que este problema que vamos a analizar es exclusivamente eucariota porque esta
compartimentalizacion profusa intercelular, la existencia de compartimientos nos referimos a reticulo endoplasmico, al
aparato de golgi, al compartimiento nuclear, a los lisosomas, es exclusivo de las celulas eucariotas. Interpretaciones evolutivas
respecto del surgimiento de las celulas eucariotas especulan que el desarrollo de las celulas eucariotas tal cual las conocemos
hoy en dia surgio a partir de un precursor que carecia tanto de mitocondrias como de los compartimientos intercelulares
membranosos y que la adquisicion de estos compartimientos celulares intramembranosos proviene a partir de
invaginaciones de la membrana plasmatica, profundas invaginaciones en el interior celular tubulos membranosos que
provenian de la membrana celular y que luego adquirieron independencia, se soltaron de la membrana generando un
compartimiento membranoso interno qu ha encerrado en el interior de estas organelas membranosas por ejemplo el
reticulo, la membrana nuclear etc un pedacito del exterior celular ahora residente en el interior de las celulas. Esto implica
que cuando pensamos en los compartimientos intracelulares podemos estabecer una correspondencia topologica, es decir,
podriamos pensar que el citosol es el verdadero interior de la celula sin embargo el espcio que ha quedado incorporado en el
interior de estas organelas membranosas no corresponde topologicamente, no es equivalente al citosol sino que es
equivalente al exterior celular. Cuando uno mide por ejemplo el pH y la composicion de iones del lumen de muchas de estas
organelas membranosas es muy diferente a la concentracion de iones del citosol y esto corresponde con esta
compartimentalizacion diferente. ¿Cómo se localizan las proteínas nucleares, sintetizadas en el citosol que luego serán
residentes del nucleo?

Antes de responder la pregunta debemos notar que el interior del núcleo corresponde topológicamente al citosol, están
conectados a través de los poros nucleares, si bien sabemos que es un compartimento no totalmente accesible a las grandes
macromoléculas y grandes proteínas del citosol, en términos de descomposición iónica hay libre difusión a través de los poros
nucleares y del citosol, si se piensa evolutivamente, el interior del núcleo es un pedazo del citosol que ha quedado
parcialmente restringido por un estructura membranosa a su alrededor, es importante entender esta compuerta que limita el
contacto del interior del núcleo con el citosol (la membrana nuclear), es una estructura doble: constituida por una
membrana nuclear interna y una membrana nuclear externa y algo importante de resaltar, es que no forma una estructura
distinta de retículo endoplásmico, esta membrana nuclear externa se continúa con los túbulos y sacos del retículo, se puede
pensar entonces, que estas dos membranas que rodean al núcleo, son una especialización de un sector del retículo
35
endoplásmico, la cual no es continua, está interrumpida por perforaciones de la membrana nuclear externa e interna,
permitiendo así la comunicación con el citosol.

El primer tipo de transporte que va a ocurrir y que permite el pasaje de moléculas desde el núcleo al citosol, un pasaje
bidireccional (así como las ciertas proteínas que recién se sintetizan pueden tener una localizacion nuclear, a veces hay
proteinas que luego de su sintesis son exportadas bajo ciertas señales específicas al exterior celular) este es un transporte
que debemos entender que representa el primer ejemplo de mecanismos de transporte mediado por compuertas

TRANSPORTE MEDIADO POR COMPUERTAS:

Las compuertas son: un complejo de muchas proteínas, denominado COMPLEJOS DEL PORO NUCLEAR, donde participan más
de 30 tipos de proteínas que actúan como compuertas selectivas respecto el pasaje de moléculas que superen un
determinado tamaño, las grandes macromoléculas que tipicamente tienen un pasaje restringido que son reguladas por estas
compuertas son las proteínas, las proteínas de aproximadamente 50 kilodaltons de masa molecular pueden difundir
libremente entre el interior del núcleo y el citosol.

Estos complejos (complejos del poro nuclear), permiten un pasaje aproximadamente libre de proteínas de hasta 50
Kilodaltons, hay proteínas mucho más grandes que también pueden ingresar al núcleo mediante un proceso activo de
localización, no lo hacen espontáneamente por difusion, sino que serán incorporadas selectivamente a través de los poros
nucleares.

Un experimento que se realizo en 1971 genero una teoria solida ya para los años 80 permitió descubrir que una de las claves
del sistema de transporte se encuentran en señales que están contenidas en las mismas proteínas, las proteínas contienen
secuencias de aminoácidos, que actúan como señales de localización que son interpretadas por la maquinaria proteica
celular, para permitir la localización de una proteína específica en un compartimiento específico, estas secuencias señales
contenidas en las proteinas se conocen como señales topogenicas porque generan la ubicación topológica especifica de una
determinada proteína, por ejemplo proteínas cuyo destino es ser importadas al interior del núcleo tienen una secuencia
consenso de aa ricas en lisinas y argininas (aminoácidos básicos) que al pH celular portan una carga eléctrica positiva neta,
ese tracto de aa básicos es característico de una señal de importación nuclear, las proteínas que poseen esa secuencia son
activamente incorporadas al interior del núcleo, independientemente de su tamaño de modo equivalente se puede
decodificar cual es la secuencia particular de aa que permite la exportación del núcleo o la localización la incorporación de las
proteínas al interior del retículo o incorporación de proteínas a las mitocondrias, es decir, se puede decodificar el sistema de
secuencia señales, que son endógenas a las proteínas.

Esto responde en parte a la pregunta de la localización de las células, porque si la información para localizar una proteína
determinada está dada por una secuencia de aa de la propia proteína, también se puede decir que es el genoma quien está
controlando la localización de esas proteínas, porque esa secuencia también forma parte, es traducida a partir de una
secuencia originalmente ubicada en un gen de esa proteina, de ese modo con este intermediario de generar secuencias
señales en las proteínas que se traducen a partir de un gen, el genoma controla la distribución y localización de las proteínas,
no siempre esta secuencia de aa es una secuencia única sino que pueden haber muchas secuencias dentro de una proteína
separadas entre sí cuando pensamos en la proteína desplegada como un péptido, pero que suelen acercarse entre sí
espacialmente cuando la proteína adopta su estructura 3 D final, y en esos casos decimos que la señal es un parche señal,
está constituido por la superficie tridimensional de un sector de la proteína que al desplegarla esos fragmento de la secuencia
estarían alejados entre sí.

¿Cuáles son las señales?

36
Señal de localización nuclear (importación = NLS) y la señal que permite la exportación específica nuclear de las proteínas
NES

¿Cuáles fueron las corroboraciones experimentales que permitieron determinar que realmente son estas secuencias las que
son necesarias y suficientes para permitir la incorporación de una proteína que comienza su síntesis en el citosol y que es
demasiado grande para atravesar el núcleo por difusión simple, pero que terminan siendo incorporadas efectivamente al
compartimiento nuclear? Uno de los sistemas experimentales clásicos para poner este sistema a prueba, utiliza la técnica
(proteínas de fusión) proteínas que tienen localización nuclear fusionadas con una proteína fluorescente, (imagen: se ve una
proteína denominada antígeno T la cual ha sido fusionada con una proteína fluorescente verde (que se ve blanco “color
blanco corresponde al color verde” y negro) las estructuras redondeadas son el núcleo de esa célula (GFP). Observando la
secuencia de aa que se considera la secuencia señal, lo que busca el experimento es demostrar si esa secuencia señal es la
responsable de la localización, lo que se hizo, fue generar otra secuencia que posee una mutación, alterando la secuencia
señal y se tansfecto esa secuencia que poseía una mutación y que afecta la potencial secuencia señal se la transfecto en las
células, que se observa? ¿Cúal es la localización ahora de GFP fusionada con la proteína que tiene mutada la secuencia señal,
tiene una secuencia citoplasmática excluida del compartimiento nuclear, en donde se observa el núcleo con ausencia de
fluorescencia, demostrando entonces que la secuencia señal es necesaria, dado entonces que al mutarla alterándola no es
posible generar la localización ¿es suficiente solo la secuencia señal para para incorporar una proteína al núcleo? y si tengo
una proteína que no es producida por las células, ejemplo GFP se le agrega una señal de localización nuclear sin una proteína
endógena ¿será suficiente esa secuencia señal, para localizarla en el interior del núcleo?

Ver experimento:

Localización de GFP y cuatro células y se observa que GFP ocupa todo el compartimento citosólico y el interior nuclear,
mostrando una localización muy amplia cuando se expresan en células eucariotas.

Cuando se agrega a GFP una señal de localización nuclear ¿que se observa? cambia la distribución de la fluorescencia, parece
estar localizada en el compartimiento nuclear y si se le agrega a GFP una señal de exportación nuclear, ¿qué pasa con la
fluorescencia de GFP? esta forzosamente excluida del núcleo. Comparen GFP sin señal de exportación e importación la
encontramos tanto en el núcleo como en el citosol, pero al agregar una secuencia de localización nuclear, fuerza (veremos
cuáles son los mecanismos), pero es suficiente como para que las proteínas endógenas localicen GFP en el compartimiento
nuclear y agregar una señal de exportación es suficiente para que los sistemas endógenos la excluyan activamente del núcleo
cuando su propia estructura es lo suficientemente pequeña como para poder difundir e ingresar por sí misma al
compartimiento nuclear.

Por qué GFP sin el agregado de ninguna señal puede ingresar al núcleo sino tiene ninguna señal de localización nuclear?
porque es lo suficientemente pequeña para difundir en el núcleo (GFP, pesa 37 kilodaltons).

Entonces esa serie de experimentos repetidos con muchisimas proteinas han permitido generar un consenso que estas
secuencias de localización son a la vez necesarias y suficientes como para producir la localización pero no quita que haya
proteínas endógenas que interactúen con esa señal para permitir la localización final. De hecho analizaremos más en detalle
como es el proceso de importación y exportación nuclear de esas proteínas que tiene la señal de localización.

Esta señal es reconocida por una serie de receptores en el interior de la célula, proteínas que pueden reconocer la secuencia
señal, las proteínas que reconocen la secuencia de importación al núcleo se denominan IMPORTINAS, y las proteínas que
reconocen las secuencias de exportación del nuclear se denominan EXPORTINAS. Estos receptores van a ser localizados
activamente o bien en el interior del núcleo permitiendo la liberación de la proteína de interés o a la inversa, para poder
explicar el fenómeno de localización específica se debe tener una distribución asimétrica de una proteína, que una proteína
GTPasa y que explicará de manera mediada, cual es la inversión energética de las células para generar este mecanismo de
ordenamiento, que al pensarlo en términos energéticos, ordenar, producir un aumento del ordenamiento intracelular,
localizar una proteína, es un procedimiento desde el punto de vista termodinámico, un proceso que consume energía,
37
porque lo espontáneo es la entropía, es la difusión de las proteínas, los fenómenos entonces de localización como aumentan
el orden intracelular, son procesos no espontáneos que consumen energía, y la energía invertida en este proceso que permite
la direccionalidad del transporte va estar dada por la creación de un gradiente diferencial entre el interior del núcleo y el
exterior, y ese gradiente esa localización diferencial va a estar por una familia de proteínas GTPasas de la familia Ran.

Es frecuente el hecho de que haya proteínas que pueden unirse por ejemplo al GTP y que bajo ciertas condiciones pueden
hidrolizar ese GTP generando GDP, este proceso donde una proteína unida a GTP rompe el grupo fosfato para generar GDP, es
un proceso que ha liberado energía en ese punto.

La célula invierte energía en regenerar esta molécula de Ran GDP a Ran GTP, la regeneración va a estar dada porque hay una
proteína que permite el intercambio del nucleótido que ya se ha hidrolizado GDP por una nueva molécula GTP.

¿Cómo se produce entonces esta distribución asimétrica? ¿Por qué el citosol es rico en la variante GDP de la proteína Ran y
por qué el núcleo es rico en la otra variante, en la que está unido a GTP?

Se explica por la localización diferencial de los factores que interactúan con esta serie, una proteína citosólica, es la proteína
activadora de la GTPasa Ran, esta proteína induce sí Ran GTP sale del citosol, esta proteína interactua con Ran GTP e induce
la hidrólisis del nucleótido generando Ran GDP, entonces la abundancia de esta proteína activadora de la GTPasa en el citosol
provoca que todas las GTP que alcancen compartimientos citosólicos sea rápidamente transformado inducido a ser
transformado a Ran GDP, de manera complementaria en el interior del núcleo exclusivamente recibe la proteína
intercambiadora de Ran aquella que permite sustituir el GDP ya utilizado por un nuevo GTP, y esta localización nuclear
específica, hace que solo el núcleo este enriquecido de la variante GTP de Ran.

¿Cómo se relaciona este gradiente con el mecanismo de transporte, con los fenómenos de importación y exportación
nuclear?

Veamos como la distribución asimétrica de las GTPasas también tiene la direccionalidad de transporte, se observa como una
proteína que posee una señal de localización nuclear puede ser reconocida eventualmente por el receptor, que es una
importina, las importinas tienen afinidad por las proteínas que conforman el complejo del poro nuclear, de manera genérica
se les denomina “NUCLEOPORINAS”, tiene afinidad y estas pueden formar uniones débiles con las nucleoporinas, estas
uniones son debiles: se forman, se rompen, se forman, se rompen, etc. permitiendo una interacción del movimiento aleatorio
de las importinas con las nucleoporinas que pueden introducirse y salir del complejo del poro nuclear y esta afinidad por las
proteínas del complejo del poro es independiente del hecho de que estén unidas a la proteína que posea la señal de
localización nuclear o no, pero al imaginar que una importina unida a la proteína al ser transportada interactuando con las
nucleoporinas pueda ingresar al compartimiento nuclear, allí al estar presente Ran GTP puede unirse de manera directa a la
importina y desplazar, inducir un cambio conformacional que permite la liberación de la proteína importada en el interior del
núcleo, este es el fenómeno de convergencia, esta competencia no ocurría en el compartimento citosólico, porque en citosol
no hay Ran GTP que pueda competir por ese lugar, esto entonces induce la liberación de la proteína en el interior celular.
Luego la importina con Ran GTP eventualmente encontrará mediante difusión se chocara con las nucleoporinas del complejo
del poro nuclear, y eventualmente con estas uniones débiles que se forman y se deforman podrá salir al compartimento
citosólico, unida a este Ran GTP, pero en el compartimento citosólico estaba la proteína activadora de GTPasa que provocará
la hidrólisis de GTP generando Ran GDP que pierde su afinidad por la importina regenerando entonces una importina libre en
el citosol haciendo que pueda repetir este ciclo nuevamente. Es entonces esta distribución asimétrica en donde Ran GTP esta
únicamente en el núcleo y Ran GDP exclusivamente en el citosol, lo que permite esta direccionalidad de transporte, la
exportación funciona con el mismo mecanismo de manera inversa, en donde las exportinas solo pueden unir a las proteínas
que poseen la señal de exportación nuclear cuando están unidas a Ran GTP y cuando salen por estas interacciones débiles
por las nucleoporinas al espacio citoplasmático hacia el citosol el activador de las GTPasas induce la hidrólisis GTP, en ese
momento la exportina al perder su unión a Ran GTP pierde su unión a la proteína que estaban transportando y la libera
quedando libre para un nuevo proceso.

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Entonces recordando, si bien las señales de importación y exportación son necesarias y suficientes, interactúan componentes
intercelulares ejemplo sus receptores las importinas y exportinas, los complejos del poro nuclear y la distribución asimétrica
de Ran GTP y Ran GDP que es la distribución que condensa esta interacción energética que realiza la célula para generar el
transporte, porque la regeneración de Ran GTP en el interior del núcleo implica consumir nucleótidos de GTP.

Se analizará otro compartimento intracelular que utiliza un mecanismo de transporte diferente para localizar a sus proteinas:

Retículo Endoplásmico: una organela que como todos los compartimentos intracelulares pudo ser descrito por primera vez
de manera consistente a partir de los año 40 (microscopio electrónico)

Y fue el microscopio electrónico quien revelo por primera vez la estructura de estos compartimentos celulares y fue a partir
de entonces, del surgimiento de la ME, que se abrió este campo de conocimiento, recuerden lo que dijimos la clase pasada,
esa si es una técnica la que abre el campo del conocimiento, este es el caso de la microscopia electrónica y las organelas
intercelulares.

Retículo endoplásmico (RE): Consiste en una serie de sacos membranosos y de túbulos membranosos que encierran en su
interior, lo que denominamos el lumen, la luz del RE compartimiento que como dijimos es topológicamente equivalente al
exterior celular y que las proteínas que están contenidas en el interior del RE deberán atravesar esa membrana que rodea al
RE, ingresar en la luz, en el lumen. A diferencia de lo que ocurría con el núcleo, no hay complejos de poros que permitan
pasaje a través de compuertas, veremos en breve que las proteínas deben atravesar directamente la membrana del retículo,
por eso analizar este transporte va a implicar analizar una segunda modalidad de transporte que se denomina: Transporte
trans membrana.

Encontrar cual es la señal que permite el transporte trans membrana fue la primera señal con la que Blobel pudo demostrar
experimentalmente su hipótesis de la señal luego en un trabajo de 20 años, pudo generalizar esta hipótesis de la señal a la
localización hacia otros compartimientos intracelulares pero la historia experimental comienza con el análisis de la
localización de proteínas al interior del RE.

¿Qué funciones cumple esta organela?

Como veremos, dado que se acopla al hilo conductor del seminario veremos:

1. Como se produce la síntesis y modificación posterior de proteínas en el retículo.

2. Que otra de las funciones en el interior es poseer un sistema de control de calidad respecto del plegamiento de las
proteínas intracelulares funcionando entonces como un sistema de detección de errores de plegamiento pero
lógicamente solo puede actuar este sistema de control de errores de plegamiento en proteínas que ingresan a la luz
del RE, cosa que no ocurre como veremos con todas las proteínas, pero si bien no profundizaremos en este seminario
tendrán oportunidad de profundizar esto en la cursada de histología.

El retículo cumple otras funciones, por ejemplo:

en sus membranas están las enzimas que permiten la biosíntesis de la mayoría de los lípidos, actúan como mencionamos en
esta cualidad de poseer un compartimiento equivalente topológicamente al exterior celular y suele ser un reservorio de
calcio intracelular, analizaremos en el seminario de señalización que mantener bajos niveles de calcio en el compartimento
citosólico es esencial porque el calcio va a cumplir el rol de una molécula señalizadora que va a inducir profundos cambios en
la actividad de muchas proteínas. Cuando aumenta su concentración en el citosol y la regulación de las concentraciones
intracelulares de calcio esta finamente regulada por las células y suele estar almacenada intracelularmente en la luz del RE.

También muchas enzimas membranosas del retículo participan de la detoxificación de muchas sustancias, sobre todo aquel
sector que conocemos como retículo endoplásmico liso (REL).

La distinción entre el retículo endoplásmico rugoso (RER) y (REL), es una distinción que simplemente alude al hecho de que
hay sectores de este sistema totalmente interconectados de túbulos y sacos, hay sectores que carecen de la adesión de

39
ribosomas en su superficie citosólica y a esos sectores los denominamos (REL) estos compartimientos suelen tener distintos
grados de especialización en los distintos tipos celulares, por ejemplo, los hepatocitos expresan su genoma, expresan ciertas
proteínas que participan del fenómeno de detoxificación y tienen asociadas una especialización de incrementar la superficie
de su (REL) en función de la alta expresión de las proteínas que participan de la detoxificación, otras células que fabrican
hormonas esteroideas que derivan del colesterol también suelen tener un alto contenido o una alta abundancia de (REL) y
veremos que dentro de los distintos tipos celulares que producen proteínas de exportación, que van a secretar proteínas son
muy ricas en (RER) por que como veremos en el seminario de hoy el camino de estas proteínas que van a tener como destino
final su secreción por parte de las células comienza con su incorporación a la luz del RE anticipamos entonces esa trayectoria.

*Aquí tenemos dos imágenes de microscopia electrónica mostrando cortes transversales en donde podemos ver los sacos
aplanados del RER y donde podemos ver esos gránulos en su superficie que corresponde a ribosomas ahora podemos
interpretar porque hay ribosomas cuando analicemos el mecanismo de transporte, sobre la superficie del RER, y aquí
podemos ver una célula de Leydig, una célula testicular especializada en la síntesis de testosterona (una hormona esteroidea)
que tiene ampliamente desarrollados los sacos de REL.

Como analizamos también la clase pasada desde el punto de vista experimental uno puede aislar al RE pero no aislarlo de
manera completa sino que en el proceso de fraccionamiento subcelular los fragmentos del REL y RER se rompen y se reciclan
formando pequeñas vesículas que denominamos microsomas que podemos aislar y obtener en fracciones puras a través de
fraccionamiento subcelular y analizarlas experimentalmente, por ejemplo, determinando que proteínas, que enzimas, que
actividades enzimáticas están presentes en esas fracciones y están ausentes en otras. Los experimentos en los que se realizó
el mecanismo de transporte transmembrana se hicieron utilizando preparaciones de microsomas porque son funcionales y
experimentalmente equivalen a pequeños retículos endoplasmicos en minitatura, estos microsomas algunos derivan del RER
y otros del REL y desarrollan posteriores afinamientos de fraccionamiento subcelular que utilizan centrifugaciones en
gradientes de sacarosa, permiten separar a las vesículas que provienen del RER y del REL y por ende esto permite desde el
punto de vista experimental, analizar que proteínas y que enzimas están presentes en el RER y cuales en el REL mediante
estos análisis podemos determinar, por ejemplo, que las proteínas encargadas de sintetizar las hormonas derivadas del
colesterol estaban enriquecidas en los microsomas lisos y no en los rugosos.

Entonces nos concentraremos después de esta breve descripción de los compartimientos en analizar este segundo tipo de
mecanismo de transporte.

TRANSPORTE TRANSMEMBRANA:

Que permite localizar proteínas que empiezan su síntesis en el citosol a la luz, al lumen en el RER una 1° diferencia entonces
de este transporte con respecto al transporte por compuertas del transporte de moléculas que se da del interior al exterior
del núcleo, que ya habíamos mencionado es que no ocurre a través de compuertas sino que el péptido tiene que atravesar
directamente la membrana y lo hará, veremos en breve de una manera cotraduccional, no será el péptido ya sintetizado el
que atraviese de manera completa la membrana que separa el exterior, el sector citosolico del interior del retículo, sino que
será una proteína que estará siendo traducida la que produzca este transporte y una 2° diferencia es que es unidireccional a
diferencia del núcleo donde se importa y exporta, aquí es fundamentalmente unidireccional del citosol hacia el interior del
RE.

¿Cómo se produce este transporte? Las proteínas que tienen localización, que han de ser importadas al RE poseen una
secuencia señal ya caracterizada, se encuentra típicamente muy cerca del extremo amino terminal de las proteínas y se
caracteriza por poseer un tracto de aminoácidos hidrofobicos, recuerden que hay algunos aminoácidos que tienen carga
positiva (básicos), hay aminoácidos que tienen cargas negativas (acidos) pero también hay aminoácidos que no tienen un
resto polar sino uno hidrofobico, estos son los aminoácidos hidrofobicos y el tracto constituido por ellos constituye la
identidad de la secuencia de señal que permite la importación al retículo.

¿Cómo es el mecanismo de manera simple? Habíamos anticipado que este transporte es postraduccional entonces tenemos
que pensar, en el transcripto de una proteína que tiene como destino ser importada en el interior del retículo que comience a

40
ser traducida por un ribosoma (en este esquema no representamos por razones de simplicidad el ARNm pero estará en su
conformación circular que permitía el reconocimiento de las subunidades ribosomales) y aquí vemos un péptido que
comienza a ser sintetizado por el ribosoma cerca del extremo amino terminal que es el primero en producirse va a aparecer
el péptido señal, la secuencia señal que es reconocida en este ribosoma que está en el citosol, es reconocida por una
ribonucleoproteina, que es la partícula que reconoce esa señal y que de hecho recibe el nombre de “partícula de
reconocimiento de la señal”, está constituida por algunos péptidos y un ARN no codificante, que puede reconocer y unirse, a
la partícula, a la secuencia de señal que está siendo producida por el péptido por el ribosoma mediante ARN no codificante
que forma parte de la partícula de reconocimiento de la señal se produce un reconocimiento de ARN no codificante que es la
partícula con la ARNribosomal y ese contacto induce un detenimiento de la traducción, la traducción no continua cuando la
partícula de reconocimiento de la señal se une a la secuencia de señal que esta protruyendo del ribosoma y esta traducción
queda detenida y ese complejo del ribosoma unido al mensajero y al péptido naciente al que esta acoplado ahora la partícula
de reconocimiento de la señal difunde en el interior de la célula hasta que choca eventualmente con la superficie del RER.
¿Qué hay sobre la superficie membranosa? Hay receptores que reconocen a su vez a la partícula de reconocimiento de la
señal hay receptores de SRP localizados en la membrana del retículo y cuando se produce esta unión entre receptores y la
partícula de reconocimiento de la señal, se acopla mediante interacciones una proteína que también está en la membrana del
retículo pero no es una proteína transmembrana, es un transportador proteico que va a permitir solo bajo esta configuración
que continúe la traducción del péptido pero que a medida que sea traducido sea incorporado a la luz del retículo a través de
esta proteína transmembrana que será transportadora, entonces a medida que esta siendo sintetizada la proteína esta siendo
“inyectada” al lumen del RE.

Eventualmente esto nos permite comprender un hecho esencial, que los ribosomas que están asociados, que vemos en las
ME asociados a las superficies de retículo, están ahí no porque pertenezcan siempre al retículo sino porque en el momento
en que fijamos la célula, eran ribosomas que estaban traduciendo la proteína que estaba siendo incorporada a la luz del
retículo, recuerden que los ribosomas se encuentran desensamblados en el citosol y solo se ensamblan sobre un mensajero
que va a ser traducido, si ese mensajero que va a ser traducido contiene una secuencia de señal que sea reconocida por la
partícula de reconocimiento de la señal y lo adose a la superficie del retículo quedara como ribosoma asociado al retículo
durante el tiempo que dure la traducción, cuando termina la traducción el ribosoma se desensambla nuevamente y vuelve al
citosol. En cambio un ribosoma que empieza a traducir un mensajero que tiene una senal citosolica será un ribosoma libre no
asociado a la membrana del retículo es decir en otras palabras, no es una diferencia esencial, intrínseca, no hay dos
poblaciones de ribosomas que sean diferentes, son el mismo conjunto de ribosomas que en algún momento los encontramos
adosados a la superficie del retículo porque están traduciendo una proteína que tiene una señal de importación al retículo y
en otro momento los encontraremos en el citosol traduciendo un mensajero que codifique para una proteína que no tenga
una localización del retículo.

Tambien podemos encontrar poliribosomas asociados a la membrana cuando ese mismo transcripto es traducido
simultáneamente por ribosomas que en fila estan incorporando ese péptido a la superficie de la membrana.

Luego de que la proteína es incorporada a traves de ese translocador proteico en algunos casos hay una enzima especifica
que produce un corte en un lugar específico de la proteína liberando al péptido traducido en el interior del RE, esto ocurre
para aquellas proteínas que van a ser solubles es decir que no van a estar asociadas a membrana en otros casos esta
peptidasa de las señales, esta enzima que cliva esta secuencia, la proteína no tiene esta secuencia la proteína quedara ligada
a la membrana entonces por este mecanismo tenemos:

- Proteinas asociadas a membrana, cuando la peptidasa de señal no corta a la proteína.

- Proteinas libres del RE.

Puede ocurrir que además de señales que permitan la incorporación de la proteína, haya señales secundarias en el interior
del péptido que funcionen como señales de detenimiento y que cuando esa secuencia que está atravesando la membrana
plasmatica se detenga la introducción de la proteína y que el resto de la traducción continúe en el compartimiento citosolico
de este modo, pueden obtenerse proteínas membranosas con una localización especifica que tiene un sector, un tracto de

41
aminoácidos particular que quedara atravesando la membrana y ** de estas secuencias de incorporación de la membrana del
retículo para pasar a través del translocador y otras secuencias que tienen este transporte, la superposición de las secuencias
en un mismo péptido originan cuando sean traducidas variaciones que permiten por ejemplo que una proteína tenga varios
pasos a través de la membrana del retículo.

las proteínas que conocemos como las proteínas transmembrana, todas las proteínas transmembrana de la célula se originan
como proteínas que inicialmente son introducidas en la membrana en el RE vemos que aun las proteínas transmembrana de
la membrana celular tienen ese origen y que luego serán localizadas en la membrana plasmática pero su incorporación a la
membrana ocurrió en las membranas del RER del mismo modo, las proteínas que quedan libres en el interior del retículo, por
ejemplo, pueden tener como destino ser proteínas de exportación que luego se liberen en la superficie celular como una
proteína secretada.

Su origen nuevamente, comienza a estar en el exterior celular en un compartimiento equivalente al exterior esa es la luz del
RE, las proteínas que alcanzan la luz del RE sufren algunas modificaciones, una de las primeras modificaciones que sufren es
la N-glicosilación, el agregado de oligosacáridos en la superficie de muchas de estas proteínas, esta primera modificación que
ocurre en el RE la denominamos N-glicosilacion ya que la unión de estos oligosacáridos ocurre en un aminoácido de
asparagina y la asparagina en el código de aminoácido de una letra se representa con la letra N, N-glicosilacion entonces
porque estos oligosacáridos son unidos a un aminoácido de asparagina, que posee una secuencia concenso particular, no
todas las asparaginas van a ser glicosiladas solo las que estén en un contexto aminoacidico particular que sea reconocido por
la enzima que induce la N-glicosilacion, esta N-glicosilacion cumple diversas funciones aunque no todas están aun
profundamente comprendidas, es un fenómeno muy frecuente la N-glicosilacion y solo tenemos atisbos de comprender la
funcionalidad de estas modificaciones estructurales hay dos hipótesis fuertes, ambas con parciales datos experimentales
sustentándolas:

1. Muchas de las proteínas N-glicosiladas van a ser exportadas de las células, secretadas o ser proteínas de membrana
cuya superficie glicosilada luego mire hacia el exterior celular y esa glicosilación suele proteger a la proteína de la
acción de proteasas extracelulares, generando un impedimento estérico, la}os oligosacáridos son moléculas rígidas
que van a poner una distancia entre la proteasa y el corazón proteico de la proteína entonces una de las funciones de
la N-glicosidación con el adicionamiento de los oligosacáridos es la de alejarlos, evitar el contacto directo con las
proteasas en aquellas proteínas que van a ser exportadas o bien van a tener una porción estructural mirando hacia la
cara extracelular.
2. Participa o permite la adición de la estructura tridimensional correcta en las proteínas es decir participa del correcto
plegamiento de las proteínas de hecho como habíamos mencionado al principio del seminario existe una gran
cantidad de proteínas en el interior del RE muchas de ellas chaperonas, que ayudan al ensamblaje correcto de las
proteínas, el ensamblaje se está produciendo ahí porque recuerden que la incorporación de las proteínas fue
cotraduccional, no tenían una estructura tridimensional en el citosol sino que ingresan al retículo y allí deben adoptar
su forma tridimensional final de hecho la enorme mayoría de proteínas que se pliegan en el RE se pliegan mal y el
mecanismo de control de calidad que está en el interior del RE a esas proteínas mal plegadas que luego de varias
ruedas de plegado y replegado ayudado por las chaperonas no logran plegarse correctamente son exportadas
nuevamente al citosol en donde son inmediatamente ubiquitinadas y degradadas. Se estiman en algunas células que
el 80% de las proteínas incorporadas al retículo son degradadas por mal plegamiento.

*Son unidireccionales por que la proteína entra por la membrana pero no vuelve a salir y si sale es para ser degradada
inmediatamente pero no hay proteínas que se hayan plegado en el RE y luego cumplan una funcion en el citosol.

DESTINOS POSIBLES PARA UNA PROTEINA QUE HA INGRESADO AL RE:

Algunas ya las hemos anticipado, por ejemplo, ser secretadas o formar parte de las proteínas de membrana entonces estas
rutas posibles de las que hablamos luego de que las proteínas son incorporadas a la membrana del retículo o a su nucleo son
tres grandes destinos posibles, que van a seguir una secuencia predeterminada como compartimientos intercelulares y la
descripción de esta ruta que permite explicar los destinos de estas proteínas que inicialmente se han incorporado al retículo
42
recibe el nombre de “ruta o vía secretora” entonces la vía secretora describe la secuencia de compartimientos que siguen las
proteínas que son incorporadas al retículo pero que como destino final se van a los compartimientos intercelulares, todas las
proteínas que no sean proteínas residentes del retículo van a pasar a otro compartimento membranoso, como el aparato de
Golgi, del cual las proteínas pueden ser secretadas al exterior celular o ser incorporadas a la membrana celular en el mismo
transporte y esta secreción puede ser:

- Por defecto, es decir ser el destino que la ausencia de otras señales el destino espontaneo de la secreción de todas
las proteínas que han sido incorporadas al retículo.
- De tipo regulado en donde se acumulen todas estas proteínas que provienen del retículo, que por bolsas se
acumulen en vesículas secretoras y ante señales extracelulares particulares se produzca la secreción.

Son dos variantes del fenómeno de exportación de proteínas al exterior celular, dijimos entonces dos destinos posibles, ser
secretado de manera constitutiva sin señales adicionales o ser secretado ante una señal específica, secreción regulada, el
otro destino posible es que luego del reticulo ciertas proteinas pueden tener como destino otra organela: los lisosomas y para
analizar como se transportan estas proteínas que ahora están en el interior del retículo para ir del interior de golgi al exterior
celular o al interior de los lisosomas tenemos que analizar el tercer y último tipo de transporte.

TRANSPORTE VESICULAR:

Un transporte que se va a caracterizar por estar mediado por vesículas, vesículas membranosas que se desprenden de un
compartimento membranoso y se fusionan con otro compartimento membranoso de destino, en este último transporte las
proteínas ya no necesitan atravesar por si mismas esa barrera membranosa sino que las vesículas al fusionarse unas con otras
van llevando una porción de la luz de un compartimento y la fusionan con la luz del compartimento siguiente.

¿Cuáles son las particularidades de este transporte vesicular? Estará mediado por vesículas, que van a brotar de las
membranas de los compartimentos, por ejemplo, de la membrana del RE y que van a fusionarse con otro compartimento
membranoso, por ejemplo, el aparato del Golgi.

*Esquema* Nos muestra la simetría entre estos dos compartimentos topológicamente distintos, noten que están dibujados
en este esquema con distintos colores, los dos sectores, cada uno de los componentes de la bicapa lipídica, la monocapa que
será la luminal y la otra monocapa que mirara hacia el citosol que sera la monocapa citosolica, cuando una vesícula se
fusiona con el compartimiento de destino la fusion va a respetar esta localizacion de modo tal que la monocapa luminal
quedara fusionada con la luminal y la citosolica con la citosolica del mismo modo el interior de la vesícula que contiene esta
porción topológicamente equivalente al exterior celular también se conectara con un compartimento topológicamente
equivalente, recordemos que este último podría representar el exterior de la célula.

Tres son los problemas desde el punto de vista molecular que tenemos que comprender en el transporte vesicular:

1. ¿Como se seleccionan aquellas proteínas que van a empaquetarse en las vesículas para ser transportadas? Porque no
todas las proteínas que están en el interior del compartimiento son transportadas por vesículas hay proteínas
residentes de ese compartimento que no suelen estar contenidas por las vesículas, no es una muestra aleatoria de
todos los componentes de ese compartimento entonces primer pregunta: como se selecionan las proteínas que van a
empaquetarse en las vesículas para ser transportadas porque no todas las proteínas que están en el interior del
compartimiento son transortadas en vesículas, hay proteínas residentes de ese compartimiento que no suelen estar
contenidas en las vesiulas de exportación.
2. Dada la abundancia de compartimentos membranosos dentro de la célula ¿Como determina esa vesícula de
transporte a que membrana debe fusionarse? como se determina el compartimento de destino, cuales son las
señales que permiten que una proteína salida del retículo y cuyo destino final es el aparto de Golgi, no se fusionen
con la membrana plasmática o con la mitocondria.
3. ¿Como se resuelve el punto de vista termodinámico, energético, la producción de vesículas? porque producir una
esfera membranosa a partir de una bicapa espontáneamente plana desde el punto de vista energético es muy poco

43
 favorable, como se resuelve energéticamente ese problema, de una superficie plana una vesícula esférica, como se
produce la formación de la vesícula.

La respuesta la vamos a encontrar analizando el fenoeno de que estas vesículas no están compuestas solo por membranas
sino que suelen estar revestidas en su cara citosolica por un conjunto de proteínas, por ende estas vesículas son vesículas
revestidas por ciertas proteínas y este revestimiento proteico comenzó a ser evidente por las imágenes que se obtuvieron a
partir de la ME que analizaba el proceso de formación de vesículas en donde se podía observar una región de mayor
electrodensidad, lo cual correspondía con la presencia de un revestimiento proteico, análisis bioquímicos posteriores
demostraron que hay tres grandes clases de recubrimientos proteicos pero que todos cumplen el mismo conjunto de
funciones.

La cubierta proteica permite la alteración de la membrana para formar la vesicula es decir ayuda a explicar que se genere esta
reacción termodinámicamente tan desfavorable, esto se produce porque este recubrimiento proteico esta formado por
monómeros que se unen a un parche particular de la membrana o que reconocen ciertas proteínas transmembranas pero
pueden ensamblarse espontáneamente entre si, si bien encuentran a ese parche membranoso como monómeros al estar lo
suficientemente cerca interactúan entre si y las deformaciones tridimensionales que tienen al encastrarse unos con otros
arrastra a la membrana subyacente y esta deformación que induce a la interacción de las proteínas que forman la membrana
proteica es lo que permite explicar la reacción tan desfavorable de la formación de la vesícula.

En muchos casos después de que se produce la vesícula posteriormente en tiempos diferentes de acuerdo con el tipo de
recubrimiento proteico se produce un desensamblaje de este recubrimiento proteico y la vesícula queda nuevamente como
una vesícula no revestida, veremos también utilizando el mismo esquema que estos componentes proteicos que van a
ensamblarse para formar la cubierta también participan en el fenómeno de selección de las moléculas que están en el
interior del compartimento y que van a ser incorporadas a la vesícula, este proceso de selección esta dado porque como
ustedes pueden apreciar muchas proteínas transmembranas que interactúan con el recubrimiento proteico actúan como
receptores de moléculas que están en el compartimento luminal de modo tal que si estos receptores interactuan con las
proteínas de recubrimiento proteico y a su vez seleccionan, se unen a un subconjunto de proteínas cuando se forme la
vesicula estará enriquecida por aquellas proteínas que interactuaron con esas proteínas que funcionaron como receptores
entonces dado que cada uno de estos recubrimientos proteicos distintos interactúan con un subconjunto particular de
receptores terminara llevándose en esa vesícula un subconjunto particular de moleculas, aquellas que eran reconocidas por
esos receptores que eran captados por la vesicula.

Con esto el recubrimiento proteico puede explicar dos de las preguntas, ¿Cómo se produce la deformación de la membrana?
Y ¿Cómo se produce la selección de las moléculas que son transportadas, la otra pregunta (¿Cómo se determinaba el
compartimiento de destino?) la veremos mas adelante en este mismo seminario.

De los tres grandes tipos de recubrimientos proteicos:

1. el mas estudiado desde el punto de vista experimental son las vesículas recubiertas de clatrina, de monómeros de
clatrina, las clatrinas tienen esta estructura formada por tres estructuras peptidicas que pueden autoensamblarse
aun in vitro formando estas estructuras esféricas, o sea esta capacidad de interactuar, para acomodarse en forma de
una esfera es espontanea de la interacción de las moléculas no nesecita ocurrir en el interior celular pero si bien in
vitro puede formar estas esferas vacías en el interior celular comienzan a ensamblarse sobre la superficie del parche
membranoso y arrastran este parche membranoso para formar una vesícula interna a este recubrimiento proteico.

Otros tipos de recubrimientos proteicos originalmente nombradas como proteínas del cuatomero pero posteriormente
fueron llamadas.

2. proteínas de cuatomero 1 (COP 1)

3. proteínas de cuatomero 2 (COP 2)

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Todas estas tienen en común que cumplen las funciones de permitir la deformación de la membrana y participar de la
selección del contenido de la vesícula y difieren específicamente en el sector de la ruta de transporte donde participan, por
ejemplo, las vesculas recubiertas de clatrina median el transporte desde el aparato de Golgi a los lisosomas o desde la
membrana plasmática hacia los endosomas, las COP 2 van a permitir el transporte de vesículas desde el RE hasta el aparato
de Golgi y el transporte reverso lo permitirán las COP 1, si bien no es un concepto escencial que ustedes sepan en que
sectores de la ruta participan cada uno de los recubrimientos proteicos es importante que ustedes sepan que función cumple
el recubrimiento proteico en el transporte vesicular.

Entonces conceptualmente lo que importa es que estos diferentes tipos de proteínas que forman parte de las cubiertas están
presentes en distintas fases de la ruta de las proteínas y habíamos dicho que la ruta espontanea de aquellas proteínas que se
incorporen al RE, el próximo paso es ser transportadas por el transporte vesicular hacia el aparato de Golgi antes de
continuar con la ruta responderemos la última de nuestras cuestiones.

¿Cómo se determina el compartimiento de destino? Hay dos familias proteicas que están en la superficie tanto de las
vesículas (que están presentes en el compartimento de origen) y que tienen proteínas complementarias de la misma familia
en los compartimientos de destino y una de esas familias son otra familia de GTPasas que se denominan RAB hay distintas
familias de proteínas RAB que están presentes en las superficies de los compartimentos de origen y que quedan incorporados
a las membranas de las vesículas de transporte y que tiene proteínas complementarias especificas de la misma familia en un
único tipo de compartimiento destino y solo mediante la interacción de estos componentes complementarios de proteínas
RAB, de proteínas efectoras de RAB que pertenecen a la misma familia es que se produce el anclaje inicialmente de una
vesicula a un compartimento destino, el paso previo a la fusión de la vesicula. Entonces, dado que los distintos
compartimentos membranosos o sea los distintos miembros de esta familia RAB y distintas proteínas efectoras, proteínas
complementarias es que solo algunas interacciones entre proteínas RAB de la misma familia y su misma proteína
complementaria son posibles porque están localizadas de manera específica, de este modo las proteínas RAB que están
presentes en las vesículas del RE solo encontraran su efector par complementario en la membrana de Golgi y solo en esta
membrana destino se podrá producir el anclaje, una vesicula que choque por azar con otra membrana no quedara anclada a
esa otra membrana porque no encontrara en esa otra membrana la proteína efectora RAB complementaria perteneciente a
esa misma familia.

Algo que no estamos mencionando pero que estudiaremos en el próximo seminario es que las vesículas suelen no moverse
por difusión sino que son transportadas activamente mediante componentes del citoesqueleto, esa vuelta de tuerca, esa
complejización del emcanismo de transporte vesicular, lo analizaremos en el seminario del citoesqueleto.

Entonces el sistema de proteínas RAB y su complementaria también permiten explicar el anclaje especifico de la membrana
pero no la fusión que se produce, el proceso final de fusión, aquí participa una segunda familia de proteínas denominadas
SNARE, se las bautizo así por la palabra en ingles “trampa” estas proteínas actúan a modo de trampa, están compuestos
como las familias RAB por proteínas complementarias las V-SNARE, están presentes en las vesículas y las D-SNARE están
presente en el compartimiento de destino, cuando una proteína V-SNARE se encuentra con una proteína D-SNARE
complementaria se reconocen entre si y se produce una interacción lo suficientemente fuerte como para acercar las dos
bicapas lipídicas, la de la vesícula y la de la membrana de destino permitiendo la función espontanea de la vesícula con el
compartimento de destino.

Es decir recapitulando lo que dijimos recién, son las proteínas de la familia RAB complementarias en los compartimentos de
origen y destino y las proteínas de la familia SNARE (V-SNARE vesículas y D-SNARE compartimento destino) los que permiten
el reconocimiento especifico de cual es la organela, cual es el compartimento al que debe fusionarse la vesicula de
transporte.

Ahora que nombramos las características centrales del transporte vesicular vamos a retomar el hilo conductor de lo que era
la ruta vesicular que siguen esas proteínas es decir, nosotros analizamos mediante el transporte transmembrana como las
proteínas que tienen señal de localización en retículo son incorporadas, o bien a la membrana del retículo o bien a la luz del

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retículo y ahora las proteínas que han sido incorporadas a las membrnas o a la luz del retículo pueden salir de ese
compartimiento membranoso y fusionarse mediante el transporte de tipo vesicular.

¿Cuáles son los destinos posibles para esas proteínas que están en la membrana o en el interior de las vesículas?

El primer destino es El aparato de Golgi, sin embargo estas vesículas que surgen del RE y van a fusionarse al aparato de Golgi
brotan recubiertas del COP 2 y las proteínas solubles que van a ser reincorporadas al retículo tinen una señal particular que
les permite su relocalización en el RE es decir, lo que estamos pensando ahora es que existe un mecanismo de seguridad en
donde hay algunas proteínas que eran originalmente residentes del RE que haya quedado incorporada accidentalmente en
una vesícula de secreción, tenemos un mecanismo de seguridad que permite el retorno de estas proteínas residentes del RE
para que vuelvan al compartimento de destino este transporte retrogrado esta mediado por señales especificas tanto en las
proteínas de membrana, como en las proteínas solubles que son residentes en el retículo y que van a ser incorporadas en
otras vesículas, vesículas de retorno nuevamente hacia la luz del RE, es decir también hay señales que permiten a que ciertas
proteínas residentes se mantengan como residentes del retículo y no sean ni secretadas, ni transportadas al lisosoma.

**Todas las vesículas que van del RE a Golgi están recubiertas por COP 2 y las que tienen un transporte retrogrado están
recubiertas por COP 1.

¿Qué es lo que ocurre en el aparato de Golgi una vez que llegan las proteínas a ese compartimiento? El aparato de Golgi esta
compuesto por una serie de sacos membranosos que suelen tener una ubicación perinuclear.

*Aquí vemos una imagen de microscopia con las tres fases en donde se a coloreado artificialmente la localización del aparato
de Golgi suelen ser diferentes desde el punto de vista bioquímico, las enzimas que encierran cada uno de estos
compartimentos no son todas iguales por eso podemos distinguir a las distintas cisternas de Golgi de acuerdo con sus
componentes enzimaticos y las reacciones que ocurren en cada uno de estos compartimentos según su relación con el nucleo
y con la membrana, aquellas cisternas, aquellos sacos membranosos del aparato de Golgi que miran hacia el nucleo serán las
cisternas “cis” de Golgi en tanto que las cisternas que miran hacia el exterior celular, serán localizadas más hacia el exterior
celular son las cisternas “trans” de Golgi y el transporte vesicular siempre ocurre desde la cara “cis” pasando por las cisternas
mediales hacia la cara “trans” y es desde la cara “trans” de Golgi que las proteínas luego van a seguir su destino final.

¿Qué reacciones ocurren en el interior de las cisternas del aparato de Golgi? En primer lugar aquellos oligosacáridos que
habían sido incorporados a las asparaginas sufren una serie de modificaciones, pueden sufrir remociones y agregados de
moléculas de oligosacáridos generando dos tipos de clases de oligosacáridos, oligosacáridos complejos, por ejemplo u
oligosacaridos ricos en manosa que se distinguen entre si por el tipo particular de monosacáridos que lo componen, ustedes
saben que muchas proteínas de la membrana van a tener decoraciones de oligosacáridos esos oligosacáridos provienen
orignialmente de las N-glicosilaciones que se produjo en el RE y que sufrio posteriores modificaciones en el aparato de Golgi.
un segundo tipo de N-glicosilacion que comienza en el aparato de Golgi es la O-glicosilacion, que se distingue de la primera
porque va a ocurrir en residuos de serina unidos directamente al aminoácido serina que posee en su resto R un grupo
hidroxilo dado que el oligosacárido va a unirse al atomo de oxigeno de ese hidroxilo de la serina se llamara O-glicosilacion.

Ahora la O-glicosilacion como veremos en un seminario posterior tiene una estructura muy diferente dado que lo que suelen
agregarse son enormes cadenas sacaridicas lineales, por ejemplo, las cadenas de glicosaminoglicanos son sintetizados en el
aparato de Golgi mediante este proceso que es la O-glicosilacion, estudiaremos algunso aaspectos funcionales de estos
productos de la o-glicosilacion en un seminario posterior.

Pero cuales son los destinos posibles para las proteínas que han logrado dejar atrás el Golgi y que han sufrido estas
modificaciones, mediante el enriquecimiento de la N-glicosilacion por un lado y por la O-glicosilacion, hay 3 destinos posibles:

● La secreción constitutiva, es decir vesículas que brotan de la cara trans del Golgi y se fusionan con la membrana
plasmática liberando la proteína para su exportación, notemos que aquellas proteínas transmembrana que quedaron
atrapadas en este tipo de vesículas van a quedar incorporadas luego de esa fusión a la membrana plasmática y noten

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 que la cara luminal de estas proteínas va a mirar ahora al exterior celular es decir los oligosacáridos que van a ser
incorporados por las proteínas en su cara luminal, serán los oligosacáridos que encontraremos en la superficie celular.
● La secreción regular.
● Transporte hacia los lisosomas.

Conclusion: Iran al exterior celular por secreción constitutiva o regular o al interior de los lisosomas.

LISOSOMAS

¿Qué son los lisosomas? Son organelas descubierta, no por microscopia electrónica porque no pueden ser diferenciadas de
otros componentes, solo con el desarrollo de técnicas de inmunohistoquimica que permitio revelar que estas organelas
contenían proteínas especificas ausentes en otras organelas se pudo determinar la existencia de los lisosomas como
organelas distintas de otros compartimentos membranosos, las enzimas que forman parte o están en el interior de los
lisosomas, son hidrolasas acidas, un conjunto diverso de enzimas que tiene como función enzimática degradar
macromoléculas, hay enzimas que degradan proteínas, hay enzimas que degradan acidos nucleicos, hay enzimas que
degradan lípidos. la función que suelen cumplir estas organelas, es ser una organela que degrada componentes
macromoleculares que pueden provenir del exterior celular por endocitosis o pinocitosis o por el mismo interior celular en
donde por ejemplo ciertas organelas que han cumplido con una determinada vida útil, que suelen tener daños moleculares
son degradadas intercelularmente también en los lisosomas.

Una característica de esas hidrolasas por lo cual se las denominada hidrolasas acidas es el hecho de que su actividad
enzimática solo se produce cuando el pH es acido, aproximadamente de 5, este pH acido es conseguido en el interior de los
lisosomas gracias a un bombeo activo de protones por proteínas de membrana, el aumento de protones en el interior de los
lisosomas acidifica el pH y permite que las enzimas se encuentren activas en el interior del lisosoma este mecanismo de
hidrolasas acidas es un mecanismo evolutivo que protege a las células de estas enzimas. Porque imaginemos ante la ruptura
hipotética de un lisosoma: si todas esas enzimas degradativas atacaran los componentes intracelulares podrían degradar los
mismos componentes intracelulares, esto no ocurre ante la ruptura de un lisosoma porque el pH es neutro en el citosol,
impidiendo la actividad de las hidrolasas acidas.

¿Cómo se produce otra señal molecular que permite que solo algunas de las proteinas que están en la cisterna trans del Golgi
sean específicamente llevadas al lisosoma? La particularidad de esta señal es que es una señal obtenida en un oligosacárido,
hay algunas proteínas que portan una señal peptídica codificada por el genoma en la forma de un parche señal, tal como lo
analizamos al comienzo de la clase que son reconocidas ese parche señal por una enzima en el interior del RE y esa enzima va
a ejercer modificaciones en el oligosacárido que esta unido a esa proteína y va a generar un oligosacárido que tenga un
monosacarido terminal de manosa unido a un grupo fosfato, la señal como esta unida a un carbono especifico, un carbono 6,
se conoce como “señal de manosa 6 fosfato” solo se adiciona esa manosa con el grupo fosfato con el grupo 6 en aquellas
proteínas que tienen el parche señal que es reconocido por esta enzima en el interior del aparato de Golgi entonces solo las
proteínas cuyo destino final es el lisosoma, las hidrolasas acidas, van a ser marcadas por esta señal. Posteriormente, hay
receptores que reconocen la señal, que están presentes en la membrana de la red trans de Golgi que reconocen a la manosa
6 fosfato y que son transportadas por transporte vesicular, por vesículas compuestas de Clatrina, estos receptores permiten
como dijimos antes la selección del contenido de la vesícula y son fusionadas en las vesículas que maduran hasta convertirse
en lisosomas una vez que aumentan su concentración de hidrolasas acidas.

Entonces la señal que permite el transporte lisosomal es la senal de manosa 6 fosfato que también esta codificada en el
genoma pirque solo serán unidas a aquellas proteínas que tengan un parche señal constituidos por varios fragmentos de
aminoácidos. Diversas patologías genéticas han demostrado la importancia de estos sistemas de localización, por ejemplo,
mutaciones que afecten o bien a las secuencias señales o a las proteínas que interactúan con estas secuencias para producir
la localización generan enfermedades en humanos y un caso paradigmatico de este conjunto de enfermedades son las
denominadas “enfermedades de deposito lisosomal” estas enfermedades de deposito lisosomal se caracterizan porque hay
alguna enzima que posea mutación y que impide que se le agregue la señal de manosa 6 fosfato y sea localizada en los
lisosomas por ende estas enfermedades, por ejemplo, la enfermedad de Tay Sachs, enfermedad de Gaucher, enfermedad de
47
Niemann-pick o enfermedad de Farber se cracterizan porque en los pacientes se producen en esos lisosomas una progresiva
acumulación de algún sustrato especifico que no puede ser degradado y que corresponde justamente al sustrato de esa
enzima que no puede ser localizada en el interior de los lisosomas, usualmente las células que acumulan estos enormes
lisosomas eventualmente mueren por muerte celular programada, las neuronas son particularmente sensibles a estas
acumulaciones lisosomales y es típico, por ejemplo, que los pacientes con estas enfermedades, tengan un fenotipo, tengan
síntomas que reflejen este ***

48
Seminario 7 giusti
Vamos a analizar una serie de procesos y de estructuras muy interesantes desde el punto de vista funcional que corresponen
a lls procesos llevados adelante por el citoesqueleto, de hecho al analkzar este sistema nos enfrentamos usualmente a una
contraposición respecto de la imagen de la celula que se parece a un sistema acuoso donde las organelas se encuentran
suspendidas. Sin embargo la ME nos ha demostrado que la morfología celular es muy diversa, podemos notar que una
inmunofluorescencia nos muestra distintos filamentos del citoesqueleto que son filamentos proteicos que están de manera
muy comleja estructurando todo el citosol. Una de las funciones del citoesqueleto es ser la maquinaria que permite ciertos
movimientos intracelulares. Por ejempli el movimiento de las mitocondrias o muchas vesículas no esta mediado puramente
por la difusión de estas organelas sino que es un movimiento drigido a lo largo de las fibras proteicas del citoesqueleto. Otra
función es la de brindar resistencia mecánica a distintos tipos celulares sobre todo a aquellos que están expuestos a
tensiones por ejemplo las células epiteliales, otra función es que permite generar especializaciones de superficie: muchos
tipos celulares tienen morfologías muy especializadas para cumplir sus funciones por ejemplo las prolongaciones de las
neuronas, las superficies de las células del epitelio intestinal que poseen microvellosidades que aumentan la superficie de
absorción, la superficie ciliada de las células del epitelio respiratorio,etc. Aquellas especializaciones de las superficies
celulares que forman parte de la diferenciación de ciertos tipos celulares están mediadas por el sistema citoesqueletico. Otra
función es la de permitir el desplazamiento celular de un lugar a otro. Hay 3 clases de filamentos que forman parte del
citoesqueleto: tenemos el citoesqueleto de actina denominado sistema de microfilamentos , el sistema de microtubulos
formado por la proteína tubulina y el sistema de los filamentos intermedios donde hay distintas subunidades proteicas que
difieren entre los distintos tipos celulares que conforman los filamentos intermedios. El termino filamentos intermedios
surge de la comparación de la medida de los 3 fiamentos de modo que los microfilamntos son los mas delgados midiendo
alrededor de 7 nm de diámetro, los microtubulos son los de mayor grosor tienen 25 nm de diamero y los filamentos
intermedios tienen un diámetro intermedio entre los dos anteriores. estos 3 filamentos tienen como características en común
que cada filamento esta formado por un polímero de proteínas unidas entre si por enlaces no covalentes. durante mucho
tiempo se pudo estudiar a cada uno de estos sistemas en sistemas in vitro dado que las subunidades proteicas que forman
parte de ests filamentos tienen la capacidad de autoensamblarse en lquido, no son ensambladas externamente sino que es
una propiedad de las subunidades poder interactuar y ensamblarse aun en una solución acuosa separada de las células. Y
este sistema de formación de los filamentos se da por una reacción de unión de las subunidades a los filamentos en
crecimiento y dependerá como toda reacción de la concentración de subunidades libres, cuanto mayor sea la concentración
mas probabilidades hay que la subunidad se una al filamento en crecimiento. Esta capacidad de ensamblarse y
desensamblarse le da la a las fibras del citoesqueleto la capacidad de remodelarse, de cambiar su estructura dentro de la
celula a lo largo del tiempo y en respuesta a distintas señales lo que convierte al sistema citoesqueletal en un sistema
dinamico y adaptable a las necesidades de las células. Los filamentos que forman parte del citoesqueleto son filamentos
complejos dado que las subunidades proteicas que lo conforman se unen entre si para formar flamentos simples
denominados protofilamentos, pero el filamento maduro citoesqueletal no esta compuesto por un único protofilamento de
subunidades proteicas sino que en general esta compuesto por muchos protofilamentos unidos entre si. Esta característica de
estar formados por muchos protofilamentos les confiere resistencia ya que la unión que mantiene unidas a las subunidades
no son las uniones covalentes, son interacciones no covalentes y mientras mayor sea la superficie de contacto entre las
distintas subunidades mayor ser la resistenca de toda la estructura dado que tenemos la sumatoria de las fuerzas de estas
multiples atracciones no covalentes de proteínas. Teniendo en cuenta estas dos grandes caractristicas que se cumplen para
todos los sistemas del citoesqueleto comenzamos a ver las particularidades de cada sisema:
FILAMENTOS INTERMEDIOS: *imagen* la inmunofluorescencia detecta un tipo de filamento intermedio , filamento de
keratina en una celula epitelial en cultivo. Donde podemos ver que estos filamentos intermedios en este caso de keratina se
distribuyen en todo el citoplasma quizás mas enriquecidos en las regiones que rodean al nucleo pero que se extenden de
manera relativamente homogénea en todo el citoplasma, cuando analizamos los filamentos intermedios mediante ME
podemos observar y medir cual es su diámetro. Recordemos que fue la introducción de la ME la que permitio descubrir a los
filamentos del citesqueleto. Una de las características que distinguen a los filamentos intermedios de los otroa filamentos del
sistema citoesqueletico es que el tipo de subunidades proteics que lo forman puede cambiar de una celula a otra, a diferencia
de los microfilamentos de actina que siemre están compuestos por sbunidades de actina y de los microtubulos que van a
estar compuestos siempre por subunidades de actina; los filaentos intermedios están compuestos de diferentes proteínas en
distintos tipos celulares, por ejemplo, podemos hacer una distinción entre filamentos intermedios que están en el
compartimiento citoplasmático y otros que están en el copartimiento nuclear, veremos mas adelante que los filamentos
49
intermedios nucleares compuestos por proteínas denominadas laminas que si sn constantes entre los distintos tipos
celulares, en contraposición a esto los filamentos intermedios citosólicos pueden fdiferir de un tipo celular al otro. En el
ejemplo de la inmunofluorescencia de keratina, la keratina es una proteína que forma los filmentos intermedios
específicamente en células epiteliales. en cambio, las células que tienen un origen mesenquimatico por ejemplo los
fibroblastos del tejido conectivo poseen filamentos intermedios de la proteína vimentina. Las células mucculars poseen
filamentos intermedios de desmina. Durante el proceso de diferenciacin celular la regulación diferencial de la expresión
génica de cada uno de estos tipos celulares permitio la expresión de un tipo diferencial de filamento intermedio. Los
filamentos intermedios pueden ser usados como marcadores de modo que si uno esta estudiando un tejido completo y
quiere identificar un determinado tipo celular. La estructura de los filamentos intermedios: habíamos dicho que los
filamentos se componen por subunidades proteicas que forman primero filamentos simples o protofilamentos y que luego
muchos filamentos simples al unirse entre si forman el filamento maduro. En el caso de los filamentos intermedios las
subunidades prteicas que ya vimos que pueden ser de keratina, de vimentina, desmina, etc. Son todas proteínas filamentosas
es decir proteínas elongadas que no tienen una morfologia globular y estas proteínas se unen primero formando dimeros qye
se enrollan uno sobre otro y luego los dimeros interactúan entre si para formar tetrámeros. 8 tetrameros se unen para formar
un filamento simple y la unión de muchos tetrámeros uno yuxtapuesto al otro forman el filamento intermedio maduro. La
abundancia de contactos laterales le confiere la abundante resistencia característica de esos filamentos intermedios, son los
mas resisentes a la tracción de todos los componentes del sistema citoesqueletico. Entonces es por esto que suelen ser muy
abundantes en células que están sometidas a tracciones. Una propiedad biofísica de estos filamentos es que son extensibles,
pueden extenderse hasta 3 veces su longitud a medida que se van estirando se van sumando subunidades y aumentan sus
contactos laterales y en el momento en que están siendo extendidos aumentan su longitud (dureza). Decíamos que no solo
hay filamentos intermedios citoplasmáticos sino que también hay nucleares estos están compuestos fundamentalmente por
proteína lamina y hay 3 clases de laminas: Tipo A, B y C. y estas si son constantes en todos ls tipos celulares , las laminas
recubren estructuralmente el sector interno del nucleo, recubren la membrana nuclear interna formando una red
bidimensional dándole soporte estructural a la membrana. Sin embargo, también ls filamentos intermedios contactan de
manera directa a la cromatina. Los filamentos intermedios nucleares sufren una enorme reestructuración dinámica durante la
adhesión celular: durante la fase M del ciclo celular habíamos estudiado que se activa un grupo de kinasas que eran las
kinasas dependientes de ciclinas características de la fase M y algunos de los sustratos de estas kinasas dependientes de
ciclinas que permitían la generación de los eventos caracteristicos de la división celular son las proteínas laminas que forman
parte de este sistema estructural de la membrana nuclear, la fosforilacion de esas lamiinas por parte de estas kinsasas
dependientes de ciclinas inducen un cambio en la organización de estas moléculas favoreciendo su despolimerización, es
desensamblaje de los filamentos intermedios que permite la desorganización de la membrana nuclear que es característica
de la fase M. algunas enfermedades genéticas humanas que son poco frecuentes están provocadas por mutacines en os
genes que codifican para las laminas nucleares y una de estas patologías es la progenia o síndrome de envejecimiento
prematuro, estos sujetos no tienen síntomas aparentes hasta aproximadamente los 2 años de edad pero a partir de ese
momento se produce un envejecimiento prematuro y muy acelerado que involucra la perdida de la masa corporal, perdida
de los dientes, etc. estos pacientes que mueren alrededor de entre los 12 y 14 anos suelen morir por ejemplo por
aterosclerosis o complicciones cardiacas que son típicas de la vejez cuando se determino que la mutacion causante de esta
enfermedad era una mutacion que codificaba para las laminas fue sorprendente dado que no podía compatibilizarse el rol
descripto como un rol estructural respecto de la membrana nuclear con los signos y síntomas especificos de esta patología,
de hecho si uno analiza como es la morfología de los nucleos de las células de estos pacientes por ejemplo realizando una
inmunofluorescencia contra la proteína lamina uno puede observar que las células de un individuo que no posee esta
mutacion tienen una estructura conservada de la membrana nuclear pero observamos deformaciones en la estructura de la
membrana en los individuos que padecen progenia. Sin embargo, por mas que observamos un cambio en la estructura de la
membrana nuclear este solo hecho no permite explicar los signos y síntomas de la enfermedad y muchas investigaciones en
los últimos años han demostrado entonces que lejos de tener un rol pasivo y estructural las laminas en su contacto directo
con la cromatina permiten modular la expresión génica de ciertos grupos celulares. El grado de la compactación de la
cromatina depende en parte de la interaccion de la crmatina con las proteínas de laminina

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seminario n° 8 Giusti

Fenómenos de producción de energía asociados a las mitocondrias

Aprovecharemos a analizar aspectos estructurales, morfológicos como solo de la mitocondria sino de otras organelas que
participan en el metabolismo de oxigeno como los peroxisomas. Hablaremos de estas estructuras dado que están vinculadas
por esta utilización bioquímica de las moléculas de oxígeno.
Comenzamos a analizar esta biología celular y molecular de las mitocondrias:
¿Desde cuándo comenzó a construirse el conocimiento experimental, celular y molecular de las mitocondrias?
Si bien, estas estructuras y el nombre mismo de mitocondrias provienen de siglo 19, cuando se observaba bajo microscopio
óptica unos pequeños orgánulos citoplasmáticos. El conocimiento más profundo de las mitocondrias, el que podemos
considerar teórico, es el conocimiento que forma parte de las teorías validadas sobre estas organelas comienza a surgir a
mediados de los años 40 del siglo 20. Y esta temporalidad está dada por el surgimiento de la microscopia electrónica que
permitió, por primera vez a mediados de los 40, observar a células bajo el microscopio electrónico y permitir analizar la
ultraestructura de las organelas que sé que se encontraban dentro de la célula. Fue entonces en los años 40 que comenzaron
a evidenciarse la estructura de las mitocondrias; la estructura de la organela: una membrana interna muy replegada sobre sí
misma, estos repliegues de la membrana interna de denominan, crestas mitocondriales y una membrana externa que limita
con el espacio citosólico que es la membrana mitocondrial externa (no replegada sobre si misma), por ende, con una
superficie relativa mucho menor que la de la membrana mitocondrial interna.
Estas dos membranas concéntricas, por ende, definen dos clases de espacios dentro de las mitocondrias; el espacio
contenido en el interior de la membrana mitocondrial interna “la matriz mitocondrial” y el espacio contenido entre la
membrana mitocondria interna y la externa, que es el espacio intermembranoso; es decir, estos espacios y membranas de las
mitocondrias que ustedes ya han analizado. Pero que se definieron originalmente a partir del análisis de la microscopia
electrónica.
Otra técnica que comenzó a desarrollarse también a los mediados de los 40 y con mayor fuerza en los años 50, fue la técnica
que estudiamos del fraccionamiento subcelular que permitió entonces de manera simultánea del análisis ultraestructural de
las mitocondrias, obtener preparaciones enriquecidas de mitocondrias a partir de un tejido determinado. La obtención de las
tensiones mitocondriales. Entonces permitió en estos años el análisis bioquímico, caracterizar cuales son los componentes
lipídicos y proteicos que están contenidas en las fracciones mitocondriales. En los años 50 se perfeccionaron las técnicas de
fraccionamiento subcelular y a partir de esta fracción mitocondrial, podrían realizarse pasos de purificación posterior,
obteniendo un procedimiento que se denomina “fraccionamiento submitocondrial” y que permite tener en tubos separados,
los distintos componentes mitocondriales. Entonces el fraccionamiento submitocondrial parte de la fracción mitocondrial
(obtenido de un fraccionamiento subcelular) y mediante centrifugaciones y procedimientos, por ejemplo, la introducción de
frox osmóticos en el medio del proceso, purificar las membranas mitocondriales internas en un tubo; el contenido de la
matriz mitocondrial en uno y el contenido de la membrana externa en otro, y así sucesivamente. Este tipo de análisis
permitió determinar que la composición de lipídica y proteica por ejemplo de la membrana mitocondrial interna es muy
diferente respecto al contenido de lípidos y proteínas de la membrana mitocondrial externa. Son dos membranas muy
distintas entre sí, en particular puede observarse que la membrana mitocondrial interna tiene un contenido proteico
inusualmente alto pero las membranas biológicas; las membranas biológicas en general por ejemplo la membrana plasmática
o la membrana de las organelas como el Retículo Endoplasmático y Aparto de Golgi tiene en general un promedio de 40% de
proteínas en su composición total. En contra posición con este valor de 40%, las membranas mitocondriales internas llegan a
un contenido proteico del 75%, son inusualmente ricas en proteínas.
Sin embargo, esta caracterización ultraestructural respecto de la disposición de las membranas y el análisis bioquímico que
permitió esta purificación mitocondrial dio durante mucho tiempo una imagen, un modelo de las mitocondrias de organelas
estáticas de pequeños bastones compuestos de doble membrana en el interior de la célula.

51
Pero las técnicas parte de las cuales hemos estudiado en los seminarios correspondientes a técnicas, permite hoy en día y
han permitido desde los años 50 observar las mitocondrias de células vivas y observar la dinámica temporal que tienen estas
organelas en el interior de la célula.

(Visualización de un video de una célula viva)

En la que sus mitocondrias están marcadas con la proteína fluorescente verde, es decir la proteína fluorescente verde se
localizó en las membranas mitocondriales y se filmó a una mitocondria durante un lapso. Así es cómo se comportan las
mitocondrias en una célula viva.

¿Qué cosas notamos en este video respecto de la imagen que tradicionalmente había sido ilustrada por los libros?
Una de las características es que no vemos a la mitocondria como bastones, sino solemos ver toda una red de túbulos
mitocondriales unidos entre sí. Si siguen con detalle a uno de esos túbulos van a observarse que algunos de ellos se fisionan,
se desprenden de otros túbulos generando pequeñas unidades mitocondriales. En estos casos esas subunidades se fusionan
entre sí para formar un túbulo. Y quizás el aspecto más sorprendente, es el hecho de que observamos movimientos en las
mitocondrias. Lo que hoy sabemos entonces es que las mitocondrias son organelas dinámicas. Es un movimiento producido a
partir del movimiento de las mitocondrias sobre los microtúbulos del citoesqueleto.
Es decir, las mitocondrias suelen poseer, tanto como en otras organelas, en su membrana mitocondrial externa vienen
incluidas proteínas motoras (Kinesina y dineínas) que se unen a los microtúbulos, por ejemplo, los que están en la célula y
pueden moverse a lo largo de esos microtúbulos; también poseen variantes de proteínas miosinas que les permiten
desplazarse a través de los microfilamentos de actina.

Los fenómenos de fusión y fisión de mitocondrias están siendo activamente estudiados hoy en día, se encuentran alterados
por ejemplo en el contexto de ciertas enfermedades de neurodegenerativas, el párkinson, la segunda enfermedad
neurodegenerativa en término de frecuencia de aparición. Al analizar las neuronas que terminan muriendo, uno puede
observar el modelo experimental que la dinámica de fusión y fisión de las mitocondrias de esa célula se encuentra alterada,
lo que aún desconocemos es qué relación existe entre los fenómenos de fusión y fisión, y la muerte posterior de la célula.

¿Cuál es el origen de las mitocondrias?

En los años 60 en partículas en 1967, se desarrolló y se publicó una teoría evolutiva respecto del origen de las mitocondrias
en la célula eucariota. Una teoría que quizás ustedes ya han oído nombrar, que es la teoría endosimbiótica que interpreta la
existencia de la mitocondria en el interior de la célula eucariota como el reflejo de un fenómeno evolutivo, en el cual ciertas
bacterias (bacterias aeróbicas) que podían utilizar el oxígeno molecular para producir (acoplando a procesos fisicoquímicos)
energía. Ingreso en el interior de las células eucariotas primitivas que carecían originalmente de estas organelas y que las
mitocondrias actuales entonces reflejan ese procedo de endosimbiosis, que ocurrió de manera temprana en la célula
eucariota.

Esta idea en términos de argumentación evolutiva que plantea Lynn Margulis fue la científica que desarrollo y encontró
algunas evidencias experimentales para esta teoría. La argumentación sigue la siguiente lógica, en el momento en el que
surgen evolutivamente las primeras células eucariotas, la atmosfera de la tierra carecía de oxígeno, las primeras células
eucariotas evolucionaron en un ambiente anaeróbico. Sin embargo y surgimiento posterior del proceso de fotosíntesis en las
bacterias (ciertas bacterias fotosintéticas), permitió posteriormente la acumulación progresiva del oxígeno molecular en la
atmosfera. Y este cambio en el medio ambiente y la aparición de una atmosfera rica en oxigeno condiciono la evolución
posterior de las células eucariotas primitivas y aquellas células en donde que incorporaron bacterias aeróbicas para utilizar el
oxígeno moléculas como parte del proceso de producción de energía, tuvieron ventaja evolutiva respecto de aquellas otras
células que no lo hicieron (que terminaron desapareciendo).
La ventaja para la bacteria primitiva que ingreso a estas células procariotas es la disponibilidad de nutrientes en el citosol de
la célula predadora.

¿Qué evidencias presento Lynn Margulis? Y se generaron de manera posterior en apoyo a esta teoría endosimbiótica.
En primer lugar, ya se presentaba características simples no muy convincentes como por ejemplo la correspondencia del
tamaño de las bacterias y el tamaño de las mitocondrias, sin embargo, las evidencias más fuertes son otras por ejemplo el
52
hecho de que cuando se le analizan las proteínas especificas están expresadas en la membrana mitocondrial interna.
Notemos que según el esquema la membrana mitocondrial interna correspondería a la membrana proveniente a la bacteria
en tanto que la membrana mitocondrial externa según esta interpretación correspondería a la invaginación a la membrana
plasmática, y hecho cuando uno analiza bioquímicamente los componentes de la membrana interna, uno observa la
presencia de proteínas que tiene mucha simbología con proteínas bacteriales. En tanto que la composición de la membrana
mitocondrial externa es muy similar a la membrana plasmática. Sin embargo, las evidencias más fuertes a favor de la teoría
endosimbiótica surgen del análisis de la replicación y el mantenimiento de las mitocondrias por ejemplo las mitocondrias se
dividen en el citoplasma a partes de mitocondrias preexistentes, esto refleja de alguna manera está capacidad típica de
identidades vivas que es la capacidad de autorreplicarse.

Y un hecho fundamental en apoyar en esta teoría fue el descubrimiento en la matriz mitocondrial, en la mitocondria propio
genoma (ADN mitocondrial). Que en el caso de genoma mitocondrial de células humanas. Si como el de muchas otras
especies eucariotas el genoma mitocondrial, es un genoma compuesta por ADN doble cadena, circular que refleja la
estructura típica de los cromosomas bacterianos. ¿Cuál es contenido genético que posee este genoma mitocondrial humano?
Que tiene aproximadamente 16500 pares de bases de longitud, un genoma muy, muy pequeño, es un genoma que posee en
total 37 genes, 13 de ellos son genes que codifican para proteínas, todas esas proteínas. 13 péptidos son péptidos que van a
estas incluidas, luego de su traducción en la membrana mitocondria interna, (si su destino celular final). Sin embargo, los
otros genes contenidos en las mitocondrias codifican pose ARN (ARNt y ARNr) dado que, dentro de las mitocondrias,
acontecen los fenómenos de transcripción del genoma mitocondrial y de traducción de esos 13 polipéptidos mitocondriales
que no utilizan las ARN de transferencia citosólicas, sino que utiliza ARNt codificados por el propio genoma mitocondrial. Y los
ribosomas que también están en la matriz mitocondrial contiene ARNr codificados por estos genomas. La existencia de este
sistema genómico en las mitocondrias es un apoyo muy fuerte a la teoría endosimbiótica. Dado que refleja este genoma
muchas características del genoma procariontes, no solo en esta estructura circular, sino que al analizar la secuencia de los
genes codificados en esté genoma, uno puede observar por ejemplo que los genes de estos polipéptidos carecen de intrones,
otra característica típica de los procariotas. Y durante la transcripción de esos genes suele generar transcriptos policistrónicos,
transcripto que contiene varios genes yuxtapuestos, otras de las características típicas de la transcripción procarionte.

Veremos en genética que mutaciones en el genoma mitocondrial también son origen de un conjunto de enfermedades
genéticas, enfermedades de transmisión mitocondrial que analizaremos específicamente durante la cursada de genética.
Esta noción de la existencia de un genoma mitocondrial a partir de la cual puede producirse 13 proteínas que van a estar
incluidas en la membrana mitocondrial interna, nos sugiere entonces que desde el punto de vista de su composición proteica
las mitocondrias son un sistema mixto. ¿Por qué? Razonemos no son solo 13 polipéptidos los que alcanzan para completar la
estructura y la función mitocondrial. La mitocondria tiene más de mil proteínas diferentes que componen sus membranas
mitocondriales interna y externa, como el contenido de la matriz y el espacio intermembrana. Esa cantidad superior a mil
proteínas como hemos visto no están codificados por el genoma mitocondrial, solo están codificados 13 polipéptidos cuya
localización es la membrana mitocondrial interna. El resto de esos péptidos esta codificado por el genoma nuclear, y va a ser
un proceso activo de traducción citoplasmática y posterior en relación con las mitocondrias, lo que permite a las
mitocondrias poseer el conjunto complejo de proteínas que las forman.

Este fenómeno, uno puede pensar ¿Cómo es posible? ¿Cómo es esto compatible con la teoría endosimbiótica? El hecho que
haya genes nucleares en el genoma nuclear que forma parte en la estructura de la mitocondria.
En el contexto de la teoría se supone que en un momento evolutivo ya pasado hubo una transferencia génica de parte del
genoma mitocondrial al genoma nuclear, permitiéndole a las células en donde había ocurrió esta transferencia de material
genético mitocondrial a nuclear, que le núcleo posee el control de la fisiología celular. Hubo una pérdida de independencia
total de esa bacteria y quedo regulada bajo la actividad del núcleo.

Entonces a partir de este análisis que hemos hecho el primer mecanismo molecular que vamos a estudiar: ¿Cómo se localizan
las proteínas mitocondriales, que son codificadas por el núcleo y traducidas en el citosol?, ¿Cómo se localizan en los
diferentes compartimientos mitocondriales? Y de hecho vamos a utilizar uno de los conceptos que ya hemos analizado en
seminarios anteriores y es el hecho que la localización de proteínas en compartimientos específicos depende de la secuencia
señal que están contenidas en la propia estructura primaria de las proteínas. Dicho de otro modo, son secuencia de
aminoácidos que forman parte de la cadena polipeptídica, las que suelen actuar como señal para que los sistemas celulares
53
localicen, ese polipéptido en un compartimiento determinado. Habíamos analizado en aquel seminario que existían señales
por ejemplo de localización nuclear, señales de exportación nuclear o péptido señales que inducían en la incorporación de
proteínas hacia la luz del retículo endoplásmico. De manera análoga existen señales de localización mitocondrial, desde el
punto de vista experimental, sabemos mucho más de aquellas señales de incorporación mitocondrial que dirige a
componentes proteicos a la matriz mitocondrial específicamente. Estas secuencias señales van a dirigir la incorporación del
polipéptido a la matriz mitocondrial está caracterizado por ser una secuencia de aminoácido que está en el extremo
N-terminal de la proteína. Y suele caracterizarse porque esa secuencia adopta rápidamente una estructura secundaria de alfa
hélice y esa alfa hélice tiene características bioquímicas muy particulares, es una alfa hélice anfipática, esto quiere decir, sus
costados tienen características fisicoquímicas distintas. Sobre uno de los costados de esta hélice se acomoda cierto residuo
aminoacídico básico, es decir que tienen carga electrónica positiva al pH celular, ósea uno de los costados de esa hélice está
cargado positivamente. El otro costado (opuesto), se acomoda en esa estructura aminoácido que tiene residuos hidrofóbicos,
por ende, llamamos a esta alfa hélice anfipática, de un lado posee cargas positivas y del lado opuesto posee residuos
hidrofóbicos. Y es esa configuración, polarizada anfipática que será reconocida por ciertos componentes de las membranas
mitocondriales que van a actuar como un receptor de esta señal de importación mitocondrial.

Los principales componentes de este sistema de importación de proteínas sintetizadas originalmente en el citosol. Los
transportadores principales, las proteínas transmembrana que actúa tanto como receptor de la secuencia señal y que
participan del proceso de importación de proteína. Hay 2 grandes complejos de transportadores: uno localizado en la
membrana mitocondrial externa se denomina “complejo TOM” (transportador de la membrana externa). El complejo TOM
posee un receptor para la secuencia señal, la alfa hélice anfipática de estas proteínas y permite la incorporación (la inyección)
de esa proteína hacia el espacio intermembrana, En el espacio intermembrana podrá interactuar con los complejos
principales de la membrana mitocondrial interna que se denomina de manera análoga “complejo TIM” (transportadores de la
membrana interna).

Entonces es la acción secuencial de los complejos TOM y el complejo TIM lo que permite la incorporación de estas proteínas
mitocondriales por ejemple en el caso de que la localización final de estas proteínas sea la matriz mitocondrial.

Otro complejo adicional, por ejemplo, el complejo SAM en la membrana mitocondrial externa, permite la incorporación de
aquellas proteínas que tiene como localización especifica la membrana mitocondrial externa. Por ejemplo, una de las familias
de proteínas que están enriquecida en la membrana mitocondrial externa son un conjunto de proteínas denominadas
porinas. Y se denomina de ese modo porque son proteínas que tienen muchos pasos transmembrana y generan poros
proteicos en la membrana mitocondrial externa, lo que le confiere a la membrana una de sus características centrales e
instintivas respecto de la membrana mitocondrial interna que es su alto grado de porosidad. Por ejemplo, si analizamos el
contenido iónico y de moléculas pequeñas que están presentes en el espacio intermembrana respecto del espacio citosólico,
veremos una enorme correspondencia en alta similitud, esto está dado por la distribución permitida a través de la enorme
cantidad de proteínas que presentan en la membrana mitocondrial externa. Todas las proteínas están codificadas por el
genoma nuclear y son incorporados a la membrana mitocondrial externa a partir de estos complejos SAM.

Otro complejo OXA, permite la incorporación a la membrana mitocondrial interna de aquellos péptidos que son producidos,
traducidos en la matriz mitocondrial y que surgen de la traducción del genoma mitocondrial. Esas proteínas entonces
originalmente sintetizadas en la matriz, solo esos 13 polipéptidos codificados del genoma mitocondrial serán incorporados a
la membrana mitocondrial interna a través del complejo OXA.
Recordemos que los 13 polipéptidos tienen una localización en la membrana mitocondrial interna. Esto implica por ejemplo
todas las proteínas solubles de la matriz mitocondrial están también codificadas por el genoma nuclear.

Si analizamos este proceso de incorporación especifica de proteínas hacia las mitocondrias. Debemos mencionar 2 aspectos,
en primer lugar, el hecho de la incorporación de proteínas hacia las mitocondrias implica una incorporación que es
postraduccional, las proteínas son completamente traducidas en el citosol y solo posteriormente son incorporadas a la matriz
mitocondrial, esto contrasta con la incorporación cotraduccional, por ejemplo, que ocurrirá a nivel de la luz en el retículo
endoplasmático. Y esta incorporación cotraduccional esta facilitada y permitida por el hecho que las proteínas suelen no
plegarse completamente, antes de la incorporación de las mitocondrias. Y este mantenimiento de un estado de no
completamente plegado se debe a la acción de un conjunto de proteínas chaperonas citoplasmáticas y mitocondriales.
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En otras palabras, aquellas proteínas que tienen como destino la mitocondria, que son traducidas en el citosol, suele
interactuar de manera muy fuerte con un conjunto de proteínas chaperonas citosólicas que pertenecen a la familia hcp70.
Como saben las chaperonas, una de las funciones generales que tiene es permitir el correcto plegamiento de las proteínas. Y
de hecho chaperonas de esta familia pueden interactuar con un conjunto muy diverso de proteínas, porque reconocen la
señal de reconocimiento de las chaperonas, no es otra cosa los parches hidrofóbicos de los residuos de aminoácidos que
forman parte del polipéptido. Intentemos comprender la lógica por el cual esta es una señal para las chaperonas, una
proteína que se pliega en el citosol, de manera espontánea dado que el citosol es un ambiente acuoso.

Aquellos residuos polares que tengan carga electrónica van a interactuar de manera facilitada con el ambiente acuoso y polar
del citosol. En tanto que los residuos no polares hidrofóbico de proteína, suele unirse entre sí y ser repelidos por el ambiente
acuoso del citosol. Suelen quedar en el interior de esa estructura globular que adopta la proteína. Un mal plegamiento
entonces podría ser señalizado porque un parche hidrofóbico, no pudo ser incorporado en el interior del péptido y queda
expuesto al ambiente acuoso. Y justamente las chaperonas reconocen (identifican) estos parches hidrofóbicos en la superficie
de la proteína. En el caso de las proteínas mitocondriales a medida que esta proteína está siendo sintetizada los parches
hidrofóbicos, son reconocidos de manera secuencial por estas chaperonas, permitiendo la interacción con el conjunto TOM
de manera parcialmente desplegado. Estas chaperonas también se encuentran en su variante mitocondrial, chaperonas
mitocondriales de la misma familia, se encuentran en la matriz mitocondrial ayudando al proceso de incorporación. De
hecho, la existencia de estas chaperonas nos permite entender a esté proceso de transporte desde el punto de vista
termodinámico; es decir desde el punto de vista de la utilización de la energía. Porque sí pensamos que la localización de una
proteína implica un ordenamiento de la célula; desde el punto de vista termodinámico este ordenamiento, esa reducción de
la entropía celular, es un proceso no espontaneó que requerirá la utilización de energía para poder producirse.

¿Dónde está la energía invertida desde el punto de vista celular en este transporte? Parte de esa inversión de energía está
dada en la actividad de las chaperonas. Porque las chaperonas no suelen unirse de manera irreversible, sino que, suelen
unirse y despegarse de manera sucesiva de los péptidos a los que están asociados. Y cada una de estas uniones y despeges
esta catalizada por ruptura de ATP, entonces la unión de las chaperonas es un proceso que utiliza la energía almacenada en el
ATP.

Otro fenómeno es el hecho de que de manera indirecta este proceso esta favorecido por la existencia en la membrana
mitocondrial interna, de una diferencia de voltaje (de una diferencia de cargas eléctricas) leve entre las dos caras de la
membrana mitocondrial interna. Esa diferencia de cargas está dada por la propia actividad de las mitocondrias, por el
funcionamiento de la cadena de transporte de electrones, como parte del proceso de generación de energía. Y pensemos que
esta distribución asimétrica de cargas a lo largo de la membrana mitocondria interna es tal, que la matriz suele ser negativa
con respecto del espacio intermembrana. Entonces dado que los péptidos que ingresan a la matriz mitocondrial tienen como
péptido señal alfa hélice cargado positivamente, son las cargas electrónicas negativas del interior de la matriz mitocondrial, lo
que favorece el desplazamiento de ese péptido hacia el interior de la matriz. Podemos pensar como un fenómeno de
electroforesis, el movimiento de una partícula en función de un campo eléctrico.
Veremos que el mantenimiento de estas diferencias de cargas es un proceso energéticamente costoso para las mitocondrias.

Otros factores importantes de las mitocondrias en el interior de la célula:

● Las mitocondrias participan de un fenómeno bioquímico denominado esteroideogénesis, que se refiere a la
producción de hormonas derivadas del colesterol (ej. Testosterona, los estrógenos son hormonas esteroideas). Y la
fabricación de esas hormonas desde el punto de vista celular hay algunos pasos que ocurren en las membranas
mitocondriales. Si bien la mayor parte de la síntesis de las moléculas derivadas del colesterol ocurren, tal como lo
hemos visto en las membranas del retículo endoplasmático. Hay algunos pasos bioquímicos que acurren
exclusivamente en las membranas mitocondriales. De hecho, existen contactos entre la membrana del retículo
endoplasmático y las membranas mitocondriales que permiten el pasaje de sustratos de una membrana a la otra. Por
ejemplo, el primer paso de la biosíntesis desde el colesterol hacia hormona esteroidea; es el paso del colesterol a un
sustrato llamado pregnelonona. Y este paso bioquímico, la enzima que convierte al colesterol a pregnelonona, tiene
localización mitocondrial. Luego de estos contactos mitocondria- retículo la pregnelonona para, difundir hacia la

55
 membrana del retículo en donde las enzimas posteriores convierten a esta pregnelonona de manera única en
hormona esteroidea.
● Reservorio de calcio. El ion Ca+2 cumple una función central en regular la actividad de un enorme conjunto de
proteínas intracelulares, por ende, en condiciones basales, el ion calcio se encuentra en concentraciones bajísimas en
el citosol y altamente reguladas. Dentro de las células el calcio se encuentra secuestrado. Ante fenómenos de
señalización especifica liberado en estas organelas en la luz del Retículo Endoplasmático, ese es el principal reservorio
de calcio intracelular. Pero las mitocondrias, la matriz mitocondrial es el reservorio secundario dentro de la célula.
● Participa de los fenómenos de señalización que conduce al proceso de muerte celular programada. La liberación de
ciertos componentes mitocondriales hacia el citosol es un fenómeno de señalización que suele indicar a la célula
(suele activar en serie de proceso celular) que conducen a la muerte celular.

Síntesis de ATP celular por parte de las mitocondrias

Repaso de concepto bioenergéticas básicas:

¿Qué entendemos por reacciones químicas acopladas?

Desde el punto de vista energético las reacciones químicas desde el punto de vista termodinámico, las reacciones químicas
pueden ser espontáneas (ocurrir espontáneamente) o necesita energía para poder ocurrir. Esta distinción fundamental
respecto de la espontaneidad de una reacción de su requerimiento de energía para ocurrir distingue a estas reacciones, como
reacciones espontaneas asociadas a la liberación de energía, por ende, exergónicas y las distingue (las opone) a aquellas
reacciones que solo pueden ocurrir por el consumo de energía, las reacciones endergónicas que por ende son no
espontaneas. Osea el concepto de reacción espontánea y no espontaneas esta enteramente ligado a sí una reacción libera
energía cuando se produce o si necesita absolver energía para producirse.

¿Qué reacciones dentro de la célula son reacciones que implican el consumo de energía?
En términos químicos, la necesidad de energía o liberación de energía está asociado a la ruptura o formación de enlaces
químicos covalentes. Porque un enlace químico covalente implica energía almacenada por los electrones de ese enlace.

Procesos que implican la ruptura de esos enlaces covalentes, libertan energía al medio ambiente como reacciones
espontaneas y tanto que, si queremos formar enlaces covalentes, es decir queremos almacenar energía en esos enlaces,
necesitamos energía del medio ambiente para producirlos; y por ende son reacciones importantes. Dentro de la célula
reacciones no espontaneas serian, por ej. La formación de todos los enlaces que conducen a la agrupación de polímeros a
partir de monómeros. La generación de largas moléculas de ácidos nucleicos a partir de nucleótidos libres, la producción de
péptidos a partir de aminoácidos, por ej. Son reacciones no espontanea que típicamente ocurren dentro de la célula.
¿Cómo es posible entonces, de donde se obtiene la energía que necesitan estas reacciones espontaneas para producirse?
El hecho es que dentro de las células las reacciones químicas pueden acoplarse, esto implica que sí 2 reacciones químicas
ocurren de manera simultánea en tiempo y en gran proximidad espacial, la energía liberada por ejemplo: una reacción
espontánea puede ser utilizada por la reacción no espontanea que está ocurriendo en ese momento y lugar para poder
producirse Y en ese sentido decimos que las 2 reacciones están acopladas, ocurren en el mismo sector espacial en el mismo
tiempo y la energía liberada por una de las reacciones es utilizada para la producción de la otra. Este es el concepto de
acoplamiento de 2 reacciones químicas desde el punto de vista energético.

Dentro de las células la reacción espontánea que típicamente suele asociarse a la producción de reacciones no espontaneas
es la ruptura de un enlace covalente presente en una molécula de ATP, para liberar este grupo P (fosfato) y ADP. Esta reacción
de ruptura de enlace covalente pasando de ATP a ADP+P es una reacción espontánea y exergónica (libera energía). Y suelen
ser la reacción que típicamente es la célula con otras reacciones que requieren la incorporación de energía. Esto implica
entonces que una célula que está acoplando este tipo de reacciones, está rompiendo moléculas de ATP para generar, para
fomentar reacciones que morirían de otro modo si no utilizara esta energía liberada, esto implica que esas células con el
tiempo van disminuyendo sus cantidades de ATP. Porque todo el ATP que tienen las células en un momento dado, está siendo
transformado de manera continua a ADP+P.

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¿Cómo es posible que las células regeneren sus cantidades internas de ATP?, ¿Cómo se produce la reacción contraria (la
generación de ATP a partir de ADP+P)?
La respuesta a esta pregunta es la que nos va a permitir comprender la función fisiológica de las mitocondrias en la interior
célula.

Otro concepto clave que nos va a permitir llegar a ese concepto son otras reacciones. Reacciones de oxido-reducción como
seguramente han estudiado en química. Recordemos conceptos centrales de las reacciones oxido-reducción: cuando
hablamos de reacciones de oxido- reducción hablamos de reacciones en donde no necesariamente participa el oxígeno
molecular como molécula. Entendemos entonces por reacciones de oxido-reducción, reacciones en donde una molécula
sede electrones a otra segunda molécula. La molécula que sede electrones diremos que se ha oxidado y la molécula que
acepta los electrones cedidos por la primera sea reducido, por ende, estas reacciones de transferencia de electrones implican
siempre un par de oxido-reducción, siempre abra una molécula que se oxide (seda electrones) y necesaria mente otras
moléculas que las incorpore. Si pensamos en la combinación de esta noción de reacciones de oxido-reducción con los
criterios termodinámicos que vimos recién, también podemos decir que estas reacciones de oxido-reducción pueden ser
espontaneas y no espontaneas; es decir liberar energía o necesitar energía para producirse.

¿En qué condiciones estas reacciones de oxido-reducción son espontaneas y liberan energía?
Esto ocurre cuando, pensando en propiedades intrínsecas en las moléculas, en la capacidad que tiene cada una de las
moléculas de atraer electrones o de cederlos. Porque según sus características fisicoquímicas particulares una molécula tiene
una determinada capacidad, atracción por los electrones que puede ser diferente de la capacidad de atracción de una
molécula diferente. Y podemos cuantificar a esta magnitud que hemos denominado capacidad de atraer electrones y esa
magnitud en términos cuantitativos se denomina potencial de reducción de una molécula. Y si una molécula tiene mayor
potencial de reducción que otra, es decir mayor capacidad de atraer electrones, ese fenómeno de incorporar electrones de la
primera molécula será espontánea y liberar energía. Entonces las reacciones de oxido-reducción son espontaneas cuando los
electrones pasan de una molécula de menor potencial de reducción a una que tiene mayor potencial de reducción (una
mayor capacidad de atraer electrones). Y analizamos estas reacciones por que veremos que son centrales en los procesos de
producción de ATP por parte de las mitocondrias, de hecho estas preparaciones de reacciones de fracciones mitocondriales,
que les había comentado que se inició a partir de los años 40 y 50, fueron estas preparaciones los que le permitieron a los
bioquímicos determinar cuáles son los sustratos que necesitaban las mitocondrias para producir ATP y una de las primeras
cosas que observaron es que muchas de las reacciones químicas que acontecían en estas fracciones mitocondriales eran
reaccione de oxido-reducción. ¿Y cuáles son las moléculas que van a comenzar a oxidarse progresivamente? Son moléculas
originalmente contenidas en los alimentos (hidratos de carbono y lípidos).

Tenemos que analizar una restricción bioquímica dentro de las células, estos fenómenos de oxido-reducción cuando ocurren
catalizados por enzimas en el contexto celular implican un desafío para las enzimas, porque las estructuras proteicas de las
enzimas suelen no estar preparadas para ser buenos aceptores de electrones entre una molécula que se oxida para dárselos a
una molécula que se reduce. Esta dificultad de las estructuras peptídicas para participar de este fenómeno de
oxido-reducción, suele estar acompañada por una serie de moléculas auxiliares dentro de la célula que participan como
aceptores temporales de los electrones en las reacciones enzimáticas. Y de hecho ustedes ya han visto los nombres de estas
moléculas químicas que actúan como aceptores temporales de electrones pensando en la propia dificultad de estas enzimas
como aceptores. Por ejemplo, una de estas moléculas que participan como aceptores temporarios de denominan coenzimas
y suelen estar formadas por moléculas orgánicas derivadas en muchos casos de nucleótidos. Una coenzima principal que
participa de fenómenos de oxido-reducción de los hidratos de carbono y los lípidos que van a culminar con la síntesis de ATP
celular, es la molécula de discontinuidad de dinucleótido, que tal como lo hemos planteado aquí sí puede participar en
fenómenos de aceptación y ceder electrones podemos encontrarlo en la célula de dos formas: en su forma oxidada, es decir
cuando aún no ha incorporado a los electrones sino que ya los ha cedido y en una segunda forma cuando ha incorporado los
electrones que será la forma reducida. La forma oxidada de esta molécula en NAD+ es cuando este dinucleótido de adenina y
nicotinamida aún no ha incorporado electrones y tiene una carga eléctrica neta positiva, esa es la forma oxidada de esta
coenzima. Una molécula de NAD oxidad tiene la capacidad, tiene un potencial de reducción tal que le permite incorporar 2e-
a su estructura, puede participar de una reacción de oxido-reducción donde una molécula cede 2e- y son capturados
(almacenados) temporariamente esos 2e- por la molécula de NAD. Ahora ¿Cuántas cargas eléctricas tendrá la forma reducida
de este aceptor temporal de electrones, si originalmente tenía una carga eléctrica positiva? Al incorporar 2e- tendrá una
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carga eléctrica negativa, sin embargo, hay presente muchos protones cargas positivas (influyen en el pH celular), cationes de
hidrogeno (H+) en el medio, ese NAD que ahora una carga negativa ahora va a incorporar simplemente del ambiente celular
un hidrogeno y va a quedar como NADH. Entonces es que la diferencia de la forma oxidad y la reducida, desde el punto de
vista funcional la importancia no está dada por ese protón (H+) sino por esos 2e- que ha incorporado. El protón que incorpora
posteriormente es simplemente un fenómeno suplementario que contra resta la carga negativa dado que hay presente en el
medio celular protones.

Otra coenzima que también es frecuente en los fenómenos metabólicos y participa como aceptor temporario de electrones
es la molécula de FAD que un dinucleótido también en este casi de adenina y flavina. De manera análoga este dinucleótido
FAD puede existir en 2 formas oxidada y reducida, su forma oxidada es cuando aún no ha incorporado esos electrones y su
forma reducida es cuando ya los ha incorporado. Dado que la molécula de FAD en estado basal no tiene carga eléctrica (carga
eléctrica neutra) luego de la incorporación de los electrones, quedará con 2 cargas eléctricas positivas incorporará entonces 2
protones del medio ambiente y su forma reducida será FADH2. Nuevamente esos protones que ha incorporado no son los
que le va a dar la importancia funcional sino los 2e- que ha incorporado en las reaccione de oxido-reducción.

¿Cuál es la diferencia fundamental ente NAD+ y NADH?

La diferencia fundamental es que NADH tiene 2e- más que NAD+, desde el punto de vista fisiológico Esto que hemos descrito
hasta ahora nos va a permitir explicar la obtención de ATP y la regeneración de ATP por parte de las mitocondrias a través de
catabolismo de los hidratos de carbono.

Concepto de catabolismo: Nos referimos a catabolismo como una parten de metabolismo, el metabolismo de forma global es
todos los conjuntos de reacciones químicas que ocurren dentro de la célula.

La ruptura de enlaces covalentes la generación de sustancias más simples a partir de sustancias más complejas son las que
denominamos catabolismo. Dicho la ruptura de enlace covalentes presentes en los hidratos de carbono y en los lípidos que
consumimos como alimento, van a formar parte de estas reacciones catabólicas que van a conducir a la liberación progresiva
de energía por parte estos enlaces y que tenemos que entender como esa liberación de energía se va a reflejar en la
producción de ATP celular. Por ejemplo, nosotros utilizamos la energía obtenida de los enlaces covalentes de los azucares, de
los hidratos de carbono que los consumimos con la dieta, a lo largo de nuestro tubo digestivo los hidratos de carbono
complejo son rotos a monosacáridos que son incorporaos a nivel intestinal en el torrente sanguíneo y luego a partir del
torrente sanguíneo son incorporados en el interior de todas las células, a través usualmente facilitado este proceso por la
acción de la hormona insulina. ¿Qué ocurre entonces en el citosol de la célula una vez ingresa estos hidratos de carbonos
simples? Ocurre una serie de 3 procesos que van a culminar con la producción de ATP celular utilizando la energía covalente
de esos monosacáridos.
1- Proceso: La glucolisis que ocurrirá en el citoplasma
2- Proceso: El ciclo de Krebs
Ocurre en la mitocondria
3- Proceso: la cadena de transporte de electrones

Con respecto a la Glucolisis mencionaremos algunos aspectos centrales.

Como sabemos la glucolisis es una pequeña vía metabólica compuesta por 10 reacciones que implicara la ruptura de un
monosacárido de 6 carbonos en 2 moléculas de 3 carbonos, en este proceso nosotros tenemos que comprender que la
energía que contienes esos enlaces covalentes que fueron rotos serán almacenas temporariamente en otras moléculas
celulares y tenemos que ver ¿cuáles son los procesos de almacenamiento temporal de energía?
Los primeros pasos de la glucolisis implican en realidad procesos endergónicos, que gastan energía, dado que hay una
fosforilación doble del sustrato original consumiendo en este paso 2 moléculas de ATP. Pero desde el punto de vista
energético esas moléculas de ATP, esa energía invertida dado que se rompieron 2 ATP para fosforilar a estos sustratos serán
recuperado en momentos posteriores de esta misma vía metabólica. Nos concentraremos en los últimos pasos finales de la
glucolisis, en particular en que parte de la energía contenida en estos enlaces covalentes, va a ser almacenada en la forma de
2 coenzimas reducidas. ¿De dónde provienen entonces los electrones de las 2 moléculas de NADH que se han formado? Esas
2 moléculas de NADH ¿Cuántos electrones han incorporado en total? Cada una de estas moléculas incorporo 2 electrones.
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¿De dónde provenían esos electrones, donde estaban originalmente? En los enlaces covalentes que formaban a este
monosacárido, la energía de esos electrones entonces se ha desplazado, ahora está contenida en las moléculas de NADH que
han incorporado (se han reducido) de manera simultánea a la ruptura de esos enlaces. Entonces este proceso implico la
oxidación de las moléculas de monosacárido, la perdida de electrones por parte de esta molécula y la reducción (el
almacenamiento de estos electrones de alta energía en la coenzima) de las coenzimas.
Otro aspecto, es el hecho de que también en la glucolisis se produce ATP de una manera bastante directa. Hay enzimas que
pueden transferir directamente estos grupos fosfato, de estos intermediarios de 3 carbonos, a moléculas de ADP para formar
de manera directa ATP y esta forma enzimática de generación de ATP mediante la transferencia de un grupo fosfato de un
sustrato orgánico al ADP para formar ATP es un modo de producción de ATP, que se denomina fosforilación a nivel de
sustrato. Veremos q este modo desde el punto de vista bioquímico es muy ineficiente, en esa reacción hay mucha energía
que se disipa en forma de calor y que no queda almacenada finalmente en el enlace covalente entre el grupo fosfato y el ADP.
Veremos entonces que desde el punto de vista bioquímico las fosforilaciones a nivel del sustrato resultan una excepción, no
son muy frecuentes dentro del metabolismo; pero vamos a utilizarla por que veremos que durante mucho tiempo fue la
única hipótesis que tenían los bioquímicos respecto a cuál era el modo de producción de ATP dentro de las células. Durante
mucho tiempo se sospechó que la generación de ATP celular se debía a todas ha fosforilaciones a nivel de sustrato. ¿Qué
ocurre una vez que se generan como consecuencia de la glucolisis estas 2 moléculas de 3 carbonos denominada ácido
piruvato o pirúvicos?

Esas moléculas que aun contienen energía en sus enlaces covalentes son incorporadas hacia la matriz mitocondrial a través
de transportadores específicos. Y ocurre dentro de la matriz mitocondrial una primera reacción que es la reacción de
descarboxilación de ese piruvato, es decir esta molécula de 3 carbonos en la matriz mitocondrial, en una reacción enzimática
se va a escindir a romper un enlace covalente liberando a ese átomo de carbono en la forma de dióxido de carbono. Parte de
la energía liberada por la ruptura de este enlace covalente va a ser almacenar 2e- nuevamente en una coenzima, en donde
una molécula de NAD+ se transforma, se reduce a una molécula de NADH y se produce la unión de esta molécula restante
que ahora tiene 2 carbonos que llamamos grupo acetilo (C-C) la unión a una molécula orgánica que está presente en la matriz
mitocondrial y que denominamos Coenzima. Que también es nuevamente un derivado complejo de un nucleótido. ¿Cuál es
la lógica bioquímica de la incorporación de este grupo de 2 carbonos, esta unión covalente a un átomo de azufre que es el
átomo terminal de la Coenzima? Una de las razones que podemos dar que sea interpretado con respecto a la evolución de
esta reacción desde el punto de vista energético, es el hecho de que la energía contenida en este enlace covalente que se ha
roto es muy grande y la energía liberada por la ruptura de ese enlace no está contenida de manera completa en la coenzima
reducida, la energía restante se utiliza para formar un enlace covalente con la molécula de la Coenzima.

Dicho de otro modo, la formación de estos enlaces con la Coenzima es una forma de no disipar la energía que aun contenía
ese enlace entre los 2 carbonos que ha sido roto, el enlace entre el carbono y el átomo de azufre es un enlace que tiene
menor energía que el enlace originalmente que se había roto la molécula y es preservado (para evitar su disipación en forma
de calor) como un enlace temporario, y luego va a ser utilizado en posteriores reacciones. Es decir, no tenemos que pensar en
los enlaces en términos absolutos, hay enlaces que tienen mayor energía que otros, entonces romper un enlace de alta
energía para formar coenzimas reducidas y además formar un enlace de menor energía, es una forma de preservar esta
energía que ha quedado en este segundo enlace para evitar que se disipe en forma de calor. Y esa es la lógica de unir este
grupo acetilo a la Coenzima.

Esta primera reacción de descarboxilación para formar acido piruvato y Acetil-Coa, es una reacción que ocurre en la matriz
mitocondrial gracias a un complejo enzimático presente en la matriz mitocondrial que es el complejo del piruvato
deshidrogenasa. Tiene muchas particularidades este complejo enzimático piruvato deshidrogenasa, en primer lugar es
enorme dese el punto de vista macromolecular, está compuesto de más de 30 subunidades peptídicas que forman un
complejo de 3 clase de enzimas distintas, es mucho más grande que las enzimas monoméricas que cundo uno genera
preparaciones, fraccionamientos subcelular en donde uno puede purificar los componentes de la matriz mitocondrial y
observar esos componentes de la matriz mitocondrial al microscopio electrónico, uno puede observar las estructura de estos
complejos macromoleculares, en general no es frecuente que uno no observa a las proteína de manera directa en el
microscopio electrónico, suelen ser muchos más chicas que el poder de resolución del microscopio. Pero podemos observar
estos complejos formados por un gran número de polipéptidos. Existen mutaciones de algunos de los componentes
moleculares de este complejo que origina enfermedades metabólicas en humanos. Imaginemos cuales serían las
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consecuencias de que mutaciones en proteínas en alguna de estas 3 clases de esta enzima que forma parte de este complejo,
haga que este complejo disminuya su actividad, la consecuencia de estas mutaciones es que estos individuo tiene reducida
capacidad de extraer energía a partir de los hidratos de carbono por ejemplo; la dustristasa la generación de AcetliCoA a
partir del piruvato se encuentra disminuida en términos de velocidad, y de hecho uno de los síntomas característicos de estos
sujetos es la letargia, es la dificultad del movimiento, no pueden moverse y suelen tener síntomas musculares y neurológicos,
aquellos 2 tejidos que tienen mayor consumo de ATP. Digo entonces que estas mutaciones implican en los pacientes
disminución de la actividad de la piruvato hidrogenasa, por que pensemos en que ocurriría en aquellas mutaciones que
anularan la actividad de la piruvato hidrogenasa ¿Qué consecuencias esperaríamos? esas mutaciones son letales, no
permiten la supervivencia del individuo. De hecho, comprender el funcionamiento de este complejo enzimático central para
el metabolismo permitió dilucidar la etiología de una patología que hoy sabemos que es una deficiencia nutricional, estoy
hablando de la enfermedad beriberi. Es una enfermedad se debe a una deficiencia vitamínica, de la vitamina B1(tiamina),
como hoy sabemos que la tiamina o vitamina B1 es un cofactor necesario para que el piruvato deshidrogenasas funcione de
manera efectiva. ¿Qué les ocurría a los pacientes que tenían esta deficiencia nutricional? Síndrome de aletargamiento y sin
signos neurológicos y musculares. Y comprender cuál fue el mecanismo molecular por el cual los individuos que padecían de
beriberi la padecían. Reconocer que esto era una deficiencia nutricional cuando originalmente se pensaba que era un tipo de
bacteria o virus el que producía estos signo y síntomas permitió generar políticas públicas de suplementos de los alimentos,
especialmente con vitamina B1 para erradicar esta deficiencia nutricional. De hecho, beriberi en el lenguaje de los locales
significa “no puedo, no puedo” justamente reflejando este aletargamiento que tenía los individuos que tenían beriberi.
Comprender estos mecanismos moleculares nos permite diseñar estrategias de prevención primaria de la salud, saber con
qué suplementar los alimentos para evitar una epidemia des nutricional, es decir nos permite operar en ambas estrategias,
estrategias de cura y tratamiento, y también estrategias de prevención primaria de la salud. Recordemos que son justamente
estas estrategias las de prevención primaria de la salud, las que la organización mundial de la salud propone como estrategias
centrales para mejorar la salud como objetivo global. Dice la organización, no solo debemos invertir en medicina personaliza.

¿Cuál es la próxima reacción que ocurre con el Acetil CoA en el interior de la matriz mitocondrial?
La próxima reacción es una serie de reacciones denominadas ciclo de Krebs, ciclo de ácido cítrico o ciclo de los ácidos
tricarboxilicos. Nosotros esperamos la ruptura progresiva de los enlaces covalentes que están contenidos en el grupo acetilo
como los pasos posteriores para completar la liberación de energía del metabolismo. Y esta idea de ruptura progresiva de los
enlaces covalentes choca con la primera reacción que implica la unión de estos 2 carbonos a una molécula de 4 carbonos el
oxalacetato para formar una molécula de 6 carbonos, que es el ácido cítrico. Entonces lo anti intuitivo es que la primera
reacción del ciclo de Krebs forma moléculas más grandes, en vez de romper progresivamente los enlaces. Desde el punto de
vista bioquímico esto se puede explicar porque estos intermediarios del ciclo de Krebs son, a pesar de tener un mayor
número de carbonos, desde el punto de vista de reacciones enzimáticas van a ocurrir, son más factibles de sus enlaces
covalentes de romperse a través de reacciones enzimáticas. Es decir, estas moléculas que se generan tienen un mayor grado
de facilidad en términos de reacciones bioquímicas de ser sustratos de enzimas que rompan sus enlaces covalentes, desde el
punto de vista bioquímico la ruptura de los enlaces en el formato del grupo acetilo unido al acetilCoA tiene un mayor grado
de dificultad enzimática. La producción de moléculas de mayor numero de carbonos pero que finalmente van a permitir la
ruptura progresiva de estos enlaces covalentes liberando a los 2 carbonos en forma de dióxido de carbono, estas moléculas
de dióxido de carbono no polares pueden difundir de manera simple a través de las membranas mitocondriales y de la
membrana plasmática y serán seguramente incorporadas a una molécula de hemoglobina que pase por un vaso sanguíneo
cercano y luego se va al sistema pulmonar donde se produzca el cambio de gases. Pero desde el punto de vista energético
nuevamente la ruptura de esos enlaces covalentes implicara la liberación de electrones de alta energía que serán capturados
por las coenzimas generando NADH a partir de NAD y FADH2 a partir de FAD y que estas series de reacciones recibe el
nombre de circulo porque el último producto vuelve a ser la molécula de 4 carbonos que participo en la primera reacción.
Mas haya entonces de que las secuencias de estas reacciones permitan la ruptura de los enlaces covalentes que estaban
comprimidos originalmente en la molécula de acetato y que originalmente si seguimos el camino hacia atrás de la molécula
del monosacáridos van a analizas, que muchos intermediarios del ciclo de Krebs pueden ser utilizados como sustratos para
reacciones anabólicas. Por ejemplo, una de estas moléculas carbonadas en vez de seguir en el ciclo de Krebs puede ser
utilizadas para generar (producir) algunos aminoácidos. Por eso el ciclo de Krebs es un núcleo del metabolismo, contiene un
conjunto de moléculas que puede el origen de unas ciertas reacciones de anabolismo o el destino de catabolismo, del mismo
modo la degradación de aminoácidos puede generar componentes que ingresan al ciclo de Krebs y que contribuyan a la
producción de energía. Entonces lo que tenemos que pensar a medida que el ciclo de Krebs progresa a medida que estas
60
reacciones ocurren comienzan a acumularse en la matriz mitocondrial, coenzimas reducidas comienzan a acumularse NADH y
comienza a acumularse FADH2 allí está contenido la energía de electrones de alta energía que originalmente estaban en los
enlaces covalentes de los alimentos. Del mismo modo el ciclo de Krebs nos permite comprender como se genera energía a
partir de los lípidos, a partir de grasas y aceites cuando lo consumos en los alimentos.

Ustedes saben que las grasas y aceites en general están enriquecidas de moléculas triacilgliceroles cuya ruptura metabólica
genera ácidos grasos. Y los ácidos grasos también son una fuente para obtener AcetilCoA dentro de la matriz mitocondrial, es
decir el AcetilCoA no solo será producto del piruvato que es descarboxilado en el interior de la matriz mitocondrial y que
proviene de la glucólisis, sino que también puede provenir de la ruptura de ácidos grasos en el interior de la matriz
mitocondrial. Esta serie de 4 reacciones químicas que permiten obtener moléculas de AcetilCoA a partir de las moléculas de
ácidos grasos recibe el nombre de β-oxidación. Pensemos que los ácidos grasos está compuesto por una cadena usualmente
larga de carbonos por ej. 18 o 24 carbonos pueden tener las moléculas de ácidos grasos, en cada una de estas serie de 4
reacciones él ácido graso se une a la coenzima y a lo largo de las 4 reacciones se produce una ruptura del ácido graso
generando solo la unión de solo 2 carbonos de la molécula del ácido graso a la Coenzima es decir se genera en cada serie de 4
reacciones, una molécula de AcetilCoA; que implicara entonces el acortamiento en 2 carbonos de la molécula del ácido graso.

¿Cuántas moléculas de AcetilCoA puede generar, en una serie de reacciones de β-oxidación un ácido graso de 18 átomos de
carbono? una molécula de ácido graso de 18 átomos de carbono puede generar, luego de diversas reacciones de β-oxidación
número total de 9 moléculas de AcetilCoA. Por ende, en términos metabólicos los ácidos grasos son mucho más energéticos
que los hidratos de carbono, se pueden esperar muchas más moléculas de AcetilCoA por cada molécula de ácido graso que el
número de moléculas de AcetilCoA que se puede generar por cada mono sacárido. Y por ende las grasas suelen ser el
mecanismo preferido de almacenamiento energético de la endotérmica. No solo son más energético por unidad de
moléculas sino que desde el punto de vista del espacio que ocupa, los lípidos se almacenan de una manera mucho más
eficiente porque al ser no polares, no incorporan agua a las moléculas, los hidratos de carbono por ej. el glucógeno se hidrata
en el citosol de la célula y ocupa un menor volumen , ese volumen es mucho menor que el volumen ocupado por las
moléculas de ácidos grasos en el interior del citosol; y es una segunda razón por cual las grasas son el mecanismo preferido
del almacenamiento energético dentro de la célula a largo plazo. Entonces generar moléculas de AcetilCoA, generadas por los
ácidos grasos del mismo modo de las moléculas de AcetilCoA generadas por el piruvato que provienen de los hidratos de
carbono, ambos conjuntos van a seguir las reacciones del ciclo de Krebs y por ende van a contribuir al almacenamiento de
coenzimas reducidas de NADH y FADH2 en la matriz mitocondrial.
Llegado a este punto: Tenemos que hacer la siguiente vinculación → ¿Qué relación existe entre la generación de las
moléculas NADH y FADH2 (estos procesos de acumulación de coenzimas reducidas) con el fenómeno de producción de ATP?
¿Qué relación hay entre esta oxidación y la fosforilación que necesitamos para producir APT?
Recordemos la hipótesis primaria que tenían los bioquímicos en aquel momento era que las reacciones de producción de ATP
eran fosforilaciones a nivel de sustrato, es decir la obtención de un fosfato de una molécula orgánica directamente transferida
a una molécula de ADP. Pero no se encontraba para los años 60 ni cual era ese intermediario fosfatado a partir del cual se iba
a obtener el fosfato ni cuál era la enzima que iba a producir esta reacción. A demás en esta hipótesis que no cerraba, otro
aspecto que no se podía explicar era ¿Por qué eran necesarias las membranas mitocondriales para producir ATP? Algo que
era observado en los experimentos solo cuando estaban las membranas mitocondriales se producía ATP en las fracciones
mitocondriales, pero no se podía explicar por qué las membranas eran necesarias. Aun cuando se extrajera todas las
proteínas de las membranas y las proteínas purificadas de las membranas se pusieran en un tubo, esas proteínas totales
purificadas no lograban producir el ATP, que se producía cuando estaban las membranas mitocondriales completas. Un
científico Ingles en los años 60 elaboro una hipótesis que permitió, luego ser corroborada experimentalmente que cambio el
modo de pensar sobre estas reacciones, luego permitió explicar esta relación existente de cómo se puede vincular en las
células, la energía almacenada en las coenzimas reducidas respecto de los fenómenos de fosforilación. Y este científico fue
Peter Mitchell que en el año 1961 publica un trabajo de investigación en la revista Science, en donde propone un método
alternativo que va a denominarse la teoría quimiosmótica. En esta teoría quimiosmótica que es el mecanismo que ya han
estudiado en el CBC, de producción de energía, implica que no hay una relación directa entre la oxidación y la fosforilación,
sino que hay un espacio intermedio fisicoquímico. La energía contenida en estos electrones de alta energía va a utilizarse
para generar un gradiente electroquímico, la acumulación de un ion en uno de los lados de la membrana y va a ser la
disipación de ese gradiente lo que libera la energía necesaria para la producción de ATP. La existencia de este intermediario,
que no hay una transferencia directa desde los electrones al ATP, sino que la energía de los electrones se utiliza para generar
61
un gradiente y luego la disipación del gradiente es directamente acoplada al fenómeno de fosforilación es el modelo
propuesto por Mitchell. Que fue corroborado en parte por el mismo y otros científicos años después.

Le preguntaba Mitchell ¿Conoces alguna enzima que pueda producir ATP gracias a la disipación de un gradiente
electroquímico? Sabemos que estas coenzimas reducidas que se acumulan en la matriz mitocondrial van a transferir sus
electrones a una serie de complejos proteicos que están en la membrana mitocondrial interna y que se denominan complejos
respiratorios. Cada uno de los complejos respiratorios está formado por más de 40 polipéptidos cada uno de estos complejos
respiratorios. ¿Cómo se produce estos fenómenos de oxido-reducción o de cadena de transporte de electrones?

Se producen de manera espontánea porque cada uno de estos complejos respiratorios tienen progresivamente un mayor
potencial de reducción respecto del complejo anterior, de modo tal que esas reacciones de pasaje de electrones a medida
que son crecientes los potenciales de reducción de cada uno de los complejos se producen de manera espontánea liberando
energía. ¿Qué ocurre con esa energía libera por esos procesos de oxido-reducción que es utilizada para hacer cambios
conformacionales? En estos complejos respiratorios que les permiten bombear protones en contra de su gradiente de
concentración, es decir la energía de la oxido-reducción es utilizada en bombear protones y generar un gradiente, que será
más concentrado en el espacio intermembrana y menos concentrado en la matiz; es decir genera una diferencia de potencial
en la matriz, más negativa en la matriz y más positiva en el espacio intermembrana. Esa polaridad que solo va a producirse
cuando esté funcionando la cadena de transporte de electrones, es la que habíamos visto la que favorecía la incorporación de
proteínas en los procesos de transporte a través de la matriz mitocondrial. ¿No era que proteínas por su estructura peptídica
eran malos aceptores temporarios de electrones, como es posible entonces que estos complejos respiratorios
fundamentalmente peptídicos participen de estas reacciones de oxido-reducción?
Muchas de las proteínas que están presentes, que forman parte del complejo respiratorio poseen estructuras adicionales no
peptídicas que le permiten funcionar como receptores temporarios de electrones. Por ejemplo, muchas proteínas contienen
citocromos, los citocromos no son otra cosa que un grupo hemo, una molécula orgánica que posee en su interior un átomo
de hierro que puede actuar como el aceptor temporal de electrones metidos en una estructura peptídica. Otra de las
proteínas muy frecuentes también en los complejos respiratorios es la ferro sulfuro proteínas que contiene en este caso
átomos de azufre y de hierro que también suelen ser aceptores temporales de electrones, otras moléculas adicionales
orgánicas pequeñas como la ubiquinona permiten también actuar como moléculas que transfieren temporariamente
electrones en estas reacciones de oxido-reducción. Y como les decía la secuencia en las que los electrones van a ir
recorriendo desde las coenzimas reducidas a los complejos respiratorios se da en un orden que sigue el potencial de
reducción creciente, siendo que todas estas reacciones sean espontaneas y liberación de energía. ¿Cuál es último aceptor de
electrones? Es aquella molécula que posee mayor potencial de reducción de todos, el oxígeno molecular, el oxígeno actúa
entonces como el ultimo aceptor de electrones que estaban en las coenzimas reducidas y que originalmente estaban en los
enlaces covalentes de los lípidos y monosacáridos que comenzaron a oxidarse, porque es el que tiene mayor potencial de
reducción. Cuando el oxígeno se reduce con 4 electrones produce 2 moléculas de agua, por ende, necesitamos para que la
cadena de transporte de electrones funcione de manera continua necesitamos un aporte continuo de oxígeno, porque el
oxígeno está constantemente aceptando los electrones y transformándose en moléculas de agua y eso explica entonces el
fenómeno vital del intercambio de gases. Necesitamos el intercambio de gases hacia el último aceptor de electrones de la
cadena respiratoria y necesitamos liberar el dióxido de carbono que surge de las reacciones de descarboxilación de las
moléculas durante el mismo proceso de oxidación. Notemos entonces que comprender la lógica de la cadena respiratoria nos
permite comprender, por ejemplo, la acción de ciertos venenos respiratorios que suelen ser tóxicos y causar la muerte de
mamíferos y a los seres humanos en particular. por ejemplo, el cianuro como veneno porque inhibe de manera irreversible al
complejo respiratorio 4 y por ende también bloquea el transporte de electrones, dado que todos los complejos respiratoria
previos quedan saturados de electrones sin poder entregarle al último aceptor los electrones y esto en ultima estancia
detendrá el bombeo de protones y por ende la síntesis de ATP. Entonces el bombeo de protones en contra el gradiente de
concentración, genera una forma de acumulación de energía potencial que Mitchell demostró, que esta energía potencial
generada por la acumulación de protones en el espacio intermembrana, pueden liberar energía al disiparse a través de una
proteína transmembrana la ATP sintetasa, que es finalmente la enzima que explica como la disipación de ese gradiente a
través de esta enzima, es utilizada cuando se disipan los protones en el gradiente de protones a través del poro generado por
la ATP sintetasa, se produce un cambio conformacional en esa enzima que permite que esa enzima haga chocar una molécula
de ADP y a una molécula de fosfato permitiendo la generación de enlaces covalentes de modo tal que la energía contenida en
este gradiente va a quedar almacenada en los enlaces covalentes de las moléculas de ATP generada por la acción de la ATP
62
sintetasa. De este modo la teoría quimiosmótica de Mitchell permite explicar la producción de ATP generada por la
producción de gradiente temporario de protones.

Fosforilación oxidativa es que comprender este camino fisiológico no solo nos permite entender el mecanismo de producción
de ATP y cómo funcionan los venenos respiratorios. Sino que nos permite explicar la acción de ciertas moléculas, por
ejemplo, los desacoplantes de la cadena respiratoria de transportes de electrones; por ejemplo, una de estas moléculas
desacoplantes es el di nitrógeno.

Cuando uno dice que las mitocondrias están acopladas, lo que esta acoplada es la transferencia de electrones a través de los
complejos respiratorios respecto a la formación de un gradiente electroquímico que luego va a ser utilizado para formar ATP.
Pero notemos que ese gradiente solo puede formarse, gracias a una de las propiedades de su impermeabilidad. Gracias que
es impermeable a lociones, los protones que son bombeados pueden acumularse para formar un gradiente y solo pasar a
través de la ATP sintetasa. Pero hay moléculas como el dinitrofenol que produce poros temporarios, en la membrana
mitocondrial interna entonces el dinitrofenol cuando es administrado a las células y genera poros en la membrana
mitocondrial interna permitirá que los electrones circulen por la cadena respiratoria de electrones que existen reacciones de
oxido-reducción pero impedirá que se forme el gradiente de protones, dado que cuando los protones son bombeados
volverán a favor del gradiente de concentración a través de los poros generados por el dinitrofenol , o sea ¿habrá producción
de ATP bajo condiciones de desacoplamiento? No porque el ATP puede producirse por la disipación de ese gradiente a través
de la ATP sintetasa, sin embargo ¿funciona la cadena de transporte de electrones? Si, entonces el mecanismo es diferente con
respecto a la cadena respiratoria. Es interesante notar que cuando las membranas están desacopladas esa energía que no
logra ser almacenada en forma de ATP se disipa en forma de calor y las mitocondrias desacopladas aumentan su
temperatura. Este mecanismo es utilizado bajo unas condiciones fisiológicas por ejemplo el tejido que conocemos como
grasa parda, el tejido adiposo parda puede producir bajo ciertas condiciones proteínas que desacoplan a las mitocondrias de
ese tejido que permeabiliza la membrana de ese tejido. En consecuencia, cuando el tejido graso parda esta desacoplando a
sus mitocondrias ese tejido se vuelve tejido que produce calor, que produce termogénesis. Grasa parda por el alto contenido
de las mitocondrias de los adipocitos y el alto contenido de mitocondrias presenta un alto contenido de citocromos y los
citocromos suelen estar coloreados y eso es lo que le da el color a la grasa parda.
….QUEDO PENDIENTE PEROXISOMAS…

63
Seminario 9

INTEGRACION DE CELULAS EN TEJIDOS

Primera parte de la materia: centrados en comprender
● Como desde el genoma las células controlan muchas de sus actividades centrales para su mantenimiento
● Como las células replicaban su genoma y controlaban la progresión de ciclo celular
● Cuáles eran los mecanismos que regulaban la expresión diferencial de los genes
Segunda parte de la materia: procesos intrínsecos a la fisiología celular
● Como hacen las células para determinar la localización final de sus proteínas (sintetizadas inicialmente en el citosol )
● Cuales son las estructuras y mecanismos que permiten el reordenamiento de su esqueleto celular
Tercera parte de la materia (sem 9 para adelante):
Como las células se relacionan con otras células en el contexto de la multicelularidad
Mecanismo que hace a la multicelularidad:
● Como las células se unen entre si y a la matriz extracelular. Esas interacciones están bajo la regulación de las células y
permiten fenómenos de movilidad celular y formación de estructuras compactas (ej: epitelio)
Propiedades de nuestro organismo: deriva propiedades complejas que son emergentes a la interacción de las células entre si
y a un conjunto de sustancias que secretan las células denominadas matriz extracelular, esas propiedades no se pueden
encontrar en cada célula aislada, las propiedades del hueso, de los cartílagos, de los músculos no pueden ser explicada
únicamente analizando los componentes de la célula, si no entendiendo las interacciones de las células entre si y con la
matriz extracelular que la forma
Para entender las interacciones se va estudiar dos tipos de tejidos:
1. Tejidos epiteliales: se caracteriza: Por tener una alta celularidad, las células están muy juntas entre si, escaza
proporción de matriz extracelular entre ella (queda reducida a un sector llamado lamina basal, que es la base del
epitelio). El extremo apical del epitelio da hacia una luz y el otro extremo basal donde el epitelio está anclado a la
lámina basal. Los epitelios al estar expuestos a las superficies del cuerpo o a la luz de vasos o tubos del interior del
cuerpo, están expuestos a tenciones mecánicas y las uniones entre las células van a permitir responder ante estas
tensiones. Otra de las características es que los epitelios no están irrigados, si no que el O2 y los nutrientes
necesarios para la supervivencia celular se difunden x la lámina basal (eso explica porque los epitelios suelen ser
delgados dado que la capacidad difusiva de las sustancias es limitada)
2. Tejidos conectivos: ej: tejido conectivo no especializado: se encuentra en las partes subyacentes a la epidermis, la
dermis tiene tej. Con. No especializado o el TCNE (tejido conectivo no especializado) que subyace al epitelio
intestinal. Hay otro TCNE que va dar los tejidos hueso, de los cartílagos, en estos tejidos la celularidad es más baja,
los contactos de célula a célula son más bajos, pero son más frecuentes los anclajes entre las células y el
componente de la matriz extracelular. estas células tienen más facilidad de migrar atreves del medio que confiere
la matriz extracelular, tan abundante en estos tejidos
▪ Aclaración: Cuando hablamos de unión celulares: no nos referimos únicamente a la unión de 2 células entre si, esa
es una unión célula a célula, un tipo de unión celular, el otro tipo de unión, es cuando las células se unen a
componentes de la matriz extracelular
Descripción detallada de los distintos tipos de unión celular:
4 tipos de criterios que se van aplicar a un primer tipo de unión entre células o entre células y la matriz extracelular que
vamos a denominar Uniones de Anclaje.
Uniones de anclaje: se denomina así porque ancla a componente del citoesqueleto del interior de las células con otras
células o con la matriz extracelular
Criterios:
¿Cuáles son los componentes de citoesqueleto, las dos subsistemas del citoesqueleto que participan de las uniones de
anclaje?
1- Son los filamentos de actina, los microfilamentos o
2- los filamentos intermedios
Aquello a lo que se va anclar esa célula
3- por un lado se puede anclar a otra célula o
4- se puede anclar a un componente de la matriz extracelular
64
Existe un componente estructural que está en la superficie de anclar
Del lado intracelular son los filamentos del citoesqueleto lo que van a permitir la unión intracelular
Moléculas de superficie que van actuar como moléculas de adhesión entre células y la matriz extracelular, una de las
moléculas que participan son proteínas de las familias de las cadherina , que se pueden clasificar según distintos criterios, por
un lados son glicoproteínas de membrana (punto de vista estructural) y por otro lado
son moléculas de adhesión (punto de vista funcional)
cadherina: propiedades estructurales:
son todas proteínas transmembrana que en su dominio extracelular, es el domino N terminal poseen una serie de dominios
proteicos llamados dominios cadherina, porque poseen una capacidad adherente con otras moléculas de cadherina
dependiente de cationes calcio. El tipo de uniones que se producen entre estas moléculas ocurre en las regiones
extracelulares, es decir las dos moléculas de cadherina genéticamente interactúan entre si van estar dispuestas en
membranas plasmáticas de células adyacentes y podrán contactarse ente si formando una unión débil pero efectivas, cuando
haya uniones de calcio en el medio extracelular.
Las primeras cadhrinas: son un grupo denominadas cadherinas clásicas que son: (se llaman así por donde se las encontró)
E-cadherina (encontrada en células epiteliales), N-cadherina (encontradas en neuronas, células musculares) y p-cadherina
(encontradas en la placenta).
Las uniones entre cadherinas son estrictamente homofílicas, esto significa que son solo cadherinas exactamente del mismo
subtipo las que pueden formar uniones adherentes entre si, cadherinas con distinto tipo por ej: una cadherina-N con un
subtipo celular puede interactuar con una cadherina-E. Esta unión homofílicas cumplen funciones esenciales durante la
morfogénesis embrionaria porque permite que un reconocimiento especifico entre distintos tipos celulares por ej: en el
proceso de neurulacion primaria que ocurre entre la 3ra y la 4ta semana de desarrollo y en este proceso se produce una
evaginación del ectodermo para generar el tubo neural que finalmente se va desprender de la lámina epitelial que constituye
este ectodermo. Existe un proceso de la regulación de la expresión génica en donde las células del ectodermo originalmente
todas expresando E-cadherina un subgrupo de esas células, aquellas que se van a trasformar en el tubo neural, disminuyen su
expresión de E-caderina y comienzan a expresar N-cadherina de modo tal de tener mayor afinidad de unión entre ellas que
respecto a las células que conformaban originalmente la lámina epitelial del ectodermo, esas uniones diferenciales permiten
en parte explicar la separación de estos grupos celulares, por otro lado un subgrupo de células, las que después serán
llamadas células de la cresta neural expresan a su vez un tipo diferente de cadhrinas distinto de las e-cadhrinas y
n-cadhrinas, que les permiten despegarse de la lámina epitelial, como del tubo neural primario, no son solo los subtipos
específicos de cadhrina los que median esta afinidad homofilica entre los tipos celulares, sino también los niveles de
expresión los que permiten un adhesión diferencial, es decir aun dentro de las células que expresen e-cadherinas aquellas
que expresen un nivel bajos de e-cadherinas tenderán a unirse entre si y las que expresen un nivel alto de e-cadherinas
también van a unirse entre si , es una regulación que no solo está dado por el subtipo sino también del número de moléculas
de cadherinas expresadas en la superficie de la célula. Las moléculas de cadherina expresadas por las células de la cresta
neural, la cadherina 7 suelen expresarse en niveles suficientemente bajos como para permitir la unión y desunión entre
células de la creta neural, que suelen migrar relativamente cercanas, pero no de manera compacta. Estos niveles bajos de
cadherina 7 permiten uniones transitorias entre las células que perimita migrar de, manera cercana pero no compacta.
Usualmente la cadherinas forman parte del primer tipo de unión entre células, que es la unión adherente (primer tipo de
uniones anclaje)
Uniones adherentes:
Están mediadas por moléculas de cadherina, que permiten la unión célula a célula y que anclan desde el lado ultracelular a
las células mediante los filamentos de actina, estas uniones adherentes son muy frecuentes en las células epiteliales (mucho
contacto célula a célula), en cambio son poco frecuentes y transitorias en las células mesenquimaticas, en aquellas celulas
que están en tej. De tipo conectivo, que tienen abundancia de matriz extracelular. Hay una zona específica usualmente en los
epitelios que es rica en cadherinas, que no está uniformemente distribuidas a lo largo de las paredes laterales de las células y
se llama zona adherens. Las uniones de cadherina son débiles pero la fortaleza de las uniones adhrentes se debe a la
suposición de muchas uniones entre cadherinas que se une de manera lateral y a este principio de generar fuerzas de
adhesión sumando, en simultaneidad un enorme número de uniones, cada una de ellas débiles es lo que conocemos como
principio del velcro (si uno ve como se produce la unión del velcro, la unión implica la unión de múltiples uniones de una
superficie con la otra cada una de esas uniones son débiles, pero la fuerza total de la unión se da por la sumatoria de
múltiples fuerzas débiles, algo así ocurre con la unión de cas cadherinas)
¿Cómo ocurre el anclaje de las fibras del citoesqueleto actina a las moléculas de cadherina?
65
En un sector de la membrana plasmática de una célula epitelial con una molécula de cadherina clásica con sus dominios
cadherina por el lado extracelular y su dominio citoplasmático que está anclado a un filamento de actina mediante proteínas
asesorías, pertenecientes a la familia cateninas por ej: alfa catenina y beta catenina son moléculas proteicas que permiten
vincular, al sector intracelular cadherinas con los filamentos de actina, usualmente estos filamentos de actina pueden
responder de manera dinámica a las tensiones a las que esta expuesta el epitelio por ej: se demostrado experimentalmente si
se aumenta la fuerza de tensión entre 2 células epiteliales unidas por cadherina, esta fuerza de tensión es trasmitida
intracelularmente a las moléculas de catenina que pueden desplegarse como respuesta a esa tensión y exponer ciertos
dominios proteicos que impliquen el reclutamiento de proteínas adicionales, que permiten finalmente aumentar el número
de filamentos de actina que están anclando en cada una de esas uniones, de modo tal que incrementar la tensión intracelular
que resista a la atracción originalmente provocada, es decir que estas uniones desde el punto de vista conceptual, pueden
cesar los niveles de tensión a los que está sometido un epitelio y generar una respuesta intracelular para contrarrestar esos
niveles de tensión, estos filamentos de actina que se ancla intracelularmente a las moléculas de catenina se encuentran
organizados de modo tal de deformar haces contráctiles, estos haces contráctiles se formaban por filamentos de actina
dispuestos de modo anti paralelo, es decir con los extremos + y – en disposición opuesta unos con otros y entre los cuales
podían unirse moléculas de miosina2 no muscular, las moléculas de miosina intercaladas entre 2 filamentos anti paralelos de
actina pueden generar el desplazamiento de un filamento entre otro y generar contracción local. Es decir que este anillo
intracelular de filamentos de actina que están anclados a las cadherinas es un anillo con capacidad contráctil y la contracción
localizada de este anillo intracelular, permite al estar las células de un epitelio ancladas entre si mediante sus esqueletos de
actinas, fomentar cambios morfológicos en las láminas epitelio, que también son utilizados en lo proceso morfogénesis
embrionaria por ejemplo el corazón, la glándulas y el túbulo neural se forman mediante la formación de túbulos epiteliales a
partir de láminas epiteliales, este cambio morfológico esta producido gracias a la acción conjunta, a coordinación de los
citoesqueletos de actina de las células que forman parte de la lámina epitelial. La producción de la evaginación, esa
provocada porque algunas células de este epitelio contraen su anillo contráctil induciendo el cambio morfológico del reto de
la lámina, si los citoesqueletos de actina no estuviera conectados entre si, cada célula podría contraerse o no pero no
alteraría la morfología de la lámina epitelial en su conjunto (las células que son bisagras en el caso de la evaginación son
aquellas donde se producen esta contracción inicial). Este fenómeno se superpone con otros procesos moleculares como la
regulación diferencial del tipo de cadherinas que van a expresar cada uno de los epitelios, para lograr por ej: el
desprendimiento del tubo neural
2do tipo de anclaje:
Los desmosomas: Son uniones intercelulares que va a conectar a las células entre si, mediante el citoesqueleto de filamentos
intermedios (fibras de mayor resistencia a la atracción mecánica). Los desmosomas son abundantes en células que están
sometidas a grandes atracciones mecánicas, como son las células epiteliales, también las células musculares como por ej:
cardiomicitos, células del musculo cardiaco, están sometidas a tensiones, están vinculadas entre si mediante desmosomas
(límites entre células musculare card. son: discos intercalares), estos se observan en ME, como puntos electro densos (en
forma de discos) en los límites de adyacencia entre dos células (epiteliales o musculares). El subtipo de proteína que
conforma a los filamentos de intermedios, difieren de un tipo de célula a otra, en células epiteliales los filamentos
intermedios son filamentos de la proteína queratina, en células musculares son filamentos de proteínas desmina.
Estructuralmente son: uniones con forma de disco, no se encuentran formando un anillo alrededor de las células, sino que se
encuentran localizadas en forma de botones, en la superficie que media las dos células, se asemejan a la familia de
cadherinas, en este caso son cadherinas no clásicas, que son las moléculas de adhesión de los desmosomas, que mediante
proteínas accesorias anclan intracelularmente con los filamentos intermedios
Adhesión mediante como los componentes del citoesqueleto se anclan a componentes de la matriz extracelular:
Las familias que actúan como receptores del componente de la matriz extracelular son las moléculas de integrinas.
Integrinas: son diversas, en humanos tenemos más de 24 clases de integrinas, cada una está formada por un heterodimeros
por dos subunidades diferente de glicoproteínas transmembrana, que tiene una región pequeña en su extremo
carboxilo-terminal, y sus dominios de unión con la matriz extracelular miran a hacia la cara extracelular y concentran los
dominios globulares, estas 24 integrinas distintas surge de combinaciones entre 18 cadenas integrinas alfa y 8 clases de
cadenas betas ambas codificadas en el genoma, no todas las combinaciones entre estas dos cadenas existen en nuestros
tejidos, la subunidad de integrinas difieren en cuál es el componente especifico de la matriz extracelular a la que se van a unir
y cuál es el tipo celular que lo expresa, ej: el subtipo alfa5-beta1 se une a una glicoproteína de la matriz extracelular que es la
fibronectina, que puede ser expresado por múltiples tipos celulares, pero hay otro tipo celulares como alfa7-beta1 que tienen
una distribución tisular más restringida, son las expresadas por células musculares, permiten el anclaje de esas células
66
musculares a un componente de la matriz extracelular llamada proteína laminina. Las uniones de las integrinas con
componentes de la matriz extracelular son dependientes de calcio o de magnesio, es decir no tienen propiedades de
adhesiones constante sino que van a depender de la concentración de la concentración iónica en el medio extracelular.
En el caso de las adhesiones focales: los filamentos del citoesqueleto que se usa son los filamentos de actina. También existes
proteínas accesorias en este caso proteínas de la familia alinas que unen a los sectores citoplasmático de las integrinas en
particular de la cadena beta con las fibras del citoesqueleto de actina. Estas adhesiones focales, no son frecuentes en células
epiteliales, sino en células mesenquimaticas rodeadas por abundante matriz extracelular, por ej: fibroblasto que son
prototipos de células del tej. Conectivos que migran dentro de la matriz extracelular, suelen utilizar en el proceso de
migración las uniones focales. Para que una célula pueda migrar tiene que existir un reordenamiento de su sistema de
citoesqueleto y habrá polimerización de filamentos de actina en forme avance, que le permita a la célula generar la milipolio
que le da la protección hacia el frente de avance, una célula no puede migrar sino tiene un punto de anclaje sobre el cual se
produzca la protección hacia adelante, ya que sin el anclaje la célula rueda en su mismo sitio, ese anclaje lo constituye las
uniones focales que están formadas por moléculas de integrina unidas a componentes de la matriz extracelular como la
fibronectina. Desde el punto de vista intracelular estos filamentos de actinas suele ser filamentos contráctiles y al producirse
la contracción, ese filamento contráctil que está anclado en el exterior, permite la retracción del polo posterior de la célula,
permitiendo: la producción del frente anterior, el anclaje al sustrato y la retracción del frente del polo posterior (estos tres
procesos son los que permiten la liberación celular). Las moléculas de integrina pueden mediar la interacción del anclaje con
filamentos intermedios, ese tipo de unión se produce de manera exclusiva en las células basales del epitelio, porque van a
permitir el anclaje de las células epiteliales a la membrana basal, integrinas como alfa6-beta4 permite a los filamentos
intermedio, en este caso queratina anclar con un componente de la membrana basal que es la laminina, esta unión se llama
m-desmosomas (ancla a una célula epitelial basal con un componente de la matriz extracelular, membrana basal).En personas
que tienen los filamentos de actina frágil por tensiones en el epitelio desgarran a la célula epitelial de la membrana basal, las
células por encima y que se despegaron de la membrana basal, por ausencia de O2 y nutrientes entran en necrosis o muerte
celular programada, por tracciones en el epitelio en esos sitios se desgarra la membrana basal y ese tejido muere se forman
ampollas, que terminan necrosando al teji. Epitelial que esta encima de la ruptura de los hemidesmosomas.
2do tipo de unión entre células:
uniones estrechas: (uniones oclusivas): están restringidas a células epiteliales, le otorgan al epitelio la propiedad de formar
barreras de permeabilidad, ej: en células del epitelio simple que tapizan el interior de intestino delgado, en la luz de este
intestino hay moléculas en proceso de digestión que no entran directamente al interior del cuerpo, sino que solo ingresa por
las células absortivas, lo que evita que se filtren las moléculas es un tipo de unión flechas que están mediadas por un
conjuntos de proteínas que se dispone formando hebras en el interior de las membranas de cada una de las células
adyacentes, estas proteínas que van a restringir esta difusión son proteínas de las familias de claudinas y ocludinas, que
tienen muchos past transmembrana y tiene afinidad entre ellas cuando se yuxtaponen un conjunto de moléculas claudinas y
ocludinas en una de las membranas con proteínas dispuestas del mismo modo en la membrana adyacente, esta secuencia de
ubicaciones yuxtapuestas de una proteína al lado de otra, es lo que forma las hebras formada de puntos donde cada punto es
la ubicación de una proteína transmembrana de la familia de las claudinas o ocludinas. En los epitelios estas uniones oclusivas
no ocupan la totalidad de las membranas laterales de las células epiteliales, sino que se restrinja a una porción muy apical de
la zona lateral de la células y esa zona donde están concentradas las uniones oclusivas es lo que se denomina zona occludens
(por debajo esta la zona adherens), los dominios intracelulares de esta proteína interactúan con una serie de proteínas (ZO)
de unión a la zona occludens; las Z01, ZO2 y ZO3 son proteínas transferentes que se unen a los dominios intracelulares de las
claudinas o ocludinas y que tienen múltiples dominios que permiten la unión de otros componentes intracelulares, que son
organizados sobre la superficie bidimensional de la membrana donde estén presentes las claudinas o ocludinas, es decir las
claudinas y ocludinas no solo forman parte de las uniones oclusivas sino generan un ordenamiento de ciertos componentes
proteicos.-
Uniones comunicantes o de tipo gap: forman canales acuosos en las membranas de las que les permite comunicarse por otro
canal acuso a las células adyacente generando un puente acuoso entre dos células yuxtapuestas entre si, por medio del
puente acuoso formados por proteínas entre dos células va a poder difundir moléculas de un determinado tamaño, pero no
pueden pasar proteínas porque son muy grandes de un 1 kilo bay. El hecho (punto de vista fisiológico) que a partir de estas
uniones puedan atravesar moléculas iónicas permite que dos células puedan estar acopladas desde el punto de vista
eléctrico, la transmisión de inf. entre ciertos tipos celulares se da mediante perturbaciones eléctrico que van a ser
transportadas por un flujo de iones entre las células, se determinó que una combinación eléctrica de una neurona con otra
puede estar mediada por una sinapsis de tipo eléctrica, que está caracterizada por uniones de tipo gap, en donde los iones
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que transportan el impulso nervioso directamente van a travesar la neurona post sináptica sin el retardo temporal que
implica la sinapsis de tipo químico, otro ejemplo es el acoplamiento sincrónico de la contracción de las células musculares
cardiacas, esa simultaneidad se produce por las comunicaciones de tipo gap entre células musculares, en donde la ola de
calcio que permite la contracción este sincronizada entre los distintos tipos células, permitiendo una de las características de
la multicelularidad que es este funcionamiento sincrónico de la célula y no el funcionamiento de aislado. Punto de vista
estructural: estas uniones están formado en cada membrana de las células que se comunican por 2 hemicanales, cada uno de
esos hemicanal se comunica con el hemicanal correspondiente en la membrana plasmática de la célula adyacente para
formar el canal acuoso, y para formar este hemicanal las proteínas(péptidos) involucradas se denominan conexinas. Muchas
células tienen uniones gap, como células epiteliales, musculares, nerviosa y etc., no hay expresión especifica muy marcada
dentro de las conectivas. Cada uno de estos hemicanales está compuesto por 6 peptidos de conexinas que están dispuestos
en forma de proteínas transmembrana en cada una de las membranas plasmáticas y estos péptidos no necesariamente
tienen que ser codificados por el mismo gen, si no que pueden ser codificadas por genes diferente.
2da parte del seminario: Los roles que cumple la matriz extracelular se encontraron poco, porque se le da más importancia a
la fisiología celular (mirando a la célula desde su interior). Pero propiedades en su totalidad depende de las propiedades dela
matriz extracelular, más que de las propiedades intrínsecas de cada una de las células, por ejemplo: las propiedades del
hueso se deben principalmente a esa particular especialización de la matriz extracelular que se calcifico, que se mineralizo y
no tanto a las propiedades intrínsecas de los osteocitos y osteoblasto. las células musculares están rodeadas de matriz
extracelular que reciben el nombre de láminas externas o laminas basales de cada una de las células musculares, es decir que
aun en casos de alta celularidad tenemos matriz extracelularidad
¿Cuáles son los componentes típicos de todas las matrices extracelulares y que van a especializarse en cada uno del tejido?
Glicosaminoglinanos (gags), otros componentes asociados a los gags son los proteoglicanos, todos los componentes de la
matriz extracelular son producidos por la misma célula y luego son secretados al exterior celular, estos componentes son
poligosacaridos no ramificados, son macromoléculas enormes. Los gagas son formados por disacáridos que se repiten uno
detrás de otro, desde el punto de vista estructural los polisacáridos se características porque son muy rígidos, no suelen por
el tipo de uniones ser flexibles, debido a que cada uno de los monosacáridos que lo componen tienen carga eléctrica, son
muy ricos en grupo carboxilo y mucho de ellos son sulfatados les confieren carga neg., estas cargas atraen moléculas de agua,
atraen de sodio al medio extracelular y estos cationes sodio osmóticamente activos arrastran agua, de modo que esto
poligosacaridos en los tej. Se encuentran formando genes altamente hidratados, las estructuras similares a los genes están
formados por enormes filamentos que atraen moléculas de agua, estas sustancias altamente hidratadas componen la
sustancia fundamental o amorfa en los tej. Ej: Ácido hialuronico forma un gags especial por su enorme tamaño y porque a
diferencia de otros gags no se encuentran sulfatados. Existen diversas moléculas gags sulfatados, el Dermatán sulfato,
queratan sulfato, difieren entre si por el tamaño especifico y localización. Todos los aminoglicanos son producidos por la
célula, en el aparato de Golgi luego por las vesículas son secretados de las células, con excepción del ácido hialuronico, que es
sintetizado directamente en la matriz extracelular. La mayoría de glicosaminoglicanos no se encuentran de manera libre sino
unido a un componente proteico, a esa unión se le llama unión proteoglicano con excepción del ácido hialuronico que no se
encuentra unido a una proteína, sino que existe independientemente; en algunos casos el proteoglicano de corina costa de 1
polipeptido unido 1 gags, pero la mayoría de proteoglicano esta constituidos a múltiples molec. De glicosaminoglicanos
unidos a un mismo filamento proteico por ej: el agrecano (mole. Enorme), fuertemente hidratada y es muy abundante en el
tej. Cartilaginoso, la resistencia a la compresión de este tej. Se debe a su gran riqueza de agrecano.
Diferencia de glicoproteína y proteoglicano: en ambos casos nos referimos a la unión de algo de origen peptídico y algo de
origen sacaridmico, pero la diferencia fundamental es cuál de las dos aporta mayor masa, en los proteoglicanos es el
componente de polisacáridos lo que le da la mayor proporción de masa de la molec. total, en cambio en las glicoproteínas
que son proteínas con una pequeña proporción de oligosacáridos la masa mayor es el componente proteico; otra diferencia
es que el oligosacárido ramificado que se une a las glicoproteínas es producto de una Nglicosilacion que ocurre inicialmente
en la luz del retículo endoplásmico, en cambio la unión de los glicosaminoglicano es producto de una glicosilación que ocurre
en el aparato de Golgi. Cuando hablamos de proteoglicano el componente principal en términos de más es el polisacárido y el
péptido es una porción menor. Los proteoglicanos pueden unirse entre si y formar complejos macromoleculares enormes, tan
grandes que pueden observas en el M.O, su estructura es compleja dado que el eje central está formado por el ácido
hialuronico (polisacárido que existe de manera independiente), sale de manera radial desde este eje distintas distintas molec.
De agrecano (proteoglicanos formados por un eje proteico y por muchas molec. De saminoglicanos), este complejo es común
en tej. Cartilaginosos y le permite a este tej. ser sometido a grandes fuerzas de.

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Otros componentes de la matriz extracelular son las glicoproteínas adhesivas, son molec.que tienen como componentes de
masa su parte peptídica y que se encuentran decoradas por oligoscaridos, estas glicoproteínas de adhesión se denominan así
porque poseen dominios proteicos en su estructura, que tienen afinidad por otros componentes de la matriz extracelular o
componentes que están presentes a la superficie de la célula, ambos les permiten a estas glicoproteínas adhesivas organizar
la distribución de componentes y células dentro de la matriz extracelular. Dos ejemplos de glicoproteínas adhesivas son la
fibronectina, componente de la matriz extracelular al que se unía las integrinas, está formada por un dimero y cada dimero
consta de una serie lineal de dominios proteicos.
Dominio proteico: me refiero a una zona de la proteína que tiene una morfología tridimensional que adopta por si sola, si
cortas los dominios entre si adoptan esa misma forma tridimensional por más que no esté unida al resto de la molec., esta
zona de la proteína que tienen una morfología propia independientemente del reto de la proteína es lo que llamamos el
dominio de una proteína, los dominios están relacionados a funciones específicas, cada uno de estos largos polipéptidos esta
subdividido en dominios morfológicos cada uno de ellos con capacidad de unirse, por ejemplo la fibronectina tiene muchos
dominios que pueden unirse a fibras de colágeno, hay otros dominios que pueden unirse a las integrinas y también a las
heparinas, las fibronectinas son muy abundantes en todos los tej. Conectivos es un ej. De regulación de la expresión génica
porque cuando se analiza los tipos de fibronectinas que hay en los distintos tej. Se encontraron más de 20 clases, difieren
entre si en el número de dominios que se une a cada clase de componentes que poseen péptidos ej: hay algunas
fibronectinas que poseen muchas uniones a colegeno y son pobres a dominios de unión a integrinas, en cambio hay otras
fibronectinas que se unen más a integrinas que a colágenos, sin embargo, todas las fibronectinas están conectadas al mismo
gen, hay un único gen de fibronectina en el genoma (este gen tiene 50 exones)
¿Cómo se genera esa enorme esa enorme diversidad de fibronectina a partir del mismo gen? La forma alternativa de splicing
permite alternar esos exones de modo tal de generar las distintas variantes de fibronectina, cada uno de los exones codifica
codifica un endominio independiente de cada proteína.
Otro ejemplo de glicoproteína es la laminina, se llama así porque forma parte de las láminas basales o membrana basales de
los epitelios de esa especialización de matriz extracelular donde se anclan las células basales del epitelio, las lamininas son
heterotrimeros, están formadas cada molécula por tres cadenas polipeptidicas de una cadena alfa, una beta y una cadena
gama, cada una de esas cadenas esta codificada por un gen independiente. Estos heterocrimeros tienen la capacidad de
unirse entre sí, para formarse redes bidimensionales y esta capacidad es propia de las molec.de laminina, pueden formar
estas redes in vitro en un medio, no es necesario estar en un contexto celular para formar estas redes bidimensionales, sobre
estas redes se organizan los distintos componentes que forman parte de las membranas basales de los epitelios.
Otros componentes principales de la matriz extracelular son los componentes fibrilares, proteínas fibrosas, que se
encuentran dentro de la matriz extracelular, estos componentes fibrilares en tres grandes tipos de fibras, fibras colágenas,
reticulares y las elásticas
● Fibras colágenas: su componente proteico bajo la técnica de rutina le da un color acidofilo, con el microscopio
electrónico en un corte longitudinal se ven excreciones, cada fibra de colágeno es el empaquetamiento de fibrillas de
menor diámetro y cada fibrilla está compuesta de una serie de hélices triples de cadenas polipeptidicas, cada una de
estas cadenas están codificadas por un gen de alfa colágeno (cada una de estas es una cadena alfa). Caracteriza a la
estructura primaria de las cadenas alfa de colágeno el hecho de que están compuestas por aminoácidos de prolina,
seguidos aminoácidos de glicina, seguido por un aminoácido diferente pero estos tripletes de prolina, glicina y otro
aminoácido es una estructura característica de las cadenas alfas y esta asociación de prolinas y glicinas es lo que le
confiere a la cadena polipeptidica la torsión espontanea para formar hélices. En algunos casos los aminoácidos de
prolina son hidroxilados es decir se le agrega un grupo hidroxilo durante su procesamiento intracelular. Las triple
hélices pueden acomodarse en el espacio formando estructuras de fibrillas, esta disposición en el espacio adopta una
separación regular entre cada molec. hace que intervalos regulares queden en secciones transversales solo 3 molec. y
no 4 y esta separación regular es lo que le va conferir a la fibra como un todo, estas extracciones observadas en el
microscopio electrónico y se debe a la disposición ordenada y regular de estas triples alfas hélices de colágeno
¿Cómo producen las células inicialmente las fibras de colágeno? Inicialmente los genes de la alfa comienzan a ser
traducidos en el citosol, tiene péptida señal y son incorporados en la luz del retículo endoplásmico, acá espontáneamente
las molec. de alfa colágeno se unen entre si para formar triple hélices alfas que luego por trasporte vesicular se llevan al
aparato de Golgi, en donde los residuos de prolina son modificados e hidroxilados y por las vesículas son secretados al
medio extracelular y espontáneamente estas alfa hélices de colágeno ya modificadas se ensamblan formando fibras
colágeno. Poseemos más de 21 genes que codifican cadena alfa, sin embargo, los tipos de colágenos existente no son
clasificados por el gen original por el cual se transcribe las cadenas alfa, sino por la morfología final que tienen las fibras
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que componen esa molec. de colágeno, estas fibras gruesas que están presentes por ej: en la dermis, son fibras que
denominamos colágeno de tipo I (más abundante en el cuerpo); pero el colágeno puede adoptar otras morfologías. El
colágeno tipo 3 forma un segundo tipo de fibras reticulares; los colágenos tipo 9, 10 y 11 están presentes en fibras del
cartílago y las láminas basales de los epitelios tenemos una alta concentración de colágeno tipo 4 que no forma fibras
gruesas sino filamentos. Mutaciones que afectan a la producción de colágeno I, por su alta prevalencia en el tej.oseo las
mutaciones que afectan a la producción de colágeno tipo 1 suelen tener un correlato genotipo en el desarrollo
embrionario, según cuales es el gen de alfa colágeno que posea la mutación y el tipo de mutación los genotipos de los
pacientes son diversos y se agrupan en distintas categorías, en distintos tipos pero estos típicos fenotipos tipo I, no
corresponde a mutaciones de colágeno tipo I todos estos ontogénesis imperfectas son parte de colágeno I, esta
caracterización genotipo se debe a los grados de severidad que posea o no la patología. En casos débiles la ontogénesis
imperfecta suele implicar una mayor probabilidad a fracturas de los huesos, en casos más graves produce a una
mortalidad perinatal y en otros casos suele haber deformación e inclusos ausencia de formación de algunos miembros
● Fibras reticulares: Formadas por colágeno tipo 3, estas fibras son más delgadas, forman redes y mallas que envuelven
y que están en el parénquima de muchos tej.ej: ganglios linfáticos, medula ósea; cuando se realizan tinciones
específicas para revelar colágeno tipo 3, las fibras reticulares mediante las técnicas de impregnación argentica se
puede observar en su parénquima una delegada red de fibras que ayuda a organizar la distribución de las células en
ese tej.; también en el hígado son frecuentes las fibras elásticas.
● Fibras elásticas: suelen estar presentes en las paredes de los vasos arteriales, permiten al tej. distenderse y volver a
su forma original. Desde el punto de vista estructural esta fibras se encuentran compuestas por 2 componentes: la
elastina, que es una proteína con baja estructuración, pueden adoptar una multiplicidad de formas, no tiene una
estructura globular rígida como muchas proteínas, sino la abundancia de aminoácidos hidrofóbicos les permite tener
una estructura poco globular y con alto grado de flexibilidad, pero la flexibilidad del tej., la propiedad de ser elástico
está determinado por las uniones que entre si forman los distintos péptidos de elastina, se produce una vinculación
en estas fibras electicas de muchas subunidades de elastina que las une de manera covalente, en este caso estos
componentes proteicos que forman parte de esta unión transversal de molec. esta dado por la proteína desmosina,
debido al alto nivel de plegamiento y desestructuración que tienen las molec. de elastina uno puede expandir y
someter atracciones laterales a esta malla de filamentos de actina, generando el desenrrollamiento de cada uno de
las subunidades y permitiendo que la longitud total de este arreglo multiproteico aumente su longitud, usualmente
las fibras de elastinas no solo están compuestas de elastina y desmosinas sino que suelen estar rodeadas por una
segunda clase de fibrillas que les confiere una mayor estabilidad y son las molec. de fifrilina, el conjunto de molec. de
elastina unidas entre si para formar esta red extensible con los elementos de fifrilina los que forman parte de la
estructura de las fibras elásticas. Mutaciones en los genes de fibrilina ocasionan una enfermedad muy frecuente que
impacta negativamente en la función de las fibras elásticas, los individuos que sufren el síndrome de marfan, su
síndrome más grave es que tienen una pronunciada debilidad de la Orta, es decir la arteria Orta suele romperse con
facilidad ya que cumplen un rol sobre la morfogénesis de los miembros, otra morfología es extremidades largas que
son hiperlaxas
Las células también producen productos proteicos que pueden romper la matriz extracelular y generar un espacio apto
para la migración, estos componente que favorecen los fenómenos de desadhesion, son un conjunto de proteasas
conocidas como metaloproteasas de la matriz (llamadas asi por que necesita como cofactores iones metalicos , son un
conj.de enzimas que existen en forma secretada por las células o como proteínas de membrana y son secretadas o
expuestas en la membrana en modo inactiva, que por señales extracelulares especificas pueden activarse y degradan
distintos componentes de la matiz extracelular por ej:fibroelectina o fibras de colágeno. Hay un repartorio de genes que
codifican diferentes metaloproasas de la matriz que permiten degradar distintos componentes de la matriz extracelular.
La matriz extracelular la identificamos como un espacian que está en continua remodelación por parte de la célula, está
fabricando constantemente y remodelando de forma simultánea, no es un escenario pasivo constante de la célula; hay
otros genes que actúan balanceando la actividad de las metaloproasas de la matriz que son proteínas de la familia actina
y que son inhibidores de estas metaloproasas, distintos tipos celulares se encuentran secretando de manera
complementaria algunos células que en un tej. secretan proteasas de la matriz y otras secretan sus antagonistas las
molec. stim y el balance de esos productos proteicos determinan el grado de estabilidad o no de una matriz extracelular
en un momento dado, dado que estos componentes a su vez están regulados en el tiempo, eso permite explicar cómo en
determinados momentos del desarrollo un sector de la matriz extracelular de un tej. se vuelve dinámico y permite la
migración de ciertas células y en otros momentos se vuelve más estable y permite la estabilización de ciertas células.
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¿Cuáles son los productos proteicos, los genes que se activarán en las células que favorecerán por un lado un genotipo
epitelial y por otro lado favorecerán un genotipo mesenquimatico característico de una célula en migración? Esta
transición epitelio-mesenquimatico (de un genotipo epitelial a uno mesenquimatico) se caracteriza por la pérdida de
caderinas epiteliales, dado que las cadeninas epiteliales forman parte de molec.de adhesión, que eran los componentes
esenciales entre células epiteliales. Las células epiteliales que expresan filamentos de queratina cuando se transforman
en células migratorias mesenquimaticas expresan filamentos de vimentina más típicas de fibras fibroblastica. La polaridad
apical y basal que caracteriza a células epiteliales y que es mantenida por las uniones estrechas que evita la difusión
simple de molec.apicales y basales, al perder la expresión de claudinas y oclidinas que formaban parte de uniones
estrechas esta polaridad estable de células epiteliales se pierde, las células que adquieren un genotipo migratorio
comienzan a secretas metaloproasas de la matriz y se comienza a espresar integrinas que les permite interactuar con los
componentes de la matriz

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Seminario 10

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Seminario 11

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Seminario 12 de Falzone

Cáncer
Un tumor se desarrolla a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. A partir de una célula mutada se
producen células descontroladas ya crecidas. Un tumor puede ser benigno o maligno.
Un tumor benigno permanece confinado en su localización original, sin invadir el tejido sano adyacente ni propagarse a
lugares distantes del cuerpo.
Un tumor maligno es capaz de invadir el tejido normal y propagarse por el cuerpo mediante sistemas circulatorios o linfáticos.
Solo a estos se los denomina canceres, y es su capacidad para invadir y dar lugar a la metástasis (distribución de tumores en
todo el organismo) lo que lo convierte al cáncer en algo tan peligroso.
También se clasifican de acuerdo al tipo de célula del que proceden:
Los carcinomas: son alteraciones epiteliales.
Sarcomas: son tumores sólidos de tejidos conectivos como el musculo, el hueso, el cartílago y tejido fibroso.
Las leucemias y los linfomas: surgen a partir de células hematopoyéticas y de células del sistema inmune.
Causas del Cáncer

La primera alteración es la proliferación continua e incontrolada de las células cancerosas. Estas crecen y se dividen de
manera incontrolada, invadiendo órganos y tejidos sanos, diseminándose por todo el cuerpo. La pérdida del control del
crecimiento que muestran las células cancerosas es el resultado de la acumulación de alteraciones en múltiples sistemas
reguladores de la célula y se refleja en varios aspectos del comportamiento celular.

Desarrollo

Los tumores se desarrollan a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. Es un proceso multietapa, en el que
las células se convierten en malignas progresivamente a través de una serie de alteraciones. Se considera un proceso
multietapa constituido por la mutación y selección de aquellas células con capacidad cada vez mayor de proliferación,
supervivencia, invasión y metástasis.
La iniciación del tumor se debe a una alteración genética que provoca la proliferación anormal de una única célula. La
proliferación celular da lugar a una población clonal de células tumorales.
La progresión del tumor ocurre a medida que se acumulan mutaciones adicionales en las células de la población del tumor
que les confieren ventajas selectivas, por lo que los tumores crecen y aumentan su carácter maligno e invasivo. Este proceso
se denomina selección clonal, ya que un nuevo clon de células tumorales evoluciona en función de su ritmo de crecimiento
más rápido o de otras propiedades, que les confiera una ventaja selectiva.
Progresión tumoral

Ocurre la remodelación de la matriz extracelular que está dada por las metaloproteasas. Estas proteínas degradan la MEC, lo
que permite a las células cancerosas invadir los tejidos normales adyacentes. La acción de las metaloproteasas sobre la MEC
es muy importante porque es capaz de alterar las uniones célula-MEC y célula-célula, mediar la liberación, activación o
desactivación de moléculas señalizadores autocrinas o paracrinas (activadores de angiogénesis, por ejemplo) y activar o
inactivar los receptores de la superficie celular.
Y también suceda la generación de nuevos vasos sanguíneos. Esto se denomina angiogénesis. La angiogénesis es necesaria
para mantener el crecimiento de un tumor por encima de un tamaño de un millón de células, en el que se requieren nuevos
vasos sanguíneos para proporcionar oxígeno y nutrientes a las células tumorales en proliferación. Estos vasos se forman en
respuesta a los factores de crecimiento secretados por células tumorales. También es importante la formación de nuevos
capilares para el establecimiento de metástasis.
Propiedades de las células cancerosas
● Manifiestan alteraciones en los mecanismos que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia celular
hormonal
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 ● Siguen creciendo hasta alcanzar una densidad elevada de células en cultivo, de la misma manera que ocurre con la
proliferación incontrolada
● Continúan moviéndose tras contactar con otras, migrando sobre células adyacentes y creciendo en patrones
multicapa desordenados
● Son capaces de crecer en ausencia de factores de crecimiento
● Producen factores de crecimiento que estimulan su propia proliferación (estimulaciones autocrinas de crecimiento)
● Tienen menor capacidad de adhesión que las células normales
Genes reguladores de la proliferación celular
Genes supresores de tumores: es un tipo de gen que elabora una proteína que se llama proteína supresora de tumores, la
cual ayuda a controlar el crecimiento celular o lo frena. Las mutaciones en genes supresores de tumores pueden conducir al
cáncer. Como, por ejemplo, p53, el retinoblastoma y el microARN (que puede ser también un oncogén).

La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA. Cuando el ADN se daña, el
P53 se acumula en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 antes que se duplique el ADN e iniciar su reparación.
P53 va a inducir la síntesis de proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs, bloqueando el ciclo celular. Si se repara la
lesión el ciclo continúa, pero si no se repara se induce la apoptosis de la célula. La alteración de la proteína P53 produce
inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la proliferación o activar la apoptosis, cuando está
comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces de acumular las mutaciones para completar la
carcinogénesis y continúan dividiéndose.

El retinoblastoma (Rb) inhibe el paso a través del punto de restricción en G1 reprimiendo la transcripción de determinados
genes relacionados con la progresión del ciclo celular y la síntesis de ADN. El paso a través de estos puntos se regula por los
complejos Cdk4, 6/ciclina D, que fosforilan e inactivan a Rb. Por lo tanto, la inactivación de Rb en los tumores supone la
pérdida de un regulador negativo de la progresión del ciclo celular.
Protooncogenes: es un que participa en el crecimiento normal de las células. Las mutaciones en un protooncogén pueden
hacer que este se convierta en un oncogén, que puede hacer que se formen células cancerosas.
El microARN puede funcionar como gen supresor de tumores o como oncogenes.
A estos se los considera reguladores de la expresión génica en las células eucariotas. Participan en la regulación de una
tercera parte de los genes que codifican proteínas, por eso es muy posible que estén implicados en el desarrollo tumoral.
Hay ARNmi que se amplifican en varios tipos tumorales y actúan sobre ARNm que codifican proteínas que inhiben la
progresión del ciclo celular (inhibidor de Cdk p21) o favorecen la apoptosis (Bcl-2 Bim)
Vías por las que un proto-oncogén puede convertirse en un oncogén:
1. Mutaciones puntuales: una sustitución de un par de bases por otro par en una secuencia de ADN
2. Reordenamiento cromosómico: una parte de un cromosoma se liga al otro cromosoma, el resultado es un
cromosoma híbrido detectable en el cariotipo. Esto da lugar a una alteración en la transcripción del ADN.
3. Por amplificación de genes: las células eucariotas están formadas por un genoma diploide. En determinadas
circunstancias una de las copias puede multiplicarse miles de veces aumentando su tasa de expresión, dando lugar a
la amplificación del gen. Es uno de los mecanismos más implicados en la carcinogénesis.
Los principales sospechosos de mutaciones relacionadas con el cáncer son los oncogenes, genes supresores de tumores
mutados, y los genes de reparación del ADN defectuoso, las mutaciones que figuran a continuación también hacen daño:

● Activar y desactivar carcinógenos

● Control de suicidio celular (apoptosis)
● Control de la señalización celular
● Control de la diferenciación celular

75
Necrosis y Apoptosis

A nivel celular existen dos formas de morir: por necrosis o por apoptosis. Por necrosis mueren las células accidentalmente
cuando son lesionadas por agresión mecánica o tóxica. Por apoptosis mueren las células cuando son inducidas a suicidarse.
En la muerte por necrosis se detectan una serie de cambios característicos:
● Las células y sus orgánulos se hinchan porque se altera la capacidad de la membrana plasmática para controlar el
paso de los iones y el agua
● Las células se rompen y su contenido se vierte al espacio intercelular
Se origina inflamación de los tejidos adyacentes
● Las membranas se rompen
Las células que son inducidas a sufrir apoptosis o suicidio celular presentan las características siguientes:
● Reducen su tamaño
● Sus mitocondrias se abren y dejan salir el citocromo c
● Las membranas no se rompen, la célula se va fragmentando en cuerpos apoptóticos
Los aspectos morfológicos de la apoptosis:
● Disminución del volumen celular
● Se generan ampollas en la membrana plasmática
● Los núcleos se rompen
● La célula se fragmenta en núcleos picnóticos

La apoptosis tiene dos vías, una extrínseca y una intrínseca. La vía extrínseca es la que necesita una señal externa, de afuera
de la célula que la induzca.

Extrínseca: existen receptores fas con dominios externo e interno en la membrana celular. Se adaptan a él, el ligando fas y
proteínas FADD. Este complejo de tres partes envía señales para que la procaspasa 8 llegue y se adjunte a ellos, liberando la
caspasa 8 ya activa, en forma de tetrámeros. Estos tetrámeros activan la caspasa 3, la 6 y la 7. La caspasa 7 empieza a
deshidratar el citoplasma, la 3 induce la fragmentación del ADN y la formación de cuerpos apoptóticos, y la 6 se encarga de
los procesos apoptóticos.

Intrínseca: se da en la mitocondria y no necesita ninguna señal. Involucra tres tipos de proteínas, las anti apoptóticas (BCL-2 y
BCL-XL), las proapoptóticas (BAX y BAK) y las proapoptóticas (BID, PUMA y BAD). Las proteínas PUMA y BAX se juntan y
comienzan un proceso de ruptura de la membrana externa mitocondrial. Cuando esta abertura surge, el citocromo C de la
mitocondria se libera hacia el citosol. Luego, el citocromo C se une a una proteína Apaf-1 y al ATP. Este último complejo forma
un apoptosoma. Para que este comience a funcionar, cuando se forman varios apoptosomas se une a este la caspasa 9 que
forma un anillo, al que se va a unir la caspasa 3 para que comience el proceso de apoptosis intrínseca. Proteínas
mitocondriales como la SMAC/Diablo entran al citoplasma donde se unen a las proteínas citoplasmáticas que actúan como
inhibidores de la apoptosis llamada IAP y las inactivan. Estas IAP, bloquean la activación de las caspasas, incluidas las caspasas
efectoras como la 3, para mantener viva a la célula.

76