Instituto Politécnico Nacional

Escuela Superior de Ingeniería Química e

Industrias Extractivas

Laboratorio De Técnicas de separación.

Practica No. 2 “Influencia de la cantidad del

analito en la respuesta del cromatógrafo de
gases”.

Alumno: Torres Aguilar Yeletzin

Profesor: Luis Camacho.

Grupo: 3IM76 Fecha: 15/03/2021

Objetivos

-Inyectar diferentes cantidades de analito para observar cómo afecta las respuestas del
cromatógrafo de gases.

-Realizar una calibración con los datos obtenidos.

-Simular la cuantificación de un analito de una muestra problema.

Introducción

-Etanol

Propiedades Fisicoquímicas.

Propiedades Físicas y Termodinámicas.

Punto de fusión: -130 oC. Densidad: 0.7893 a 20 oC.

Densidad de vapor: 1.59 g /ml Punto de ebullición: 78.3 oC.

Indice de refracción (a 20 oC):1.361. Presión de vapor: 59 mm de Hg a 20 oC.

Temperatura de ignición: 363 oC Límites de explosividad: 3.3- 19 %

Temperatura de autoignición: 793 oC. Punto de congelación: -114.1 oC

Calor específico:(J/g oC): 2.42 (a 20 oC). Conductividad térmica (W/m K): 0.17
(a 20 oC).

Momento dipolar: 1.699 debyes. Constante dielétrica: 25.7 (a 20 oC).

Solubilidad: Miscible con agua en todas proporciones, éter, metanol, cloroformo y

acetona.

Temperatura crítica: 243.1 oC. Presión crítica: 63.116 atm.

Volumen crítico: 0.167 l/mol. Tensión superficial (din/cm): 231 (a 25

oC).

Viscosidad (cP): 1.17 (a 20oC). Calor de combustión (J/g): 29677.69 (a

25 oC)

Calor de fusión (J/g): 104.6

Calor de vaporización en el punto normal de ebullición (J/g): 839.31.

El etanol es un líquido inflamable cuyos vapores pueden generar mezclas explosivas e
inflamables con el aire a temperatura ambiente.

Propiedades Quimicas:

Se ha informado de reacciones vigorosas de este producto con una gran variedad de

reactivos.

En general, es incompatible con ácidos, cloruros de ácido, agentes oxidantes y

reductores y metales alcalinos.

pH: neutro Solubilidad: Miscible con agua

-Aplicaciones del Etanol

De manera natural, se obtiene a través de fermentación, por medio de levaduras a partir

de frutas, caña de azúcar, maiz, cebada, sorgo, papas y arroz entre otros, generando las
variadas bebidas alcohólicas que existen en el mundo. Después de la fermentación
puede llevarse a cabo una destilación para obtener un producto con una mayor cantidad
de alcohol.
El etanol se utiliza industrialmente para la obtención de acetaldehido, vinagre,
butadieno, cloruro de etilo y nitrocelulosa, entre otros. Es muy utilizado como
disolvente en síntesis de fármacos, plásticos, lacas, perfumes, cosméticos, etc. También
se utiliza en mezclas anticongelantes, como combustible, como antiséptico en cirugía,
como materia prima en síntesis y en la preservación de especímenes fisiológicos y
patológicos.

El llamado alcohol desnaturalizado consiste en etanol al que se le agregan sustancias

como metanol, isopropanol o, incluso, piridinas y benceno. Estos compuestos
desnaturalizantes son altamente tóxicos por lo que, este tipo de etanol, no debe de
ingerirse.

-¿Como se modifica la respuesta de un cromotagrafo con respecto a la cantidad de

analito inyectado?

Para que la separación sea eficaz es necesario un sistema que permita la introducción de
una muestra de tamaño adecuado de forma rápida. La introducción de muestras grandes
o demasiado lentamente provoca la aparición de bandas anchas lo que se traduce en una
resolución pobre. El método más sencillo de introducción de la muestra es el empleo de
una microjeringa. La muestra se inyecta a través de un tapón de goma (septum) en una
cámara de vaporización situada en la cabeza de la columna. La temperatura de esta
cámara está unos 50 grados centígrados por encima de la temperatura de volatilización
del componente menos volátil de la muestra. El volumen de muestra inyectado es de
unos pocos microlitros. Las columnas denominadas capilares necesitan mucha menor

cantidad de muestra, por ello suele usarse un divisor de muestra, que permite pasar a la
columna sólo una pequeña fracción del volumen inyectado desechando el resto.
-¿Por qué el area y altura de pico cromatografico son buenas medidad para calibrar el
equipo?

El tamaño de los picos y el tiempo de retención se usan para establecer la determinación

cuantitativa y cualitativa de un compuesto respectivamente. En primer lugar, es necesario
analizar una cantidad conocida de una muestra auténtica pura del compuesto para
determinar el tiempo de retención y el tamaño de los picos. Después este valor se puede
comparar con los resultados de una muestra desconocida para determinar si está presente
el compuesto de interés (mediante
la comparación de los tiempos de retención) y en qué
cantidad (mediante la comparación
del tamaño de los picos).

El cromatógrafo ideal tiene picos con muy poca separación que no se solapan (coelución).
Esto es muy importante por dos motivos. En primer lugar, la coelución no permite medir
los picos con exactitud. En segundo lugar, si dos picos tienen el mismo tiempo de
retención, ninguno de ellos se puede identificar exactamente. Sin embargo la presencia
de los picos indican cuántos componentes pueden haber en la muestra; es por eso que
resulta practico calibrar el equipo basándose en los picos de alguna sustancia ya conocida.

-Investigar como se realiza la calibración por estandar externo de un cromatografo.

1. Preparar una serie de disoluciones de concentraciones crecientes, del patrón

correspondiente al compuesto a cuantificar. El intervalo de concentraciones ha
de ser similar a la concentración del analito en la muestra problema.
2. Inyectar el mismo volumen de cada una de las disoluciones patrón en el
cromatógrafo, así como del extracto de la muestra. De esta forma tendremos los
distintos cromatogramas de los patrones (un cromatograma para cada disolución
patrón) y el cromatograma de la muestra.
Procedimiento

-Encendido del equipo Autosystem XL

Primero buscar las tres válvulas de gases que tenemos de argón, hidrogeno y aire.

• Las válvulas corresponden a los

gases de la fase móvil y los dos
auxiliares para el encendido de una
flama.
• Todas las válvulas cierran en el
sentido de las manecillas del reloj y
se debe asegurar que las tres válvulas
que están a un lado del panel de
control. (Del lado que se indica en la
imagen)

• Se realiza esto porque tenemos que

asegurarnos de que al abrir los
tanques de gas no llegue una
gran cantidad de presión muy
fuerte de gases ya que pudiera
descomponerlo.
• Se abre la puerta del horno del
cromatógrafo para tomar datos
de la columna.

• Se tiene una columna que sirve para hacer la separación de los componentes de
la muestra y que se pueda hacer alguna medición con ellos.
• La etiqueta de la columna tiene que tener estas características:

Fase: Polietilenglicol.

Longitud: 30 cm.
Diámetro interno: 0.25 mm. Espesor: 0.25 μm.
Rango: 20 a 240 °C. Sangrado: 250 °C.

• Se tiene que abrir la puerta del horno antes de encenderlo, porque ya cuando lo
prendemos ya no vamos a poder abrir la puerta.
• Después se tiene que ir hasta la jaula de los tanques donde se encuentran
almacenados lejos de cualquier situación que pudiera genera accidentes.
• Se tienen tres tanques el de argón (Ptanque=1500 psi, Pregulada=80 psi),
hidrogeno (Ptanque=500 psi, Pregulada=0 psi) y aire (Ptanque=900 psi,
Pregulada=60 psi).
• ⬧ La válvula tiene un manómetro del lado que está conectado al tanque, que
mide la presión que hay interna del tanque y después al pasar por el dispositivo
regular dudas depresión, el cual se tiene otro medidor de presión que nos va a
decir a que presión esta saliendo y llegando al cromatógrafo.

• ⬧ Este es el arreglo de tuberías que se va a tener el servicio de los fluidos de

servicio y acarreador del cromatógrafo.
• ⬧ Se tiene un cilindro de hidrogeno y uno
de aire que nos va a generar una flama en el
detector
• ⬧ Se tiene un cilindro de argón que será el
gas alrededor.
• ⬧ Todas las líneas de gas deben tener
trampas para hidrocarburos,
 agua, que nos pudieran generar algunos
problemas en la medición.

• Regresando al cromatógrafo lo que se va a

hacer es abrir la llave de argón.

• Y se darán dos vueltas completas a la

manivela.
• Y se va a conectar el regulador de energía
al enchufe.
• Una vez enchufado podemos encender el cromatógrafo.
• También se enciende la computadora que controla el cromatógrafo.
• El tiempo que se necesita entre lo que se abre la válvula y prender el

cromatógrafo luego de dejar pasar aproximadamente 1 minuto y medio para

permitir el flujo del argón hasta la columna.

-Apagado del equipo Autosystem XL

-Se verifica una vez encendido el cromatógrafo las condiciones de apagado, las cuales
son las condiciones en las que lo dejo la última persona que lo utilizo.

-Sabemos de checar en estos 6 botones.

La presión del gas acarreador debe ser 3 psi, 3 psi es el valor mínimo que tiene que
tener el cromatógrafo para asegurarnos de que el flujo de fase móvil en la columna si no
tenemos flujo desde fase móvil o que podemos provocar es que acortemos la vida útil de
la columna.

o El tiempo de análisis debe ser de 99 minutos.

o El valor de arriba es el valor actual y el de abajo es el setpoint
-Vamos a esperar a que empiece a ajustarse o aparecer los datos del setpoint con el
actual.

-El arngon nos da un nivel de amplificación de la señal del detector,para las condiciones
de apagado se necesita entre 1-20.

o Verificar que la rampa tambiént enga un valor de cero,esto nos indica que no hay
incremento de temperatura.

o Abrir las dos llaves que faltan, la de hidrogeno y la llave de aire.

o Para encender la flama utilizamos los botones, enter, detector y set. o Temperatura
mínima de 100°C

o Hacer una limpieza de la columna

cromatográfica con las siguientes condiciones.

o La flama debe de estar encendida con un rango

de 20 da un valor de 1.7 y si esta apagada da un
valor de 0.001.

o Cuando ya se hallan llegado los valores al nivel

del setpoint ya se puede hacer la corrida de
limpieza.

o Cuando ya se llegaron a las condiciones

deanálisis presionar el botón ground.

o Duranteunacorridadelimpiezasolamentesepuedeverelruidoenla señal de el detector el

ruido es la señal aleatoria.

- Creación de un método de análisis usando el programa Total Chrom

➢ El programa sirve para controlar el método de análisis.

➢ El botón que me ayuda a controlarlo es este

• ➢ Aparece esta ventana que te indica con que nos indica con que equipo se va a
trabajar y lo seleccionamos.

• ➢ Luego aparecerá resta ventana que es el inicio de la creación de un método.

• ➢ Seleccionamos la segunda plantilla del menú.

➢ Y escribimos las siguientes condiciones:

➢ Enseguida presionamos ok y aparece la siguiente ventana.

➢ AL presionar la siguiente pestaña, nos graficara los datos del canal y escribir las
siguientes condiciones:
➢ Enseguida aparece la ventada del control del horno y el inyector, cambiando lo
siguiente:

• ➢ La temperatura de sangrado es una característica que se debe observar para

cuando se está generando un método cromatográfico.
• ➢ El tiempo de equilibrio es el tiempo que va a esperar el cromatógrafo

después de haber alcanzado todas las condiciones del parámetro

que se establecieron.

• ➢ El tiempo de equilibrio es de 2 min y esto se hace para ver que no va

a haber variación y que se puede trabajar con toda normalidad.

• ➢ Cuando se tiene un análisis isotérmico nos damos cuenta porque en

la grafica del horno se observa solamente una línea horizontal.

• ➢ En la siguiente pestaña tenemos la presión del gas acarreador que para el

análisis se habían establecido las siguientes condiciones
➢ En la siguiente pestaña tenemos los detectores, se cambian las siguientes
condiciones:

➢ En la siguiente ventana se tienen los eventos programados en el tiempo.

• ➢ Cuando se hace la limpieza se necesita que el Split este cerrado y cunado
estemos realizando el trabajo de análisis el Split necesitara estar abierto.
• ➢ La última pestaña que aparece es la siguiente en la que se pone la
descripción del método.

• ➢ Presionando ok nos pedirá que indiquemos la ruta donde se va a guardar el

método de análisis.
• ➢ Se vuelven a indicar las condiciones de apagado.

• ➢ Cuando se llegue a 100 en la temperatura del detector, se comienza a cerrar

las válvulas de aire y de hidrogeno.
• ➢ Y se espera de 10 a 20 segundos para ver que la flama se apague.
• ➢ Después se espera a que la temperatura del inyector llegue a 60°C.
• ➢ Y en cuanto se llegue a ese valor se puede apagar el cromatógrafo y
 se apaga la válvula de argón, se puede apagar la computadora y

enseguida apagar el regulador.

• ➢ Finalmente se va a la válvula te tanques y se cierra la válvula.

 -Diagrama para el uso de la jeringa de cromatografía para ingresar la muestra en el
equipo de cromatografía de gases.

La jeringa Microlitros es sensible a volúmenes Se toma la muestra de un vial y se realizan 5

pequeños; funciona como una jeringa normal. lavados; esto para que la muestra penetre
en toda la jeringa y no presente
interferencia.

En seguida se procede a inyectar tomando en

cuenta que se debe colocar los dedos alrededor
para que el embolo no se mueva de la jeringa.

Se añade aire hasta el volumen deseado

menos 10; por ejemplo si se necesitan
agregar 2 microlitros de muestra, llenamos
de aire hasta 8 microlitros y añadimos los 2
microlitros restantes para llegar a los 10
microlitros deseados.

Luego de iniciado el programa se muestra en el

computador.
Datos Experimentales

Inyección Vol (mL) tR (min) Area Altura A/H (s)

(mV.s) (mV.s)
1 0.1 2.170 27929 3955 7.0583
2 0.2 2.103 105700 16430 6.4686
3 0.3 2.039 274814 42311 6.4950
4 0.4 2.017 513747 76750 6.6938
5 0.5 1.978 806026 115412 6.9839

-Grafica: Volumen vs Tiempo de Retención

Volumen vs Tiempo de retención

2.2
0.1
2.15
Tiempo de Retención

2.1 0.2

2.05 Series1
0.3
0.4
2
0.5, 1.978
1.95
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volumen

Análisis:
Por el comportamiento de esta grafica podemos comprender que el tiempo de retención
disminuye con forme el volumen del analito aumenta; esto se debe a que al aumentar el
volumen del analito disminuye la eficiencia con la que las moléculas son atraídas pues
causa mas competencia entre las moléculas por ser atraídas por la fase estacionaria.
-Grafica: Volumen vs Área de Pico

Volumen vs Área de Pico

900000
800000 0.5, 806026
700000
600000
Área de Pico

500000 0.4
400000
Series1
300000 0.3
200000
100000 0.2
0 0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volumen

Análisis:
Por el comportamiento de la grafica podemos observar que a ritmo que aumenta el
volumen del analito el pico se hace mas grande y mas ancho por lo que es necesario que
las muestras sean pequeñas; pues esto evitara este tipo de picos que son engañosos al
momento de leer.
-Grafica: Volumen vs Altura de Pico

Volumen vs Altura de Pico

140000

120000
0.5, 115412
100000
Altura de Pico

80000 0.4
60000
Series1
40000 0.3

20000 0.2
0 0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volumen

Análisis:
De a cuerdo a la grafica de volumen vs Altura de pico podemos observar que con forme
aumenta el volumen del analito, también aumenta la altura del pico esto debido a que el
detector reacciona a la cantidad de analito ingresado; por lo que se recomienda tener
muestras pequeñas.
Cálculos

a) Utilizar el método de estándar externo para realizar la calibración del

equipo usando área y altura.

Volumen vs Altura de Pico

140000

120000 y = 435229x2 + 22097x - 3532.6

0.5, 115412
R² = 0.999
100000
Altura de Pico

80000 0.4
60000 Series1

0.3 Poly. (Series1)

40000

20000 0.2
0 0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volumen

A=30 000 µV.s

Volumen vs Área de Pico

900000
800000 y = 4E+06x2 - 173623x + 5788.4 0.5, 806026
R² = 0.9996
700000
600000
Área de Pico

500000 0.4

400000 Series1
300000 Poly. (Series1)
0.3
200000
100000 0.2
0 0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volumen

A=600 000 µV.s

b) Calcular el contenido de etanol en una muestra ficticia usando la
calibración anterior.

Masa= Densidad x Volumen

m = (0.798mg/µL) (0.4335 µL) = 0.345933 mg

m = (0.798mg/µL) (0.2535 µL) = 0.202293 mg

Conclusiones y Recomendaciones.

Con base a lo estudiado anteriormente en la practica No. 2 del laboratorio de Técnicas

de Separación podemos concluir que durante la practica pudimos reafirmar los
conocimientos adquiridos en la practica anterior, como son los pasos de encendido,
calibración, uso y apagado del equipo, al igual que conocimos puntos clave y necesarios
para que la practica se pudiera desarrollar de la mejor manera; alguno de los mas
importantes son: agregar todos los datos correctamente, al momento de inyectar la
muestra tener cuidado con la aguja pues la jeringa es muy débil y es posible que rompa,
al igual que es necesario ingresar una muestra lo mas pequeña posible pues facilita el
análisis, pues muestras grandes generan interferencias.
Bibliografía.

Fernández I, García E, Cuantificación de compuestos por cromatografía: Método del

Patrón Externo (sitio web), España, ETSIAMN - Universitat Politècnica de València,---
.(https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16719/M%E9todo%20Patr%F3n%20Exte
rno.pdf;jsessionid=915E04A8627F34840FFCCD98BACD5B50?sequence=1) ,
(consulta: 15 Marzo 2021).

González M, Sacristán M, Díaz E, Alarcón B, Vicente C, Curso de cromatografía de

líquidos de alta resolución (HPLC): Prácticas de laboratorio y cuestiones teórico-
prácticas. Parte I.Introducción y práctica de laboratorio: cálculo de la eficiencia y
representación gráfica de la ecuación de van Deemter (sitio web), España, Universidad
Complutense de Madrid,2011, (https://webs.ucm.es/info/cvicente/reduca/5.pdf),
(consulta: 15 Marzo 2021).