Maracuya Gulupa Sennova 1

MANUAL PARA EL
ANÁLISIS
DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS
Aplicaciones en el Estudio de GULUPA
Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-
CompartirIgual 4.0 Internacional.
MANUAL PARA EL
ANÁLISIS
DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS
Manual para el Analisis de Biocompuestos en Frutas. Aplicaciones en el
Estudio de GULUPA/ Quiceno, J., Ospina, L., David, D., Román, M., Betancur, M.,
Cadavid, N., Cardona, L., Muñoz L., Imbachí, P., Martínez, B., Passaro, C. -
Rionegro: Servicio Nacional de Aprendizaje, 2017.
40 p.; 16,5 cm x 23 cm
Código ISBN: 978-958-15-0278-3
Manual para el Analisis de Biocompuestos en

Frutas. Aplicaciones en el Estudio de GULUPA
Autores
Juan Manuel Quiceno Rico, Biólogo con
Especialización en Gestión Ambiental y M.Sc. con
Especialidad en Biotecnología de Plantas
Leopoldo Andrés Ospina Arbeláez, Agrónomo,
José Antonio Lizarazo Colombiano, leospinarbelaez@gmail.com
Director general (e) Dorely David Gómez, Ingeniera Biológica, M.Sc.
Ciencia y Tecnología de alimentos
Melissa Andrea Román Páez, Química con
Juan Felipe Rendón Ochoa Especialización tecnológica en calidad de aguas,
Director Regional Antioquia validación de métodos analíticos
María Isabel Betancur Nieto, Ingeniera Química y
Jorge Antonio Londoño Magíster en Ingeniería Agroindustrial
Natalia Cadavid Muñoz, Química Farmacéutica con
Subdirector Centro de la Especialización en Estadística y Magíster en Química
Innovación la Agroindustria y la Liliana María Cardona Bermúdez, Zootecnista y M.Sc.
Aviación Biotecnología
Laura María Muñoz Echeverri , Ingeniera Biológica y
M.Sc. Biotecnología
Luisa Fernanda Granger
Paola Catalina Imbachí Narváez, Ingeniera
Serrano Agroindustrial con Especialización en Ciencia y
Líder SENNOVA Tecnología de Alimentos Bladimir Antonio Martínez
Varela, Tecnólogo de Alimentos
Esteban Ocampo Catarina Pedro Pássaro Carvalho, Ing. Agronomo y Ph.D.
Ing. Alimentos
Dinamizador Tecnoparque Nodo
Rionegro
ISBN: 978-958-15-0278-3
Adel II González Alcalá © Servicio Nacional de Aprendizaje - SENA

Instructor SENNOVA
Diseño, diagramación e impresión:
Divegráficas Ltda.
Hecho el depósito que exige la ley
Este libro, salvo las excepciones previstas por la Ley, no puede ser reproducido por ningún
medio sin previa autorización escrita del autor.
Los textos publicados son de propiedad intelectual de los Autores y pueden utilizarse con
propósitos educativos y académicos, siempre que se cite al autor y la publicación. Las opiniones
aquí contenidas son de responsabilidad exclusiva de los autores y no reflejan necesariamente el
pensamiento del editor ni del SENA.
Este libro es producto del proyecto de investigación “Genotipo-ambiente y composición funcional de
frutos de gulupa: una estrategia de valor agregado para el fortalecimiento del sector en el Oriente
Antioqueño (01-2017-TPRionegro)”, financiado por el Sena en el marco del Sistema de Investigación
del Sena SENNOVA y que ha sido ejecutado por Grupo de Investigación Interacción Genotipo-
Ambiente y Calidad de frutas, código COLCIENCIAS COL0106783 en el año 2017.
Rionegro, Colombia. Noviembre, 2017.
ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS
Introducción
Los cambios en la alimentación siempre han ido muy de la
mano con los cambios culturales y económicos concurrentes en
la sociedad. Desde la época en que nuestros ancestros cazaban
y cultivaban sus propios alimentos, hasta el día de hoy en que
nos invaden los conservantes y los alimentos ultra procesados,
se han visto modificaciones en la calidad de los productos
alimenticios que han ido muy de la mano con los cambios
socioculturales y socioeconómicos concurrentes. Algunas de las
consecuencias inherentes a dichos cambios, y que se le han
sumado al crecimiento poblacional acelerado de la actualidad,
han sido la hambruna y la malnutrición. Tanto ha sido la
preocupación mundial por dichas problemáticas, que a finales
del año 2015 fue propuesta la Agenda 2030 sobre los Objetivos
del Desarrollo Sostenible (ODS), como una estrategia mundial
que al pretender continuar con el legado de los Objetivos del
Milenio, plantea entre sus metas para el año 2030 poner fin al
hambre, lograr la seguridad alimentaria y la mejora de la
nutrición, promover la agricultura sostenible, garantizar una vida
sana, promover el bienestar para todos en todas las edades y
garantizar modalidades de consumo y producción sostenibles1.
Iniciativas encaminadas a reducir la subalimentación y la

malnutrición, proponen entonces mejorar los rendimientos en la
producción de alimentos al igual que mejorar la calidad
nutricional de los mismos. Si bien la calidad puede ser algo
objetivo o subjetivo según el contexto, representa aquellos
parámetros o características que debería cumplir un producto
para llevar al consumidor a tomar la decisión de adquirirlo. De
esta manera, la calidad de un alimento no solo tiene que ver con
las características físicas (observables), sino también con las
propiedades fisicoquímicas que influyen sobre las cualidades
organolépticas y nutricionales de la misma, lo que lo vuelve más
3
o menos atractivo al comprador2.
Se conoce que los alimentos de origen vegetal como frutas,
hortalizas, granos o cereales, etc., son productos de gran interés
no sólo porque proveen de azúcares, vitaminas, minerales y otros
nutrientes esenciales para la vida, sino también porque son una
fuente abundante de compuestos bioactivos, que aunque no tienen
una función nutricional definida si ayudan a promover la salud y a
prevenir enfermedades como las cardiopatías y el cáncer; motivos
que los hacen atractivos para ser incorporados en la dieta diaria3-5.
La tendencia mundial hacia un mayor consumo de frutas y

verduras para mantener una buena salud, sumado a la
preocupación por lo que llega finalmente a la mesa, hace
evidente la necesidad de conocer cuáles pueden ser esas
propiedades fisicoquímicas que influyen en la calidad de los
alimentos que se consumen en fresco o que sirven como
materia prima para alimentos procesados, y que los hacen más
llamativos para el consumidor6. Es así como el conocimiento
sobre los fitoquímicos que poseen los frutos, verduras, granos,
etc., son datos de relevancia en el mercado alimentario de hoy,
y su determinación se convierte en una oportunidad para darle
valor agregado no solo a los productos en fresco sino a
productos elaborados a partir de ellos; de manera que se pueda
apoyar la lucha contra la malnutrición.
Esta cartilla fue concebida para brindar al lector una información

básica sobre algunos de los compuestos bioactivos encontrados
en frutos y verduras, al igual que se detallan ensayos de
laboratorio empleados para medirlos a partir de matrices
vegetales o alimentos.
ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN
FRUTAS
¿POR QUÉ Colombia goza de tener una posición geográfica y

ES ÚTIL
climática estratégica, que le permite producir gran
ESTA
diversidad de frutos y verduras durante todo el año.
INFORMACIÓN
Esta característica la convierte en una dispensa
EN EL
hortofrutícola importante para el mundo, lo que
ESTUDIO DE
se ve reflejado al tener gran variedad de productos
FRUTAS
COMO LA compitiendo por el mercado internacional. Tal es el
GULUPA? caso del plátano, aguacate, gulupa, uchuva, piña,
bananito bocadillo, lima Tahití y mango, como
protagonistas de más del 70% de las exportaciones
del país7.
Es de resaltar el caso de la gulupa (Passiflora

edulis Sims f. edulis), curuba redonda o curuba
morada como también se le conoce. Esta fruta
pertenece a la familia de las Passifloras donde
también se encuentran la granadilla y el maracuyá, y
fue la cuarta fruta más exportada en el país en el
año 2016, con más de 6.000 toneladas según lo
reporta la Asociación Nacional de Comercio
Exterior8. Es una fruta que tiene gran acogida debido
a su sabor, aroma, presencia de vitaminas y
antioxidantes, estos últimos compuestos de
importancia nutricional y médica por su capacidad
anticancerígena9-10.
Conocer algunos aspectos de importancia nutricional

con repercusiones sobre la salud de los
consumidores en nuestras frutas y verduras, se
convierte entonces en una oportunidad para
otorgarle más características de calidad a los
5
producto
s que
comerci
alizamos
, más
cuando
son de
talla
internaci
onal.
6
¿QUÉ SON LOS Se conoce como fitoquímico bioactivo a todo

FITOQUÍMICOS compuesto químico obtenido de las plantas que no
BIOACTIVOS? es considerado un nutriente, pero que su consumo
se ha correlacionado con la mejora en la salud y la
reducción en el padecimiento de enfermedades
crónicas. Al parecer se conocen más de 5000
componentes fitoquímicos provenientes de frutas,
verduras y granos, pero se estima que la lista de
los que se desconocen y como consecuencia sus
beneficios, pueden ser mayor11.
Se ha propuesto que la actividad sinérgica entre

los fitoquímicos presentes en frutas y verduras
es la responsable de la actividad antioxidante,
anticancerígena y demás beneficios para la salud
que pueden tener. Esto explica el hecho de que un
solo antioxidante no es capaz de reemplazar la
acción combinada que se consigue cuando
incorporamos frutas y verduras en la dieta 12.
Seconocenvariostiposdecompuestosbioactivosque
se han clasificado como carotenoides, compuestos
fenólicos, alcaloides, compuestos nitrogenados y
compuestos organosulfurados12 (Fig. 1). Los más
estudiados entre todos estos grupos de fitoquímicos
han sido los carotenoides y los compuestos
fenólicos, los cuales se describen más adelante.
¿QUÉ SON LOS La oxidación es una reacción química que
ANTIOXIDANTES? involucra la transferencia de electrones desde una
molécula donadora hacia una molécula receptora
(denominada agente oxidante), quien se reduce en
el proceso. Como resultado de dicha reacción se
pueden generar especies químicas con electrones
desapareados denominadas radicales libres, que
son inestables y altamente reactivas13. La
reactividad de los radicales libres puede afectar
biomoléculas como el ADN, proteínas,
carbohidratos y lípidos; lo que ocasiona
desequilibrio,
daño celular y
hasta muerte
celular .
14
FRUTAS
Figura 1. Clasificación de los Compuestos Bioactivos o

Fitoquímicos de importancia alimenticia y nutricional12.
Los radicales libres y otras especies reactivas de oxígeno (ROS, por

sus siglas en inglés), pueden ser producidas mediante el metabolismo
celular normal o por la exposición a rayos X, ozono, humo de cigarrillo,
contaminantes del aire, químicos industriales, entre otros15. Los
radicales libres oxigenados más importantes por su alta reactividad y
por estar implicados en patologías son el radical hidroxilo, radical
anión superóxido, peróxido de hidrógeno, singulete de oxígeno,
hipoclorito, radical de óxido nítrico y radical peroxinitrito14.
7
Para prevenir los daños ocasionados por los radicales libres, las
células cuentan con mecanismos de defensa denominados
antioxidantes que mantienen el balance celular oxidativo. Cuando se
rompe el equilibrio entre la producción de radicales libres y las
defensas antioxidantes, se produce daño oxidativo a especies
moleculares como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Si esto ocurre
se dice que en la célula hay estrés oxidativo16.
Los ANTIOXIDANTES son entonces moléculas, que en pequeñas

cantidades previenen o retardan la oxidación de compuestos fácilmente
oxidables. De esta manera, son los responsables de la defensa del
organismo frente a patologías degenerativas asociadas con el ataque de
radicales libres y el estrés oxidativo, como el cáncer, Parkinson,
Alzheimer o arterosclerosis17-20.
Acorde con Ratnam y col.21 los antioxidantes se pueden clasificar de

acuerdo a su procedencia en antioxidantes enzimáticos o
antioxidantes no enzimáticos (Fig. 2). Los primeros son de síntesis
celular endógena y corresponden a enzimas, moléculas de bajo peso
molecular y cofactores enzimáticos. Los segundos corresponden a
moléculas obtenidas a través de la dieta, donde se encuentran los
compuestos fenólicos, vitaminas, carotenoides, compuestos
organosulfurados y minerales.
Figura 2. Clasificación de los Antioxidantes22.
FRUTAS
¿CÓMO SE La diversidad estructural de los fitoquímicos

PUEDE EVALUAR favorece la variabilidad en la actividad que puede
LA CAPACIDAD tener este tipo de moléculas biológicas. En términos
ANTIOXIDANTE? de actividad antioxidante, los compuestos bioactivos
cumplen su función al participar en reacciones
donde hay transferencia de átomos de hidrógeno o
en reacciones donde hay transferencia de
electrones individuales; ambas determinadas por la
estructura del antioxidante y el pH. En este sentido,
no existe un método sencillo y universal para
determinar la capacidad antioxidante de una
muestra donde existe variedad de componentes
trabajando sinérgicamente23.
Los métodos que se emplean para evaluar la

capacidad antioxidante de una muestra se pueden
categorizar en: espectrométricos, electroquímicos
y cromatográficos20. En la Tabla 1 se listan algunos
de los ensayos espectrométricos que permiten
evaluar la capacidad antioxidante de una muestra
dependiendo del modo de acción del antioxidante y
del agente oxidante.
Tabla 1. Algunos métodos para evaluar la capacidad

antioxidante por espectrometría20.
DETERMINACIÓ
ENSA PRINCIPIO DEL
DEL PRODUC
YO MÉTODO FINAL
Reacc antioxidan c u radic
DP Colorimet
ión te o n al
PH orgáni ría
n
co
Reacción antioxidante con un catión
AB Colorimet
9
radical orgánico
TS
1
DETERMINACIÓN
ENSA PRINCIPIO DEL
DEL PRODUCTO
YO MÉTODO FINAL
FR Reacción antioxidante con un complejo Colorimetría
AP Fe(III)
Reacción antioxidante con radicales Pérdida de
OR peroxilo, inducido por el AAPH (2,2’- fluorescencia
AC azobis-2-amidino- propano) de la
fluoresceína
Capacidad antioxidante para limpiar los
Detección de
TR radicales derivados del luminol,
quimioluminiscen
AP generados de la descomposición del
cia
AAPH
Métodos por Transferencia de Átomos de Hidrógeno
Acorde con Prior y col.23 los ensayos basados en la transferencia de

átomos de hidrógeno miden la capacidad de un antioxidante de
atrapar radicales libres, por la donación de átomos de hidrógeno. El
mecanismo de acción antioxidante en el cual un átomo de hidrógeno
(H) de una biomolécula o antioxidante (AH) se transfiere a un radical
X•, se puede sintetizar en la siguiente ecuación:
X• + AH → XH + A•
Un sustrato oxidable (AH) es atacado por un radical libre (X•)

generando una especie no radical (XH) y un nuevo radical libre A•. El
radical A• del fitoquímico se estabiliza por resonancia. Para que las
biomoléculas no sufran daño oxidativo, los antioxidantes deben
reaccionar más rápido con los radicales libres. La medición de la
capacidad antioxidante se basa entonces en cinéticas competitivas que
son generalmente rápidas23.
Losmétodosdetransferenciadeátomosdehidrógenossonindependientes del
solvente y el pH, sin embargo, la presencia de agentes reductores
como los metales, son una grave complicación ya que pueden mostrar
reactividades altas no reales23.
Siguiendo esté modo de acción de los antioxidantes, se han

desarrollado varios ensayos que permiten detectar la actividad
antioxidante general o específica. Se destacan el método para
determinar la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC,
siglas en inglés para oxygen
FRUTAS
radical absorbance capacity) y el ensayo para determinar el parámetro

antioxidante de captura de radicales (TRAP, siglas en inglés para radical-
trapping antioxidant parameter), que miden en general la inhibición de la
oxidación inducida por radicales peroxilo23.
Método ORAC: Mide la inhibición antioxidante de la oxidación inducida

por el radical peroxilo de manera que refleja la actividad antioxidante
rompedora de cadenas mediada por la transferencia de átomos de H.
En el ensayo, el radical peroxilo reacciona con una sonda fluorescente (β-
ficoeritrina o fluoresceína) para formar un producto no fluorescente, de
manera que la capacidad antioxidante se determina por la tasa de
disminución y la cantidad de producto formado en un tiempo definido.
El resultado es reportado como equivalentes empleando curvas estándar
de 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, un análogo
hidrosoluble de la vitamina E conocido como Trolox23.
Método TRAP: Mide la capacidad de un antioxidante de interferir

con la reacción entre los radicales peroxilo generados por el AAPH [2,2′-
azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride] y una sonda blanco.
Variaciones a este método han incluido la medición del consumo de
oxígeno, fluorescencia de la R-ficoeritrina o la absorbancia del ABTS
(2,2′-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-suslfonic acid), de manera que
la oxidación de la sonda es detectada óptica o fluorométricamente. La
actividad antioxidante se determina cuando se ha consumido todo el
antioxidante, la extensión del tiempo de retraso por la apariencia de la
sonda oxidada cuando hay presencia de los antioxidantes, y por el
porcentaje de reducción de la reacción. Los valores TRAP se
expresan normalmente como tiempo de retraso o tiempo de reacción
de la muestra comparada con los tiempos correspondientes al
Trolox23.
1
Métodos por Transferencia de Electrones Individuales
Los métodos basados en la transferencia de electrones individuales

miden la capacidad de un antioxidante de transferir un electrón para
reducir algún compuesto, incluyendo metales, carbonilos y radicales23.
Las reactividades relativas en los métodos por transferencia de

electrones son usualmente bajas y dependen del pH. Además, los
cálculos de la capacidad antioxidante están basados en la reducción del
porcentaje de producto más que en la cinética. Es de anotar que
componentes traza y contaminantes (metales en particular), interfieren
con estos métodos y pueden dar lugar a alta variabilidad y baja
reproducibilidad en los resultados23.
Siguiendo este mecanismo de acción de los antioxidantes, se han

desarrollado varias estrategias para medir el poder antioxidante de
la reducción Férrica, la reducción del radical DPPH, y la capacidad
antioxidante equivalente al Trolox, entre otros.
Método de Poder Antioxidante de la Reducción Férrica (FRAP):

Mide la reducción del complejo férrico-2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)
a un producto coloreado (Fig. 3). El ensayo se lleva a cabo en un pH
ácido (3,6) para mantener la solubilidad del hierro. El mecanismo de
reacción es únicamente por transferencia de electrones, de manera que
en combinación con otros métodos el FRAP es muy útil en distinguir
los mecanismos de reacción dominantes con diferentes antioxidantes.
Adicionalmente, debido a que los metales reducidos son propagadores
activos de cadenas de radicales por medio de la reducción del
hidroperóxido a RO•, es interesante para evaluar si valores de FRAP altos
se correlacionan con la tendencia de ciertos polifenoles a convertirse en
pro- oxidantes bajo ciertas condiciones. La reducción se monitorea
midiendo el cambio en la absorción a 595nm en un espectrofotómetro23.
FRUTAS
Figura 3. Reacción del ensayo FRAP23.
Método 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH): Mide la capacidad de

un antioxidante de reducir el radical DPPHŸ (Fig. 4). Este radical es uno
de los radicales orgánicos nitrogenados más estables, el cual presenta un
color morado intenso. La capacidad de los antioxidantes se puede medir
por resonancia espín electrón o midiendo como disminuyen los niveles de
absorbancia a 515nm por espectrofotometría23.
Figura 4. Estructura del radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) 23
1
Método de Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox (TEAC)

u otros ensayos con ABTS: Miden la capacidad de los antioxidantes
de atrapar el anión de larga vida ABTS•+. En este ensayo, el ABTS (Fig. 5)
es oxidado por radicales peroxilo u otros oxidantes a su radical catiónico
ABTS•+, quien tiene un color intenso. La reacción del radical con el
antioxidante disminuye el color del radical, de manera que los resultados
de las muestras problema se expresan como equivalentes al Trolox, el
cual es usado para elaborar curvas estándar23.
El radical ABTS•+ se puede generar de varias formas. Por medio de

reacciones químicas con dióxido de manganeso, persulfato de potasio,
o con reacciones enzimáticas con la metmioglobina, hemoglobina o
peroxidasas. Normalmente las reacciones químicas son más demoradas
(más de 16 h) que las reacciones enzimáticas23.
Figura 5. Estructura del 2, 2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-

sulfonic acid (ABTS)23.
La absorbancia máxima del radical ABTS•+ se ha visto a longitudes de

415, 645, 734, y 815 nm; sin embargo, 415nm y 734nm han sido las más
empleadas para las mediciones espectrofotométricas23.
¿QUÉ SON Los compuestos fenólicos son metabolitos

LOS secundarios de las plantas formados por uno
COMPUESTOS o más anillos aromáticos, con uno más grupos
FENÓLICOS? hidroxilos. Según la estructura se clasifican
como ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos,
coumarinas y taninos12 (Fig. 6). Al ser uno de
los grupos de fitoquímicos más diversos en las
plantas, su importancia fisiológica y morfológica
es
FRUTAS
considerable: Pueden actuar como fitoalexinas para proteger las

plantas de microorganismos, como repelentes para depredadores,
atrayentes de polinizadores, pigmentos, antioxidantes y como agentes
protectores contra la radiación UV, entre otras24-25.
Figura 6. Estructura general de algunos flavonoides12.
En la dieta los compuestos fenólicos son importantes en la

determinación de la calidad sensorial y nutricional frutas y vegetales26-
27
. De igual manera se ha visto que tienen cualidades como
preservantes para alimentos y funciones asociadas con la reducción del
riesgo de enfermedades crónicas, gran parte conferida por su
capacidad antioxidante12, 28.
Dada la importancia de este tipo de fitoquímicos, se ha desarrollado

un método que permite determinar la cantidad de compuestos
fenólicos totales, denominado ensayo Folin-Ciocalteu (F-C).
Método de Folin-Ciocalteu (F-C): Mide la capacidad que tienen

los polifenoles para reducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal
reacción, el reactivo de color amarillo adquiere un intenso color azul
que se mide por espectrofotometría en longitudes de onda cercanas a
1
765nm.
1
Mo(VI) (Amarillo) + e- è Mo(V)

(Azul)
El principio de este método colorimétrico está basado en reacciones
de transferencia de electrones entre el reactivo F-C y los compuestos
fenólicos. Se emplea normalmente el ácido gálico como el fenol estándar
de referencia y los resultados se expresan con relación a éste.
¿QUÉ SON LAS Las antocianinas son pigmentos vacuolares solubles

ANTOCIANINAS? en agua que pueden mostrar una coloración roja,
morada o azul dependiendo del pH en el que se
encuentren. Pertenecen al grupo de los flavonoides
y se encuentran en todos los tejidos vegetales
desde hojas, tallos, raíces, flores y frutos29.
Las antocianidinas son las estructuras básicas de

las antocianinas. Las antocianidinas (o aglicona)
consisten de un anillo aromático A unido a un anillos
heterocíclico C que contiene oxígeno, y el cual se
uno por enlaces carbono-carbono a un tercer anillo
aromático B (Fig. 7). Las antocianidinas cuando
se encuentran en su forma glicosídica (unidas a un
azúcar), se denominan antocianinas29-30.
Las antocianidinas que más se encuentran en

las plantas se listan en la Figura 7. Los azúcares
más comunes que se encuentran unidos a tales
antocianidinas son la glucosa, galactosa, ramnosa
y arabinosa; y di o trisacáridos formados a partir de
dichos monosacárido31.
Lasantocianinasposeenpropiedadesfarmacológicas
y funciones biológicas bien conocidas como su
capacidad antioxidante y antiinflamatoria32; lo
que las hace moléculas perfectas para reemplazar
los colorantes sintéticos usados en la industria de
alimentos33. Sin embargo, cuando están aisladas
son muy inestables y susceptibles a la degradación.
FRUTAS
En gran medida, su estabilidad depende del pH, temperatura de

almacenamiento, estructura química, concentración, luz, oxígeno,
solventes, presencia de enzimas, flavonoides, iones metálicos y
proteínas34.
Figura 7. Estructura general y sustituyentes para algunas

antocianidinas35.
La determinación de las antocianinas en una muestra se puede llevar

a cabo de varias formas donde destacan los métodos cromatográficos
y los espectrofotométricos. En este último grupo se ubica uno muy
popular denominado método diferencial de pH.
Método Diferencial de pH: Mide el contenido de antocianinas

monoméricas totales en una muestra, aprovechando el cambio
reversible de color de dichas moléculas con los cambios en el pH (Fig.
8). En el método se prepara la muestra en soluciones buffer a pH 1.0 y
pH 4.5, y se hacen las mediciones de la absorbancia en la longitud de
máxima absorbancia de la solución a pH 1.0. La diferencia en la
1
absorbancia entre las dos soluciones
1
buffer se debe a los pigmentos de antocianinas monoméricas, ya que las

antocianinas polimerizadas no exhiben el comportamiento reversible con
el pH de manera que son excluidas del cálculo36.
Para el cálculo de las Antocianinas totales se procede con la siguiente

ecuación:
A= (Amax – A700nm)pH1.0 – (Amax – A700nm)pH4.5

MW = Peso molecular de la antocianina (Cianidina-3-glucósido)
DF = Factor de dilución
ɛ = Coeficiente de extinción molar, L x mol-1 x cm-1
l = Longitud de paso de celda
Figura 8. Espectro UV-visible de antocianinas en buffers de pH

1.0 y 4.5. También se muestran las formas flavilio y hemiacetal de
las antocianinas bajo los diferentes pH. R=H o sustituyente
glicosídico36.
El cálculo de las antocianinas totales se obtiene empleando el peso

molecular y el coeficiente de extinción de la antocianina que se
encuentra en mayor medida en la muestra. Usualmente se emplea la
información
FRUTAS
de la Cianidina-3-glucósido por ser una de las antocianinas más comunes

en la naturaleza. De esta manera, los resultados se reportan como
equivalentes de cianidina-3-glucósido36.
¿QUÉ SON LOS Los carotenoides son el grupo más extenso de

CAROTENOIDES? pigmentos isoprenoides sintetizados principalmente,
aunque no de forma exclusiva, por las plantas. Son
los responsables de la coloración amarilla, naranja y
rojiza de muchos frutos y vegetales, y la mayoría de
los animales deben obtenerlo mediante la dieta ya
que cumple una función provitamina y
antioxidante37-38.
Este grupo de moléculas son importantes en el

proceso fotosintético y fotoprotector de las plantas.
Su papel fotoprotector proviene de su habilidad
para atrapar e inactivar especies reactivas de
oxígeno como el singulete de oxígeno formado
de la exposición de la luz y el aire. Este mismo
papel protector es el que se atribuye a su actividad
antioxidante en los seres humanos. Los
carotenoides pueden reaccionar con radicales libres
y convertirse ellos mismos en radicales. Su
reactividad depende de la longitud de las cadenas
con dobles enlaces conjugados y las características
de los grupos de los extremos. Los radicales
carotenoides son estables debido a la
deslocalización de un par de electrones sobre la
cadena conjugada de polieno de las moléculas.
Dicha deslocalización también permite que ocurran
reacciones de adición sobre muchos sitios del
radical39.
1
Los carotenoides tienen un esqueleto de 40 carbonos formado por

unidades de isopreno y se han identificado más de 600 tipos en la
naturaleza. Su característica distintiva es una serie de dobles enlaces
conjugados que constituyen la parte central de la molécula y le otorgan
su forma, reactividad química y propiedades de absorción de la luz
(Fig. 9). Se clasifican según sus grupos funcionales en xantofilas y
carotenos, las primeras conteniendo oxígeno como grupo funcional y
los segundos solo teniendo sus cadenas hidrocarbonadas. El α-
caroteno, β-caroteno y β-criptoxantina tienen la capacidad de
funcionar como provitamina A. La Zeaxantina y la luteína con los
carotenoides principales de la región macular del ojo en humanos12.
Frutos y vegetales naranjados donde se incluye la zanahoria, papaya,

mango, calabaza, melón cantalupo entre otros son fuentes ricas en β-
caroteno. Los tomates, sandías, pomelos rosados, guayaba rosada entre
otros son fuentes ricas en licopeno12.
La disponibilidad y facilidad en la obtención de estos compuestos,

ha facilitado su utilización en la industria alimenticia, cosmética y
farmacéutica12.
Para el análisis de carotenoides se suele utilizar la extracción con

solventes orgánicos como la acetona, cloroformo, hexano,
isopropanol, metanol, cloruro de metileno y dietil éter. Con relación a
los solventes, el método soxhlet es muy popular para extraer estas
moléculas, sin embargo hoy en día existen estrategias más limpias y
rápidas como la extracción por fluidos supercríticos. El análisis
posterior normalmente involucra técnicas cromatográficas o
espectrofotométricas40.
Figura 9. Estructura química de algunos carotenoides 12.
¿QUÉ ES EL El ácido L-ascórbico (AA) es un compuesto natural

ÁCIDO
encontrado en la mayoría de frutas y verduras (melón
ASCÓRBICO?
cantalupo, pomelo, kiwi, mango, papaya, fresa,
brócoli, coliflor, pepino, repollo, etc.). Debe ser
consumido en la dieta ya que los humanos no tienen
la capacidad de sintetizarlo. Es bastante soluble en
agua, pero menos soluble en etanol absoluto, etanol
al 95%, ácido acético, acetonitrilo y propilenglicol41.
Bajo condiciones fisiológicas, el AA se encuentra

principalmente en su forma reducida, como el
monoanión ascorbato (AscH-) que reacciona con ROS
para formar el radical ascorbilo relativamente estable
(semideshidroascorbato, Asc·-) que se puede reducir de
2
nuevo a ascorbato con acción enzimática (Fig. 10). La capacidad de

donar electrones hace el AA el principal componente detoxificante de
ROS en fase acuosa, protegiendo las membranas contra la
peroxidación al atrapar directamente los radicales peroxilipídicos o por
la interacción con el radical tocoferoxilo, dando como resultado la
regeneración del α-tocoferol o vitamina E42.
Figura 10. Estructura química del ácido ascórbico y sus derivados 42.
Para la determinación del ácido ascórbico se emplean métodos

titulométricos, fluorométricos, complexométricos, amperométricos,
espectrofotométricos, enzimáticos y cromatográficos43-50. Entre los
métodos aprobados por las AOAC se utiliza el método titulométrico
con 2,6.diclorofenolindofenol (DCPIP).
Método Titulométrico con 2,6.diclorofenolindofenol (DCPIP): Para

el caso de jugos existe el método titulométrico con
2,6.diclorofenolindofenol (Método AOAC 967.21). El principio de este
método se basa en la reducción de un indicador coloreado (DCPIP) por
acción del ácido ascórbico, hasta que se pierda el color. En el punto final
de la titulación de una muestra que contenga ácido ascórbico con la
solución coloreada, el exceso de colorante se torna de un color rosado-
fucsia en la solución ácida. La titulación del colorante (DCPIP) se puede
determinar empleando soluciones de ácido ascórbico estándar. Las
muestras de alimentos en solución pueden ser tituladas con DCPIP, y el
volumen usado en la titulación se emplea para calcular el contenido de
ácido ascórbico51.
PROTOCOLOS PARA ANÁLISIS

DE BIOCOMPUESTOS EN
MATRICES VEGETALES Y
ALIMENTOS
En la literatura se pueden encontrar reportadas gran variedad de

metodologías para la determinación y análisis de compuestos
bioactivos en frutas, verduras y otros alimentos. A continuación, se
presentan algunos protocolos para evaluar la capacidad antioxidante,
la concentración de antocianinas, carotenoides y ácido ascórbico; a
partir de matrices vegetales (frutas, verduras) o extractos vegetales.
Se describen los pasos generales y se comparan con variantes
encontradas en la literatura para gulupa u otros alimentos
relacionados.
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS
Protocolo para Ensayo FRAP
1. Preparar un Solución Buffer Acetato, pH: 3,6

Sln A: Acetato de Sodio Trihidratado en H20 destilada (3,1 g/L).
Sln B: Ácido Acético Glacial en H2O destilada (1,6%).
Utilizar la Sln B para llevar la Sln A hasta un pH de 3,6.
2. Preparar una Solución de HCl 40mM.
3. Preparar una Solución de TPTZ en solución de HCl 40mM (3,12 g/mL).
4. Preparar una Solución de FeCl3 en H20 (5,4 mg/mL).
5. Preparar una solución madre 1:1:10 de FeCl3:TPTZ:Buffer,
conservando el orden de adición.
6. Preparar soluciones del estándar de ácido ascórbico en
concentraciones de 0.025mM, 0.033mM, 0.05mM, 0.075mM, 0.1mM,
0.175 mM y 0.25mM.
7. Preparar las muestras en tubos de ensayo adicionando 50 μL de
cada disolución de ácido ascórbico (o muestra problema), 50 μL de
solución buffer y 900 μL de solución madre.
8. Preparar blancos de muestra utilizando 50 μL de cada disolución y 950
μL de la solución buffer.
2
9. Incubar las muestras 30min. en completa oscuridad y se procede a
leer en espectrofotómetro a 590nm, usando la solución buffer 3,6
como blanco para el equipo.
2
En la literatura se reporta el uso de buffer acetato a 300 mM con un de pH

3,4 y 3.6, los tiempos de incubación de las muestras desde van desde los
4-60 minutos y la temperatura entre 36-37°C. Las absorbancias utilizadas
están comprendidas en un rango de 590-595 nm. y utilizan las mismas
relaciones y órdenes para elaborar la solución FRAP (10 partes buffer
acetato (300 mM)- 1 parte: de la solución (10 mM) TPTZ (2, 4, 6 tripiridil-
s-triazina) -1: parte solución (20 mM) FeCl3 acidificada con HCl (40mM)) la
solución madre se parara el mismo día en el que realizan las mediciones.
Para conformar las muestras se reportan volúmenes desde 180-900 μL
de la solución FRAP, el volumen de la muestra desde los 10-50 μL (en
algunos casos los autores realizan diluciones de los extractos a evaluar) y
desde los 30-50 μL de agua destilada o de solución buffer. Para la
obtención de las curvas de calibración se utiliza una solución conocida
Fe2+ entre el rango de 100-3000 μM, a partir de una solución madre que
varias desde los 1000-3000 μM de FeSO4. Las actividades de los
extractos se expresan
como μmol de equivalentes de Trolox/g de pulpa, como valor FRAP (g de
ácido ascórbico por cada 100 g de muestra), o como equivalentes de
ácido gálico/mg de muestra52-59.
Protocolo para Ensayo DPPH
1. Elaborar una curva estándar de Trolox a diferentes concentraciones:

0.25mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.25mM, 1.5mM, 1.75mM. El Trolox se
prepara en Metanol.
2. Preparar una solución madre de DPPH 0,4 mg/mL en metanol.
Dejar reposar en oscuridad mínimo por 2 h.
3. Preparar una solución estandarizada de DPPH en Metanol. Se toma
solución madre de DPPH (0,4 mg/mL), se adiciona en un volumen de
metanol y se mide la absorbancia a 517nm. Se adiciona DPPH hasta
obtener una absorbancia entre 0,3-0,35. Almacenar en oscuridad.
4. Preparar en tubos de ensayo 10 μL de cada disolución de Trolox o
de muestra problema y se adicionan 990 μL de la solución de DPPH
estandarizada.
5. Evaluar Blancos de cada una de las muestras. Los blancos se
preparan tomando 10 μL de cada disolución y 990 μL de metanol.
6. Preparar Referencias para cada solvente donde se encuentren
disueltas las muestras. Se toma 10 μL de metanol (en caso de que este
sea el solvente) y 990 μl de solución estandarizada de DPPH.
FRUTAS
7. Incubar todas las muestras en oscuridad por 30 min. y hacer lectura

en espectrofotómetro a 517nm, empleando metanol como blanco para
el equipo.
En la literatura se encuentran protocolos donde emplean concentraciones

del reactivo DPPH (2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo) en 0,1 μM, 20 mg/mL
y 20 mg/L, los solventes utilizados son agua o metanol. Los volúmenes
utilizados del reactivo varían desde los 900 μL-3,9 mL. Los volúmenes
de la muestra son desde los 30 μL-0,5 mL (en algunos casos los autores
realizan diluciones de los extractos a evaluar). Los tiempos de incubación
de las muestras se encuentran entre 5 y 60 minutos con temperaturas 10-
30°C. Absorbancias máximas 515-517 nm. Las curvas de calibración se
encuentran entre 0,08-1000 μM y la actividad antioxidante se expresa μM
equivalentes de Trolox/ 100 g de peso seco, o, μM equivalentes de
Trolox/g de peso fresco53, 60-65.
Protocolo para Ensayo ABTS
1. Preparar una solución de persulfato de potasio 34 mg/mL.

2. Pesar 17 mg de ABTS, adicionar 100 μL de la solución de persulfato de
potasio y llevar a 10 mL con agua destilada. Almacenar en un frasco
ámbar y usar después de 24 horas.
3. Preparar buffer PBS (buffer fosfato) 100mM pH 7.4.
4. Estandarizar un poco de solución buffer fosfato adicionando
solución de ABTS y midiendo la absorbancia a 732nm hasta lograr un
valor de 0.700±0.005.
5. Construir una curva de calibración con el estándar de Trolox. Se
recomiendan valores entre 0,25-1,7 mM.
6. Preparar las muestras tomando 990 μL de solución ABTS
estandarizada y agregando 10 μL de la muestra en cuestión.
7. Preparar blanco de cada muestra adicionando 990 μL del buffer fosfato
y 10 μL de la muestras.
2
8. Preparar referencias para cada tipo de solvente en el que estén diluidas

las muestras. En 990 μL del ABTS estandarizado adicionar 10 μL del
solvente.
9. Incubar todas las muestras por 30 min. y proceder a leer por
espectrometría a 732nm.
Las concentraciones de ABTS (Acido 2,2 -azinobis-(3-etilbenzo-tioazolín-

6- sulfónico) reportadas son de 3,5 -7 Mm, y concentraciones de
persulfato de potasio 1,25-140 mM o persulfato de amonio a 4,9 Mm, y
una solución buffer fosfato con pH 7,4. Los solventes para la preparación
de las soluciones madre son con agua destilada o etanol y tienen
periodos de incubación de 16-24 horas. La solución de trabajo es
estandarizada a una longitud de onda 732-754 nm con una absorbancia
0,7± 0,2. Es común encontrar que para la medición de actividad
antioxidante se adicionen 10-100 μL de los extractos (muestra), 800-1000
μL de la solución de trabajado de ABTS y en los blancos se utilice el
solvente de trabajo con un mismo volumen de la muestra. Los periodos
de incubación de las muestras son de 1-30 minutos. Las curvas de
calibración 0-8 mM y los resultados son expresados en μM equivalentes
de Trolox/ 100 g de peso seco, o, μM equivalentes de Trolox/g de peso
fresco. Algunos autores utilizan kits creados por empresas las cuales dan
las instrucciones para la cuantificación de antioxidantes59, 66-70.
Protocolo para determinar Compuestos Fenólicos Totales
1. Preparar una Solución de Carbonato de Sodio al 7.1 % al menos

con un día de anticipación.
2. Preparar una curva estándar con ácido gálico. Se recomiendan
concentraciones de 0.313, 0.625, 0.9, 1.25, 2.5 y 2.75mM.
3. Preparar las muestras en tubos de ensayo adicionando 50 μL de cada
disolución, 425 μL de agua destilada, 125 μL de reactivo de Folin.
Pasados 5 min. se agregan 400 μL de Carbonato de Sodio y se agita.
4. Preparar los blancos de muestra tomando 50 μL de cada disolución, 550
μl de agua destilada y 400 μL de Carbonato de Sodio.
5. Incubar las muestras en oscuridad por 30 min. y leer por
espectrofoto- metría a 760nm. Se emplea agua destilada como blanco
para el equipo.
En la cuantificación de polifenoles utilizan los reactivo Folin –

Ciocalteu (FC) y carbonato de sodio (2-20%). Para realizar las
muestras se debe seguir un orden en la adición de los reactivos, los
extractos (30-1000 μL),
FRUTAS
luego el FC (30-4000 μL), pasados 1-6 minutos de reacción adicionan el

carbonato de sodio 75-2000 μL (algunos autores reportan la adición de
un buffer fostato-citrato), se incuba en periodos de 30-90 minutos y se
procede a medir en el espectrofotómetro con una absorbancia de 750-
765 nm. Los datos son expresados como mg de ácido ascórbico/g peso
seco o fresco (GAE)52, 54, 59, 62, 64, 70-76.
Protocolo para determinar Corotenoides Totales
1. Elaborar una curva estándar para el carotenoide más

abundante en la muestra. Es común usar el beta-caroteno.
2. Pesar 1 g de muestra, mezclar con 5 mL de acetona fría y dejar
reposar por 15 min. a 4 ºC y en oscuridad.
3. Mezclar con vortex por 2 min. y centrifugar a 1370xg por 10 min.
4. Colectar el sobrenadante y al precipitado adicionar 5 mL de acetona
fría. Dejar reposar por 15 min. a 4 ºC y en oscuridad.
5. Mezclar con vortex por 2 min. y centrifugar a 1370xg por 10 min.
6. Colectar el sobrenadante y mezclar con el primer
sobrenadante obtenido.
7. Filtrar el extracto a través de papel filtro (Whatmann No. 42).
8. Leer cada una de las muestras por espectrofotometría a la
máxima absorbancia según datos de la curva estándar.
Normalmente el rango de absorbancia está entre 449 y 470 nm.
9. Expresar los resultados como mg o μg del carotenoide empleado en la
curva de estandarización, con relación al volumen de muestra extraído.
Este protocolo sigue los lineamientos descritos por Biswas y col. en el

201177. Para la cuantificación de carotenos en la literatura se reportan
extracción con acetona fría, éter de petróleo o con hexano, etanol,
acetona (50/25/25). Las muestras son centrifugadas de 1370 a 9000
RPM o 1370 RCF para retirar los solventes, medir absorbancias entre
449-470 nm, los resultados se expresan Resultados en µg/100g55, 78-80.
2
Protocolo para determinar Antocianinas Totales por el Método

Diferencial del pH
1. Preparar dos buffers pH 1,0 y pH 4,5 para la cuantificación.

2. Para muestras sólidas, pesar aproximadamente 0,5 gramos de
muestra y se adicionan 5 mL de agua destilada.
3. Para muestras líquidas, proceder directamente a la medición.
4. En ocasiones se requiere diluir la muestra en un solvente adecuado
(definido previamente).
5. Posteriormente, unir la muestra diluida con la solución buffer (pH 1,0
y 4,5).
6. Tomar 100 μL y 900 μL de buffer, el valor de absorbancia de todas las
muestras se compara con el blanco (buffer solo).
7. Pasados 20 minutos, leer en una absorbancia de 520 y 700 nm.
8. El valor obtenido debe estar entre 0,2 y 1,4 si pasa estos límites es
recomendable diluir la muestra.
El protocolo anterior es utilizado en algunas investigaciones que han

cuantificado antocianinas por este método (diferencial de pH), los autores
no realizan ninguna modificación al protocolo81-83.
Determinación de Ácido Ascórbico (Vitamina C) por el Método

Titulométrico con DCPIP
El 2,6-Dichlorophenolindophenol (DCPIP) Se encuentra dentro los

métodos titulométricos y es un método oficial de la AOAC.
1. El ensayo se recomienda hacer por triplicado en Erlenmeyer de 50
mL, se adicionan 5mL de ácido metafosfórico- ácido acético y 2 mL de
muestra.
2. Titular cada muestra con la solución colorante indofenol hasta que
un color rosado persista por 5 segundos.
3. Anotar las lecturas (iniciales - finales) y calcule la cantidad de
colorante usado para cada titulación
4. Fórmula: mg ácido ascórbico en volumen de la solución
estándar / (promedio mL de colorante usado en la titulación
estandar) - (promedio mL blanco de titulación).
FRUTAS
Para utilizar este método se deben calibrar las soluciones estándar, para
esto se reportan los siguientes reactivos Ácido ascórbico estandarizado,
Solución indofenol (0.1N), bicarbonato de sodio (42 mg), DCPIP (50
mg), en la titulación se utilizan de (1-25 ml) muestra, (5-9 mL) de ácido
metafosfórico (5-10%) algunos investigadores lo acidulan con ácido
acético. Luego titulan hasta que se observe un color rosa (5-15 min.). El
procedimiento se repite tres veces y se expresa como cantidad de
Vitamina C necesaria para reducir 1 ml de la solución de yodo84-89.
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