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Identificación forense
de fluido seminal
Gabriel Mayoral-Andrade,1,2
Eduardo Pérez-Campos-Mayoral,2
Lucía Martínez-Martínez,3 Pedro Hernández-Cruz,3
Eduardo Pérez-Campos1,3
1. Unidad de Bioquímica e Inmunología ITO-UNAM, Oaxaca, México.
2. Laboratorio de Patología Clínica “Dr. Eduardo Pérez Ortega”.
3. Centro de Investigación en Ciencias Médicas y Biológicas,
Facultad de Medicina. UABJO.
INTRODUCCIÓN
El riesgo mundial de sufrir una violación es cuatro veces más
en la mujer que en el hombre. En una encuesta entre es-
tudiantes en México se encontró una prevalencia de 4.3%,
no habiendo diferencias estadísticamente significativas en el
sexo.(1) La edad más frecuente es entre 16 y 24 años de edad.
El tipo de victimización corresponde en orden de frecuencia a
violación, abuso sexual, tentativa de violación, y estupro.(2)
Más del 70% de personas que han sido violadas, nun-
ca pensaron que pudiera sucederles. Cerca de 75% de todos
los casos de violación son cometidos por conocidos de la víc-
tima.
En consideración a lo anterior se hace necesario que los
órganos de procuración de justicia en el país tengan herra-
mientas para el estudio científico de este tipo de problemas.
Aquí hacemos una revisión de diversas técnicas empleadas por
la ciencia forense en el estudio del fluido seminal.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA O
“MANCHAS DE EVIDENCIA”
Las muestras obtenidas de las “manchas de evidencia” o “tra-
zas de evidencia” se deberán emplear para: examen microscó-
pico con objeto de visualizar espermatozoides, identificar fos-
fatasa ácida como prueba presuntiva de presencia de semen,
e identificación de antígeno prostático específico como prue-
ba confirmatoria. Las muestras extraídas de la “escena del cri-
Correspondencia: Dr. Eduardo Pérez-Campos, Centro de Investigación en
Ciencias Médicas y Biológicas. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma
Benito Juárez de Oaxaca. Ex-Hacienda de Aguilera s/n, Carretera a San Felipe del
Agua, Oaxaca, 68020, México. Correo-e: perezcampos@prodigy.net.mx
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especial
ABSTRACT
A review of some methods used to detect seminal fluid in rape ca-
ses. Cytological examination of spermatozoa, detection of acid phos-
phatase, and immunoassays for prostate specific antigen (PSA) to
provide forensic evidence among the most important in forensic iden-
tification. Also we mention some techniques DNA-based human iden-
tification.
Keywords. Forensic identification. Seminal fluid. Prostate specific
antigen. Acid phosphatase. Short tandem repeats. Rape.
RESUMEN
Presentamos una revisión de los métodos empleados para detectar
e identificar el fluido seminal, como es el examen microscópico, de-
tección de fosfatasa ácida y el antígeno prostático específico. Adicio-
nalmente comentamos respecto a las técnicas basadas en el DNA
para la identificación de individuos.
Palabras clave. Forense. Fluido seminal. Antígeno específico de
próstata. Fosfatasa ácida. Espermatozoides. Secuencias cortas repe-
tidas en tándem. Violaciones.
men” sirven para efectuar análisis del DNA de los sospecho-
sos, mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y
RFLPs (patrones de fragmentos de restricción).
La recolección de la evidencia debe considerar hisopos
vaginales, orales, anales y peinado púbico, además de mues-
tras del cabello de la cabeza y pubis como controles, mues-
tras de saliva, muestras de sangre, huellas digitales y ropa.
En el caso de ropa u otros materiales, la localización de
la “mancha de evidencia” se puede hacer mediante luz fluo-
rescente. El espectro de excitación de las muestras de semen
tiene longitudes de onda que van de 350 nm (UV) a 500
nm (azul-verde). Cuando las “manchas de evidencia” están
sobre algodón blanco la óptima condición de observación es
de 505/555 nm (Ex/Em) y cuando la tela tiene un satinado
rosa la óptima condición queda en 450/530 nm.(3) Aunque
se ha reportado que el semen es fluorescente a la luz ultravio-
leta emitida por una lámpara de Wood, se ha mostrado que
hay significativa inespecificidad en la fluorescencia debido al
empleo de aceites o cremas.(4)
Por último, se debe señalar que todas las muestras deben
de colectarse en contenedores herméticos, para que no se con-
taminen.
43
 Identificación microscópica de espermatozoides
Gabriel Mayoral-Andrade y cols
El semen está constituido por espermatozoides y plasma se-
minal. Entre 15 a 30% del volumen del semen proviene de
la próstata, 60-70% de las vesículas seminales y sólo 10%
proviene de epidídimo. El espermatozoide tiene una cabeza,
una pieza media y un flagelo. La cabeza está constituida por
el acrosoma y el material genético, y la pieza media tiene em-
paquetadas las mitocondrias.
Cuando el hombre eyacula, los espermatozoides tienen
un máximo de supervivencia dependiendo de la región del
cuerpo donde se depositan; la posibilidad de encontrarlos de-
pende fundamentalmente de que se haya o no realizado lim-
pieza. La duración aproximada en canal endocervical es de
114 h, en fondo de saco vaginal 120 h, rectal 65 h, anal 46
h, y en la boca de 6 h. En el caso de niños, si no se recolec-
ta la evidencia antes de las 24 h es mejor no recolectarla.(5)
El estudio citológico en busca de espermatozoides es un
estándar de oro aun si otros métodos son empleados.(6)
Entre los procedimientos que se han utilizado para la
identificación de espermatozoides en las muestras de fluido
vaginal están la tinción de hematoxilina-eosina, la tinción
de “Christmas tree” (rojo rápido nuclear/picroindigocarmi-
na) y fuscina alcalina. También se han empleado variantes de
Giemsa-May-Grumwald, vgr: Diff-Quick, que emplea eosina
G y verde rápido.(7) La técnica de Papanicolaou no se reco-
mienda como rutina en una técnica forense.(8) De las técnicas
anteriores, de preferencia se debe emplear la de hematoxilina-
eosina y la tinción de “Christmas tree”.(9)
El análisis de células epiteliales glicogenadas (median-
te tinción con ácido periódico de Schiff ) en “objetos de evi-
dencia” ha sido empleado para indicar una inserción vaginal,
este procedimiento se usa particularmente en cadáveres.(10)
Fosfatasa ácida
La fosfatasa ácida es una fosfomonoesterasa no específica, se-
cretada por la glándula prostática, está presente en grandes
cantidades en el fluido seminal. Se puede encontrar en otros
fluidos en muy bajas concentraciones. Aunque es muy raro, se
han descrito casos de hombres con muy baja concentración de
fosfatasa ácida y mujeres con alta concentración de ella.(11)
Su identificación es de mucha ayuda en casos de viola-
ciones, en ellos, la presencia de semen debe confirmarse en
forma adicional por otro método como: 1) La identificación
microscópica de espermatozoides, 2) antígeno específico de
vesículas seminales, y/o 3) la cuantificación de antígeno pros-
tático específico.(12)
La “muestra de evidencia” de la secreción vaginal, obte-
nida mediante una sonda o mediante un hisopo humedeci-
do con solución salina, con el que se limpió la “mancha de
evidencia”, se deberá frotar sobre un papel filtro en donde se
realizará la prueba. Otra forma de procesar la muestra, es pre-
sionando un papel blanco absorbente húmedo, sobre la su-
44
perficie que se sospecha que contiene semen o fluido vaginal.
Considerando que la fosfatasa ácida es una proteína soluble
al agua, ésta se absorbe rápidamente al papel. Ya sobre éste se
hace la reacción. Es decir, la búsqueda de fosfatasa ácida nun-
ca deberá hacerse directamente sobre la prueba de la “mancha
de evidencia”.(13)
El principio de los métodos se basa en que la fosfatasa
ácida, cataliza en medio ácido la hidrólisis del alfa-naftil fos-
fato. El alfa-naftol producido, reacciona con una sal de dia-
zonio (Fast Red TR) formando un cromógeno púrpura. En
algunos métodos se les adiciona pentanodiol, para acelerar la
reacción al actuar como aceptor del fosfato. El tartrato se pue-
de emplear como inhibidor específico de la denominada frac-
ción prostática.
Una reacción positiva significa la presencia de fosfatasa
ácida. La positividad para la fosfatasa ácida sólo puede estar
dada por tejido prostático, tejido de bazo, de hígado o de ri-
ñón, es decir el único líquido que puede ser aplicado o dis-
persado como tal es el líquido proveniente de secreción genital
próstata-seminales-testículo. Por lo que una prueba positiva
se interpreta como la presencia de semen.
La cuantificación de fosfatasa ácida es un indicador más
sensible de semen, que la identificación de espermatozoides
en el fluido vaginal,(14) incluso puede ser un indicador del
tiempo aproximado del coito.(15)
Antígeno prostático específico
El antígeno prostático específico (PSA) es una glicoproteína
de la familia de las serino proteasas, también conocido co-
mo antígeno p30.
Idealmente cuando la eyaculación ocurre, se deben iden-
tificar los espermatozoides en la muestra de la víctima, sin em-
bargo cuando el agresor se ha realizado vasectomía, la mues-
tra puede no contener espermatozoides, en estos casos es de
utilidad identificar fosfatasa ácida y el PSA.
El tiempo promedio en que desaparece la fosfatasa áci-
da en muestras vaginales es de 14 h, mientras que el PSA se
puede encontrar todavía a las 27 h. La medición o identifica-
ción del PSA se considera una prueba confirmatoria.
El PSA se encuentra en bajas concentraciones, menor a
1 ng/mL en leche materna, glándulas peri-uretrales, y fluido
amniótico. En orina femenina se han encontrado valores en-
tre 0.12-1.06 ng/mL,(16) e incluso ligeramente mayores, con
un promedio de 3.72 ng/mL.(17) Por otra parte, se ha medi-
do mediante inmunoensayo enzimático, que el punto de cor-
te del PSA en secreción transvaginal es de 1.77 mg/mL en
muestras extraídas en un área de 0.5 ⫻ 0.5 cm. de la prenda
de vestir y preparadas en volúmenes de 1.5 mL de PSA.(18) A
diferencia de las secreciones antes mencionadas, en semen el
promedio de PSA es de 820 000 ng/mL.(19)
Tomando en cuenta que los niveles en las muestras de
evidencia son mayores de 4 ng/ml de PSA, en los últimos
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años se han empleado como método alterno la inmunocro-
matografía cualitativa de muestras extraídas con HEPES-sa-
lina provenientes de hisopos. Estas mismas muestras pueden
ser adecuadas para la extracción de DNA.(20)
Al comparar los métodos citológicos con la medición de
fosfatasa ácida y la cuantificación de PSA a dos diferentes
tiempos (0 y 24 h), se ha reportado una sensibilidad para las
tres pruebas, al tiempo 0, de 67.5, 96 y 99.4%, respectiva-
mente, en comparación con las 48 h, la fosfatasa ácida, baja
a 40.3% y el PSA disminuye discretamente a 96%. Además
el PSA proporciona buenos resultados cuando la muestra pro-
viene de sujetos oligospérmicos o azozpérmicos.(7)
Otras moléculas
Con objeto de mejorar la especificidad y sensibilidad en la de-
tección de semen, se ha empleado la cuantificación de un antí-
geno específico de vesículas seminales (SVSA), las ventajas son
su especificidad y que permite la detección en semen diluido
más de un millón de veces, sin embargo hay interferencia con
algunas proteínas presentes en el fluido vaginal.(21)
Existen algunas otras proteínas que se han empleado ini-
cialmente como marcadores tumorales de cáncer de próstata,
y que posteriormente se les ha dado una aplicación forense.
Entre estos marcadores se encuentran la glicoproteína trans-
membranal denominada “antígeno de membrana específico
de próstata” (PSMA), el péptido inhibitorio prostático (PIP),
y el gen P-53.
Por último, se ha reportado que la cuantificación de zinc
en fluido vaginal es significativa para considerar la presencia
de fluido seminal.(22)
Análisis molecular del DNA
En el caso concreto del fluido seminal, la obtención del DNA
para su comparación con la de los probables inculpados re-
presenta un problema técnico, debido a que la muestra se en-
cuentra o se puede encontrar con una mezcla de células de
epitelio vaginal y de espermatozoides. Para su estudio se re-
quiere una extracción del DNA partiendo de una lisis diferen-
cial.(23) Este método se basa en las diferencias de empaqueta-
miento del DNA en la cabeza del esperma y en los núcleos de
las células del epitelio vaginal, debido a que el DNA del es-
permatozoide tiene puentes cruzados de protamina. Esta difi-
cultad es parcialmente resuelta con otros procedimientos, co-
mo el empleo de filtros con poros de 10 ␮m, lo que da una
purificación de espermatozoides del 98 al 99%.(24)
Los primeros en analizar un locus polimórfico caracteri-
zado por un número de fragmentos de restricción variable en
el campo de las ciencias forenses fue Jeffreys y cols en 1985,
el método empleado se denomina RFLPs (restriction fragment
length polymorphism).
La búsqueda de polimorfismos en DNA minisatélite con
RFLPs se basa en identificar la longitud de fragmentos de res-
L A B O R AT- ac ta Vo l . 18 N úm. 2 2006
tricción, mediante digestión del DNA con enzimas de restric-
ción e hibridización con sondas específicas. En este método
Identificación forense de fluido seminal
se emplean sondas multilocus MLPs denominadas “Huellas
de DNA” (DNA fingerprints), o de un único locus SLPs, tam-
bién llamadas “Perfiles de DNA” (DNA profiling).(25) El pro-
blema de estas técnicas es que el DNA debe estar íntegro, y
debe haber en cantidad suficiente (cabellos, manchas de san-
gre, semen, etcétera). Las células deben ser frescas o reciente-
mente muertas y sin dañar.
Otra técnica empleada en el estudio del DNA es el aná-
lisis con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de
microsatélites STRs. La posibilidad de exclusión individual
de los marcadores empleados por PCR es menor que con las
sondas unilocus. El análisis de polimorfismos por PCR es
muy amplio. Una ventaja de la reacción en cadena de la po-
limerasa es que se puede realizar con muy pequeñas cantida-
des de la muestra. El análisis de DNA puede ser estudiado en
un solo locus (singleplex system) o al mismo tiempo más de un
locus (multiplex system).
Después de la amplificación se emplean métodos para se-
parar el DNA por su tamaño, entre éstos están la electrofore-
sis en geles de agarosa y de poliacrilamida. Los geles de aga-
rosa separan moléculas de 100 a 10 000 bases y se emplean
comúnmente con VNTR (Variable number of tandem repeats),
mientras que los geles de poliacrilamida, que separan bien de
50 a 500 bases, son generalmente empleados para secuencias
cortas repetidas en tándem STRs (short tandem repeats). Otro
procedimiento altamente eficiente para separar las moléculas
amplificadas de DNA, es el que utiliza la electroforesis capi-
lar en STRs con nucleótidos fluorescentes.(26)
La variación genética que se busca es de longitud, em-
pleando STRs o variaciones de secuencia empleando polimor-
fismo en un solo nucleótido SNPs (single nucleotide polymor-
phism).
En el análisis molecular del DNA se utiliza un marca-
dor genético que tenga un patrón de herencia bien conoci-
do, elevado polimorfismo (con muchas variaciones genéticas,
de tal manera que la más rara de las variantes de este gen no
pueda mantenerse a través de una mutación), con alto grado
de heterocigosidad, cuya herencia sea independiente de otros
genes, y con una tasa de mutación baja. Existen tres tipos de
marcadores nucleares, los microsatélites, los minisatélites y los
de variación de secuencia. En el DNA mitocondrial existen
sólo dos marcadores polimórficos de variación de secuencia
que corresponden a las regiones HVR1 y HVR2.
Hay marcadores tanto autosómicos dominantes como de
polimorfismos del cromosoma Y, de microsatélites (STRs) y
minisatélites (AMP-FLPs). También hay polimorfismos de se-
cuencia como HLADQA1, y polimorfismos de DNA repeti-
do en tándem (MVR).(25)
Como ejemplo de los marcadores de STRs que se em-
plean en genética forense están los siguientes: HUMFES/
FPS, HUMF13A1, HUMTH01 “TC11”, HUMVWA31A,
45
 HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMACTBP2 “SE33”, y
D21S11.(27)
Gabriel Mayoral-Andrade y cols
Otros marcadores que han sido frecuentemente emplea-
dos en diversas poblaciones son los microsatélites D8S1179,
D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317,
D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51,
D5S818, FGA, además de la Amelogenina; el D2S1338 y el
D19S433 proporcionan un alto nivel de discriminación en
procedimientos forenses.(28,29)
Por último, se recomienda que adicionalmente a los pro-
cedimientos de identificación de espermatozoides o de fluido
seminal, se deba buscar alguna droga que se le haya adminis-
trado a la víctima. Actualmente se emplean con mayor fre-
cuencia sustancias que producen pérdidas de la conciencia o
del control muscular, y que incluso algunas de ellas pueden
llevar a la muerte. Entre las drogas de mayor uso que deben
localizarse están: etanol, benzodiazepinas, GHB, ketamina,
escopolamina, anfetaminas, cocaína, y relajantes muscula-
res.(30)
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