NMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

En la actualidad, la industria
requiere gran cantidad de enzimas
con el fin de obtener productos con
mejores
características y menor costo. Por
ello, la implementación de
procedimientos que aumenten la
estabilidad de las
enzimas y permitan su reutilización
ha sido por muchos años el objetivo
de diversos laboratorios alrededor
del
mundo. La preparación y
estabilización de enzimas ha sido un
tema de estudio desde hace casi 50
años (Piug-
Muset, 1964) y es de interés tanto
científico como económico.
La inmovilización combina la
actividad elevada y específica de las
biomoléculas activas, como las
enzimas o
anticuerpos, con la estabilidad
química y mecánica del soporte.
Consiste en mantener la biomolécula
unida o
atrapada en un soporte físico,
conservando su actividad catalítica y
permitiendo el flujo de sustratos y
productos. Las
enzimas pueden ser inmovilizadas en
sustratos naturales y/o sintéticos por
medios químicos (uniéndolas al
sustrato
mediante enlaces covalentes) o físicos
(fuerzas electrostáticas o membranas),
y pueden además ser encapsuladas
mecánicamente la adición de agentes
que formen una película protectora
alrededor de la enzima inmovilizada,
permitiendo el paso de reactivos y
productos de pequeño tamaño, pero no
de proteínas (Heering et al., 2004;
Wang
y Caruso, 2005).
Las enzimas inmovilizadas presentan
varias ventajas sobre su contraparte en
solución. Permiten un uso continuo,
reutilización y control de las
concentraciones de proteína empleada.
Asimismo, es viable mejorar la
estabilidad y
actividad de la enzima en función del
pH y la temperatura, además, al ser
inmovilizadas quedan protegidas ante
enzimas proteolíticas, aumentando
así la eficiencia del sistema. Sin
embargo, la inmovilización también
puede
presentar ciertas desventajas, por
ejemplo, la actividad de la enzima
puede verse afectada por el proceso
de
inmovilización, además, la velocidad
de reacción puede estar limitada por
la velocidad de difusión de sustratos y
productos hacia dentro y fuera del
sistema.

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2.1 Clasificación de métodos de
inmovilización
Los métodos de inmovilización de
enzimas se clasifican en dos rubros:
métodos reversibles y métodos
irreversibles
(Gupta y Mattiasson, 1992).
2.1.1 Métodos de Inmovilización
Irreversibles
El concepto de inmovilización
irreversible implica el enlace del
biocatalizador a un soporte de manera
permanente,
por lo cual el biocatalizador no puede
ser liberado sin destruir o modificar
su actividad biológica o el soporte.
Los
procedimientos más comunes de
inmovilización irreversible son el
enlace covalente, enlace cruzado,
atrapamiento y
micro encapsulado.
a) Formación de enlaces covalentes
La inmovilización de proteínas por
métodos basados en la formación de
enlaces covalentes están entre los más
usados. La ventaja de estos métodos
estriba en la naturaleza estable de los
enlaces formados entre las enzimas y
el
soporte. De igual manera, las enzimas
en este método no son liberadas en la
solución en uso. Sin embargo, para
lograr altos niveles de enlace, los
residuos de aminoácidos esenciales
para la actividad catalítica no deben
involucrar un enlace covalente con el
soporte aunque esto puede resultar
difícil de lograr en algunos casos.
Los métodos covalentes de
inmovilización son empleados cuando
existe un requerimiento estricto de
ausencia de
enzimas en el producto.
Los métodos de acoplamiento en
general pueden dividirse en 2 clases:
1) activación de la matriz o soporte
por
adición de una función reactiva en un
polímero y 2) modificación del
polímero para producir un grupo
activado. Los
procesos de activación son
comúnmente diseñados para generar
grupos electrofílicos en el soporte, el
cual durante
el acoplamiento reaccionan con los
fuertes nucleófilos en las proteínas.
Los principios básicos que controlan
el
acoplamiento covalente con matrices
son análogos con las usadas en la
modificación química de proteínas.
Las
reacciones más usadas involucran las
siguientes cadenas de amino ácidos:
lisina (grupo amino), cisteína (grupo
tiol), y ácidos aspártico y glutámico
(grupo carboxilo).
En este método se enlaza
covalentemente la enzima con un
soporte insoluble natural o sintético.
El enlace se da
entre algún grupo funcional reactivo
de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-
hidroxil o His-imidazol) y el
soporte
previamente activado, generalmente
recubierto con grupos funcionales
orgánicos en la superficie
(Monocapas tiol
autoensambladas, oro, CNBr-
Sepharosa, etc.) (Figura 1). El
seguimiento de la inmovilización se
realiza
cuantificando la concentración de
proteína libre (generalmente por el
método de Bradford), y de la
proteína unida
covalentemente al soporte (ej. ácido
bicinconínico). Las desventajas de este
método radican en el sitio del enlace,
ya que puede modificarse el sitio
activo o pueden ocurrir impedimentos
estéricos que reduzcan la actividad.
Sin
embargo, esto es poco probable y
puede verse reducido al dirigir el
enlace a sitios específicos y/o con
una
orientación molecular definida
(Wood et al., 1997; Heering et al.,
2004). Además, la unión por enlace
covalente
confiere a la enzima una
inmovilización más estable a cambios
de pH y temperatura en el medio
(Queiroz-Claret et
al., 1997).
Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un
soporte físico por enlace covalente, las
enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
Enzima inmovilizada y
orientada mediante
enlace covalente
Soporte con grupos
funcionales en la superficie
Sitio de enlace
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b) Formación de enlaces cruzados
Con esta técnica los soportes no son
necesarios, ya que la inmovilización se
da por un enlace directo entre enzimas,
que puede ser mediado o no por un
agente de unión. Generalmente se
añade el agente de bajo peso molecular
(ej.
glutaraldehído) a la enzima en
solución, uniendo covalentemente los
grupos funcionales de las enzimas para
formar
agregados (Figura 2). Este método
tiene como ventaja su sencillez, sin
embargo, es susceptible a cambios
pequeños de pH y temperatura en las
condiciones de operación (Gódia-
Casablancas, 2005).

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por

enlaces cruzados (líneas negras).
c) Atrapamiento
El método de atrapamiento está basado
en la oclusión de las enzimas dentro de
una red polimérica que permite al
sustrato y a los productos pasar a
través de ellos y retener las enzimas
(O’Driscoll, 1976). Este método difiere
de
los métodos de acoplamiento covalente
descritos anteriormente, ya que las
enzimas no están enlazadas a la matriz
o soporte. Existen diversos métodos
de atrapamiento de enzimas como
el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o
atrapamiento por fibras (Dinelli et al,
1976), microencapsulado (Wadiack y
Carbonell, 1975) y por inclusión. El
uso
práctico de estos métodos es limitado
debido a la baja transferencia de masa
a través de las membranas o geles.
Atrapamiento por inclusión. Con este
método la enzima queda atrapada
dentro de una matriz de gel que
permite
una fácil difusión de productos. La
matriz puede ser de origen natural o
sintético y de diversos materiales
(Sílica gel,
poliacrilamida, agarosa, carregnatos,
entre otros), y pueden clasificarse
como geles húmedos, geles secos
(xerogeles) o geles en aerosol
(aerogeles) (Figura 3). En este
método las enzimas son colocadas en
una solución
que posteriormente es gelificada (por
temperatura o adición de
polimerizantes), quedando atrapadas
dentro de la
matriz (Figura 3A). En algunos casos
el gel es sometido a un proceso de
secado y molido, obteniendo así
mayor
área de contacto entre la enzima y la
solución que contiene el sustrato
(Figura 3B), dando como resultado
esferas
de 2 µm con un tamaño de poro de 35
± 7 Å (Mureseanu et al., 2005).
También es posible incrementar la
capacidad
de inmovilización de los geles al
utilizar agentes estabilizadores
(sorbitol, polietilenglicol, diferentes
mono- o
disacáridos) y surfactantes (lecitina,
lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina,
bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB))
(Mureseanu et al., 2005), o al añadir
agentes policatiónicos o polianiónicos
con carga contraria a la enzima o a
regiones de la superficie de la
misma como el poli(1-vinilimidazol)
(PVI) y la poli(etilamina) (PEI)
antes de la
polimerización (Chen et al., 1998).
La inclusión tiene la ventaja de
prevenir el acceso de proteasas y
mantener
intacta la estructura de la proteína, por
lo que su actividad no se ve afectada.
Sin embargo, el tamaño de los poros
no puede ser controlado, es difícil de
escalar y reutilizar ya que el gel puede
disolverse bajo ciertas condiciones o
tras poco tiempo de uso, y un
aumento en la cantidad de enzima
cargada más allá de cierto punto no
implica
necesariamente un aumento de la
actividad, debido a las limitantes de
difusión que se podrían presentar.
Proteína inmovilizada
Agente de unión
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