PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE

Lina Dávila Aguilera, Sarimar Hernández Tapia, Lucelys Pérez Vergara, Paola Rivera Ávila,
Jorge Ramos Berrocal.
linadavila80@gmail.com, saryh.sh@gmail.com, lucelisperez7@gmail.com,
paolandreavila15@gmail.com, ramosberrocaljorge@gmail.com
Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias
Departamento de Biología y Química
Programa de Biología
Sincelejo, Sucre, Colombia.
Marzo, 2020.

Resumen: Se usó soluciones buffer de lisis de eritrocitos, cuyos restos se eliminaron por
centrifugación. La proteínas encontradas en el suero obtenido fueron desnaturalizadas
utilizando proteinasa K y precipitadas en disolventes orgánicos como etanol, fenol y
cloroformo para la posterior eliminación del precipitado de proteínas por centrifugación para
recuperar el ADN, purificado usando isopropanol. Por medio de esta práctica, se comprender
el fundamento de el proceso de extracción de ADN en sangre que, a pesar de ser un proceso
relativamente sencillo, requiere que se le dedique un tiempo prolongado.

Palabras clave: Lisis, eritrocitos, centrifugación, precipitación.

Introducción: blancos, en cambio, poseen núcleo y por

En la actualidad, el estudio de la variación
genética entre individuos, poblaciones y
especies para explicar patrones y procesos
ecológico-evolutivos se aborda mediante
marcadores moleculares, segmentos de
ADN con o sin función conocida que
proporcionan información sobre la
variación alélica y permiten distinguir
individuos (Schlötterer 2004). [2]
Se llevó a cabo distintos protocolos con el
objetivo de obtener una cantidad y calidad
de ADN adecuados, así como garantizar la
eliminación de inhibidores potenciales que
dificulten el tratamiento posterior de la
molécula, igualmente existen métodos que
requieren preparar soluciones y la
extracción puede tomar desde unas horas
hasta varios días por los numerosos pasos
que deben realizarse.
La sangre se compone de varios tipos
celulares, los más importantes son los
glóbulos rojos y los glóbulos blancos, los
primeros carecen de núcleo pues lo
pierden durante su maduración, por lo
tanto no poseen ADN, los glóbulos
tanto ADN, entonces para obtener ADN a
partir de muestras de sangre sólo son
necesarios los glóbulos blancos. El
objetivo de la práctica realizada fue
purificar ADN a partir de muestras de
sangre.
Materiales y métodos:
Para el desarrollo de este ensayo fue
necesario usar 250 microlitros de sangre, a
la cual se le agregó un volumen dos veces
mayor de solución buffer de células rojas,
agitando por inversión varias veces para
favorecer la lisis de eritrocitos,
posteriormente fue llevado a refrigeración
por un lapso de 15 minutos, para luego
centrifugar por primera vez a 4500 rpm
durante 15 minutos a 4°C, posterior a esto
se observó la presencia de una capa de
suero, debido a que sus componentes eran
proteínas, agua y electrolitos, además de
que lo que se buscaba no se encontraba en
el fue necesario deshacerse de esta capa ya
que las proteínas presentes en el mismo
podrían llegar a ser un contaminante para
el ADN. El botón resultante después de la
centrifugación fue lavado con solución
amortiguadora repitiendo los pasos
anteriores para centrifugar por segunda
vez hasta observar el botón limpio, a este
último se le agregaron 500 microlitros de
solución amortiguadora y se agitó
ligeramente ni, además de agregar 200
microlitros de SDS 10% y 5 microlitros de
proteinasa K, Luego, se agitó en el vortex
hasta que el botón se disolvió. Después, el
tubo con su contenido se llevó a incubar a
55°C durante una hora, luego para
desechar la proteína se agregó 1 volumen
de solución saturada de cloruro de sodio 6
M, en solución son iones que se unen al
ADN de la proteína y de esta forma
favorecen la precipitación, agitando así
durante 15 segundos para centrifugar por
tercera vez a 5000 rpm durante 15
minutos. Posterior a esto el sobrenadante
obtenido (que contenía el ADN) fue
transferido a un tubo eppendorf de 1.5 ml
a el cual se le adicionaron 2 volúmenes de
etanol absoluto frío agitando por inversión
en varias ocasiones; así mismo, fue llevado
a centrifugar por cuarta vez a 12000 rpm
durante 5 minutos, para eliminar todo el
sobrenadante posible y se lavó con etanol
al 70% repitiendo el paso anterior de
centrifugación, dejando secar el ADN para
diluir con solución TE agitando levemente
el tubo que contenía el ADN para
homogeneizar y almacenar a una
temperatura baja.
Resultados:
Al analizar la mezcla de 250 microlitros de
sangre más los 500 microlitros de la
solución buffer de eritrocitos fue
apreciable el leve cambio de color que
presentó la muestra, de un escarlata
intenso (figura 1) a rojo (figura 2), color
que se mantuvo después a la primera
centrifugación (figura 3), para la segunda
centrifugación la coloración obtenida fue
un rosado ya que se le agregó la solución
amortiguadora (figura 4), después de
centrifugar por tercera vez, se apreció el
pellet y el sobrenadante obtenido (figura
5). del cual se sacó el sobrenadante para
limpiar el botón con 700 micro litros de
cloruro de sodio 6 M ya que las altas
concentraciones de NaCl se emplean para
prevenir la contaminación de la muestra
con polisacáridos que afecten la pureza del
ADN, pudiendo inhibir la actividad de
algunas enzimas como polimerasas, ligasas
y endonucleasas de restricción; la base
para la separación de los polisacáridos de
los ácidos nucleicos, es su solubilidad
diferencial en presencia de las altas
concentraciones de NaCl los polisacáridos
precipitan bajo la acción de fuerzas
centrífugas. Así mismo se agregaron 200
microlitros de SDS (Dodecil sulfato de
sodio) que es un detergente aniónico que
actúa como agente solubilizante de
proteínas y de componentes de tejidos y
membranas y también se agregó la
proteinasa K pues estos ayudan a
desdoblar las proteínas para que se
vuelven insolubles y se puedan enlazar. Se
llevó a incubar a 55ºC esto con el fin de
facilitar el rompimiento de las membranas
celulares y así dejar solo el material
genético.
Finalmente hubo que separar el ADN de la
fase acuosa, para lo cual se debió
precipitar el mismo, usando isopropanol
(figura 6), el cual es selectivo en la
precipitación del ADN en presencia de
ARN. Después de precipitado el ADN se
disolvió en una solución tampón (TE de
pH 8.0) o en agua bidestilada, [4] pero
como es evidente en la evidencia
fotográfica, no fue posible identificar la
presencia mínima de ningún filamento
adherido en el tubo eppendorf. (figura 7)
Discusión:
En el procedimiento realizado en
laboratorio, se consiguió extracción de
ADN de muestras de sangre, obteniendo
una muestra para cuantificar en la cual no
se evidenció rastro alguno de lo que se
hubiera esperado (filamentos o coágulos)
con base en los resultados obtenidos con
procedimientos anteriores de extracción de
ADN (en material vegetal y en un órgano
animal). En trabajos realizados con
anterioridad acerca del mismo
procedimiento, coinciden en que los
procedimientos que anteriormente se
realizaban para este tipo de extracción
requerían una purificación inicial de
glóbulos blancos para la posterior
extracción de ADN a partir de estos, cosa
que no sucede en la actualidad con el
avance de la técnica, que hace posible la
que se pueda extraer ADN de sangre
“entera” obteniendo buenos estándares de
pureza y haciendo el proceso un poco más
sencillo (Castillo, A. Guerrero, L. Arrieta,
V. Romero, F. S.f). En este mismo trabajo,
se concluye que los métodos salting out
son uno de los métodos de extracción de
ADN más usados por su fácil
implementación, la baja toxicidad de los
reactivos y la buena extracción de ADN
que es el fin principal de estos
procedimientos (Castillo, A. Et. Al, s.f),
pero cuyo único punto sólo sería
comprobable a la hora de realizar la
respectiva cuantificación del ADN de la
muestra que se obtuvo en esta práctica.
La proteinasa K cumple una función muy
importante en la purificación de ácidos
nucleicos, debido a su nivel de
especificidad el cual permite romper
cualquier enlace peptídico, y de esta
manera degrada todas las proteínas
presentes en la muestra. (Sambrook 1998).
En este proceso, la incubación permitió
mantener la muestra con las condiciones
necesarias hasta la próxima sesión. Por
otro lado, la centrifugación de las muestras
en diversas ocasiones permitió conseguir
una sedimentación más rápida de la
muestra y obtener rápidamente dos fases,
una sólida y una líquida pertenecientes al
pellet y sobrenadante respectivamente. El
etanol fue usado con el fin de precipitar el
ADN , ya que al ser un alcohol es menos
denso que al agua, por tal razón se situó en
la capa superior precipitando el ADN , el
cual es insoluble en altas concentraciones
de sal y alcohol .[3]
En cuanto al método, en un trabajo titulado
Análisis Comparativo de Diferentes
Métodos de Extracción de DNA y su
Eficiencia de Genotipificación en
Población Mexicana, donde se compara la
calidad y cantidad de ADN que se obtiene
en sangre basándose en distintos métodos
de extracción y purificación con el fin de
comparar los resultados obtenidos en cada
uno de ellos. En este, se obtuvo alta
variabilidad, obteniendo mayor cantidad
de ADN con métodos como el de salting
out (Ríos-Sánchez, E., Calleros, E.,
González-Zamora, A., Rubio, J., Martínez,
O. C., Martínez, A., ... & Pérez-Morales,
R. (2016).) lo que, sin embargo, no es
indicador de pureza.Más tarde, se
menciona que la calidad de DNA
purificado es clave para posteriores
análisis moleculares, sin embargo, al no
ser capaces de ver el ADN obtenido, sólo
sería posible intentar comprobar la
efectividad del método con la posterior
cuantificación del ADN que se obtuvo en
esta práctica.
Conclusiones:
-El ADN es una molécula compleja que
tiene una función fundamental para la
preservación de todos los seres vivos, es
muy importante porque se encarga de
transmitir la información contenida en los
genes de generación en generación
-La proteinasa es una enzima posee en su
centro catalítico activo un aminoácido
serina, tiene la capacidad de degradar las
proteínas presentes en las membranas
celulares, es por esta razón que se se le
utiliza en los métodos de extracción de
ácidos nucleicos.
-El ADN se encuentra presente en todos
los tejidos de los seres vivos, es decir, se
puede encontrar en todas las células a
excepción de los glóbulos rojos y estos (el
ADN) son los responsables de codificar
todo lo que nosotros somos, desde el color
del pelo hasta las proteínas que tenemos en
nuestra sangre.
Bibliografías:
● http://www.labome.es/method/D
NA-Extraction-and-
Purification.html [1]
● https://scholar.google.com/scholar?
cluster=468187670165312107&hl
=es&as_sdt=0,5&sciodt=0,5 [2]
Apéndices: (figuras)
figura 1. 250 microlitros de sangre
buffer de eritrocitos
● Sambrook J, Fritsch E &
Maniatis T (1989)
MolecularCloning: A
LaboratoryManual, 2nd edn. Cold
Spring [3]
● Dialnet-
MarcadoresMolecularesYLaExtrac
cionDeADN-6117966.pdf [4]
● http://es-
la.dbpedia.org/page/resource/Agent
e_caotr%C3%B3pico [5]
● Ríos-Sánchez, E., Calleros, E.,
González-Zamora, A., Rubio, J.,
Martínez, O. C., Martínez, A., ... &
Pérez-Morales, R. (2016). Análisis
comparativo de diferentes métodos
de extracción de DNA y su
eficiencia de genotipificación en
población mexicana. Acta
universitaria, 26(4), 56-65.
figura 2. Sangre con 500 microlitros e
figura 3. muestra posterior a primera
centrifugación figura 6. sobrenadante con alcohol
absoluto

figura 4. muestra posterior a segunda

centrifugación figura 7. resultado final de la práctica.
donde se debió observar los filamentos de
AND

(cálculos para la solución buffer de

eritrocitos)

(consultas)
1. ¿que es una sustancia
cariotípica?
Un agente caotrópico es una sustancia que
desorganiza la estructura tridimensional en
macromoléculas tales que proteínas, ADN
o ARN y las desnaturaliza. Lo realizan
figura 5. muestra posterior a tercera
actuando sobre las interacciones
centrifugación. evidencia de sobrenadante
intermoleculares no covalentes, que
y pellet
tendrían un papel estabilizador en la
molécula; algunos ejemplos de estas
interacciones son los puentes de
hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y
las interacciones hidrofóbicas. Algunos
ejemplos son la urea, la tiourea o el cloruro
de guanidinio. [5]