Extracción de la caseína, determinación del punto isoeléctrico y

precipitación salina de proteínas.

Nombres: Simón Bayer - sgbayerm@unadvirtual.edu.co

Andrea Carolina– acpardor@unadvirtual.edu.co
Angela Gil- lagilh@unadvirtual.edu.co
Fabian Eduardo Matiz Abril- fematiza@unadvirtual.edu.co

Correo:
OBJETIVO:
El objetivo de esta práctica es la determinación del punto isoeléctrico de la
caseina extraída de la leche .
LA CASEINA
La caseína de la leche es una proteína que esta asociada la calcio esta proteína
tiene gran influencia en la composición de la leche además está relacionada con la
coagulación (formación del cuajo) en general con la formación de los quesos, esta
es considerada una fosfoproteína esta contiene ácidofosfórico la mayoría es del
grupo fosfato que están unidas por grupos hidroxilos a los aminoácidos de serina y
treonina principalmente su parte exterior es fácilmente soluble en agua
Gracias a los grupos polares su otra parte de superficie se une a las alfa y beta
que forman las micelas estas son responsables de la apariencia opaca blanca de
la leche.
La función de las micelas es transportar grandes cantidades de calcio y fosfato
para formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutrición eficiente.

PUNTO ISOELECTRICO

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se

dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que
la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas
tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de
los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando
que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la
composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en
tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos
aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de
Arginina y lysina estarían protonados (-NH3 + ). De igual forma si la proteína se
encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que
en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO - ) y los grupos
amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las
proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el
equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su
máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
agregación.

Precipitación de la salina de proteínas:

Este fenómeno está vinculado al fenómeno cosmotrópico ejercido por algunas
sales. La concentración salina y el tipo de sal requerida para
la precipitación varían de soluto a soluto. Este fenómeno es empleado para la
separación de proteínas.
RESULTADOS Y ANALISIS:

CONCLUSIONES:
Es posible la purificación Parcial y el aislamiento de la caseína de la leche
utilizando la poca solubilidad que esta proteína tiene cuando se le lleva hasta su
punto isoeléctrico y la rapidez de sedimentación de la misma al utilizar la
centrifuga . No obstante, el rendimiento puede ser variado si se considera que los
métodos de purificación son también variados.
En la parctica llegamos a comprobar todo lo que aprendimos en a teoria y pudimos
poner en parctica que se puede obtener una alta variedad de subproductos de la
leche que tiene su uso e importancia en varias ramas de la industria y la quimica.
Con esto concluimos que ninguno de los componentes de la leche, deberia ser
menospreciada puesto que constituyen una emulsion cmpuesta de componentes
organicos vitales. Se aprendio a caracterizar cada uno de ells mediante reacciones
simples que dan lugar a observaciones para diferenciar sus caracteristicas y
propiedades.
De igual manera, cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica
que la hace diferente unas con otras y, por tanto su comportamiento en sus
disoluciones es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son insolubles en
agua y resisten a la degradación enzimática, sin embargo con soluciones de cierta
fuerza iónica se puede solubilizar. Las proteínas globulares son relativamente más
solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunos coagulan
cuando se calientan. Por otro lado, la composición de aminoácidos es también
responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de
pH. Así al acidificar o alcalinizar una proteína determina, esta puede llegar a su
punto isoeléctrico, alcanzar una carga neta cero y, por tanto precipitar. La caseína
luego de que la leche se cortó no fue soluble en agua, debido a este motivo se
pudo filtrar.
La ovoalbúmina fue soluble en agua, gracias a esto se pudo formar una solución
para su posterior análisis.
Practica No. 5. Cuantificación de proteínas.

OBJETIVO : reconocimos métodos de cuantificación de proteínas y

reconocimos su curva de calibración
MARCO TEORICO:
Proteínas son la asociación de varios aminoácidos puestos en una cadena lineal.
Contienen carbono, oxígeno, nitrógeno e hidrógeno.
Los aminoácidos se unen entre sí por enlaces peptídicos, uniendo el extremo
amino de uno con el extremo carboxilo de otro aminoácido. De acuerdo con la
disposición de estos aminoácidos en la cadena, es decir, el orden, es como va a
estar dispuesto el ADN, código genético propio de cada persona.

Para la realización de este laboratorio se utilizará el método de Bradford que

consiste en En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las
proteínas pueden interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes
para dar lugar a precipitados con un color característico. Para el ensayo de
Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la
conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de color
intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los
grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y
también existe una relación lineal dentro de determinadas concentraciones de
proteínas.
Curvas de calibración
Las curvas de calibración se utilizan para comprender la respuesta instrumental a
un analito y predecir la concentración en una muestra desconocida. Por lo general,
un conjunto de muestras estándar se hace a diferentes concentraciones con una
gama que incluye al desconocido de interés y se registra la respuesta instrumental
en cada concentración. Para más exactitud y comprender el error, se puede repetir
la respuesta en cada concentración por lo que se obtiene una barra de error. Los
datos entonces se caben con una función por lo que se pueden predecir las
concentraciones desconocidas. Por lo general la respuesta es lineal, sin embargo,
una curva se puede hacer con otras funciones como la función es conocida. La
curva de calibración puede utilizarse para calcular el límite de detección y límite de
cuantificación (JoVE,2019).
Método de Bradford
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie
en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto inter
acciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta
unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de
absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa
en la propiedad del Azul Brillante de Coomassie G-250 de presentarse en dos
formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul
cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia
de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm). El método tiene una
sensibilidad de 1-15 μg.
Método de Biuret
La reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de
un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un
enlace peptídico, como las proteínas:

Este método tiene una sensibilidad de 1000-10000 μg.

RESULTADOS Y ANALISIS:
Las tablas 1 y 2 muestran los datos espectrometricos obtenidos luego de aplicar los
métodos de cuantificación de proteínas; en ellas se especifica la concentración de cada
patrón de la curva y su respectiva absorbancia así como la absorbancia de la muestra
problema que en los dos métodos se ubicó dentro del rango de cuantificación por lo que
no fue necesario diluir la muestra.
Método de Bradford

Tubo Concentración(mg/ml Absorbanci

) a
Blanco 0 0,001
1 0,2 0,669
2 0,6 1,066
3 0,8 1,149
4 1 1,422
M. problema M1 0,59 1,027

Tabla 1. Datos espectrometricos obtenidos durante el ensayo de Bradford.

A=0,902C +0,4902
1,027=0,902C +0,4902

Por lo que la concentración en mg/ml de la solución es

1,027−0,4902
C= =0,59 mg/ml
0,902

De igual forma se halló la concentración de una muestra problema empleando el

método de Biuret. A partir de la gráfica 2 se obtiene que la concentración está
dada por la expresión

0,150−0,0135
C= =5,80 mg /ml
0,0235
CONCLUSIONES:
1. Dada la sensibilidad de los dos métodos era de esperarse que la concentración
de la muestra analizada por el método de Bradford tuviera una concentración
menor que la muestra analizada por el método de Biuret.

2. La concentración real de la muestra analizada por el método de Bradford es

menor. Las desviaciones de la curva de calibración generan un aumento de la
concentración a la hora de realizar la interpolación con la absorbancia obtenida.

3.Cuando se presentan limitaciones en la cantidad de muestra disponible, el

método de Biuret es una buena opción para realizar procedimientos de
cuantificación de proteínas.

Bibliografia:
Feduchi, E. (2014). Bioquímica: Conceptos esenciales (2ª edición). Madrid. Médica
Panamericana, S.A. (pp. 28-45). Recuperado de
-http://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2055/VisorEbookV2/Ebook/9788498358742#{"
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Fernández, G. (s.f). Aminoácidos y punto isoeléctrico. Química Orgánica.
Recuperado de:https://www.quimicaorganica.org/aminoacidos-peptidos/528-
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Peña, C. (s.f). Digestión. Fundacionolgatorres. Recuperado:
http://www.fundacionolgatorres.org/aparato_digestivo/introduccion/