Monitoreo de la calidad del agua potable: un enfoque alternativo para
Eventos de contaminación microbiana
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João CG Simões, Tao Dong, Miembro IEEE, Yili Yang, Carlos A. Silva
Resumen - El crecimiento incesante de la población mundial y
el consiguiente aumento de la demanda de agua, lo que aumenta el interés
por los sistemas de control de agua potable continuos y en tiempo real. El
siguiente estudio tiene como objetivo estudiar la fluorescencia intrínseca
del triptófano como método para detectar eventos de contaminación
microbiana en el agua potable.
Palabras clave— Triptófano; Fluorescencia intrínseca; Luciferasa;
EEM; E. coli; Dispersión Raman; ATP
I. I NTRODUCCIÓN
Los datos de la OMS (Organización Mundial de la Salud) informan
que para 2025, la mitad de la población mundial vivirá en áreas con
estrés hídrico [1]. Los proveedores de agua ya no podrán atender las
futuras demandas de agua, lo que aumentará la posibilidad de
eventos de contaminación del agua.
Los casos más comunes son cuando E. coli, que normalmente vive en el
tracto intestinal de los seres humanos, entra en un sistema de conducción
de agua (contaminación fecal). Como ejemplo, en verano
2000, un sistema de distribución de agua local de Walkerton (Ontario,
Canadá), fue contaminado por una infección E. coli cepa (O157: H7),
causando 2.000 enfermedades y siete muertes [2]. Teniendo en cuenta
que durante el último año ha aumentado el número de personas con
acceso al agua del grifo, este tipo de eventos pueden ser potencialmente
catastróficos. Por lo tanto, un método para la detección continua y en
tiempo real de organismos microbianos es una necesidad en la sociedad
actual.
Los requisitos básicos de este sistema son un tiempo de respuesta
rápido, una alta sensibilidad y un amplio rango de detección (sensible a
una gran variedad de microorganismos) [3]. Estos parámetros son
suficientes para caracterizar un método eficiente, aunque desde un punto
de vista comercial solo un equipo con un bajo costo de compra /
mantenimiento y dimensiones reducidas es realmente viable para
aplicaciones reales, aquí es donde la mayoría de los sistemas fallan [4].
La investigación ha apoyado principalmente el proyecto regional
forskningsfond de Oslofjordfondet «Disruptiv Innovasjon for
Vannovervåking - Forbedring i Styringen av Vannkvalitet» (proyecto n.
° 272037) y el proyecto regional forskningsfond Hovedstaden
«Biologisk Vannalarmsystem for å styrke projtsy. ). También se
agradecen los fondos del Consejo de Investigación de Noruega
(subvención nº 276650) y de la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (subvención nº 61650410655). La investigación
también fue apoyada por el Programa de Investigación de
Investigación Básica y Tecnología de Frontera de Chongqing (proj.
Nos. Cstc2015jcyjA20023, cstc2016jcyjA2161, cstc2017jcyjA1842),
Comisión de Educación de Chongqing - Programa de Investigación de
Ciencia y Tecnología (no.
Tao Dong trabaja en el Departamento de Microsistemas - IMS, Facultad de
Tecnología, Ciencias Naturales y Ciencias Marítimas, University College of
978-1-5386-3646-6 / 18 / $ 31.00 © 2018 IEEE
Un método ampliamente utilizado es la bioluminiscencia de ATP
(DLuciferina y luciferasa) [5], la reacción se basa en la oxidación de la
dluciferina por la luciferasa, que tiene una intensidad luminosa
emisora proporcional a la concentración de ATP. Este método es
considerado uno de los más sensibles y rápidos para la detección
microbiana, el único inconveniente es el uso de reactivos costosos,
que limita sus aplicaciones en un sistema continuo para ser colocado
en el campo. Sin embargo, el método de bioluminiscencia de ATP se
utiliza como comparación / validación para el método presentado en
este estudio. Otros métodos disponibles consumen mucho tiempo
(recuento de placas) y PCR (reacción en cadena de la polimerasa) [6],
lo que los hace no adecuados para aplicaciones en línea.
II. T RIPTÓFANO I NTRÍNSICO F LUORESCENCIA
A. Principio de fluorescencia
La radiación emitida por determinadas moléculas como
resultado de una radiación incidente de longitud de onda más
corta, como la luz ultravioleta, se denomina fluorescencia. Este
fenómeno, es característico de las moléculas denominadas
fluoróforos, y comprende tres pasos (Figura 1): Excitación (A),
Excitación-tiempo de vida (B) y Emisión-Fluorescencia (C).
En la excitación se absorbe un fotón de cierta energía.
(MI 1 '), lo que hace que el fluoróforo se mueva a un estado electrónico excitado. Este proceso es
seguido por el período de vida del estado excitado,
donde el fluoróforo sufre cambios conformacionales,
provocando una pequeña disipación de energía (E 1 '- E 1), que normalmente duran
10 nanosegundos. La emisión de la llamada "luz de fluorescencia" ocurre en el
tercer paso, donde el fluoróforo regresa
al estado de preexcitación, emitiendo un fotón (E 1) de mayor
longitud de onda que el fotón excitante, esta diferencia en
longitud de onda, se denomina cambio de Stoke. Otra característica
del fluoróforo se denomina rendimiento cuántico y representa la
fracción de fotones absorbidos, lo que resultará en emisión.
Sudeste de Noruega, Postboks 235, 3603 Kongsberg, Noruega (correo electrónico del autor
correspondiente: Tao.Dong@usn.no ).
João CG Simões trabaja en el Instituto de Micro-Nano Ciencia y Tecnología
Aplicadas - IAMNST, Laboratorio Clave de Colegios y Universidades de
Chongqing en Tecnología de Micro-Nano Sistemas y Transducción Inteligente.
Laboratorio de Ingeniería de Chongqing para Detección, Control y Sistema
Integrado, Base Nacional de Investigación del Servicio de Fabricación
Inteligente, Universidad de Tecnología y Negocios de Chongqing, Distrito de
Nan'an, Chongqing 400067, China, y con el Departamento de Microsistemas -
IMS, Facultad de Tecnología, Ciencias Naturales y Ciencias Marítimas, University
College of Southeast Norway, Postboks 235, 3603 Kongsberg, Noruega.
Yili Yang está en el Hospital del Centro de la Ciudad de Nanyang, No. 312,
Gongnong Road, Distrito de Wancheng, Nanyang 473009, China.
Carlos A. Silva trabaja en CMEMS-UMinho, Universidad de Minho, 4800-058
Guimarães, Portugal
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 veces. A continuación, se añadieron las bacterias a muestras de agua
potable (pH 8,0 a 25ºC).

Figura 1. Diagrama de energía e intensidad para fluorescencia estándar
principio.
de luz fluorescente. Ambos parámetros son críticos para la
sensibilidad del método, permitiendo diferenciar los fotones
de emisión del ruido de fondo y del fotón de excitación [7].
B. Triptófano
La fenilalanina (Phe), la tirosina (Tyr) y el triptófano (Trp) son los únicos tres
aminoácidos esenciales que tienen propiedades intrínsecas de fluorescencia. Entre
estos tres, el triptófano presenta un mayor rendimiento cuántico (0,20) [8], por lo que
se eligió como indicador microbiano. La literatura sugiere que la florescencia del
triptófano tiene una mayor intensidad de absorción a 280 nm (± 20) y emisión a 350 (±
20 nm). Sin embargo, las características fluorescentes del triptófano dependen del
disolvente, lo que significa que se espera que se produzca un desplazamiento del
espectro a una longitud de onda más corta cuando la polaridad del disolvente
disminuye [9].
B. Condiciones de medición
Para medir la fluorescencia intrínseca de triptófano, se utilizó un
espectrofluorómetro FS5 (Edinburgh Instruments, Reino Unido).
Dentro del dispositivo, la fuente de luz y el detector están
desplazados en un ángulo de 90º, por lo que la única radiación que
llega al detector proviene de la fluorescencia de la muestra y no
directamente de la fuente de luz.
A modo de comparación, se midió la bioluminiscencia de ATP
utilizando un lector de microplacas (Reader 2 Bio Tek Synergy2, EE.
UU.). Para el protocolo se utilizó un kit de bioluminiscencia (ATP
Biomass Kit HS, Biothema, SWE). El protocolo para este kit comprende
la adición de 50 μL de Extractante B / S al pocillo de la microplaca,
seguido de 50 μL de muestra y 400 μL de Reactivo ATP premezclado
con Diluyente B. Las mediciones se tomaron inmediatamente
después de la preparación, como el bioluminiscente la señal
disminuye un 6% cada minuto.
IV. R ESULTADOS Y DISCUSIÓN
A. Análisis de longitud de onda de emisión / absorción de triptófano
Para muestras de agua potable, con E. coli a 25ºC y pH 8.0, se
probaron varias longitudes de onda de excitación, que van desde
260 nm a 300 nm (CWL). Las pruebas se realizaron con un alto
concentración de E. coli ( sobredosis 600 = 0,190), y utilice la función
espectrofluorómetro llamada EEM (emisión de excitación
matriz), para permitir la ejecución continua de medidas en diferentes longitudes
de onda de excitación.
Los resultados mostrados en la Figura 2 sugieren que la
fluorescencia de triptófano tenía una señal alta a la excitación de
270-280 nm y emisión de 320-340 nm. La línea roja, que se muestra
en la imagen, es el efecto provocado al medir la luz de excitación y
emisión en la misma longitud de onda, y por lo tanto no representan
datos relevantes para el estudio.

III. METRO ÉTODOS Y MATERIALES

Cultivo de AE coli y preparación de muestras

El experimento utilizó congelación seca E. coli ( Cepa K-12), para
simular el organismo contaminante. En primer lugar, se preparó la
activación celular y el precultivo en caldo estándar Luria-Bertani
durante la noche a 100 rpm y 37ºC. La literatura indica que E. coli concentración
en suspensión, puede ser estimada por el
sobredosis 600 ( absorbancia a 600 nm) y tiene una relación de 1 AU
(Unidades de absorbancia) igual a 8 x 10 8 UFC / ml en suspensión,
aunque esta relación solo es válida para OD 600 valores entre
0,01 y 1 [10].
Después de la E. coli Activación con el precultivo, se realizó un
nuevo cultivo durante 250 min, a 150 rpm para 37ºC. Se obtuvo Figura 2-Escaneo EEM de una muestra de agua con alto contenido de bacterias

una densidad óptica de 0.193, lo que indicó una concentración de concentración.

1,54 x 10 7 UFC / ml.

La E. coli Luego se centrifugó la muestra a 4400 rpm durante 5 min Teóricamente se espera un pico de interferencia a 311 nm, causado
y se lavó en una solución de PBS (tamponada con fosfato) para por el efecto de dispersión Raman (para una longitud de onda de
eliminar el medio de crecimiento, este paso se repitió tres excitación de 280 nm, el pico de dispersión Raman ocurre a 310 nm).
La dispersión Raman siempre ocurre a una constante

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longitud de onda diferente de la luz incidente y se puede
identificar cambiando la longitud de onda de excitación [11]. Esto
puede ser confirmado por la Fig.3, donde comienza a aparecer
una línea paralela (con menor intensidad) a la longitud de onda
de excitación / emisión (línea roja), lo que demuestra que este
efecto depende de la longitud de onda de excitación. Este pico
normalmente se ve abrumado por la alta fluorescencia (altas
Los resultados de la medición con ambos métodos se muestran
en la figura 5. Ambas curvas se ajustan a un modelo lineal, para
el ATP Bioluminiscencia R 2 = 0, 99 (y = 0,012x - 25429), y para el
Triptófano R 2 = 0, 99 (y = 0,0001x + 270), que muestran que ambos
métodos tienen una relación directa con la concentración celular.
Además, al comparar los métodos, tienen una alta correlación (R 2
= 0,993).

concentraciones de bacterias), aunque al tener soluciones con

bajas concentraciones de células, la ganancia del detector
aumenta para compensar la solución diluida y este pico puede
causar interferencia en la señal (Fig.4).

Figura 5- Medidas realizadas en la serie de diluciones (1: 2).

Figura 3-Escaneo EEM de una muestra de agua sin bacterias agregadas.

V. E CONFIGURACIÓN Y PRUEBAS XPERIMENTAL

Se diseñó y ensambló una configuración experimental utilizando una

impresora 3D y componentes comerciales de bajo precio. Como se
muestra en la Fig.6, el sistema está constituido por un UV-LED, CWL de 280
nm (con una salida radiante de 0,9 mW), un filtro de paso de banda de 340
nm con un ancho de banda de 20 nm ((Edmunds Optics, Reino Unido) y un
alto fotomultiplicador de sensibilidad (Hamamatsu H17023).

Figura 4-Escaneo EEM de una muestra de agua que contiene pocas bacterias
concentración.

B. Factor de correlación entre fluorescencia intrínseca y

bioluminiscencia de ATP
Un volumen inicial de 20 ml con concentración 1,54 x 10 7
Se utilizó UFC / ml. A esta solución se le aplicó una serie de diluciones
(dilución diez), con un factor de dilución de 1: 2.
Para asegurar que las medidas de Bioluminiscencia de ATP y
Fluorescencia Intrínseca, se realizaron con la misma
concentración celular, para minimizar el error, ambas muestras
para análisis se recuperaron del mismo matraz (de la serie de
Figura 6- Prototipo y esquema de instalación experimental.
diluciones) y se realizaron al mismo tiempo.

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 A AGRADECIMIENTO
Esta investigación fue apoyada por University College of Southeast
Norway en asociación con Chongqing Technology & Business
University, quienes brindaron conocimientos y experiencia que
mejoran enormemente la calidad de la investigación.

R EFERENCIAS
[1] "OMS | Agua potable," OMS, 2017. Disponible:
http://www.who.int/. [Consultado: 01-Dic-2017].
[2] “Microbiología del agua potable | Eventos Globales | Estados Unidos | Europa | Oriente Medio
| Asia Pacífico." Disponible:
https://www.omicsonline.org/conferences-list/drinking-watermicrobiology.
[Consultado: 10 de diciembre de 2017].
[3] W. Organización Meteorológica, “Planificación de los sistemas de monitoreo de
la calidad del agua Serie de informes técnicos no. 3. "
[4] J. Crocker y J. Bartram, “Comparación y análisis de costos de los requisitos
de monitoreo de la calidad del agua potable versus la práctica en siete
países en desarrollo”, Int. J. Environ. Res. Salud Pública, vol. 11, no.
7, págs. 7333–46, julio de 2014.
[5] RA Deininger y J. Lee, "Determinación rápida de bacterias en agua
potable mediante un ensayo de ATP".
[6] W. Köster et al., “Métodos analíticos para pruebas microbiológicas de la calidad del
Figura 7- Medidas realizadas en la configuración experimental. agua”.
[7] “Espectroscopia de fluorescencia: una herramienta para el estudio de plegamiento / despliegue
de proteínas”, 2007.
La E. coli La preparación se realizó siguiendo el mismo protocolo, pero el
tiempo de incubación se redujo a 170 min, dando como resultado una
[8] ABT Ghisaidoobe y SJ Chung, “Fluorescencia intrínseca del triptófano en la
detección y análisis de proteínas: un enfoque en las técnicas de transferencia de
concentración final de 8.8 x 10 7 UFC / ml. A esta solución se le aplicó una energía por resonancia de Förster”. Int. J. Mol. Sci., Vol. 15, no. 12, págs.
serie de diluciones (ocho diluciones), con un factor de dilución de 1: 2. El 22518–38, diciembre de 2014.
resultado de la Fig.7 muestra que la configuración experimental también [9] “Cuantificación de péptidos y aminoácidos mediante fluorescencia UV en
el lector de microplacas multimodo Synergy HT | 18 de abril de 2003 ". [En
tiene una relación lineal con la concentración celular, (y = 6E-08x + 0,3787,
línea]. Disponible:
R² = 0,9507).
https://www.biotek.com/resources/applicationnotes/peptide-and-amino-acid-quantification-
[Consultado: 02-Dic2017].

VI. C ONCLUSIÓN [10] Biochrom, "Medición del cultivo de células bacterianas usando Biowave II
(y CO8000)", Science (80-)., Vol. 44.
El ATP y la fluorescencia de triptófano son métodos indirectos para [11] JR Lakowicz, "Instrumentación para espectroscopia de fluorescencia 2.1.", Princ.
medir el contenido microbiano en el agua, ambos son ideales para Fluoresc. Spectrosc., Pág. 36, 2006.

aplicaciones que tienen como objetivo monitorear la calidad del agua.

La fluorescencia intrínseca de triptófano no contiene reactivos (no es
necesario preparar o mezclar la muestra) y no hay tiempo de espera
entre la absorción o la emisión de luz. Además en los últimos años,
han llegado al mercado LED Deep-UV de baja potencia, lo que
permite reducir aún más el coste. Con respecto al efecto de
dispersión Raman que obstaculizaría las mediciones de
concentraciones bajas, actualmente hay dos opciones: usar un filtro
de paso de banda óptico que bloquee el pico de 310 nm como se usa
en la configuración experimental, o cambiar la longitud de onda de
excitación a la longitud de onda más baja posible a 260 -270 nm, de
esta manera el pico se moverá a 300 nm y se evitará la interferencia.

La fluorescencia intrínseca de triptófano permite una alta

reducción en el costo de operación de los sensores y hace que este
método sea adecuado para aplicaciones de monitoreo de agua
continuo y en tiempo real.
Dado que la sensibilidad de los sistemas depende de la luz que
llega al PMT es posible incrementarla, implementando una
fuente de luz con alta potencia de salida y usando lentes ópticas
para disminuir la dispersión de la luz y enfocar la radiación en el
detector. Es necesario realizar más investigaciones para
desarrollar un sensor en línea y probar el límite de detección con
instrumentación más sensible. Además, deben realizarse pruebas
adicionales con otros microorganismos.

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