Adaptación de una técnica de amplificación isotérmica visualizada con bucle

para la detección de campo de la infección de Plasmodium vivax

Resumen

Antecedentes: La amplificación isotérmica mediada por un lazo (LAMP) es un método

de alto rendimiento para detectar el ADN y es prometedor para su uso en la detección
molecular de patógenos infecciosos, incluyendo Plasmodium spp. Sin embargo, en la
mayoría de las zonas endémicas de paludismo, que suelen tener recursos limitados,
los métodos actuales de LAMP no son viables para diagnóstico debido a las
dificultades para interpretar con precisión los resultados con problemas de
visualización sensible de la amplificación y el riesgo de contaminación resultante de la
gran cantidad de ADN amplificado que se produce. En este estudio, establecemos un
novedoso método LAMP visualizado en un sistema de tubo cerrado, y lo validamos
para el diagnóstico de la malaria bajo condiciones de campo simuladas.

Métodos: Se estableció un método LAMP visualizado mediante la adición de una

cápsula de cera microcristalina de colorante que contiene el colorante fluorescente de
ADN altamente sensible SYBR Verde I a una reacción normal de LAMP antes de la
iniciación de la reacción. Se recogieron un total de 89 muestras de sangre en papel
de filtro y se procesaron con un simple método de ebullición para la extracción de
ADN, y luego probado por el método LAMP visualizado para el Plasmodium vivax
infección.

Resultados: La cápsula de cera permaneció intacta durante la amplificación

isotérmica, y liberó el colorante de ADN al mezcla de reacción sólo cuando la
temperatura se elevó al punto de fusión después de la amplificación. Poco después
enfriándose, la cera solidificada selló la mezcla de reacción en el fondo del tubo,
minimizando así el riesgo de contaminación por aerosol. Comparado con la
microscopía, la sensibilidad y especificidad del LAMP fue del 98,3% (95% intervalo de
confianza (IC): 91.1-99.7%) y 100% (IC del 95%: 88.3-100%), y estaban en estrecho
acuerdo con un método de reacción en cadena de la polimerasa.

Conclusiones: Este novedoso método LAMP, barato y de rápida visualización, es

factible para el diagnóstico de la malaria en ajustes de campo.

Antecedentes
Entre los años 2000 y 2008, hubo un resurgimiento de la malaria de Plasmodium
vivax en la parte central de la República Popular China (R. P. China) [1]. El
diagnóstico rápido y preciso del paludismo no sólo es crucial para el tratamiento del
paciente, pero también es importante para el control de la enfermedad, especialmente
durante los intentos de eliminación, ya que las infecciones por P. vivax se encuentran
a menudo en densidades bajas de parásitos, y cualquier caso de paludismo no
detectado podría ser una fuente potencial de transmisión local. El examen
microscópico de frotis de sangre es el método de diagnóstico más utilizado en el
campo y sigue siendo el estándar "de oro". Sin embargo, este método es laborioso,
requiere expertos bien capacitados y puede provocar retrasos terapéuticos.

Las pruebas de diagnóstico rápido (PDR) de la malaria basadas en flujo lateral

desarrolladas recientemente han resultado útiles en países endémicos de P.
falciparum, ya que la sensibilidad de las PDR frente a la proteína II rica en histidina de
P. falciparum II (PfHRP-II) y la P. falciparum lactato deshidrogenasa (PfLDH) es alto
[2,3]. En contraste, los PDR para P. vivax actualmente no son tan sensibles como los
de P. falciparum, debido a la baja parasitemia y la falta de antígenos específicos
expresados en abundancia[3].

La amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) es un método de alto

rendimiento para detectar ADN [4], que es prometedor para su uso en el diagnóstico
molecular de patógenos en la batalla de primera línea contra enfermedades
infecciosas, incluida la malaria y la tuberculosis [5-8]. LAMP utiliza un conjunto de
cebadores que inician la síntesis de ácidos nucleicos a gran escala mediante la ADN
polimerasa Bst en condiciones isotérmicas.
Como método candidato para el diagnóstico de malaria en el campo, se han
desarrollado previamente algunos conjuntos de cebadores diferentes que se dirigen a
numerosos genes. Se ha afirmado que el método LAMP puede detectar tan solo 100
copias de la plantilla de ADN en muestras de sangre (equivalentes aproximadamente
a 5 parásitos / μl) [9,10]. Esta sensibilidad es notablemente mayor que la de cualquier
PDR basada en inmunocromatografía conocida, recomendada por la OMS como
parte de la estrategia mundial de control de la malaria [11].

Los resultados del LAMP pueden ser observados con precisión usando un
turbidímetro [12,13], pero a la luz del hecho de que la mayoría de los casos de
paludismo se producen en regiones pobres y rurales, se debe considerar un método
menos costoso y simplificado para un máximo impacto. Aunque la introducción del
manganeso en la reacción puede generar una precipitación blanca visible[6], dicha
turbidez suele ser demasiado débil para ser observada a simple vista y puede
producirse un sesgo debido a diferencias entre observadores. Se puede agregar
calceína a la mezcla de reacción para visualizar el resultado de LAMP, pero el cambio
de color inducido es menos notable que el obtenido con el colorante de ácido nucleico
de rutina SYBR Green I [14], que, desafortunadamente, inhibe la reacción de
amplificación, por lo que no puede ser añadido antes de la reacción.
Por lo tanto, a menudo se agrega un tinte de fluorescencia después de que ha
ocurrido la reacción para teñir los productos LAMP [15]. Sin embargo, esto implica
abrir los tubos en los que se ha producido la reacción antes de la visualización, y este
procedimiento conlleva el riesgo de contaminación debido al elevado número de
copias de los productos LAMP amplificados [16]; incluso una pequeña cantidad de
amplicón en aerosol liberado al ambiente del laboratorio podría causar una
contaminación que es muy difícil de eliminar. Este tipo de riesgo de contaminación es
un obstáculo para el uso del método LAMP como herramienta de diagnóstico de
campo para la malaria y otras enfermedades infecciosas [15].

Históricamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de inicio en caliente

dependía del uso de perlas de cera para separar la polimerasa del resto de la mezcla
de reacción antes de un paso de calentamiento inicial [17]. A diferencia de los ciclos
de temperatura alta-baja-media de la PCR general, LAMP utiliza una temperatura
constante de aproximadamente 65 ° C para la amplificación. Esto permite la adición
de una gota sólida de cera que contiene colorante a la mezcla de reacción LAMP
antes de la amplificación. La cera permanecerá sin fundir durante la amplificación y
luego puede exponerse a una temperatura más alta después del cese de la reacción,
lo que permite que se libere el tinte y se visualicen los productos. La cera
microcristalina tiene un peso molecular y un punto de fusión más altos que las ceras
de parafina, y también es más elástica y fácil de moldear. En este estudio, elegimos
cera microcristalina y SYBR Green I como materiales básicos a fin de desarrollar una
cápsula de tinte de cera para el establecimiento de un nuevo ensayo de detección
LAMP visualizado para P. vivax, que evita la necesidad de abrir el tubo de reacción
después amplificación y determinó su viabilidad como PDR para el diagnóstico de
campo de la malaria por P. vivax en un entorno de recursos limitados.

Métodos

Preparación de la cápsula de cera microcristalina de colorante.

Para crear la cápsula de tinte de cera, se retiró el extremo distal de la jeringa
desechable de 1 ml y se utilizó la parte restante del vástago y el tapón como molde.
Se colocó una pequeña cantidad de cera microcristalina (nº 85 #, punto de fusión =
85ºC; Sinopec, Nanyang, P. R. China) en una cuchara de laboratorio de acero
inoxidable y se calentó usando la llama de una lámpara de alcohol para fundir la cera.
A continuación, se vertieron 0,3 ml de cera líquida en el molde de jeringa y se enfrió
de modo que la cera solidificara. Luego, se añadió 1 μl de solución SYBR Green I
(1000 X) a la superficie de cera en el molde de la jeringa. Posteriormente, se vertieron
otros 0,3 ml de cera líquida sobre la solución de tinte. Cuando la capa de cera final se
enfrió, se creó una cápsula sólida y se empujó fuera del molde usando el tapón. Estas
cápsulas pueden prepararse en lotes y almacenarse a -20 ° C hasta su uso (Figura
1A).

Recolección de muestras de campo y extracción de ADN

Se recolectaron un total de 89 muestras de sangre seca (DBS) en la parte norte de la
provincia de Anhui, P. R. China, donde P. vivax es el único parásito de la malaria
transmitido. Se recolectaron muestras de pacientes febriles con sospecha de
infección por malaria entre julio de 2008 y agosto de 2009. Tras la obtención del
consentimiento por escrito, se extrajo sangre en un tubo de vacío tratado con
heparina, se vertieron 70 μl de sangre total en papel de filtro (Whatman, S & S 903 ),
secados al aire y almacenados a -20°C. Simultáneamente, se hicieron frotis de sangre
y se tiñeron con la solución de Giemsa para examen microscópico, y dos
microscopistas expertos leyeron todos los portaobjetos, cada uno con más de 10 años
de experiencia. Se modificó un método de extracción de ADN rápido para DBS del
método descrito previamente por Bereczky et al. [18]. En resumen, se cortó una
mancha de papel de filtro DBS en cuatro piezas iguales, se colocó una pieza (~ 18 μl
de sangre entera) en un tubo de centrífuga de 0,5 ml, se añadieron 100 μl de agua
bidestilada, se dejó reposar durante 5 min y luego hervido durante 10 min a 100 ° C.
El sobrenadante, que contiene ADN, se usó posteriormente tanto en LAMP
visualizado como en análisis de PCR anidado.

Figura 1 Uso de una cápsula de tinte de cera microcristalina en la detección

LAMP. (A) Tinte contenido dentro de una cápsula de cera microcristalina; no hay
contacto entre la cera y la mezcla LAMP antes de la amplificación (B) Después de la
amplificación isotérmica, la cápsula permanece intacta y el tinte se liberó por fusión a
95 ° C; El tubo positivo muestra un verde brillante, el negativo es naranja, mientras
que la cera de enfriamiento se convierte en una barrera sólida. (C) La reacción LAMP
se controló mediante un turbidímetro en tiempo real, las curvas de amplificación y
juicio de los tubos con cápsula agregada son similares a los de los tubos sin cápsulas,
y la adición de SYBR Green I directamente a la reacción antes de la amplificación
inhibió completamente la reacción. (D) Una linterna doméstica modificada con un LED
de 475 nm y el resultado de la excitación de la luz azul.

Diseño de los cebadores LAMP

Se eligió el ADN mitocondrial (ADNmt) de P. vivax como región diana, porque es un

ADN no nuclear de múltiples copias tipo plásmido y es fácil de extraer mediante el
método de ebullición. La longitud total del mtDNA de P. vivax (número de acceso de
GenBank AY598140.1) es de 5.990 pb con un contenido global de GC del 30,5%. Se
seleccionó un fragmento de 565 pb relativamente rico en GC (44%) (posición 694 a
1258) de ADNmt de P. vivax como secuencia diana para el diseño de cebadores y la
detección de LAMP. El diseño del cebador se realizó utilizando la herramienta en
línea Primer Explorer versión 4.0 http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html. Todos
los parámetros se establecieron por defecto, mientras que se eligió y sintetizó un
conjunto de cebadores (Figura 2).

Condiciones de la lámpara y visualización

La preparación de las soluciones de reacción LAMP se llevó a cabo según Zhu et al.
[19]; cada mezcla de reacción de 25 μl contenía lo siguiente: Tris-HCl 20 mM pH 8.8,
KCl 10 mM, (NH4) 2SO4 10 mM, Tween 20 al 0.1%, MgSO4 8 mM, 1.4 mM de cada
uno de los dNTP, 1.6 μM FIP, 1.6 μM BIP , 0,2 μM F3, 0,2 μM B3, 8 U Bst ADN
polimerasa. Se añadió 1 μl de plantilla de ADN al tubo de reacción y se agitó
brevemente en vórtex antes de colocarlo en un turbidímetro en tiempo real (LA 320c,
Teramecs; Kyoto, Japón), y se colocó una cápsula de tinte de cera en el tubo antes
de sellar con una tapa. Las condiciones de reacción de LAMP fueron: 65 ° C durante
60 min, durante la amplificación, la temperatura de la tapa se mantuvo a 80 ° C, y el
umbral positivo de turbidez se fijó en 0,1, la reacción se terminó a 80 ° C durante 5
min. Después de la amplificación, los tubos de reacción se transfirieron a una
máquina de PCR general (Mastercycler, Eppendorf; Hamburgo, Alemania), la
temperatura del bloque de calor y la tapa se ajustaron a 95 ° C durante 5 min para
fundir la cápsula de tinte de cera y liberar SYBR Green I en la mezcla de reacción.
Luego, el bloque se enfrió a 4 ° C durante 5 min. Los tubos de reacción se retiraron y
se observaron a simple vista (Figura 1B). Para las muestras de DBS de campo, todas
las reacciones LAMP se llevaron a cabo en un baño de agua: 65 ° C durante 60 min,
95 ° C durante 5 min a temperatura ambiente durante 10 min. Se desarrolló una
herramienta modelo simple para la excitación de luz azul de SYBR Green I. Se usó un
elemento LED de 475 nm (luz azul visible) para reemplazar la bombilla de una linterna
doméstica (Figura 1D). Luego se observaron los resultados de LAMP y se
determinaron bajo esta luz azul.
Figura 2 Ubicación y secuencia del cebador LAMP para la detección de
Plasmodium vivax. (A) Secuencia parcial del ADNmt de P. vivax y la ubicación de
cuatro cebadores: F3, B3, FIP (F1c-F2) y BIP (B1c-B2), las flechas indican la
dirección de extensión y un sitio Dde I de la enzima de restricción localizado en la
región F1c. (B) Secuencia de cebadores para la reacción LAMP de ADNmt de P.
vivax.

Construcción de ADN plasmídico de control positivo

Los productos de PCR obtenidos tras la amplificación del ADN con los cebadores
LAMP F3 y B3c se insertaron en el vector pGEM-T (Promega). Cada mezcla de 20 μl
de PCR contenía: tampón de PCR 10 × 2 μl, MgCl2 25 mM 1,2 μl, 2,5 mM de cada
dNTP 1,6 μl, polimerasa Taq 0,1 μl, plantilla de ADN 1 μl, agua desionizada destilada
(DDW) 13,2 μl, cebador F3 10 μM 1,0 μl y cebador B3c 10 μM 1,0 μl. La PCR se
realizó a 95 ° C durante 5 min para la desnaturalización, seguida de 35 ciclos; 95 ° C
durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 sy extensión final 72 ° C durante
5 min. Los productos de la PCR se clonaron en un vector siguiendo un protocolo
estándar [20]. El fragmento de ADNmt de P. vivax clonado pGEM-T plas-mid
recombinante (pGEM-PvMito) se extrajo con un kit Miniprep (Sangon) de Escherichia
coli (cepa DH5a), se midió la concentración mediante un espectrofotómetro y se
calcularon los números de copias.

Sensibilidad analítica y especificidad de LAMP

Tras el establecimiento del método LAMP de tubo cerrado visualizado para la

detección de mtDNA de P. vivax, los productos LAMP fueron digeridos por Dde I para
evaluar la especificidad de la amplificación. Posteriormente, se evaluó la sensibilidad
de la siguiente manera; El ADN plasmídico pGEM-PvMito recombinante se diluyó en
serie (10 veces), de modo que cada muestra contenía 1,0 x 106 a 1,0 x 102 copias, y
las reacciones LAMP se llevaron a cabo como anteriormente. Una muestra de ADN
de DBS de un paciente con parasitemia de 11.000 parásitos / μl de sangre se diluyó
en serie 10 veces utilizando agua estéril o una muestra de DN de DBS negativa mixta,
respectivamente. La tasa de dilución en serie del ADN de P. vivax es de 1 a 10.000.
La detección de LAMP se llevó a cabo como anteriormente y se comparó con la PCR
anidada.

PCR anidado

Se realizó una PCR anidada bien establecida dirigida al gen ARNr 18S como se
describió anteriormente con optimización para la detección de P. vivax [21].
Brevemente, para la primera ronda, se utilizó 1 μl de muestra de ADN de DBS como
plantilla de ADN, y los cebadores fueron: rPLU6: 5’-
TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3 ’y rPLU5: 5’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3’;
y el producto de amplificación para P. vivax es de aproximadamente 1,2 kb.
Amplificación del ADN realizada en las siguientes condiciones: 95 ° C durante 5 min,
luego seguido de 24 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante
80 sy extensión final a 72 ° C durante 10 min. Para la segunda ronda, se usó 1 μl de
producto de PCR de la primera ronda como molde, y los cebadores fueron: rVIV1: 5’-
CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGA-TAC-3 ’y rVIV2: 5’-
ACTTCCAAGCCGAAGCAAA-GAAAGTCCTTA-3 ’; siendo el producto de
aproximadamente 120 pb. Las condiciones de amplificación fueron: 95 ° C durante 5
min, seguido de 30 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante
30 sy extensión final a 72 ° C durante 5 min. Los productos de la PCR se analizaron
corriendo durante 15 min en un gel de agarosa al 2,0% teñido con bromuro de etidio a
100 v.

análisis estadístico

La sensibilidad y la especificidad del diagnóstico de LAMP visualizado novedoso y

PCR anidado se compararon con la microscopía (considerada como estándar 'oro'), y
los intervalos de confianza (IC) del 95% y los valores p se calcularon utilizando el
software SAS (SAS Institute; Cary, NC, EE. UU.) .

Declaración ética

El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional (IRB00004221) del

Instituto de Enfermedades Parasitarias de Jiangsu, Wuxi, P. R. China. Los
cuestionarios, el examen físico y el trabajo de laboratorio se llevaron a cabo después
de que se les explicara a los participantes el propósito y el procedimiento del estudio,
a quienes se les otorgó el derecho a retirarse del estudio en cualquier momento. Se
obtuvo un formulario de consentimiento por escrito de cada participante o de su tutor.

RESULTADOS

Establecimiento de un sistema LAMP de visualización de tubo cerrado

Se utilizaron tubos de PCR estándar de pared delgada y se colocaron 25 µl de

soluciones de reacción LAMP en la sección inferior. El nivel de fluido permaneció
constantemente por debajo de la interfaz de la sección inferior ahusada y la sección
del cuerpo de la columna recta. Esto permitió el espacio para la inserción de la
cápsula de tinte de cera en forma de columna sin entrar en contacto con la solución
de reacción (Figura 1A). Después de la amplificación de LAMP a 65 ° C durante 60
min, los tubos de reacción se retiraron del baño de agua y se observó que todas las
cápsulas de cera de los tubos permanecían intactas durante el proceso de reacción. A
continuación, todos los tubos se calentaron a 95ºC durante 5 min, fundiendo las
cápsulas de cera. Posteriormente, los tubos se dejaron enfriar a temperatura
ambiente y se observó que se había formado una capa sólida blanca espesa sobre la
solución de reacción (Figura 1B).
Los tubos positivos mostraron un color verde visible, mientras que los tubos negativos
mantuvieron el color naranja del SYBR Green I sin unir. Cuando se utilizó luz azul
visible o UV para excitar el SYBR Green I, los tubos positivos mostraron un mayor
grado de fluorescencia verde y el los tubos negativos permanecieron anaranjados. Sin
embargo, sin usar la cápsula, cuando se agregó la misma cantidad de SYBR Green I
al tubo LAMP antes de la reacción, la amplificación se inhibió por completo (Figura
1C).

Sensibilidad y especificidad del método LAMP visualizado

Los productos LAMP amplificados se analizaron usando la enzima de restricción de I,

se observaron bandas de ~ 80 pb (Figura 3A), que estaban de acuerdo con el análisis
teórico. Los plásmidos pGEM-PvMito se diluyeron en serie 10 veces para determinar
el límite de detección del método LAMP de ADNmt de P. vivax visualizado. Los
resultados de la electroforesis revelaron que era posible detectar 1.0 × 102 copias
(Figura 3B). Una muestra de ADN de DBS de un paciente de P. vivax con densidad
de parásitos de 11.000 parásitos / μl de sangre se diluyó en serie con DDW o se
mezcló con muestras de ADN de DBS negativas; el método LAMP visualizado pudo
detectar ambas series de muestras a una tasa de dilución de 1: 1.000 (Figura 3C). La
PCR anidada también pudo amplificar el ADN a esta concentración cuando la muestra
se diluyó con DDW. Sin embargo, la sensibilidad de la PCR anidada se redujo a una
dilución de 1: 100, cuando el agente de dilución era sobrenadante de extracción de
ADN DBS negativo (Figura 3D).

Prueba de campo de muestra usando LAMP visualizada

Se analizaron un total de 89 muestras de ADN de DBS mediante LAMP visualizado y

PCR anidada. Se examinaron frotis de sangre gruesa y fina teñidos con Giemsa por
microscopía para compararlos; 60 de las 89 muestras fueron positivas por
microscopía. Para el método LAMP visualizado, 59 de 89 fueron positivos, para PCR
anidada, 57 de 89 fueron positivos. Dos muestras de DBS fueron positivas para LAMP
pero negativas para el método de PCR anidado. En comparación con el método de
microscopía referencial, la sensibilidad de LAMP y PCR anidada fue del 98,3% (IC del
95%: 91,1-99,7%) y del 95,0% (IC del 95%: 86,3-98,3%), respectivamente. La
especificidad fue del 100% para ambos métodos (Tabla 1 y Figura 4). En
comparación con la microscopía, no se observaron diferencias significativas (P
<0,05).
Figura 3 Límite de detección de LAMP de ADNmt de Plasmodium vivax y PCR
anidada. (A) Electroforesis en gel de agarosa del producto LAMP antes (1) y después
(2) de la digestión por Dde I (Fermentas). M: escalera de ADN (1 kb Plus, Fermentas).
(B) El plásmido pGEM-PvMito se diluyó en serie 10 veces y se analizó mediante
LAMP, M: escalera de ADN, 1: 1.0 × 106, 2: 1.0 × 105, 3: 1.0 × 104, 4: 1.0 × 103, 5:
1.0 × 102, 6: 1.0 × 101, 7: DDW, los resultados se observaron tanto por electroforesis
como bajo luz azul. (C) Una muestra de DBS de P. vivax con parasitemia a 11.000
parásitos / μl de sangre se diluyó en serie con DDW y se analizó mediante LAMP y
PCR anidada: M: escalera de ADN, 1, sin diluir, 2: 1:10, 3, 1: 100 , 4, 1: 1.000, 5, 1:
10.000; 6, DDW. (D) La misma muestra de DBS de P. vivax de (C) se diluyó usando
una muestra de DBS negativa mixta y se analizó como (C).
 Se analizaron un total de 89 muestras de ADN de DBS mediante el método LAMP
visualizado y PCR anidada. Los tubos LAMP positivos muestran fluorescencia verde
brillante, los tubos negativos permanecen anaranjados. El producto de PCR anidado
para el gen ARNr 18S de P. vivax es de aproximadamente 120 pb. (+): control
positivo, (-): control negativo, 1-89: muestras de ADN de DBS. * Esas 2 muestras de
DBS fueron positivas para LAMP pero negativas para el método de PCR anidado.

DISCUSIÓN

El uso de LAMP para detectar patógenos tiene muchas ventajas, especialmente con
respecto a su alta sensibilidad y especificidad y al hecho de que solo requiere
pequeñas cantidades de ADN diana para estar presentes en una muestra para un
diagnóstico positivo. También se puede considerar un método atractivo para su uso
en áreas con recursos limitados, debido a su bajo costo y los requisitos mínimos de
equipo o experiencia especial. Sin embargo, según Wastling et al. [22], la
visualización mediante la observación del cambio de color de la metodología calceína-
MnCl2 es menos sensible. SYBR Green I es uno de los tintes de fluorescencia de
ácidos nucleicos generales más sensibles disponibles [23]. En comparación con la
calceína, que ahora se usa a menudo como un colorante fluorescente en análisis
LAMP de tubo cerrado, SYBR Green I puede excitarse tanto con luz UV como visible.
El color de este tinte cambia de naranja a verde brillante fluorescente cuando se
conjuga en el ADN y se excita con luz ultravioleta o azul, y este cambio es más
dramático que el logrado con la calceína [14]. Además, la excitación de la luz azul se
puede establecer fácilmente sin usar luz ultravioleta, que puede ser costosa y
peligrosa. En este informe, hicimos un teléfono simple para proporcionar una fuente
de luz azul para excitar SYBR Green I, cuyo uso resultó en una discriminación más
fácil entre reacciones positivas y negativas. El teléfono se basa en una única linterna
LED doméstica con la bombilla cambiada a una LED de 475 nm. Esta herramienta
portátil del tamaño de un pulgar es reutilizable y el costo total es inferior a US $ 0,5.
Aunque SYBR Green I es ventajoso debido a su alta sensibilidad en la detección de
ácidos nucleicos amplificados, la inhibición de la reacción ocurre si el tinte se agrega
directamente a las soluciones de reacción LAMP en las concentraciones requeridas
para la visualización. En nuestro sistema LAMP de tubo cerrado, se utilizó una
cápsula de cera microcristalina como recipiente de tinte, y evitó eficazmente este
efecto inhibidor al mantener el tinte separado de la mezcla de reacción hasta que la
reacción cesó. Probamos este método usando un turbidímetro en tiempo real y
descubrimos que no hubo cambios significativos en la curva de amplificación entre los
tubos con y sin tinte de cera. Este resultado sugiere que la cápsula de tinte de cera no
liberó material interferencial durante la amplificación isotérmica a 65 ° C. Por el
contrario, sin usar la cápsula, SYBR Green I inhibió completamente la reacción. Este
nuevo método también tiene la ventaja adicional de reducir el riesgo de contaminación
por aerosol de los amplicones LAMP. Durante el proceso de calentamiento a alta
temperatura, la capa de cera se funde en un líquido de baja densidad, que flota sobre
el nivel del líquido. El núcleo de tinte se hunde en la solución de reacción para formar
una mezcla. Después de enfriarse, la cera se solidifica y forma una barrera que sella
la solución de amplificación en el fondo del tubo. Por tanto, el riesgo de contaminación
se redujo durante y después de la prueba.
El procedimiento de extracción de ADN es uno de los pasos críticos para las
herramientas de diagnóstico molecular de campo basadas en PCR, ya que los
factores en la sangre humana pueden inhibir las reacciones de PCR. El método de
ebullición rápida para extraer ADN de DBS es simple y rápido, y adecuado para su
uso en el campo. Con un paso de lavado, puede proporcionar ADN de placa de
plantilla de calidad relativamente alta para PCR, pero este paso prolonga el tiempo de
respuesta. En comparación con la polimerasa Taq, LAMP utiliza la enzima Bst, que no
se ve afectada por las proteínas sanguíneas.
[24]. En este estudio, una muestra de ADN de DBS de un paciente de P. vivax con
una densidad de parásitos de 11.000 parásitos / μl se diluyó en serie con DDW o una
solución de ADN de DBS negativa mixta y se sometió tanto a LAMP como a PCR
anidada. No hubo diferencia entre las sensibilidades de PCR anidada y LAMP cuando
el diluyente era DDW, pero la sensibilidad de la PCR anidada fue 10 veces menor que
la de LAMP cuando la plantilla se diluyó con sobrenadante del proceso de extracción
de ADN realizado en sangre con parásito negativo. muestras. Este resultado sugiere
que la PCR anidada basada en la polimerasa Taq es más vulnerable que LAMP a las
sustancias interferenciales en el extracto de ADN de DBS. Sin embargo, debe tenerse
en cuenta que el objetivo del ensayo LAMP es el genoma mitocondrial, que se sabe
que tiene muchas copias por parásito (probablemente 20-50 veces más) que el
genoma nuclear, en el que el gen 18S rRNA dirigido por el anidado PCR se
encuentra. Un total de 89 muestras de DBS de campo se sometieron al método de
extracción de ADN de ebullición rápida y se analizaron mediante LAMP visualizado y
PCR anidada. La sensibilidad y la especificidad del ensayo LAMP fueron similares a
informes anteriores [9, 25, 26], y la sensibilidad de LAMP es ligeramente más alta que
la PCR anidada en este estudio, que puede haber sido causada por factores
inhibidores presentes en el ADN extraído, o la diferencia en el número de copias de
los genes diana.
La PCR anidada se basa en el gen ARNr 18S, cuyo número de copias es de
aproximadamente 4-8 por Plasmodium spp. genoma [27], mientras que LAMP se
basa en mtDNA, que, para un parásito Plasmodium, hay alrededor de 30-150 copias
[28]. Según Guo et al. [29], el método de mayor rendimiento para extraer mtDNA con
fines de diagnóstico es fenol-cloroformo-alcohol isoamílico, ya que el uso de métodos
de columna a base de sílice puede provocar la pérdida de mtDNA. El método de
ebullición rápida es rápido y de bajo costo, lo que lo hace adecuado para los métodos
de diagnóstico molecular basados en ADNmt.

CONCLUSIONES

Se estableció un método LAMP de tubo cerrado visualizado utilizando cápsulas de

tinte de cera microcristalinas, que pueden entregar tinte de fluorescencia de ADN
altamente sensible a la mezcla de reacción después de la amplificación al fundir la
capa de cera mediante calentamiento a 95 ° C. Esta visua-
El método LAMP lized conserva una alta sensibilidad y especificidad incluso utilizando
la extracción de ADN en ebullición rápida de la técnica DBS. Además, con el fin de
evaluar su idoneidad para su uso en el campo, se analizaron un total de 89 muestras
de campo mediante este método. En comparación con la microscopía, considerada
como el "estándar de oro" para el diagnóstico de la malaria, se encontró una
sensibilidad y especificidad muy altas de este método LAMP visualizado modificado, y
estaban en buena concordancia con un método clásico de PCR anidado de P. vivax.
Este método LAMP novedoso, económico y de visualización rápida es prometedor
para el diagnóstico de la malaria en entornos con recursos limitados. El procedimiento
ofrece un gran potencial y merece una validación de campo adicional y completa
antes de que pueda convertirse en parte de los enfoques de vigilancia-respuesta de
rutina en China o en otros lugares.
Figura 1 Usando la cápsula de cera microcristalina en la detección de LAMP. A) Tinte
contenido en una cápsula de cera microcristalina; no hay
contacto entre la cera y la mezcla de LAMP antes de la amplificación. (B) Después de
la amplificación isotérmica la cápsula permanece intacta, y el tinte
se liberó al derretirse a 95°C; el tubo positivo muestra un verde brillante, el negativo
es naranja, mientras que la cera de refrigeración se convierte en una barrera sólida.
(C) La LÁMPARA La reacción fue monitoreada por un turbidímetro en tiempo real, las
curvas de amplificación y juicio de los tubos con cápsula añadida son similares a las
de los tubos sin y la adición de SYBR Green I directamente a la reacción antes de la
amplificación inhibió completamente la reacción. (D) Un modificado linterna doméstica
con un LED de 475 nm, y el resultado de la excitación de la luz azul.

Figura 2 Ubicación y secuencia del cebador LAMP para

Detección de Plasmodium vivax. A) Secuencia parcial del ADNmt de P. vivax y
ubicación de cuatro cebadores: F3, B3, FIP (F1c-F2) y BIP (B1c-B2), las flechas
indican la dirección de extensión, y un sitio de la enzima de restricción Dde I ubicado
en la región F1c. (B) Secuencia de cebadores para la reacción de la LÁMPARA DE
ADNmt de P. vivax.

Figura 3 Límite de detección de la lámpara de ADNmt de Plasmodium vivax y de la

PCR anidada. (A) Electroforesis en gel de agarosa del producto LAMP antes de (1)
y después de (2) la digestión por Dde I (Fermentas). M: Escalera de ADN (1 kb más,
Fermentas). (B) El plásmido pGEM-PvMito fue diluido 10 veces en serie y
probado por LAMP, M: escalera de ADN, 1: 1.0 × 106, 2: 1.0 × 105, 3: 1.0 × 104, 4:
1.0 × 103, 5: 1.0 × 102, 6: 1.0 × 101, 7: DDW, los resultados fueron observados por
tanto por electroforesis como bajo luz azul. (C) Una muestra de ECP de P. vivax con
parasitosis en 11.000 parásitos/μl sangre fue diluida en serie con
DDW y probado por LAMP y PCR anidado: M: escalera de ADN, 1, sin diluir, 2: 1:10,
3, 1:100, 4, 1:1.000, 5, 1:10.000; 6, DDW. (D) El mismo P. vivax
La muestra de ECP de (C) se diluyó usando una muestra de ECP mixta negativa y se
probó como (C).
Figura 4 Resultados de LAMP y PCR anidado. Se analizaron un total de 89 muestras
de ADN de DBS por el método LAMP visualizado y PCR anidado. LAMP
Los tubos positivos muestran una fluorescencia verde brillante, los tubos negativos
permanecen naranja. El producto de PCR anidado para el gen del ARNr de P. vivax
18S es de unos 120 pb.
(+): control positivo, (-): control negativo, 1-89: Muestras de ADN de ECP. * Esas 2
muestras de ECP fueron positivas para LAMP pero negativas para PCR anidada
método.