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Programa de Doctorado en Señalización Celular
HORMONA LIBERADORA DE LA
HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y
SUS ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIÓN
DEL CÁNCER DE PRÓSTATA
Tesis Doctoral presentada por
LAURA MUÑOZ MORENO
2014
Programa de Doctorado en Señalización Celular
HORMONA LIBERADORA DE LA
HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y
SUS ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIÓN
DEL CÁNCER DE PRÓSTATA
Tesis Doctoral presentada por
LAURA MUÑOZ MORENO
Directoras:
DRA. ANA MARÍA BAJO CHUECA
DRA. MARÍA JOSÉ CARMENA SIERRA
Alcalá de Henares, 2014

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE
SISTEMAS.
Facultad de Medicina
Campus Universitario.
28871 Alcalá de Henares (Madrid)
Teléfonos: 91 885 45 77 Fax: 91 885 45 85
ANA MARÍA BAJO CHUECA y MARÍA JOSÉ CARMENA SIERRA

Profesora Titular y Catedrática del Departamento de Biología de Sistemas de la
Universidad de Alcalá,
INFORMAN:
Que el trabajo presentado por Laura Muñoz Moreno, titulado “HORMONA

LIBERADORA DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y SUS
ANTAGONISTAS EN LA PROGRESIÓN DEL CÁNCER DE
PRÓSTATA”, ha sido realizado en el Departamento de Biología de Sistemas de
la Universidad de Alcalá bajo su dirección y, a su juicio, cumple todos los
requisitos necesarios para que la interesada opte al Grado de Doctor.
Alcalá de Henares,
Dra. Ana Mª Bajo Chueca Dra. Mª José Carmena Sierra

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE
SISTEMAS.
Facultad de Medicina
Campus Universitario.
28871 Alcalá de Henares (Madrid)
Teléfonos: 91 885 45 77 Fax: 91 885 45 85
ANTONIO JIMÉNEZ RUIZ, como Director del Departamento de Biología de

Sistemas de la Universidad de Alcalá,
INFORMA:
Que Tesis Doctoral que lleva como título: “HORMONA LIBERADORA DE

LA HORMONA DEL CRECIMIENTO (GHRH) Y SUS ANTAGONISTAS
EN LA PROGRESIÓN DEL CÁNCER DE PRÓSTATA”, ha sido realizada
por Laura Muñoz Moreno en el Departamento de Biología de Sistemas de la
Universidad de Alcalá bajo la dirección de ANA MARÍA BAJO CHUECA y
MARÍA JOSÉ CARMENA SIERRA y, a su juicio, cumple todos los requisitos
necesarios para que la interesada opte al Grado de Doctor.
Alcalá de Henares,
Dr. Antonio Jiménez Ruiz

“La ciencia, a pesar de sus progresos increíbles, no podrá
nunca explicarlo todo. Cada vez ganará nuevas zonas a
lo que hoy parece inexplicable. Pero las rayas fronterizas
del saber, por muy lejos que se eleven, tendrán siempre
delante un infinito mundo de misterio”
Gregorio Marañón
A mis padres y hermana
A Felipe
Ahora echo la vista atrás y me doy cuenta de lo afortunada que soy por tener
tanta gente a la que agradecer el apoyo que me han dado durante estos increíbles años…
No podía comenzar sin agradecer a Juan Carlos por acogerme en su laboratorio,
por ayudarme a conseguir la tan esperada beca, y por soportar mis continuas peticiones
de “autógrafos”…He aprendido muchísimo de ti durante estos años.
Todavía recuerdo el primer momento que llegué al laboratorio para
“entrevistarme” con mí, ahora, Directora de Tesis, Ana Bajo, por intermediación de “mi
mejor amigo”, era un sueño para mí poder entrar en un laboratorio y tener la opción de
hacer la Tesis. No sé cómo expresar lo mucho que agradezco lo que has hecho para que
este sueño se hiciera realidad, por confiar en mi desde el primer momento, por luchar por
mi como investigadora, por animarme cuando algo salía mal, pero sobre todo por ser un
apoyo, por escucharme y ayudarme a nivel personal.
Como olvidarme de mi querida Co-directora Maria José, tantos años planificando
experimentos, proyectos y congresos, inventándonos “que hacer”, y peleándonos con cada
línea que escribía en esta Tesis. Estos años no han sido fáciles, pero tú conseguiste que todo
resultara más sencillo, buscando soluciones increibles a cada problema. Ahora me toca
agradecerte de corazón todo el tiempo que has empleado en ayudarme, el gran entusiasmo
que me has transmitido por la investigación y la docencia, además de las luchas para
darme alguna oportunidad como docente, no cambies nunca, eres increíble!
Anuska y Eva mis grandes apoyos durante estos años…como decir unas palabras
que estén a vuestra altura…os llevaís un pedacito de mi corazón… Eva, cuantos años
juntas en este laboratorio y cuanto te echo de menos amiga…creo que no podía haber
tenido mejor compañera en este “viaje”. Hemos vivido tantas alegrías y tristezas, pero
siempre juntas, peleando por hacernos un hueco en el maravilloso mundo de la
investigación que nos traía de cabeza, hemos vivido tantas experiencias dentro, y fuera
del laboratorio en esos maravillosos congresos…y como no, a nivel personal me llevo a una
amiga muy especial, para siempre. Gracias por ayudarme y apoyarme siempre que lo
necesitaba, sin condiciones. Te deseo lo mejor es tu nueva etapa como madre, eres increíble
y Álvaro es la gran prueba de ello. Anuska, gracias por estar siempre a mi lado, por
aguantarme cuando no podía más, por escucharme siempre sin quejas, por esos grandes
consejos…que sabia eres tía…, por mostrarme ese entusiasmo por la vida aunque algo
vaya mal…me siento realmente afortunada de tenerte haberte conocido y de tenerte como
amiga, y quiero que sepas que me tendrás a tu lado siempre que me necesites. Espero que
puedas seguir en este mundo y que dentro de unos añitos nos invites para celebrar tu
nombramiento como profesora titular, porque te lo mereces, pero prometo no equivocarme
esta vez en lo que escriba en la banda. De mayor quiero ser como tú, no cambies nunca!!!
Y como no agradecer a mis Liebhers, porque sin ellos esta tesis no hubiera sido
posible, siempre me han dado todo lo que necesitaba, gracias!.
Toño, mi farmacéutico particular, eres un tío increíble de verdad, no olvidaré esas
comidas amenizadas con las magníficas “antoñadas”…Espero que te vaya todo genial,
pero me tengo enterar, que los amigos se cuentan las cosas importantes… Disfruta de la
oportunidad que te brindan Anuska y Javier cada día, es una suerte que les tengas a tu
lado ayudándote. Javier Lucio, eres un ejemplo para todos los docentes e investigadores de
la universidad, quiero pensar que si todos fueran como tú, todo iría mejor…espero que te
dejen seguir luchando. A Maribel, muchas gracias por todo tu trabajo que está también
reflejado en todos nuestros trabajos y, por supuesto, en esta Tesis, bien lo sabes… Coral,
eres una máquina, no dejes que esas ganas decaigan, mucho ánimo, puedes hacerlo!. Paula,
no te pongas celosa que tú eres mi farmacéutica particular también, sigue con esa energía
inagotable que tienes y llegarás muy lejos. Carlos, el toque andaluz de las comidas, espero
que tengas mucha suerte con tu Tesis. Mati, todo el esfuerzo que has realizado durante
estos años tendrá una gran recompensa.
Mis antecesoras…Valdehita, he tenido la suerte de disfrutar de ti durante unos
meses, y de esas charlas y consejos a la hora de la comida, ojalá se vuelvan a repetir, te
deseo todo lo mejor, y que disfrutes de esa peque tan preciosa, Vera; Sandra, espero que te
vaya genial en esta nueva etapa, y a ver si retomamos las quedadas fuera del labo de las 5
“Prietas” que últimamente está complicado. A mis posibles predecesoras…Bea, Isabel y
María, mucha suerte, espero que podáis disfrutar de la experiencia de realizar la Tesis.
Jose, mucho tiempo ha pasado desde que empezamos la carrera, todavía recuerdo
que me dijiste que sería capaz y parece que así ha sido, gracias por tener siempre palabras
de ánimo, eres un gran amigo, y estoy muy orgullosa de todo lo que has conseguido.
Ceci y Nadia, sois las siguientes, será un honor ver como os convertís en doctoras,
un título más que merecido, sé que no es nada fácil pero vosotras podéis con todo, sois unas
luchadoras. Agatha, mi querida FPU…me encanta que seas mi compi de esas “guerras”
contra el mundo, y su compi Alicia, espero que disfrutéis muchísimo de vuestros años
aquí, y si necesitáis algo aquí sigo. A mis compis de pasillo, Arancha, por ayudarnos
siempre en todo lo que estaba en tus manos y por organizar las fiestas de Navidad, espero
que acabes donde acabes seas muy feliz; el laboratorio de los “Guijarro”, Borja, Patricia y
David, por vuestra compañía en este pasillo tan solitario, os deseo lo mejor a los tres.
A los pocos “becarios” que sobreviven, Ana, ya te queda poquito, mucho ánimo;
Irene, la famosa vecina de María José, espero que sigáis las dos así de encantadoras;
Héctor, disfruta siguiendo los pasos de tu padre; Miguel, que guerra me has dado con las
centrífugas…jajaja, a Eva, un gran chino, que bueno... A Nuria, espero que tengas mucha
suerte. A los que se han ido ya Elia, Andrea, Irene, Diana, Carlos Marío, Ariel, Raúl,
Mali, Pablo, Ester, Carmen…
Agradecer la compañía en esas eternas prácticas de los técnicos Miguel y Luis, a
Angélica, por tu ayuda con todos los papeleos, a Isabel y Cristina, y a Lourdes, que ya se
nos fue, por vuestra ayuda en cultivos. A la gente de gerencia…no podían faltar…
A todos los profesores del departamento, en especial a Eduardo y Miguel Ángel
una gran compañía de pasillo. Gracias Miguel Ángel por esas conversaciones
transcendentales que solemos tener y por tus “cancioncillas” que me animan el día.
Al laboratorio de Sevilla, gracias a Jose A. Pintor que me acogió durante esos meses
en su laboratorio como una más, gracias a More, por enseñarme un mundo nuevo en la
investigación y por hacernos reír siempre, a Belén por ayudarme siempre que podía, y
sobre todo a mi Cris, que además de una compañera se convirtió en una gran amiga.
A mis amigos, sobre todo a mis queridas “Pa ti la vida”, Myri, Elena y Silvia que a
pesar de no entender mucho lo que hacía siempre me han apoyado y aconsejado, os quiero.
A Miguel, Juanma, Yoyer, Santi, Pablo, Álvaro, Mitos, Laura, Saras, Tati, Ester, Sonia…A
las chicas de la academia, que me han acompañado durante estos años.
A mis primas, MªCarmen, mi ejemplo a seguir, Sonia y Julia, sois un apoyo muy
importante para mí, os quiero primis, y a mis tíos que ya no están, os echo de menos… A
mis tíos Tomás y Alfonsa, y mis primos Verónica y Daniel. A mi familia política,
especialmente a mis peques que adoro, Diego y Martita.

A mi amor, Felipe, eres el pilar que me sostiene arriba, gracias por todo tu apoyo
en los malos y en los buenos momentos, por estar siempre sin necesidad de pedírtelo, por
escucharme, ayudarme y mimarme tanto, eres increíble y te quiero con locura, siempre
+∞.
A mis padres, que gran suerte tengo de teneros a mi lado, nos os cambiaría por
nada del mundo, todo esto es gracias a vuestro esfuerzo, sin vosotros mi sueño no se podría
haber hecho realidad, sois únicos, ¡os quiero!. A mi hermana, Carol, gracias por apoyarme
siempre que te he necesitado y por ayudarme siempre que has podido, te quiero “enana”, y
espero que todo te vaya genial. A mi peque, Jairo, un bichito al que adoro con todas mi
corazón.
ABREVIATURAS
Universidad de Alcalá Abreviaturas
α-SMA: Actina de músculo liso α EGFR: Receptor del factor de crecimiento

AAH: Hiperplasia adenomatosa atípica epidérmico
ABTS: 2,2´-acinobis-(3- tilbenzotiazolina -6-) EGTA: Ácido etilenglicoltetracético
AC: Adenilato ciclasa ELISA: Inmunoanálisis ligado a enzima
ADAM: Desintegrina y metaloproteasa EMT: Tansición epitelio-mesénquima
AR: Receptor de andrógenos EP: Dibujo de elaboración propia.
AFR: Anfiregulina EPG: Epigenina
BAX: Proteína X asociada a BCL2 EPR: Epirregulina
BCL2: Proteína del linfoma de células B 2 ERE: Receptor de estrógenos
BRCA1, -2: gen de cáncer de mama 1 y 2 ERK: Quinasas reguladas por señales
BrdU: Bromodeoxiuridina extracelulares
BSA: Albúmina sérica bovina FAK: Quinasa de adhesión focal
BTC: Betacelulina FBS: Suero fetal bovino
CAM: Moléculas de adhesión celular FDA: “Food and Drug Administration”
cAMP: Adenosin monofosfato cíclico FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos
CBP: Proteína de unión a CREB FITC: Isotiocianato de fluoresceína
CDK. Quinasa dependiente de ciclina GABA: Ácido gamma-aminobutírico
COX: Ciclooxigenasa GDP: Guanosina difosfato
CP: Cáncer de próstata GH: Hormona del crecimiento
CRE: Elemento de respuesta a cAMP GHRH: Hormona liberadora de la
CREB: Proteína de unión a CRE hormona de crecimiento
CSC: Célula madre cancerosa GHRH-RP: Péptido relacionado con GHRH
DAG: Diacilglicerol GnRH: Hormona liberadora de
DBD: Dominio de unión al DNA gonadotropinas
DEPC: Dietilpirocarbonato GPCRs: Receptores acoplados a proteínas G
DMSO: Dimetilsulfóxido GTP: Guanosina trifosfato
dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato HB-EGF: EGF de unión a heparina
DRE: Examen digital del recto HER2, -3 y -4: Receptor del factor de
DTT: Ditiotreitol crecimiento epidérmico humano tipo 2, 3 y 4
EGF: Factor de crecimiento epidérmico HER2-P: HER2 fosforilado
EDTA: Ácido etilendiaminotetracético hGHRH-R: Receptor de GHRH hipofisario
Abreviaturas Universidad de Alcalá
HGPIN: Neoplasia prostática intraepitelial de OMS: Organización Mundial de la Salud

alto grado PACAP: Péptido activador de la
HIF: Factor inductor de hipoxia adenilato ciclasa hipofisaria
HIFU: Ultrasonidos focalizados de alta PBMC: Células mononucleares en sangre
frecuencia periférica
HRG: Heregulina PC1: Proproteína convertasa 1
HRP: Peróxidasa de rábano PCNA: Antígeno nuclear de
IFN-γ: Interferon γ proliferación celular
IGF: Factor de crecimiento similar a PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
insulina PDGF: Factor de crecimiento derivado
IL-17: Interleuquina 17 de plaquetas
IP: Ioduro de propidio PI3K: Fosfoinosítido 3 quinasa
iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible PIGF: Factor de crecimiento placentario
IP3: Inositol trifosfato PIN: Neoplasia prostática intraepitelial
JAK: Janus Quinasa PIP2: Fosfatidilinositol 4-5, bisfosfato
KGF: Factor de crecimiento de keratinocitos PKA: Proteína quinasa A
LEF: Factor potenciador linfoide PKC: Proteína quinasa C
LGPIN: Neoplasia prostática intraepitelial de PLC: Fosfolipasa C
bajo grado PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
MAPK: Proteína quinasa activada PON1: Paraoxonasa 1
por mitógenos PR: Prostactectomía radical
MDR: gen de sensibilidad a medicamentos PSA: Antígeno prostático humano
MEK: Quinasa de MAPK PTB: Dominio de unión a fosfotirosina
MET: Transición mesénquima-epitelio PTEN: Homólogo de fosfatasa y tensina
MMPs: Metaloproteasa de matriz PyK2: Proteína tirosina quinasa 2
MT-MMP: Metaloproteasa de la membrana RECK: Proteína rica en cisteína inductora de
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- reversión
2,5-difenil-tetrazol RNASEL: Ribonucleasa L
NAD: Dominio de autorregulación negativa SH2: Dominio de unión a Src
NFκB: Factor de transcripción nuclear κ B STAT3: Transductor de señal y activador de
Nrg1, 2, 3 y 4: Neuregulina 1, 2, 3 y 4 la transcripción
Universidad de Alcalá Abreviaturas
SVs: Variantes de splicing

TDT: tiempo de duplicación del tumor
TGF: Factor de crecimiento transformante
TIMP: Inhibidor tisular de metaloproteasas
TMD: Dominio transmembrana
TNF: Factor de necrosis tumoral
TRH: Hormona liberadora de tirotropina
VEGF: Factor de crecimiento del
endotelio vascular
VEGFR: Receptor deVEGF
VIP: Péptido intestinal vasoactivo
1. INTRODUCCIÓN……….………………………….………………… 1
1.1 Cáncer de próstata…………………………...……….………………. 3
1.1.1 Epidemiología……………………………...…………….……… 4
1.1.2 Etiología………………………………………………………… 5
1.1.3 Diagnóstico………………………………………….……….….. 7
1.1.4 Clasificación………………………………………...…………… 7
1.1.5 Tratamiento………………………………………………..…… 12
1.1.6 Progresión tumoral…………………………...………………… 13
1.1.6.1 Lesiones premalignas……………………………………… 14
1.1.6.2 Transición epitelio-mesénquima y mesénquima-epitelio
………(EMT y MET)…………………………………………….. 15
1.1.6.3 Dependencia/Independencia androgénica……...………… 16

1.2 Procesos tumorales implicados en la progresión del CP………….… 18
1.2.1 Proliferación………………………………..…………………… 18
1.2.2 Adhesión……………………………………….………...……… 23
1.2.3 Degradación de la matriz extracelular…………….…………… 25
1.2.4 Angiogénesis…………………………………….……………… 27
1.3 Familia del EGFR………………………………………………….… 29
1.3.1 Receptores y ligandos…………….…….…….………………… 30
1.3.2 Activación de los receptores…………….……………………… 32
1.3.3 Transactivación de la familia EGFR mediada por GPCR……... 34
1.3.4 Familia EGFR y cáncer………………………………………… 36
1.4 Hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH).…...… 37
1.4.1 Acciones biológicas de GHRH…………………………………. 41
1.4.2 Receptores de GHRH……………….……...…………………… 45
1.4.3 Señalización de GHRH……….………………………………… 49
1.4.4 Antagonistas de GHRH………………………………………… 53
2. OBJETIVOS…………….………………………………….…..……… 57
3. MATERIAL Y MÉTODOS…….……….….….……………….……. 61
3.1 Materiales…………………………...…………….………….………. 65
3.1.1 Reactivos…………………………………………………...…… 65
3.1.2 Modelos experimentales………….…….…….…….……...….… 69
3.1.2.1 Líneas celulares……………………………………….…… 69
3.1.2.2 Animales de experimentación..………………………….… 70
3.2 Métodos……..………………………...…….….………...…………… 61
3.2.1 Células………………………….……….….…………………… 61
3.2.1.1 Ácidos nucleicos…………………………………………… 61
Aislamiento de RNA…………………………………………… 61
Retrotranscripción de RNA (RT)...……….…………………… 61
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)...…………………. 72
3.2.1.2 Proteínas………………..………..………………………… 74
Aislamiento de proteínas totales…………….………………… 74
Aislamiento de citosoles y núcleos….…….…………………… 75
Inmunodetección de proteínas……………….………………… 75
Inmunocitoquímica …………….……………………………… 77
Zimografía………..………………………………..…………… 78
ELISA para valorar el VEGF……..…………………………… 79
3.2.1.3 Ensayo de incorporación de bromodesoxiuridina………… 80
3.2.1.4 Ensayo de viabilidad con MTT…………………………… 81
3.2.1.5 Ensayo de ciclo celular…..………………………………… 82
3.2.1.6 Ensayo de adhesión….…..………………………………… 82
3.2.1.7 Ensayo de migración.…..………………………………….. 83
3.2.2 Ratones………………..………………………………………… 84
3.2.2.1 Inducción de tumores con células PC3……………….…… 84
3.2.2.2 Inducción de tumores con células RWPE-1……………… 86
3.2.2.3 Seguimiento de los experimentos de tumorigenicidad….… 87
3.2.2.4 Aislamiento de RNA y RT-PCR…………..……………… 87
3.2.2.5 Inmunohistoquímica…………...…….………..…………… 87
3.2.2.6 Tricrómico de Masson………...…….………..………….… 89
3.2.2.7 Lisados de tejido tumoral y “Western blotting”.………..… 89
3.2.2.8 Estudio de la expresión de VEGF y de la actividad
………………...gelatinolítica de MMPs…………………………………… 90
3.2.2.9 Aislamiento de membranas y núcleos……..……………… 90

3.2.2.10 Sonda 2-desoxi-D-glucosa .………………..…………….. 91
3.2.2.11 Rayos X……….………..………………………………… 92
3.2.3 Análisis estadístico…..…………………………….……………. 93
4. RESULTADOS……………………..………………………..………… 95
4.1 Estudio de GHRH y sus receptores en células prostáticas humanas.. 97
4.1.1 Expresión de GHRH..…………………………………………... 97
4.1.2 Expresión de los receptores de GHRH………………………… 98
4.1.3 Localización de los receptores de GHRH..…………………...… 97
4.1.4 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la expresión de sus
……….…..receptores……………………………………………………..… 100
4.2 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en procesos implicados en la

……...progresión del cáncer de próstata………...………………………..….101
4.2.1 Viabilidad celular y citotoxicidad…….……………………….…101

4.2.2 Proliferación celular…………….…….………………………… 104
4.2.2.1 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en la proliferación
………………...de células RWPE-1, LNCaP y PC3.………………….…… 104
4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la

………………...proliferación inducida por GHRH en células PC3……....… 106
4.2.2.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la.expresión de

………………...PCNA en células RWPE-1, LNCaP y PC3.……..........…… 108
4.2.3 Ciclo celular y apoptosis en PC3.…….……………………….… 110

4.2.3.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular...… 110
4.2.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre el factor de
………………...transcripción p53 en PC3...…………………………...…… 112
4.2.3.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre p21 en PC3...… 113
4.2.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre las proteínas
………………...Bcl2 y Bax implicadas en apoptosis en PC3……….…….…114
4.2.4 Adhesión celular.…….……………………………………….…. 115

4.2.4.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la adhesión celular
………………... de células RWPE-1, LNCaP y PC3……………….……… 116
4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de.

…………….....E-cadherina en células RWPE-1, LNCaP y PC3………… 118
4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de

…….β-catenina en células RWPE-1, LNCaP y PC3…………. 121
4.2.4.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de,

……….……......CD44, c-Myc y Ciclina D1 en células PC3……………… 125
4.2.5 Migración celular.……….……………………………..………. 126

4.2.6 Degradación de la matriz extracelular………..………………… 130
4.2.7 Neurodiferenciación….……………………………….……..….. 133
4.2.8 Angiogénesis…...…….………………………………..…………. 135
4.3 Efecto de GHRH y de sus antagonistas sobre la vía del EGF………. 136
4.3.1 Expresión y activación de EGFR Y HER2…………...………… 136
4.3.2 Heterodimerización de EGFR-HER2…………..….…….……. 139
4.3.3 Vías de señalización implicadas en la transactivación de EGFR
…………..y HER2 mediada por GHRH…….……….………………….… 140
4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivación de EGFR

………….……..y.HER2 por GHRH…………………………………….… 140
4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activación

………………...de.pSrc ……………………………………………….….... 142
4.3.3.3 Implicación de las metaloproteasas en la transactivación

……................... .de EGFR y HER2 por GHRH ………………………….... 144
4.3.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la expresión de
………………..TACE/ADAM17………………………………………… 147
4.3.3.5 Implicación de la transactivación de EGFR y HER2

……... …….......inducida por GHRH en angiogénesis, adhesión y
…………………migración celular………………………………………… 148
4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidérmico, EGF, sobre

……......................la.expresión de GHRH y sus receptores………………… 152
4.4 Estudio del efecto los antagonistas de GHRH en un modelo

……….experimental in vivo de cáncer de próstata humano……………… 153
4.4.1 Efecto de JMR-132 y JV-1-38 en el crecimiento de tumores

………...in vivo………………………………………………………..….… 153
4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad………………………………. 153

4.4.1.2 Expresión de GHRH y sus receptores……………….…….. 155
4.4.1.3 Proliferación celular……….…..........…………………..….. 157
4.4.1.4 Ciclo celular y apoptosis…...………………………………. 158
4.4.1.5 Adhesión celular…………………………………………… 159
4.4.1.6 Degradación de la matriz extracelular……………………. 162
4.4.1.7 Angiogénesis……….……………………………….……… 164
4.4.1.8 Metástasis……………………………………….……….… 165
4.4.1.9 Expresión de EGFR, HER2 y Src……………………….… 167
4.4.1.10 Expresión de diferentes isoformas de PKCs……………. 169
4.4.2 Efecto de MIA-690 y Gefitinib en el crecimiento de tumores
.in vivo…………………………………………………………..… 170
4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad…………….………………… 171

4.4.2.2 Angiogénesis ……………….……………………………… 172
4.4.2.3 Metástasis…………………..…………………………….. 173
4.5 Efecto de GHRH sobre la inducción de tumores………………….. 174
5. DISCUSIÓN…………..…………..…………………………………….. 177
6. CONCLUSIONES…….…………..…………………...…………….…. 197
7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………….… 203
8. SUMMARY………….…..…………..…………………………………. 235
9. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA…..………………………………...… 241
10. FINANCIACIÓN…….……..……..……………………………..…… 247
1. INTRODUCCIÓN
Universidad de Alcalá Introducción
En 1853, J. Adams, un cirujano inglés realiza la primera descripción del

cáncer de próstata mediante un examen histológico, señalándola en su informe
como “una enfermedad muy rara”. Durante los últimos 150 años la prevalencia
de cáncer de próstata ha aumentado de forma drástica, y aunque se ha
encontrado tratamiento eficaz para estadios menos avanzados de la enfermedad,
todavía no se ha encontrado una cura para los casos más agresivos.
1.1 CÁNCER DE PRÓSTATA
La próstata es una glándula del aparato reproductor masculino que aporta

el líquido seminal y sustancias que protegen y nutren a los espermatozoides.
Tiene forma de castaña, su tamaño es de 4 cm de largo por 3 cm de ancho y su
peso es de 20 g, aunque sus dimensiones varían con la edad. Se encuentra
delante del recto y por debajo de la vejiga, rodeando a la primera porción de la
uretra, la cual separa la próstata en porción ventral (fibromuscular) y dorsal
(glandular) (Figura 1A). Se han descrito diferentes modelos para el estudio
anatómico de la próstata, pero el más aceptado es el modelo de McNeal que
distingue 4 zonas (Figura 1B) (Kirby y col., 2006):
• Zona anterior: exclusivamente fibromuscular.

• Zona central: representa el 25%, en ella se originan los procesos
inflamatorios y se asientan el 8% de los cánceres de próstata.
• Zona de transición: constituye el 5%, y en ella se desarrollan el 25% de
los adenocarcinomas de próstata.
• Zona periférica: representa el 70% de la próstata, y es el sitio de origen
del 75% de los carcinomas prostáticos. Esta es la razón de que los
hombres operados de hiperplasia benigna de próstata sigan teniendo
riesgo de desarrollar un carcinoma en el futuro, por haber sufrido una
cirugía conservadora donde solo se ha eliminado la zona central.
-3-
Introducción Universidad de Alcalá
A) B)
Vejiga
Próstata Uretra Zona central

Zona de transición
Uretra
Zona periférica
Figura 1. Vista lateral del órgano reproductor masculino (A) y detalle de la

anatomía de la próstata (B). Imagen tomada de www.nlm.nih.gov (A) y
modificadas de www.hkua.org (B).
1.1.1 EPIDEMIOLOGÍA
El cáncer de próstata (CP) es la segunda neoplasia más común en los

hombres a nivel mundial. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se
estima que 1,1 millones de hombres en todo el mundo fueron diagnosticados de
cáncer de próstata en el año 2012, representando el 15% de los cánceres
diagnosticados en los hombres, y un 70% de los casos se producen en países
desarrollados. Con un valor estimado de 307.000 muertes en 2012, el CP es la
quinta causa de muerte por cáncer en los hombres y supone el 6,6% del total de
muertes de hombres en el mundo. La tasa de mortalidad es generalmente alta en
poblaciones como el Caribe (29 por 100.000) y África subsahariana (19-24 por
100.000), siendo muy baja en Asia (2,9 por 100.000 habitantes) e intermedia en
América y Oceanía. En EEUU, el CP constituye la neoplasia más frecuente y la
segunda causa de muerte específica por cáncer en los hombres (Siegel y col.,
2014). En España se sitúa en el primer puesto en cuanto a la incidencia, y el
segundo más frecuente en las tasas mortalidad por cáncer (Figura 2).
-4-
SIN DATOS
Figura 2. Tasa de mortalidad del cáncer de próstata por cada 100.000

habitantes. Imagen modificada de www.theglobeandmail.com.
1.1.2 ETIOLOGÍA
Se han encontrado una serie de factores de riesgo que aumentan la

probabilidad de padecer cáncer de próstata:
• Edad: El 99% de los pacientes han sido diagnosticados con CP a partir de

los 50 años de edad. La incidencia del CP aumenta de forma exponencial
con el aumento de la edad, siendo mayor en el rango de 65-69 años, el
cual contribuye a un 32% de los cánceres de próstata. En cuanto a la
mortalidad, la mayor tasa se sitúa en pacientes con edades por encima de
85 años, que suponen un 23% de las muertes por cáncer de próstata (Dörr
y col., 2013).
• Raza: Los datos disponibles apuntan a que los hombres de raza negra
tienen mayor probabilidad de desarrollar cáncer de próstata que la
población de raza blanca. Se piensa que puede haber factores genéticos
implicados en esta mayor susceptibilidad al CP. La diferencia que se
-5-
observa en la tasa de incidencia entre los hombres de raza negra en

distintos países, sugiere que están implicados factores ambientales como
la dieta y el nivel socioeconómico (Kheirandish y Chinegwundoh, 2011).
• Antecedentes familiares: Se trata de un factor de riesgo importante sobre

todo en hombres jóvenes. Cuando existe un pariente de primer grado con
CP el riesgo se duplica, y para el caso de 2 o 3 parientes, el riesgo se
multiplica por 5 y 11. Aproximadamente, un 10-15% de pacientes con
cáncer de próstata tienen un familiar con cáncer de próstata. Se han
encontrado genes asociados al CP hereditario: BRCA2, BRCA1,
RNASEL y PON1 (Colloca y Venturino, 2011). Además, algunos autores
afirman que mutaciones en los locus 8q y 17q son las responsables del
16% de los cánceres de próstata hereditarios (Kote-Jarai y col., 2008).
• Dieta: Algunos estudios en modelos animales implican a ciertas

sustancias de la dieta en el riesgo de padecer CP, tales como, las aminas
heterocíclicas, producidas por socarrar las carnes, y por la presencia de
las hormonas esteroides sexuales, particularmente los estrógenos. Varios
estudios apuntan a que la ingesta de frutas y verduras está asociada
directamente a un menor riesgo de padecer CP (Nelson y col., 2014).
• Factores infecciosos: Existen estudios que afirman que los agentes

infecciosos pueden influir en la incidencia del CP a través de varios
mecanismos como, incorporación de oncogenes víricos al genoma,
inhibición de los genes supresores de tumores, estimulación de la
proliferación y supresión de la vigilancia inmunológica. La inflamación
crónica de la próstata generada por las enfermedades de transmisión
sexual se asocia con mayor riesgo al CP, pero actualmente no se ha
relacionado específicamente con ningún agente infeccioso específico
(Ferrís-I-Tortajada y col., 2011).
-6-
• Otros factores: Algunos estudios han encontrado que la obesidad y la

Diabetes mellitus tipo II están relacionadas con la aparición de CP
agresivo. Estas alteraciones metabólicas pueden producir estrés oxidativo
y causar un estado pro-inflamatorio permanente, lo que incrementa el
riesgo de padecer cáncer de próstata (Di Francesco y Tenaglia, 2014).
1.1.3 DIAGNÓSTICO
En general, el CP en etapas iniciales no causa síntomas, y para su

detección los métodos más utilizados son el análisis de la cantidad de antígeno
prostático específico (PSA) en la sangre, y el examen digital del recto (DRE).
Sin embargo, varios estudios ponen en duda que el PSA sea un buen marcador
de CP, ya que se encuentra alterado en otras enfermedades como la hiperplasia
benigna de próstata, prostatitis e infección urinaria (Dimakakos y col., 2014). El
marcador más apropiado para el diagnóstico del CP en una etapa temprana no
ha sido descubierto todavía, incluso se cree que un solo marcador no sería
suficiente.
1.1.4 CLASIFICACIÓN
El CP se clasifica según la parte afectada, el grado de diferenciación

histológico y el estadio del tumor.
Según el tipo celular afectado por el cáncer encontramos la siguiente

clasificación (Kirby y col., 2006):
• Tumores epiteliales: adenocarcinoma, carcinosarcoma, adenocarcinoma

ductal, carcinoma urotelial, escamoso y de células basales. Este tipo
supone el 95 % de los canceres de próstata.
-7-
• Tumores neuroendocrinos: carcinoma de células pequeñas, tumor

carcinoide, tumor neurodiferenciado endocrino, paraganglioma y
neuroblastoma.
• Tumores estromales
• Tumores mesenquimáticos
• Tumores hematolinfoides
• Otros tumores
El grado de diferenciación histológica se determina por el grado de

Gleason, que se estableció en 1992 para el CP y está reconocido
internacionalmente para la gradación del cáncer. Para ello, se realiza un examen
histológico de la muestra, otorgando una puntuación (Figura 3) a los dos
patrones más habituales, y sumándola posteriormente para obtener el grado de
Gleason que irá de 2-10 (Gleason, 1992; Iczkowski y Lucia, 2011).
-8-
Grado 1: Glándulas pequeñas y redondeadas,

monoestratificadas, con citoplasma claro y sin
estroma interglandular. El conjunto glandular está
bien compacto y delimitado del entorno.
Grado 2: Glándulas más irregulares y citoplasma

más claro y existe estroma entre las glándulas. El
conjunto glandular está mal delimitado.
Grado 3: Glándulas mucho más irregulares con

mayor separación estromal. El citoplasma es más
basófilo y existe una mala delimitación del
entorno. El epitelio puede adquirir una forma
papilar y cibriforme.
Grado 4: Existe una progresiva fusión de las

glándulas que se ramifican y forman ramas sólidas.
Se observan células grandes con un citoplasma
pálido. El conjunto está mal delimitado e invaden
de forma agresiva el estroma.
Grado 5: El tejido está formado por masas

infiltrantes irregulares con configuraciones
glandulares ocasionales o células con anillo de
sello de distribución irregular. La invasión del
estroma es intensa y destructiva.
Figura 3. Representación de los grados de la clasificación de Gleason en el

cáncer de próstata. Imagen tomada de www.stjohnprovidence.org.
El sistema de estadiaje aceptado internacionalmente es el TNM, cuyas

siglas indican el tamaño del tumor (T), nódulos linfáticos afectados (N) y
generación de metástasis (M). La clasificación realizada para 2010 (Sobin y
Compton, 2010) es la siguiente:
T- Tumor primario
• TX No se puede evaluar el tumor primario.

• T0 Ausencia de datos de tumor primario.
-9-
• T1 Tumor clínicamente inaparente no palpable ni visible en las

pruebas de imagen.
T1a El tumor es un hallazgo histológico fortuito en el 5% o
menos del tejido resecado.
T1b El tumor es un hallazgo histológico fortuito en más del 5%
del tejido resecado.
T1c Tumor identificado en una biopsia por punción, por
ejemplo, debido a una concentración elevada de PSA.
• T2 Tumor limitado a la próstata.

T2a El tumor afecta a la mitad de un lóbulo o menos.
T2b El tumor afecta a más de la mitad de un lóbulo, pero no a los

dos lóbulos.
T2c El tumor afecta a los dos lóbulos.
• T3 El tumor se extiende a través de la cápsula prostática.

T3a Extensión extra-capsular, incluida afectación microscópica
del cuello de la vejiga.
T3b El tumor invade una o ambas vesículas seminales.
• T4 El tumor está fijo o invade estructuras adyacentes distintas de las

vesículas seminales: esfínter externo, recto, músculos elevadores o
pared de la pelvis.
N- Ganglios linfáticos regionales
• NX No se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales

• N0 Ausencia de metástasis ganglionares regionales
• N1 Metástasis ganglionares regionales.
- 10 -
M- Metástasis a distancia
• MX No se pueden evaluar las metástasis a distancia.
• M0 Ausencia de metástasis a distancia.
• M1 Metástasis a distancia.
M1a Ganglios linfáticos no regionales.
M1b Huesos.
M1c Otros focos.
Actualmente para valorar el estadio clínico de un paciente con CP se

combina la clasificación TNM, la gradación de Gleason y las concentraciones de
PSA séricas para clasificar el cáncer de próstata por etapas como se muestra en
la tabla 1 (Edge y col., 2010).
Tabla 1. Estadios clínicos del cáncer de próstata.
T N M PSA Gleason
Etapa I T1a-c N0 M0 <10 ≤6
T2a N0 M0 <10 ≤6
Etapa IIA T1a-c N0 M0 <20 7

T1a-c N0 M0 10-20 ≤6
Cáncer
T2a N0 M0 10-20 ≤6
T2a N0 M0 <20 7
T2b N0 M0 <20 ≤7
Etapa IIB T2c N0 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-2 N0 M0 ≥20 Cualquiera
- 11 -
T1-2 N0 M0 Cualquiera ≥8
Etapa III T3a-b N0 M0 Cualquiera Cualquiera
Etapa IV T4 N0 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-4 N1 M0 Cualquiera Cualquiera
T1-4 N0-1 M1 Cualquiera Cualquiera
1.1.5 TRATAMIENTO
Entre las diferentes opciones que se utilizan en el tratamiento del CP

destacan la cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, criocirugía y
ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU).
Dentro de las opciones quirúrgicas encontramos la prostatectomía

radical (PR) y la linfoadenectomía pélvica, que se suelen combinar cuando el
riesgo de metástasis es alto, ya que normalmente entre el 15 y 40% de los
nódulos extirpados tienen células tumorales (Joniau y col., 2013). Otro tipo de
tratamiento quirúrgico es la criocirugía que consiste en aplicar frío extremo
para destruir el tejido enfermo, y que normalmente se utiliza en tratamientos a
corto plazo.
La radioterapia es la segunda modalidad de tratamiento más habitual

para CP localizado. Dentro de ella encontramos la terapia con haz de
protones, que utiliza radiación ionizante de una forma más localizada, precisa y
- 12 -
menos tóxica. Así mismo, se ha visto que produce un incremento en la

supervivencia de los enfermos de CP (Pugh y col., 2013).
La terapia hormonal se basa en el hecho de que los andrógenos suponen

una fuente de alimentación para el crecimiento del tumor. Por ello, la terapia de
deprivación de andrógenos, junto con otras aproximaciones médicas, supone un
tratamiento inicial para evitar el CP metastásico. Los tratamientos utilizados
para la deprivación androgénica incluyen: estrógenos, agonistas de la GnRH
(hormona liberadora de gonadotropinas) e inhibidores de la 5-α reductasa.
Normalmente los tratamientos van dirigidos a las células cancerígenas, pero es
importante también inhibir el estroma prostático, ya que juega un papel
importante en la invasividad de las células tumorales (Chen y Zhao, 2013).
La quimioterapia es principalmente utilizada en el CP avanzado

independiente de andrógenos, donde ha conseguido resultados satisfactorios
incrementando la supervivencia, disminuyendo los niveles de PSA y mejorando
la calidad de vida del paciente. Entre los fármacos utilizados encontramos:
docetaxol, doxorubicina, vinblastina, paclitaxel, mitoxantrona y otros, siendo
utilizados solos o combinados entre sí. Estos compuestos inhiben vías
importantes en el crecimiento tumoral como el ciclo celular (Chen y Zhao,
2013).
La elección del tratamiento adecuado depende del estadio en el que se

encuentre la enfermedad; además, hay que tener en cuenta la edad del paciente,
sus condiciones generales de salud y los posibles efectos adversos del
tratamiento.
1.1.6 PROGRESIÓN TUMORAL
El CP se inicia con pequeñas lesiones bien localizadas; algunas de estas

lesiones progresan dando lugar a carcinomas, que pueden alcanzar el estadio
- 13 -
más avanzado de la enfermedad, metastatizando a otros órganos. En pacientes

con CP localizado, la supervivencia en un periodo de 5 años es de un 100%; sin
embargo, cuando la enfermedad progresa hacia la metástasis la supervivencia se
reduce a un 31%. El 80% de las metástasis observadas en pacientes con CP se
producen en el hueso y dentro del 20% restante encontramos metástasis en
pulmón, cerebro e hígado (Jin y col., 2011).
1.1.6.1 Lesiones premalignas
En 1926, Oertel describió por primera vez las lesiones premalignas de la

próstata. Actualmente se han estudiado en profundidad y se han clasificado en
neoplasia prostática intraepitelial (PIN) e hiperplasia adenomatosa atípica
(AAH) (Greg, 2013).(Oertel, 1926)
La PIN se caracteriza por una proliferación displásica del epitelio ducto-

acinar de la próstata. Actualmente se clasifica en alto (HGPIN) y bajo (LGPIN)
grado. La HGPIN es probablemente la precursora del carcinoma prostático. En
estas lesiones, las glándulas se observan con bordes ondulados, papiliformes o
cribiformes. Los núcleos se vuelven atípicos conforme aumenta el grado de la
lesión, apareciendo acumulaciones cromáticas y nucléolos muy prominentes.
La AAH presenta una proliferación bien delimitada de las glándulas

parecidas a las observadas en un carcinoma con un grado de Gleason 1-2. Las
células tienen citoplasma claro y los núcleos con una morfología normal y
nucléolos no prominentes. Esta lesión se encuentra en un 23% de las
prostatectomías.
- 14 -
1.1.6.2 Transición epitelio-mesénquima y mesénquima-epitelio (EMT y

MET)
En los últimos años, se ha propuesto a la EMT y a las cancer stem cells

(CSCs) como protagonistas de la resistencia a fármacos del CP (Li y col., 2014).
La EMT es un proceso fisiológico por el cual las células epiteliales pierden su
fenotipo epitelial, su polaridad y la adhesión con otras células. Esto conlleva a la
adquisición de un fenotipo mesenquimal, con una alta capacidad de invasión,
migración, anti-apoptosis y desorganización de la matriz extracelular. Muchos
estudios establecen la importancia de la EMT en la progresión del cáncer de
próstata, permitiendo que las células tumorales epiteliales invadan el estroma y
se diseminen hacia órganos distantes (Grant y Kyprianou, 2013; Li y col., 2014;
Yao y col., 2011).
Se ha visto que la formación de tumores secundarios en órganos distantes

depende de la EMT. Las células metastáticas con fenotipo mesenquimal, llegan
a un foco secundario, donde se transforman, de nuevo, en células con
características epiteliales.
Es decir, la EMT es necesaria para la transformación de las células

tumorales en metastáticas y la MET para el crecimiento de esas células en un
foco secundario. Uno de los primeros pasos en la EMT es la pérdida de la
expresión y actividad de E-cadherina en las células tumorales, hecho que se
revierte tras el proceso de MET (Yao y col., 2011).
Las CSCs son una pequeña población de células neoplásicas que se

encuentran dentro del tumor, cuya característica principal es la capacidad de
generar nuevos tumores. Estas células se han encontrado en diversos tumores
sólidos, entre ellos, el CP. Se ha visto que en el desarrollo de metástasis están
implicadas CSCs de los márgenes tumorales sometidas a EMT (Li y col., 2014;
Yao y col., 2011).
- 15 -
1.1.6.3 Dependencia/Independencia Androgénica
Las células del tejido prostático normal necesitan andrógenos para su

crecimiento y supervivencia. Igualmente las células de CP son dependientes de
andrógenos. Cuando el CP se detecta de una forma temprana, se aplican
tratamientos anti-androgénicos que consiguen destruir las células tumorales,
pero en ocasiones se seleccionan poblaciones celulares que sobreviven a la
ablación de andrógenos, permitiendo la progresión hacia la independencia
androgénica, lo que traducido a la enfermedad se considera como cáncer de
próstata resitente a castración (CRPC) (Figura 4). Esta progresión provoca un
incremento de la angiogénesis y de la metástasis (Saraon y col., 2011). Si no se
evita, el CP evolucionará a un estado de independencia androgénica. Entre las
causas que pueden inducir la independencia androgénica están:
 Cambios genéticos y epigenéticos producidos en células de CP

(Schröder, 2008)
 Activación de diferentes vías de señalización independientes del

receptor de andrógenos (AR) por activación de oncogenes (por ejemplo,
Bcl2) o inhibición de genes supresores de tumores (por ejemplo, PTEN)
(Saraon y col., 2011; Schröder, 2008)
 Activación del AR independiente de ligando por factores de crecimiento

(IGF, KGF, etc) o receptores tirosina quinasa (como EGFR o HER2)
(Saraon y col., 2011; Schröder, 2008; Greg, 2013).
 Hipersensibilidad de AR por la acción de co-activadores y co-represores

(Schröder, 2008)
 Mutaciones en el AR en un 10-20% de los pacientes con CP avanzado

(Saraon y col., 2011; Schröder, 2008).
- 16 -
 La diferenciación neuroendocrina de las células de CP dependientes de

andrógenos puede inducir la independencia androgénica (Conteduca y
col., 2014). La transformación de las células epiteliales prostáticas hacia
un fenotipo neuroendocrino hace que estas se vuelvan resistentes a los
tratamientos actuales y secreten neuropéptidos y factores de crecimiento
influyendo en la proliferación y la apoptosis celular (Terry y Beltran,
2014).
Próstata normal Cáncer de próstata

PIN y AAH
Dependiente de
Andrógenos
EMT
Cáncer de próstata
Independiente de
Andrógenos
Proliferación del Invasión de órganos Migración a órganos

tumor secundario distantes distantes
MET
Figura 4. Progresión hacia la independencia androgénica del cáncer de

próstata. (EP).
- 17 -
1.2 PROCESOS TUMORALES IMPLICADOS EN LA

PROGRESIÓN DEL CÁNCER DE PRÓSTATA
1.2.1 PROLIFERACIÓN
El control de la proliferación celular es fundamental para el

mantenimiento de un organismo; cuando este control falla se puede producir
una proliferación descontrolada de las células, iniciando así un proceso
cancerígeno. El equilibrio entre la proliferación y la muerte celular es crucial en
el control de la prevención del proceso tumoral. En este sentido, la muerte
celular programada o apoptosis controla el número de células y elimina las
células dañadas (Kirby y col., 2006).
Las células tumorales adquieren la autonomía necesaria para su

proliferación en ausencia de estímulos, desregulando la maquinaria de control
del ciclo celular, al menos en uno de sus tres puntos de control: en la fase M
donde se comprueba si la alineación cromosómica es correcta, al final de G1
donde se prueba si el DNA está dañado, y al finalizar G2 donde se analiza si la
replicación ha sido adecuada y si el entorno es favorable. El control del ciclo
celular se lleva a cabo de una forma muy estricta a través de una serie de
proteínas reguladoras: las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas (CDK).
Ambos tipos de proteínas forman los diferentes complejos Ciclina-CDK según
la fase de ciclo en la que nos encontremos (Figura 5).
- 18 -
Ciclina E-CDK2
Ciclina A-CDK2
Ciclina D-CDK4 y 6
S
G1
M G2
Ciclina B-CDK1
Figura 5. Esquema representativo de las fases del ciclo celular y de sus

puntos de control. (EP).
En este complejo sistema de control participan otro tipo de moléculas que

interactúan con las diferentes proteínas implicadas en el ciclo celular. Este es el
caso del PCNA (Antígeno nuclear de proliferación celular), que es un
componente de la holoenzima DNA polimerasa δ, responsable de la replicación
del DNA en la fase S del ciclo celular (Maga y Hubscher, 2003). La mayor
expresión de PCNA se ha encontrado en la última parte de la fase G1 y en la
primera parte de la fase S. Existe, de hecho, un especial interés del papel de
PCNA en el cáncer, debido a su gran relevancia en la proliferación celular,
llegando a proponerse como diana terapéutica en esta enfermedad (Wang,
2014).
PCNA puede interactuar con otras proteínas debido a la presencia en su

extremo C-terminal de un motivo de unión de proteínas llamado PIP-Box. La
- 19 -
proteína que presenta una mayor afinidad de unión a PCNA es p21

(Cip1/WAF1), uniéndose al PIP-Box por su extremo C-terminal, impidiendo la
acción de PCNA sobre la polimerasa, y con ello la replicación (Moldovan y col.,
2007). Por otro lado, p21 es capaz de unirse por su extremo amino-terminal a
los complejos ciclina-CDKs inhibiéndolos y provocando, en consecuencia, una
parada del ciclo, en cualquiera de sus fases, según el complejo con el que
interaccione (Abbas y Dutta, 2009). La regulación de p21 puede ocurrir a través
de dos vías: dependiente o independiente de p53. En esta última vía, diversos
factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico (EGF),
derivado de plaquetas (PDGF), de fibroblastos (FGF) y de insulina (IGF), y
otras moléculas como c-Myc, son capaces de inducir la activación de p21 a
través de sus receptores tirosina quinasa (RTKs) (Pérez-Sayáns y col., 2013). La
vía dependiente se inicia cuando p53 activa la trascripción de p21. Por otro lado,
se ha visto la existencia de moléculas como c-Myc que inhibe la transcripción de
p21 al unirse a una región próxima a su promotor reprimiéndolo (van de
Wetering y col., 2002)
La proteína p53 es un factor de transcripción regulador del crecimiento y

de la apoptosis, actuando como supresor de tumores. Su activación se inicia tras
producirse un daño en el DNA, parando el ciclo celular en los puntos de control
de G1 y G2. Estructuralmente, p53 contiene 5 dominios funcionales, entre los
más importantes se encuentran, el dominio N-terminal, necesario para la
activación de los genes inducibles por p53, el dominio central de unión a
elementos de respuesta a DNA, y el dominio de interacción con otros
monómeros (Löhr y col., 2003). Diversos estudios han demostrado su
implicación en cáncer, encontrándose mutado en un 50% de las neoplasias
analizadas, incluido el CP. Las mutaciones de p53 en cáncer afectan
normalmente al dominio de unión de elementos respuesta a DNA, además, estas
mutaciones hacen que p53 active la trascripción de genes, entre los que se
encuentran, EGF, c-myc, fos y MDR-1 (Mirzayans y col., 2012). Este último se
- 20 -
sabe que codifica para una proteína que confiere resistencia selectiva a ciertos
fármacos usados para el tratamiento del cáncer (Thottassery y col., 1997).
Entre las diversas proteínas que regula p53 encontramos a STAT3

(Transductor de señal y activador de transcripción 3), que también es un factor
de transcripción que regula proliferación, supervivencia, diferenciación y
motilidad celular (Qi y Yang, 2014). STAT3 ha sido detectado, de una forma
constitutiva, en diversas neoplasias como, el cáncer de próstata, mama, ovario y
de cabeza y cuello (Lin y col., 2002). Por otro lado, se ha visto que p53 inhibe la
fosforilación de STAT3, así como, su unión al DNA en líneas celulares de cáncer
de próstata (Lin y col., 2002). Además, se ha observado, que STAT3 se sobre-
expresa y se activa por acción de agentes carcinogénicos, activando la
transcripción de genes como c-myc y el propio STAT3, e inhibiendo la de otros
como p53 al unirse a su promotor (Niu y col., 2005; Qi y Yang, 2014).
Otra función de p53 es inducir apoptosis mediante la regulación de genes

como, Bcl2 y Bax. En concreto, p53 activa la trascripción de Bax (pro-
apoptótica) y reprime la de Bcl2 (anti-apoptótica), provocando así, la activación
de la apoptosis (Basu y Haldar, 1998; Johnstone y col., 2002; Mirzayans y col.,
2012). En tumores que presentan perdida de función de p53, se ha encontrado
un incremento en el cociente Bcl2/Bax como resultado de los efectos opuestos
que ejerce p53 sobre cada uno de ellos (Mirzayans y col., 2012).
Existe una gran variedad de proteínas quinasas implicadas en diferentes

vías de señalización, y por ende, en los procesos fisiológicos y en el desarrollo de
enfermedades como el cáncer. Es el caso de una de las familias más estudiadas,
las Proteínas Kinasas C (PKC). Las PKCs participan directa o indirectamente
en procesos biológicos tan importantes como ciclo celular (actuando sobre p53 y
p21), apoptosis (a través de Bax y Bcl2), síntesis de DNA, motilidad, adhesión,
proliferación y diferenciación celular (mediante EGFR entre otros) y resistencia
a fármacos (Kang, 2014). Las PKCs se dividen en tres subfamilias: clásica (α, βI,
- 21 -
βII y γ), nuevas o no clásicas (δ, ε, η y θ) y atípicas (ζ, ι y λ). Dentro de ellas se
destaca el papel en el CP de las isoenzimas α, βI, βII, δ y ζ (Kang, 2014). Así, se
ha visto que la supresión de las isoenzimas α y β provoca un incremento en la
apoptosis y reducción de la proliferación en células de CP independiente de
andrógenos (Kang, 2014; Kuo y col., 2011); la expresión de PKC δ se asocia a un
proceso de apoptosis en células de CP (Castilla y col., 2013; Kang, 2014); y PKC
ζ, en CP independiente de andrógenos, actúa como supresor de tumores
inactivando a c-myc in vivo e in vitro, impidiendo además la transcripción de
genes implicados en proliferación y anti-apoptosis (Kim y col., 2013).
Otro tipo de quinasas implicadas en el equilibrio mitogénico son las

MAPKs (Proteínas quinasas activadas por mitógenos). Estas proteínas se
activan gracias a la unión de factores de crecimiento, citoquinas y otros
mitógenos, a sus receptores de membrana. Esta activación inicia hasta siete
cascadas de señalización diferentes según las MAPKs implicadas en ellas. La vía
de señalización ERK1/2 ha sido la más implicada en proliferación y desarrollo
de tumores; de hecho, se han encontrado diversas mutaciones en todos los
miembros de la cascada de señalización en varios tumores humanos
(Carlomagno y Chiariello, 2014). Tras la activación de la vía, la proteína
ERK1/2 se dirige al núcleo donde se acumula, y allí se encarga de fosforilar a
proteínas oncogénicas como c-Myc y STAT3 (Cargnello y Roux, 2011;
Carlomagno y Chiariello, 2014). ERK1/2 también modula proteínas implicadas
en ciclo celular, mediante la activación directa o indirecta de reguladores
positivos de dicho proceso como es la Ciclina D1 (Cargnello y Roux, 2011).
En su conjunto, todas las moléculas indicadas en este apartado

intervienen en el equilibrio proliferación/muerte celular, lo cual se muestra en la
figura 6.
- 22 -
Factores de RTKs
crecimiento
p21 ERK1/2
PCNA p21
Ciclo celular c-myc

p21 STAT3
Ciclina-CDK
p53 Proliferación
PKC
Bcl-2 Bax
Apoptosis
Figura 6. Conexiones entre las diferentes moléculas implicadas en el

balance proliferación/muerte celular. (EP).
1.2.2 ADHESIÓN
El proceso conocido como adhesión celular representa la capacidad que

tienen las células de formar uniones célula-célula o célula-matriz extracelular,
regulando así, la comunicación entre ellas. Dicho proceso está implicado en la
progresión tumoral ya que, la metastasis se inicia con la disrupción del contacto
célula-célula (Cavallaro y Christofori, 2004). Las moléculas implicadas en la
adhesión son glicoproteínas transmembrana denominadas de forma genérica
como CAM (Moléculas de adhesión celular). Existen dos tipos de CAM:
dependientes de calcio (cadherinas) e independientes de calcio (integrinas,
selectinas, sindecanos e inmunoglobulinas) (Cavallaro y Christofori, 2004;
- 23 -
Paredes y col., 2012). De todas ellas las más importantes son las cadherinas, que
se encargan de la unión célula-célula.
Las cadherinas se unen por su dominio extracelular a otras cadherinas

presentes en células adyacentes. Tienen también un dominio transmembrana y
un dominio citoplasmático que conecta con moléculas intracelulares implicadas
en el mantenimiento del citoesqueleto, la señalización celular y el transporte
intracelular (Paredes y col., 2012). El miembro principal de esta familia es la E-
cadherina o cadherina 1. Se ha visto que la pérdida de la expresión y de la
actividad de la E-cadherina en células epiteliales conduce a un estado invasivo y
metastásico. De hecho, la función de la E-cadherina está ausente en muchos
tumores epiteliales, indicando un papel supresivo en la tumorigenesis epitelial,
este hecho, se observa principalmente en casos de cáncer avanzado, por ello, se
utiliza como marcador en procesos tumorales (Berx y van Roy, 2009; Canel y
col., 2013). En este sentido, la perdida de E-cadherina no solo provoca una
menor adhesión celular, sino que, induce la transición epitelio-mesenquima
(EMT), provocando un aumento en la motilidad e invasividad celular, y
resistencia a la apoptosis (Onder y col., 2008).
La E-cadherina se une por su dominio citoplasmático a la β-catenina y a

la p120-catenina formando un complejo proteico que se une a la actina,
estabilizando el citoesqueleto. La pérdida de la E-cadherina provoca la
liberación de la β-catenina de la membrana, uniéndose en el citoplasma al factor
de transcripción Lef/TcF (Lymphoid enhancer factor/T cell Factor). Este
complejo se trasloca al núcleo, donde, la β-catenina-Lef/TcF activa la
transcripción de genes implicados en procesos de proliferación, adhesión,
invasión, apoptosis y angiogénesis como son los de ciclina D1, CD44, MMPs,
c-myc y VEGF. La localización nuclear de la β-catenina puede también ser
promovida por factores de crecimiento, como EGF, IGF y PDGF, tras la
activación de las MAPK o PKC.. Diversos estudios han demostrado la elevada
presencia nuclear de β-catenina en varios tumores avanzados, convirtiéndose en
- 24 -
un marcador pronóstico para el cáncer resistente a quimioterapia y con

capacidad de metastatizar (Thakur y Mishra, 2013).
EGF, IGF,
PDGF
E-Cadherina PKC ERK1/2

β-Catenina
E-Cadherina
E-Cadherina
β-Catenina β-Catenina
Lef/TCF
VEGF
Lef/TCF CD44
β-Catenina c-myc
ciclina D1
Figura 7. Vía de señalización de la E-cadherina/β-catenina. (EP).
1.2.3 DEGRADACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
La metástasis es un proceso complejo por el cual, las células tumorales se

diseminan desde el tumor primario colonizando órganos distantes. Este proceso
consta de varias etapas: invasión y degradación de la matriz extracelular (ECM),
intravasación en el torrente sanguíneo, extravasación en órganos distantes y
proliferación de las células tumorales en dichos órganos. Por ello, conocer los
mecanismos implicados en dichas etapas es fundamental para la comprensión del
proceso metastásico. El mecanismo que inicia el proceso metastásico requiere la
- 25 -
activación de los sistemas proteolíticos. Estos sistemas se encargan de degradar

la ECM facilitando la diseminación de las células tumorales.
Entre las moléculas más importantes que participan en este proceso

encontramos la familia de las metaloproteasas de matriz (MMP). Las MMPs
son endopeptidasas dependientes de zinc, que contienen tres dominios típicos:
péptido-señal, pro-péptido y catalítico. Existen 4 grupos de MMPs: matrilisinas,
gelatinasas, MMPs típicas y dependientes de furina. A su vez, pueden estar
ancladas a la membrana celular (MT-MMPs) o estar libres en el citoplasma
(Gong y col., 2014b). Las MMPs más estudiadas en la progresión del cáncer de
próstata son la MMP-2 y MMP-9 (Gong y col., 2014b; Hadler-Olsen y col.,
2013). Ambas son gelatinasas ya que contienen un dominio de unión a gelatina,
y se secretan como zimógenos inactivos, activándose tras la ruptura de su pro-
dominio. Su sobre-expresión y actividad están asociadas con el incremento de la
agresividad tumoral. En pacientes con CP se han asociado a un elevado grado de
Gleason y TMN. Estas gelatinasas degradan la matriz extracelular liberando
moléculas bioactivas como VEGF, TGF-β, FGF-2, EGF y otras, que
intervienen en la progresión tumoral, activando la migración celular y la
angiogénesis. La MT-MMP1, activada vía cAMP, escinde el pro-dominio de la
pro-MMP2, activándola, y a su vez la MMP2 escinde la pro-MMP9, dando
lugar a la forma activa de la MMP9 (Bauvois, 2012; Gong y col., 2014b) (Figura
8).
Las MMPs están específicamente reguladas por una familia de proteínas

pequeñas extracelulares llamadas TIMPs (Inhibidores de metaloproteasas de
tejido). Existen 4 miembros, TIMP-1, -2 -3 y -4, y cada uno de ellos inhibe
varias MMPs. La expresión de estos inhibidores se encuentra silenciada en
numerosas líneas celulares de cáncer. Los TIMPs tienen funciones
independientes de las metaloproteasas, actuando sobre la angiogénesis,
apoptosis, proliferación, migración y diferenciación celular (Sun, 2010). Otra
proteína inhibidora de metaloproteasas es RECK (proteína rica en cisteína
- 26 -
inductora de reversión), la cual se localiza en la membrana plamática. RECK

bloquea la acción de MMP2, 9 y MT-MMP1 a través de varios mecanismos,
inhibiendo su actividad proteolítica, regulando su secreción o secuestrando las
MMPs en la superficie celular (Meng y col., 2008; Xu y col., 2010).
MMP-2
pro-MMP-2
Degradación TIMPs
de la ECM
Activación de
moléculas
MT-MMP1
MMP-9
RECK
cAMP ATP
TIMPs
pro-MMP-9
proMT-MMP1
Figura 8. Activación de las metaloproteasas de matriz. (EP).
1.2.4 ANGIOGÉNESIS
El desarrollo de la red vascular en mamíferos se produce a través de tres

mecanismos principales: vasculogénesis (formación de vasos sanguíneos de
novo), angiogénesis (generación de vasos sanguíneos a partir de vasos ya
existentes) y remodelación vascular (incremento del volumen luminal de vasos
formados) (Kubota, 2012). En 1971, Folkman propuso que el crecimiento
tumoral y la metástasis eran dependientes de la angiogénesis, de tal forma que si
se bloqueaba la angiogénesis se podría frenar la progresión tumoral. En este
- 27 -
sentido se ha comprobado que la aplicación de terapia anti-angiogénica

incrementa la supervivencia de los enfermos de cáncer (Kubota, 2012). El
proceso angiogénico está sometido a un complejo sistema de control por parte
de factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos (Welti y col., 2013). (Folkman,
1971)
Uno de los factores pro-angiogénicos más importantes es el VEGF

(Factor de crecimiento del endotelio vascular). Dentro de la familia del VEGF
existen siete miembros diferentes: -A, -B, -C, -D, -E y PlGF (Factor de
crecimiento placentario) (Hoeben y col., 2004). El VEGF-A es el miembro más
estudiado de la familia y se encuentra sobre-expresado en muchos tumores. Las
células tumorales son capaces de liberar VEGF-A incrementando la
permeabilidad vascular y el transporte a través de los vasos sanguíneos, lo que
provoca la salida de proteínas plasmáticas que inducen el crecimiento, migración
e invasión de las células endoteliales (Prager y col., 2011). El VEGF responde a
diferentes estímulos como la hipoxia, a través del HIF-1α (Factor inducible por
hipoxia 1α); los factores de crecimiento como son EGF, TGF, FGF, PDGF e
IGF; y otras moléculas como p53 mutado, Src, ras, citoquinas y óxido nítrico
(Kubota, 2012; Welti y col., 2013) (Figura 9).
Actualmente se ha visto que las propias células tumorales pueden

diferenciarse en células endoteliales, y formar vasos sanguíneos útiles; a este
proceso se le denomina mimetismo vascular, y sus mecanismos, a día de hoy,
son poco conocidos (Welti y col., 2013).
- 28 -
Factores
HIF-1α de crecimiento
Src Citoquinas
NO Células
p53 tumorales
VEGF
Vasos
sanguíneos
VEGFR
Figura 9. Angiogénesis y liberación de VEGF. (EP).
1.3 FAMILIA DEL EGFR
La familia del receptor de crecimiento epidérmico (EGFR) se encarga de

controlar múltiples procesos biológicos fisiológicos y patológicos. La
importancia de esta familia se observa en los ratones knockout generados para
cada miembro de esta familia, los cuales eran no natos o morían en una etapa
temprana tras el nacimiento, al producirse defectos neuronales, cardiacos, óseos
y epiteliales en pulmón, piel, pelo y ojos (Lemmon y col., 2014).
- 29 -
1.3.1 RECEPTORES Y LIGANDOS
La familia de los EGFR está formada por cuatro miembros: EGFR1

(HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4). Son
glicoproteínas constituidas por tres partes principales: una parte extracelular
formada por 4 dominios, de unión a ligando (I y III), de dimerización (II), y de
transmisión de la señal (IV); una parte transmembrana y una parte intercelular,
con un dominio con actividad tirosina quinasa (V) y un extremo carboxi-
terminal con residuos de tirosina, exceptuando el receptor HER3 que carece de
actividad tirosina quinasa (Carrión-Salip y col., 2012; Roskoski, 2014b) (Figura
10). Los receptores de la familia EGFR se localizan generalmente en epitelio,
mesénquima y células neuronales (Roskoski, 2014b).
EGFR HER-2 I HER-3 HER-4

II
IV
V V V
V
Y Y Y
Y Y Y Y
Y Y Y Y
Y
Figura 10. Esquema de la estructura de los receptores de la familia EGFR. (EP).
Los receptores de esta familia son activados por diversos factores de

crecimiento que se unen como ligandos específicos de cada miembro de la familia
(Roskoski, 2014b). Estos ligandos se pueden dividir en 4 grupos según se
observa en la tabla 2.
- 30 -
Tabla 2. Relación entre los receptores de la familia del EGFR y sus

ligandos.
Ligandos Receptores
Grupo I EGF (Factor de crecimiento epidérmico) EGFR
EPG (Epigenina)
TGFα (Factor de crecimiento transformante α)
AFR (Anfiregulina)
Grupo II BTC (Betacelulina) EGFR, HER4
HB-EGF (EGF de unión a heparina)
EPR (Epiregulina)
Grupo III Nrg1 (Neuregulina 1) HER3, HER4
Nrg2 (Neuregulina 2)
Grupo IV Nrg3 (Neuregulina 3) HER4
Nrg4 (Neuregulina 4)
El receptor de HER2 carece de ligando conocido hasta el momento. Se ha

demostrado que MUC4, una mucina transmembrana, modula la expresión de
HER2 estabilizándolo (Kozloski y col., 2010).
Todos los ligandos de la familia del receptor de EGFR se generan como

pro-ligandos que poseen una parte extracelular, un segmento transmembrana y
otro pequeño intercelular. La parte extracelular es el ligando efectivo y se libera
por proteolisis gracias a la acción de la familia de las ADAMs (Desintegrina y
metaloproteasa). Esta familia de metaloproteasas está compuesta por 12
miembros que se encuentran ancladas a la membrana y se activan por Zinc. Las
- 31 -
ADAM10 y ADAM17 son las implicadas en el procesamiento y generación de

los ligandos de la familia del EGFR (Duffy y col., 2011; Roskoski, 2014b).
Los ligandos de los receptores EGFR suelen actuar en distancias cortas,

de forma autocrina, generalmente sobre los receptores de la misma célula desde
donde se liberaron, aunque también pueden actuar de una forma paracrina
sobre otras células adyacentes (Roskoski, 2014b).
1.3.2 ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES
La estimulación de los receptores es provocada por la unión del ligando

que induce un cambio conformacional al interactuar con los dominio I y III del
receptor, dejando expuesto el dominio II de dimerización, que se unirá con el
mismo o distintos miembros de la familia (homo u heterodimerización,
respectivamente) (Bertelsen y Stang, 2014; Lemmon y col., 2014). Los
receptores EGFR y HER4 forman fuertes homodimeros tras la unión del
ligando, sin embargo, HER2 y HER3 solo dimerizan con otros miembros de la
familia, sin llegar a formar homodímeros (Lemmon y col., 2014). HER2, a pesar
de carecer de ligandos, es el receptor prioritariamente elegido para dimerizar
con el resto de miembros de la familia, ya que su dominio de dimerización esta
constitutivamente expuesto y se piensa que no sufre proceso de internalización o
que este es seguido de un rápido proceso de reciclaje (Bertelsen y Stang, 2014;
Lemmon y col., 2014).
Tras la unión del ligando al receptor, y la dimerización posterior, los

receptores se autofosforilan en los residuos de tirosina del dominio
citoplasmático, generando sitios de unión para proteínas adaptadoras o enzimas
que se encuentran en los siguientes pasos de las cascadas de señalización. Dichas
proteínas contienen dominios de unión a Src (SH2) o de unión a fosfotirosinas
(PTB). Estas proteínas activan varias cascadas de señalización dependiendo del
- 32 -
dímero formado por los receptores al activarse, siendo los más frecuentes los
que aparecen en la tabla 3 (Arteaga, 2002; Bertelsen y Stang, 2014; Kong y col.,
2008; Way y Lin, 2005; Zaczek y col., 2005):
Tabla 3. Relación entre los dímeros de receptores de la familia del EGFR y

las vías de señalización que activan.
DÍMERO VIA DE SEÑALIZACIÓN QUE ACTIVA
EGFR/EGFR PLC, PI3K/AKT, JAK/STAT y MAPK
EGFR/HER2 PLC y MAPK
EGFR/HER3 PLC y PI3K
HER2/HER3 MAPK y PI3K/AKT
HER2/HER4 MAPK
HER4/HER4 PI3K/AKT
Esta maquinaria de señalización regula procesos implicados en la

progresión tumoral: EMT, angiogénesis, adhesión, migración, diferenciación y
proliferación celular (Figura 11) (Roskoski, 2014b).
- 33 -
EGFR-EGFR
EGFR I I
II II
EGF
EGF
IV IV
V V
V
Y
Y
Y
p-Y Y -p
p-Y Y -p
p-Y Y -p
PI3K-AKT MAPK PLCγ JAK-STAT
Angiogénesis, adhesión, migración, diferenciación

y proliferación celular
Figura 11. Activación de los receptores de la familia EGFR. (EP).
1.3.3 TRANSACTIVACIÓN DE LA FAMILIA DE LOS EGFRS

MEDIADA POR GPCR
En 1996, un estudio llevado a cabo por Daub y colaboradores, demostró

que distintos agonistas de GPCRs eran capaces de fosforilar a los receptores
EGFR y HER2, activándolos. Actualmente, se conocen multitud de GPCRs
capaces de transactivar a los receptores de la familia EGFR.
La transactivación llevada a cabo por los GPCRs (Figura 12) depende de

varios factores, entre ellos, la clase de GPCR, el tipo celular y el ambiente
- 34 -
extracelular. Existen dos tipos de mecanismos, dependiente e independiente

de ligando. La transactivación dependiente de ligando o Triple-membrane
passing signal mechanism (TMPS), implica tres pasos. Primero, se produce la
activación de las metaloproteasas, MMPs o ADAMs, por parte de segundos
mensajeros, como Src, que activan los GPCRs. En segundo lugar, las
metaloproteasas provocan la liberación de los ligandos anclados a la membrana,
y por último, estos ligandos se dirigirán a los receptores uniéndose a ellos y
activándolos (George y col., 2013; Sur y Agrawal, 2014). La transactivación de
los EGFR mediada por las ADAM10 y 17 está directamente implicada en el
desarrollo, crecimiento y progresión de distintos cánceres (Duffy y col., 2011;
George y col., 2013).
El segundo mecanismo de transactivación se lleva a cabo en el interior

celular sin necesidad de ligando. El GPCR activa moléculas efectoras como Src,
Ca2+, PKC, PyK2 (Proteina tirosina quinasa 2), arrestinas y especies reactivas
de oxígeno, que desencadenan la fosforilación de los residuos de tirosina del
dominio citoplasmático del receptor activando las cascadas de señalización
consecuentes (George y col., 2013; Sur y Agrawal, 2014).
En nuestro grupo de investigación, se ha demostrado como el péptido

intestinal vasoactivo (VIP), a través de sus receptores de membrana, provoca la
transactivación de EGFR y HER2, en líneas celulares de cáncer de próstata y de
mama (Sotomayor y col., 2007; Valdehita y col., 2009). VIP pertenece a una
superfamilia que incluye al glucagón, secretina y otros péptidos similares, y
cuyos receptores son GPCR. El tratamiento con VIP en líneas celulares de CP
provoca la transactivación independiente de ligando de EGFR y HER2 a
tiempos cortos, así como, dependiente de ligando a tiempos más largos de
tratamiento (Sotomayor y col., 2007).
- 35 -
Ligandos
ADAM
GPCR
EGFR EGFR
α βγ
Src
p-Y Y -p
p-Y Y -p
Ca2+ Pro-ligandos
p-Y Y -p p-Y Y -p
PKC p-Y
p-Y Y -p Y -p
PyK2
Arrestinas
ROS Transactivación dependiente de ligando
Transactivación independiente de ligando
Figura 12. Transactivación de los receptores EGFR por GPCR. (EP).
1.3.4 FAMILIA EGFR Y CÁNCER
La desregulación de los miembros de la familia EGFR está implicada en

varias patologías: cáncer, diabetes, autoinmunidad, inflamación, enfermedades
cardiovasculares y nerviosas. En cáncer contribuyen de manera relevante a la
proliferación, migración, transformación, angiogénesis e invasión de las células
tumorales (Androutsopoulos y col., 2013). Varios estudios remarcan la
importancia de los receptores de EGF en cáncer, en concreto de EGFR y HER2.
La sobre-expresión de estos receptores ha sido implicada en la adquisición de la
independencia andrógenica en el CP, correlacionándose con un peor prosnóstico
de la enfermedad. Se estima que entre un 40-80% de los tumores prostáticos
sobre-expresan EGFR. La señalización por EGFR se encuentra hiperactivada
por una sobreproducción de ligandos y/o receptores, por activación constitutiva
de los receptores, o debido a la transactivación producida por IGF-1R, GPCRs y
receptores de citoquinas (Huang y Chang, 2010).
- 36 -
La gran importancia de la famila EGFR en cáncer ha llevado a la

generación de tratamientos específicos. Muchos de ellos han sido aprobados
para su utilización en pacientes, y se pueden dividir en dos grupos principales:
Inhibidores de la actividad tirosina quinasa de los receptores, y anticuerpos
monoclonales dirigidos frente a dichos receptores (Tabla 4) (Roskoski, 2014a;
Roskoski, 2014b):
Tabla 4. Tratamientos aprobados para pacientes con cáncer contra los

receptores de la familia del EGF.
Tipo de Nombre Diana Año de

tratamiento aprobación
Pequeños Afatinib/Gilotrif® EGFR 2013
inhibidores Erlotinib/Tarceva® EGFR 2004
Gefitinib/Iressa® EGFR 2003
Lapatinib/Tykerb® EGFR y HER2 2007
Anticuerpos Ado-trastuzumab HER2 2013
monoclonales emtansine/Kadcyla®
Cetuximab/Erbitux® EGFR 2004
Panitumumab/Vecibix® EGFR 2006
Pertuzumab/Omnitarg® HER2 2012
Trastuzumab/Herceptin® HER2 1998
1.4 HORMONA LIBERADORA DE LA HORMONA DEL

CRECIMIENTO (GHRH)
A finales de los años 60 y principios de los 70, los Doctores Andrew

Schally y Roger Guillemin, aislaron, caracterizaron y secuenciaron las
hormonas reguladoras hipotalámicas. La primera hormona reguladora
- 37 -
hipotalámica en ser secuenciada fue la TRH (Hormona liberadora de

tirotropina), la segunda fue la GnRH (Hormona liberadora de gonadotropina), y
la tercera la somatostatina. La existencia de GHRH se comenzó a sugerir a
principios de 1961 por Reichlin. Este investigador realizó lesiones en el
hipotálamo de ratas, provocando la disminución de hormona del crecimiento
(GH) en la hipófisis, lo que indicaba la existencia de una sustancia del
hipotálamo que provocaba la liberación de la GH en la hipófisis (Frohman y
Szabo, 1981).; Reichlin, 1961)
En 1981, se demostró la presencia ectópica de la neurohormona GHRH

en tumores pancreáticos (Frohman y Szabo, 1981). Un año más tarde, dos
grupos independientes identificaron GHRH en hipotálamo animal y humano
(Guillemin y col., 1982; Rivier y col., 1982). El grupo de Rivier encontró un
único péptido formado por 40 aminoácidos, mientras que, el grupo de Guillemin
aisló tres péptidos de 37, 40 y 44 aminoácidos, en una proporción de 22%, 12% y
64%, respectivamente. Al comparar dichos péptidos, se observó que los 40
aminoácidos descubiertos por el grupo de Rivier coincidían con los primeros del
péptido de 44 aminoácidos del grupo de Guillemin (Guillemin y col., 1982;
Rivier y col., 1982). Posteriormente, se caracterizó completamente GHRH, su
forma madura está constituida por 44 aminoácidos que aparecen representados
en la figura 13. Sin embargo, la acción biológica de GHRH reside en los 29
últimos aminoácidos. Se ha comprobado que la presencia de la tirosina en
posición uno es clave para la unión de la hormona a su receptor (Frohman y col.,
1989)
HO - Tyr - Ala - Asp - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys -
Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gln - Asp -
Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu - Ser - Asn - Gln - Glu - Arg -
Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2
- 38 -
Figura 13. Secuencia de la hormona liberadora de la hormona del

crecimiento, GHRH. Se marcan subrayados los 29 aminoácidos que
confieren la acción biológica a GHRH.
En 1984, se caracterizó la estructura de GHRH en las hipófisis de

diferentes mamíferos: cerdo, cabra, oveja, vaca y rata. Al comparar dichas
estructuras con la obtenida en hipófisis humana, se observa que todas presentan
44 aminoácidos excepto la GHRH de rata que presenta 43 aminoácidos (Figura
14). Se observa, además, como la GHRH de cerdo es la que presenta mayor
homología con la humana difiriendo tan solo en 3 aminoácidos, mientras que, la
GHRH de rata es la que presenta una menor homología, diferenciándose en 14
aminoacidos de la GHRH humana (Ling y col., 1984).
hGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M S R Q Q G E S N Q E R G A R A R L - NH2
pGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M S R Q Q G E R N Q E Q G A R V R L - NH2
c, bGHRH Y A D A I F T N S Y R K V L G Q L S A R K L L Q D I M N R Q Q G E R N Q E Q G A K V R L - NH2
oGHRH Y A D A I F T N S Y R K I L G Q L S A R K L L Q D I M N R Q Q G E R N Q E Q G A K V R L - NH2
rGHRH H A DA I F T S S Y R R I LG Q LYA R K L L H E I M N RQ Q G E R N Q E Q R S R F N - NH2
Figura 14. Comparativa de la estructura de la GHRH humana (h), porcina

(p), caprina (c), bovina (b), ovina (o) y murina (r).
El gen de la GHRH se encuentra localizado en el cromosoma 20

(20q11.2) del genoma humano (Pezzolo y col., 1994), con un tamaño de 10 kb.
Está formado por 5 exones con 750 pares de bases, de los cuales el exón 3 y
parte del exón 4 codifican para el péptido completo, sin embargo, solo el exón 3
codifica para la parte biológicamente activa del péptido (Frohman y col., 1989).
GHRH se sintetiza inicialmente como un precursor inactivo de 104

aminoácidos que sufre un procesamiento post-transcripcional. Este precursor es
- 39 -
escindido en tres etapas por la furina y la proproteína convertasa 1 (PC1),

obteniendo finalmente la GRHR activa y el GHRH-RP (Péptido relacionado con
GHRH) tal como se muestra en la figura 15 (Posner y col., 2004).
Gen GHRH
5’ GHRH GHRH-RP 3’ cDNA GHRH
proGHRH
proGHRH
1 19 30 73 104
Furina
preproGHRH
20 30 73 104
PC1
preGHRH
31 73 104
GHRH GHRH-RP
31 73 74 104
Figura 15. Procesamiento pre y post-transcripcional de la hormona

liberadora de la hormona del crecimiento, GHRH. (EP).
- 40 -
GHRH pertenece a una familia de péptidos que tienen cierta homología

estructural y biológica, entre los que se encuentran: el péptido intestinal
vasoactivo (VIP), el péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria
(PACAP), la secretina, el glucagón y el neuropéptido Y. Además, esta familia de
péptidos comparte homología entre sus receptores, lo que conlleva una actividad
cruzada, pudiendo unirse entre ellos (Csernus y col., 1999b).
Aunque GHRH fue aislada inicialmente en tumores pancreáticos,

posteriormente se localizó en la hipófisis humana y animal. Actualmente se sabe
que GHRH se localiza ectópicamente en ciertos tejidos sanos: linfocitos, útero,
ovario, testículos, placenta, corteza cerebral, hipófisis, riñón, próstata, hígado y
pulmón (Barabutis y Schally, 2010). Además, GHRH se ha localizado en
diversos tipos de tumores y líneas celulares tumorales: ovario, endometrio,
mama, próstata, estómago, pancreas, pulmón, hueso, colón y glia (Busto y col.,
2002; Fainstein Day y col., 2007; Garcia-Fernandez y col., 2003; Halmos y col.,
2002; Khorram y col., 2001; Kiaris y col., 1999).
1.4.1 ACCIONES BIOLÓGICAS DE GHRH
Desde su descubrimiento a principios de los 80, se han investigado las

posibles acciones biológicas de GHRH en el organismo, debido a su presencia en
diferentes tejidos. La función principal de GHRH se localiza en la hipófisis.
GHRH es liberada desde el hipotálamo y se dirige hacia el lóbulo anterior de la
hipófisis estimulando la secreción de la hormona del crecimiento (GH)(Kiaris y
col., 2011b). Esta hormona se dirige directamente a órganos diana o al hígado
estimulando la secreción de IGF, el cual vuelve al hipotálamo regulando
negativamente la liberación de GHRH. Se conocen otras acciones biológicas de
GHRH, que se detallan a continuación para diferentes órganos o sistemas:
- 41 -
Efectos en tejido sano
Sistema Nervioso Central
• Ayuda a la consolidación de la memoria (Hallschmid y col., 2011)

• Mejora el deterioro cognitivo en adultos (Baker y col., 2012)
• Incrementa los niveles de GABA (Ácido gamma-aminobutírico)
(Friedman y col., 2013)
• Estimula las neuronas reguladoras del sueño en el hipotálamo (Peterfi y
col., 2010)
• Provoca la producción y liberación de GH en la hipófisis (Kiaris y col.,
2011b)
• Activa la cascada de señalización de las MAPKs en la hipófisis (Pombo y
col., 2000)
Glándula suprarrenal
• Facilita la liberación del cortisol tras una situación de hipoglucemia
(Perras y col., 2002)
Sistema cardiovascular
• Promueve la supervivencia de los cardiomiocitos (Granata y col., 2009)
• Tiene un papel protector y regenerativo tras un infarto de miocardio
(Barabutis y Schally, 2010)
Epitelios
• Mejora el cierre de heridas provocadas por traumas o cirugía (Dioufa y
col., 2010; Kiaris y col., 2011a)
- 42 -
Páncreas
• Estimula la proliferación y supervivencia de islotes pancreáticos
(Barabutis y Schally, 2010; Ludwig y col., 2010)
Sistema inmune
• Regula la diferenciación del sistema inmune y la producción de citoquinas
(Kiaris y col., 2011b)
• Estimula la secreción de IL-17 en células mononucleares de sangre
periféricas (PBMC) (Stepien y col., 2010)
Sistema reproductor
• Regula la diferenciación celular, apoptosis y maduración de células
germinales (Moretti y col., 2002)
• Promueve la maduración folicular (Moretti y col., 1990)
• Regula la espermatogénesis actuando sobre las células de Leydig
(Ciampani y col., 1992)
Tejido adiposo
• Reduce el tejido adiposo visceral (Makimura y col., 2012)
Fibroblastos
• Induce la proliferación y migración de fibroblastos (Kiaris y col., 2001)

• Incrementa la expresión de la proteína α-SMA en fibroblastos,
induciendo la diferenciación en miofibroblastos (Kiaris y col., 2011a)
Efectos en tejido tumoral
Generales
• Promueve la actividad de la telomerasa en células tumorales (Kiaris y

Schally, 1999)
- 43 -
Próstata
• Puede inducir la proliferación de células de cáncer de próstata

dependientes e independientes de andrógenos, al activar la vía
GHRH/GH/IGF (Chopin y Herington, 2001)
Mama
• Estimula la proliferación de las células de cáncer de mama activando la

vía Ras/Raf/MAPK (Siriwardana y col., 2006)
Pulmón
• Estimula la proliferación de células tumorales y la producción de IGF-I y

–II (Kiaris y col., 1999)
• Incrementa la expresión de la óxido nítrico sintasa (Barabutis y col.,
2011)
Cérvix
• Activa las proteínas JAK y STAT3 (Siejka y col., 2010a)

Ovario y endometrio
• Puede inducir la proliferación de células de cáncer de ovario y

endometrio, al activar la vía GHRH/GH/IGF (Kahán y col., 1999)
Neuroendocrino
• Estimula la proliferación tumoral, así como, la liberación de VEGF y

cromogranina A (Stepień y col., 2009)
Linfomas
• Puede inducir la malignidad en linfomas, al activar la vía

GHRH/GH/IGF (Heath., 2005)
- 44 -
1.4.2 RECEPTORES DE GHRH
El receptor de GHRH (GHRH-R) es un receptor acoplado a proteína G

(GPCR) de tipo II o B (Mayo, 1992). Esta familia de receptores, a la que
pertenecen otros como los receptores de VIP y PACAP, presenta una estructura
con varios intrones que les permiten la formación de numerosas variantes de
splicing alternativo. El gen de GHRH-R está localizado en el cromosoma 7p14-
15 y se encuentra codificado por 1269 pb, contiene 13 exones separados por
intrones de diferentes tamaños, que alargan su longitud hasta 15 kb (Gaylinn,
2002; Gaylinn y col., 1994). En el promotor del gen se han encontrado multitud
de sitios de unión para factores de transcripción como Pit-1, Oct-1, Brn-2, NF-
1, cAMP (CRE) y receptor de estrógenos (ERE) (Petersenn y col., 1998). El
GHRH-R que inicialmente se localizó en la hipófisis (p-GHRH-R) posee un
dominio extracelular con el extremo amino, como primera parte de la molécula,
7 dominios transmembrana, 3 bucles extracelulares y 3 intracelulares, y un
dominio intracelular que acaba en el extremo carboxi-terminal (Figura 16).
- 45 -
1
-NH2
-COOH
423
Figura 16. Estructura del receptor de GHRH presente en hipófisis. Las

flechas separan las partes codificadas por cada uno de los trece exones.
(EP).
En 1995, Tang y colaboradores identificaron la presencia de 3 variantes

de GHRH-R humano en muestras de tejido normal y tejido tumoral de hipófisis
y ovario. La primera variante tenía una secuencia idéntica al conocido p-
GHRH-R, pero la segunda y tercera eran formas truncadas de la primera. En el
año 2000, se aislaron y secuenciaron las diferentes variantes del GHRH-R
(Rekasi y col., 2000). Se identificaron 4 variantes de splicing del receptor: SV1,
SV2, SV3 y SV4. La variante SV1, presenta una homología de un 99% con
respecto al fragmento codificado del exón 3 al 13 p-GHRH-R, sin embargo, los
primeros 334 nucleótidos son completamente diferentes. Esta diferencia se
produce debido a la inserción del intrón 1 junto con la desaparición de los tres
primeros exones por una modificación del sitio de splicing. La proteína formada
es completamente funcional ya que contiene la parte distal del primer dominio
- 46 -
extracelular, los dominios transmembrana, los bucles extra- e intracelulares y el

extremo carboxi-terminal del p-GHRH-R. La variante SV2 tiene menor
homología que SV1, ya que además de perder los exones del 1 al 3, pierde el
exón 7. Esta variante da lugar a una proteína funcional pero que solo contiene
los dos primeros dominios transmembrana, el primer bucle intracelular y la
mayoría de los bucles extracelulares. La variante SV3, además de perder los
mismos exones que SV2, tiene incompleta la secuencia intrónica inicial. La
variante SV4 pierde los exones 5 y 6, adicionalmente. El receptor que da lugar a
partir de estas dos últimas variantes no es maduro, ya que pierde los dominios
transmembrana, los bucles y el extremo carboxi-terminal. La secuencia
intrónica inicial, que presentan todas la variantes, codifica para el extremo N-
terminal de la proteína, de lo cual carece la SV3 al tenerlo incompleto (Halmos y
col., 2002). El proceso de splicing de las diferentes variantes esta esquematizado
en la figura 17.
- 47 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gen
GHRH-R
5’ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3’ cDNA
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 p-GHRH-R
5’ Intron 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3’ cDNA
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 SV1
5’ Intron 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 3’ cDNA
TM1 TM2
SV2
5’ Intron 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 3’ cDNA
SV3
5’ Intron 3 4 8 9 10 11 12 13 3’ cDNA
SV4
Figura 17. Esquema del gen de GHRH-R y de los cDNAs de p-GHRH-R y

SVs. Se indican las regiones correspondientes a los exones con números, los
dominios transmembrana (TM) y las zonas de splicing. (EP).
Los receptores de GHRH se han localizado en varios tumores humanos:

mama (50%), ovario (80%), próstata (75%), adenoma hipofisario (75%),
glioblastoma (100%) y meniangioma (100%) (Schulz y Röcken, 2006). Los
receptores de GHRH (p-GHRH-R y SVs) están presentes en tejido normal y
tumoral. El p-GHRH-R está altamente expresado en hipófisis, y además, se
encuentra más expresado en tejidos tumorales, si lo comparamos con sus
correspondientes tejidos normales en riñón, pulmón, hígado y próstata. Por otro
lado, los receptores SVs se encuentran más expresados en tejidos tumorales que
en tejidos sanos, siendo la variante SV1 la mayoritaria (Havt y col., 2005).
- 48 -
Estudios realizados en cáncer de próstata humano indican que el receptor de

hipófisis se encuentra sobre-expresado en el 86% de los cánceres de próstata que
expresan GHRH-R, así mismo, las variantes se sobre-expresan en un 65% para
SV1, en un 60% para SV2 y en un 15% para SV4 (Halmos y col., 2002).
1.4.3 SEÑALIZACIÓN DE GHRH
La señalización producida por GHRH no ha sido completamente

discernida, aunque si se conocen los efectos que produce. GHRH hipotalámica es
liberada de las células neurosecretoras del núcleo arqueado presente en el
hipotálamo, dirigiéndose al lóbulo anterior de la hipófisis donde se une a sus
receptores por el dominio extracelular. Esta unión produce un cambio
conformacional en el receptor, lo que provoca que el receptor interactúe con la
proteína G heterotrimérica (α, β y γ), promoviendo el intercambio de guanil
nucleótidos y provocando la disociación de la subunidad α y el dímero βγ
(Martin y col., 2005). Existen 16 tipos de Gα acoplados a diferentes efectores
(Dorsam y Gutkind, 2007). En este sentido GHRH es capaz de activar dos de
ellas, la proteína Gαs y Gαq.
La estimulación del receptor de GHRH por su ligando puede activar la

subunidad α de la proteína Gs heterotrimérica, la cual activa la enzima adenilato
ciclasa que transforma el ATP en cAMP. Esto provoca la acumulación de cAMP
que se une a las subunidades reguladoras de la Proteína Kinasa dependiente de
cAMP (PKA), permitiendo la disociación de las subunidades catalíticas. Estas
subunidades fosforilan proteínas de membrana e intracelulares provocando la
activación de canales iónicos, despolarización de la membrana y una entrada de
Ca2+ que induce la liberación de la hormona del crecimiento (GH) de las células
somatotropas (Mayo y col., 2000; Zeitler y Siriwardana, 2000). GH se dirige a
sus sitios diana: músculo, hueso, tejido nervioso, adiposo y sistema inmune,
estimulando el metabolismo, proliferación y diferenciación celular. Así mismo,
- 49 -
se dirige al hígado donde induce la producción de factor de crecimiento

semejante a la insulina tipo I (IGF-I) hepático, que a su vez, puede actuar sobre
el crecimiento de células normales y tumorales (Kiaris y col., 2011b) (Figura 18).
Hipotálamo
GHRH
Hipófisis
GH
Hígado
GH
Sistema inmune
IGF-I
Hueso Músculo
Sistema nervioso
Células tumorales
Figura 18. Principales tejidos regulados directa o indirectamente por

GHRH. (EP).
Las subunidades catalíticas de PKA son capaces de fosforilar a diversas

proteínas, entre las que encontramos a CREB, la proteína de unión al elemento
regulador de cAMP. CREB se transloca al núcleo y se une al coactivador
p300/CBP, juntos inducen la transcripción de genes con el elemento respuesta
- 50 -
CRE en su promotor como es el caso de jun, fos, pit-1 y ghrhr (Frohman y

Kineman, 2002). La proteína que se genera tras la traducción de pit-1 se unirá al
promotor del gen de GHRH provocando su transcripción y posterior
traducción. De esta manera, GHRH es capaz de incrementar su propia expresión
y la de su receptor, tanto en células normales como tumorales. La GHRH
sintetizada de novo es liberada ejerciendo sus efectos mediante mecanismos
autocrinos y paracrinos. Por otro lado, la estimulación de PKA por cAMP puede
activar la cascada de las MAPKs, a través de la proteína Ras que, a su vez,
activa a Raf /MEK/ERK (Kiaris y col., 2011b; Pombo y col., 2000; Siriwardana
y col., 2006). La señalización mediada por la proteína Gαs está esquematizada en
la figura 19.
GHRH-R
GTP AC
α βγ αs
GTP ATP
GDP cAMP
Pit-1
Pit-1
Ras PKA
CREB
Raf p- CREB
Pit-1
MEK Jun
Fos
p300 Pit-1
p-
ERK CBP CREB Ghrhr
Ghrh
Pit-1
Figura 19. Señalización de GHRH a través de proteína Gαs. (EP).
- 51 -
GHRH, a través de su receptor, puede activar también a la proteína Gq,

que libera la subunidad subunidad αq capaz de activar la fosfolipasa C (PLC)
(Frohman y Kineman, 2002; Kiaris y col., 2011b). Esta enzima cataliza la
hidrólisis del fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) en diacilgliceril (DAG) e inositol
trifosfato (IP3). Por un lado, el DAG se queda unido a la membrana activando a
las PKCs, que a su vez, pueden activar a ERK a través de Raf (Zeitler y
Siriwardana, 2000). Por otro lado, el IP3 se dirige al retículo endoplasmático
uniéndose a su receptor y activando los canales de calcio, provocando un
incremento de la concentración citosólica del mismo, que activa a proteínas
dependientes de calcio como Ras (Siriwardana y col., 2006) (Figura 20).
El dimero βγ, independientemente del tipo de subunidad α a la que

acompañe, es liberado tras la estimulación de GHRH-R por su ligando, es capaz
de activar a PLC y regular la actividad de canales iónicos (Pombo y col., 2000).
Mediante la PLC se produce a su vez, la activación de PKC y con ello se
estimula la cascada de señalización de MAPK (Figura 20).
GHRH-R
α β γ αq PIP2 DAG PKC

PLC-β/ε
β γ
Ca2+
IP3 Ras Raf
Ca2+
Ca2+ Ca
2+
MEK
IP3
ERK
Retículo Endoplasmático
Figura 20. Señalización de GHRH a través de la subunidad Gαq y del dímero
βγ. (EP).
- 52 -
Un hecho destacable, es que, se ha comprobado que en ausencia del

ligando GHRH, el receptor SV1 es capaz de activar señales mitogénicas en
células de cáncer de endometrio, teniendo dicho receptor una activación
dependiente e independiente de ligando (Kiaris y col., 2003); este hecho cobra
una mayor importancia en células tumorales ya que son las que sobre-expresan
el receptor SV1.
1.4.4 ANTAGONISTAS DE GHRH
En 1985, el Dr. P. Robberecht sintetizó el primer antagonista de la

GHRH, reemplazando en su estructura el aminoácido Ala de la posición 2, por la
D-Arg, de esta forma conseguía bloquear la liberación de GH en ratas
(Robberecht y col., 1985). Sin embargo, este antagonista no lograba bloquear
por completo la actividad del receptor. Dese 1994, el grupo del Dr. A.V. Schally
ha sintetizado antagonistas y agonistas de GHRH. Los primeros compuestos
antagonistas, MZ-4-71 y MZ-5-156, eran entre 7 y 19 veces más potentes que el
antagonista de Robberecht (Zarandi y col., 1994). Posteriormente, se han
desarrollado varios antagonistas entre los que encontramos el JV-1-38 (Varga y
col., 1999), el JMR-132 (Buchholz y col., 2007), y la nueva serie de antagonistas
MIA-602, -606 y -690 (Fahrenholtz y col., 2014). Para la síntesis de estos
compuestos se han ido realizando diferentes sustituciones en los aminoácidos de
la estructura de GHRH, que mejoraban distintos aspectos de los antagonistas
(Schally, 2008; Zarandi y col., 1994):
La sustitución de Ala por D-Arg en posición 2, que poseen todos los

antagonistas, les otorga la capacidad antagónica.
Las sustituciones realizadas al introducir la D-Arg, Har o Agm en los

aminoácidos 28 y 29, proporcionan la estabilidad metabólica de los
compuestos.
- 53 -
El intercambio de Gly por Abu, en posición 15, estabiliza la estructura

central (hélice alfa) del antagonista.
La sustitución del aminoácido Met por Nle en posición 27, ayuda a evitar
la inactivación oxidativa del antagonista.
El resto de intercambios mejoran la afinidad por los receptores de

GHRH, la capacidad de inhibir la liberación de GH y la duración de este
efecto in vitro e in vivo.
En la tabla 5 vienen representadas las sustituciones producidas en los

antagonistas del Dr. Schally en comparación con el antagonista de Robberech y
la estructura del péptido GHRH.
- 54 -
Tabla 5. Estructuras comparativas del fragmento funcional de GHRH (1-29)-NH2 y distintos
antagonistas. Los aminoácidos que no varían entre las diferentes estructuras se representan con puntos. Los
sustituyentes son abreviados como: Abu, α-aminobutirico; Ac, acetil; Ada, acido 12-aminododecanoico; Agm,
4-aminobutil-guanidina; Cpa, paracloro-fenilalanina; Fpa5, pentafluoruro-fenilalanina; Har, homoarginina;
Universidad de Alcalá
Ibu, isobutiril; Me-Ala, N-metil-alanina; Nle, norleucina; Orn, ornitina; PhAc, fenilacetil; Tyr(Me), O-
metiltirosina.
hGHRH
(1-29)NH2 H Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg NH2
- 55 -
Antagonista
Ac ● D-Arg ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● NH2
de Robberecht
MZ-4-71 Ibu ● D-Arg ● ● ● Phe(4-Cl) ● ● ● ● ● ● ● ● Abu ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Nle ● Agm
Phe(4-Cl)
MZ-5-156 PhAc ● D-Arg ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Abu ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Nle ● Agm
Phe(4-Cl)
JV-1-38 PhAc ● D-Arg ● ● ● ● ● Har Tyr (Me) ● ● ● ● Abu ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Nle D-Arg Har NH2
Phe(4-Cl)
JMR-132 PhAc ● D-Arg ● ● ● ● Ala Har Tyr (Me) His ● ● ● Abu ● ● ● ● His ● ● ● ● ● ● Nle D-Arg Har NH2
MIA-602 PhAc-Ada ● D-Arg ● ● ● Fpa5 ● Ala Har Tyr (Me) His Orn ● ● Abu ● ● ● ● His Orn ● ● ● ● ● Nle D-Arg Har NH2
MIA-606 PhAc-Ada ● D-Arg ● ● ● Fpa5 ● Me-Ala Har Tyr (Me) His Orn ● ● Abu ● ● ● ● His Orn ● ● ● ● ● Nle D-Arg Agm
MIA-690 PhAc-Ada ● D-Arg ● ● ● Cpa ● Ala Har Fpa5 His Orn ● ● Abu ● ● ● ● His Orn ● ● ● ● ● Nle D-Arg Har NH2
Introducción
La eficacia antitumoral de los antagonistas ha sido probada mediante

estudios in vitro e in vivo, en los que se ha demostrado una significativa
supresión del crecimiento de varios cánceres experimentales: próstata
(Fahrenholtz y col., 2014), mama (Buchholz y col., 2007), ovario (Schally y
Varga, 2006), páncreas (Szepeshazi y col., 2000b), endometrio (Engel y col.,
2005) carcinomas de células renales (Schally y Varga, 2006), colorectal
(Szepeshazi y col., 2000a), de células pequeñas y no pequeñas de pulmón (Kiaris
y col., 1999), sarcomas de hueso (Braczkowski y col., 2002), glioblastomas
malignos (Kiaris y Schally, 1999) y linfoma no Hodgkin (Heath, 2005).
Actualmente, la nueva serie MIA muestra unos efectos mucho más potentes, in
cluso uno de los antagonistas, en concreto MIA-602, se encuentra en la fase
inicial de un ensayo clínico para cáncer de próstata, de mama y de ovario. Los
antagonistas de GHRH inhiben la secreción de GH y bloquean la unión de
GHRH a sus receptores en células tumorales, de esta forma consiguen suprimir
la producción hepática de IGF-I y la propia formación de GHRH y sus
receptores por parte de la célula tumoral. Se ha visto que el bloqueo producido
por los antagonistas provoca consecuencias a diferentes niveles en la
señalización celular de las células tumorales:
• Apoptosis: incrementan la expresión de factores pro-apoptóticos como

Bax, caspasas -3,-8,-9, PARP y FAS, y disminuyen la expresión de la
proteína anti-apoptótica, Bcl2 (Hohla y col., 2009).
• Ciclo celular: incrementan los niveles de p21 y p53 (Hohla y col., 2009;
Stangelberger y col., 2012).
• Proliferación: disminuyen la expresión de PCNA y Ki67 (Siejka y col.,

2010b).
• Invasión y adhesión: reducen los niveles de las formas activas de MMP-

2 y -9, e incrementan los de la caveolina-1 (Bellyei y col., 2010).
- 56 -
• Factores de transcripción: disminuyen la expresión de NFκB y

pSTAT3 (Bellyei y col., 2010).
• Quinasas: reducen la expresión de ERK1/2, Akt, JAK, FAK y regulan las

distintas isoformas de PKC (Kanashiro y col., 2004; Siejka y col., 2010b).
• Factores de crecimiento: disminuyen los niveles de IGF-I y II, GH,

VEGF y bFGF (Schally, 2008; Stangelberger y col., 2005a).
• Receptores de factores de crecimiento: disminuyen la expresión de

EGFR, HER-2, HER-3, VEGF-R1 y VEGF-R2 (Guo y col., 2010).
• Proto-oncogenes: reducen los niveles de K-Ras, c-fos y c-jun (Kanashiro

y col., 2004).
• Enzimas: disminuyen la expresión de iNOS, COX-2 y COX-1v

(Barabutis y col., 2011).
• Citoquinas: reducen los niveles de interferón-γ (IFN-γ) (Siejka y col.,

2004).
Actualmente, se estudian diferentes usos terapéuticos de los antagonistas

de GHRH en enfermedades no tumorales. Los antagonistas de GHRH son
capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, y reducir la agregación de β-
amiloide y filamentos T en la enfermedad de Alzheimer, restaurando el
metabolismo neuronal normal (Jaszberenyi y col., 2012). Además, se ha
comprobado que en la acromegalia, el tratamiento con los antagonistas reduce la
secreción de GH e IGF-I (Kovacs y col., 1997).
El grupo del Dr. Schally ha generado también varios agonistas de
GHRH, a los cuales se les ha atribuido diversos usos terapéuticos, como,
mejorar la supervivencia y proliferación de islotes pancreáticos en ratones
diabéticos (Ludwig y col., 2010) e inducir la supervivencia de los cardiomiocitos
(Granata y col., 2009).
- 57 -
2. OBJETIVOS
Objetivos Universidad de Alcalá
En la introducción de este trabajo se han mencionado aspectos clave para

el desarrollo y progresión tumoral del cáncer de próstata, por tanto, profundizar
en los mecanismos de señalización implicados es una pieza clave en la búsqueda
de nuevas dianas terapéuticas. En este sentido, se ha visto que el péptido GHRH
y sus receptores pueden estar implicados en la progresión tumoral, así como los
beneficios que muestran el tratamiento con antagonistas de GHRH sobre
tumores experimentales. En base a los antecedentes señalados nos proponemos
ahondar en los mecanismos de señalización a través de los cuales, GHRH está
implicado en los diferentes procesos de la progresión del CP. Consideramos que
estas aproximaciones experimentales pueden contribuir a optimizar estrategias
terapéuticas dirigidas a combatir el avance de la enfermedad.
Los objetivos de la presente Tesis Doctoral se resumen en los siguientes

apartados:
1. Determinar y comparar la presencia de GHRH y sus receptores, así

como la localización de estos en tres líneas celulares de próstata
representativas de un estado no tumoral, RWPE-1, y de un estado
tumoral andrógeno dependiente, LNCaP, e independiente, PC3.
2. Estudiar, en líneas celulares, el efecto de GHRH y de sus

antagonistas en procesos implicados en la progresión del cáncer de
próstata:
2.1. Actividad metabólica

2.2. Proliferación celular
2.3. Ciclo celular y apoptosis
2.4. Adhesión celular
2.5. Migración celular
2.6. Expresión y actividad de las principales MMPs
2.7. Angiogénesis
- 61 -
Objetivos Universidad de Alcalá
2.8. Neurodiferenciación
3. Determinar la implicación de GHRH y sus antagonistas sobre la

señalización de los receptores de la familia de los HER, en la línea
celular PC3.
3.1. Expresión, transactivación y heterodimerización de EGFR y

HER2.
3.2. Vías de señalización implicadas en la transactivación de los

receptores EGFR y HER2.
3.3. Implicación de la activación de EGFR y HER2 por parte de

GHRH está implicada en procesos relacionados con la progresión
tumoral.
3.4. Transactivación de receptores de GHRH por EGF.
4. Validar en modelos experimentales animales, la eficacia de los

antagonistas de GHRH y de su combinación con un inhibidor de
EGFR de uso clínico.
5. Valorar la capacidad de GHRH de transformar la línea celular no

tumoral mediante la formación de tumores in vivo.
- 62 -
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Universidad de Alcalá Material y Métodos
3.1 MATERIALES
3.1.1 REACTIVOS
Cultivos celulares
Medio RPMI-1640, Medio “Keratynocite-SFM” y sus suplementos, suero

fetal bovino (FBS), antibiótico-antimicótico, PBS (Tampón fosfato salino)
y tripsina de Gibco® Life Technologies (Alcobendas, España).
Antagonistas de GHRH: JMR-132, JV-1-38, MIA-602, MIA-606 y MIA-
690. Cedidos por el profesor A.V. Schally (Universidad de Miami, FL, EE
UU).
GHRH de PolyPeptide (Estrasburgo, Francia).
PD98059 y H89 de Alexis (Grünberg, Alemania).
PP2, AG-1478, GM6001 y TAPI-1 de Calbiochem Millipore (Darmstadt,
Alemania).
AG-825 de Tocris Bioscience (Bristol, Gran Bretaña).
Ioduro de propidio de InvitrogenTM Life Technologies.
Bromodesoxiuridina (BrdU) de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE
UU).
Colageno tipo I de Sigma Aldrich (Madrid, España).
Frascos de cultivos, pipetas, placas, etc de CELLSTARR Greiner Bio-one
GmbH (Frickenhausen, Alemania).
Ensayos in vivo
Matrigel® de Corning (New York, NY, EE UU).

Gefitinib (Iressa, ZD-1839) de Biorbyt (Cambridge, Gran Bretaña).
Sonda IRDye® 800CW 2-DG de LI-COR GmbH (Lincoln, NE, EE UU).
Isofluorano de Abbot Laboratories Ltd. (Queensborough, Gran Bretaña).
Formaldehído y Etanol de Panreac (Barcelona, España).
- 65 -
Material y Métodos Universidad de Alcalá
Material quirúrgico y microcalibrador de Fine Science Tools

(Heidelberg, Alemania).
Jeringas y agujas de BD Biosciences.
Extracción de RNA y RT-PCR
TRI Reagent®, cloroformo, isopropanol, dietilpolicarbonato (DEPC) de

Sigma Aldrich.
Transcriptasa reversa M-MuLV, OligoDT, desoxinucleótidos trifosfato
(dNTPs), ditiotreitol (DTT) de InvitrogenTM Life Technologies.
RNasin de Promega (Madison, WI, EE UU).
Agarosa D1 de CONDA (Madrid, España).
Taq polimerasa de Biotools B&M Labs (Madrid, España).
Marcadores de peso molecular de NIPON Genetics Europe GmbH
(Düren, Alemania).
Gel Red TM Nucleic Acid Gel Stain de Biotium (Hayward, CA, EEUU).
Detección, cuantificación y extracción de proteínas
Agente de tinción para Bradford (Dye-Reagent) y persulfato amónico de

BioRad (Richmond, CA, EE UU).
Acrilamida/Bis-acrilamida de National Diagnostics (Atlanta, GE, EE
UU).
Marcadores de peso molecular para SDS-PAGE de NIPON Genetics
Europe GmbH.
Membranas de nitrocelulosa Bio Trace NT de Pall Corporation (Madrid,
España).
Supersignal® West Pico sustrato de quimioluminiscencia de Pierce
(Rockford, IL, EE UU).
Películas fotográficas CURIX RP2 PLUS de AGFA (Mortsei, Bélgica)
- 66 -
Líquido de montaje para inmunocitoquímica FluorsaveTM Reagent de

Calbiochem Millipore.
Anticuerpos específicos:
Anticuerpo Casa comercial

STAT3 (F-2) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-STAT3 (F-2) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
β-catenina Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
Bcl2 (100) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
Bax (N-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
EGFR (sc-3) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
HER-2 (sc-284) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-HER2 (Tyr1248) Upstate (Lake Placid, NY, EE UU)
p-EGFR (Tyr1173) Upstate (Lake Placid, NY, EE UU)
PKC-α (C-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-βI (C-16) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-βII (C-18) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-ζ (C-20) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
PKC-δ BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE UU)

TACE (C-15) Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE UU)
p-Src (Tyr416) Calbiochem Millipore (Darmstadt, Alemania)
p44/42 (Erk1/2) Cell Signalling (Danvers, MA, EE UU)
p-p44/42 (Erk1/2)
Cell Signalling (Danvers, MA, EE UU)
(Thr202/Tyr204)
p53 Sigma Aldrich (Madrid, España)
β-actina Sigma Aldrich (Madrid, España)
MMP9 Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
MMP2 Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
PCNA Zymed (Viena, Austria)
- 67 -
E-cadherina BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EE UU)

HIF-1α Abcam (Cambrigde, Reino Unido)
GHRH Abbiotec ( San Diego, CA, EE UU)
Anticuerpos específicos frente a p-GHRH-R (número 2321/5) y SVs

(contra SV1-SV2-Sv4, número 2317/7) cedidos por el profesor A.V.
Schally (Universidad de Miami, FL, EE UU).
Anticuerpos secundarios para “Western blotting”, anti-ratón, y anti-
cabra de Sigma y anti-conejo de Calbiochem. Anticuerpo secundario para
inmunocitoquímica, anti-conejo de Molecular Probes (Barcelona,
España). Anticuerpo secundario universal para inmuhistoquímica (LSAB®
+ System-HRP) de Dako.
Medio de montaje de inmunohistoquímica DePex (Probus, Barcelona,
España).
Kit de ELISA para VEGF165 y βIg-H3 de R&D System (Minneapolis,
MN, EE UU).
Formaldehído, metanol, hematoxilina de Carazzi y hematoxilina de
Mayer de Panreac.
Kit comercial NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents
Thermo Scientific (Rockford, IL, EE UU).
- 68 -
Tampones y disoluciones
Ácido acético, acetato potásico, metanol, etanol, cloruro sódico, hidróxido

sódico, ácido clorhídrico, ácido tricloroacético (TCA), butanol, Tris,
Glicina y SDS de Panreac.
Aprotinina, leupeptina, pepstatina, azida sódica, gelatina, azul brillante
(R-250), glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), ortovanadato de sodio
(Na3VO4), β-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF),
Tritón X-100, Tween-20, TEMED, albumina sérica bovina (BSA) de
Sigma Aldrich.
CaCl2, MgCl2, KCl, DTT, EDTA, EGTA, KHPO4, Na2S2O2 de Merk
(Madrid, España).
3.1.2 MODELOS EXPERIMENTALES
3.1.2.1 Líneas celulares
Se utilizan tres líneas celulares prostáticas humanas: RWPE-1,

representativa de células epiteliales control; y LNCaP y PC3 representativas de
un estadio temprano y tardío, respectivamente, del cáncer de próstata humano.
Las tres líneas celulares proceden de ATCC (“American Type Culture
Collection”, Rockville, MD, EEUU). Las células RWPE-1 se cultivan en el
medio “Keratinocyte-SFM” que contiene 50 µg/ml de extracto de hipófisis
bovino y 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico. Las células LNCaP y
PC3 requieren el medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS. Ambos
medios de cultivo se suplementan con 1% de una mezcla de antibiótico y
antimicótico (penicilina/estreptomicina/anfotericina). Las células se mantienen
a 37 ºC en un ambiente húmedo y con un 5% de CO2. El medio se renueva cada
dos días y cuando llegan al 70-80% de confluencia se lavan las células con PBS,
se levantan con Tripsina/EDTA y se siembran en un flask de cultivo para
- 69 -
mantenerlas o bien en las diferentes placas de cultivo según las necesidades del
experimento. Las diferencias morfológicas de las tres líneas celulares se
observan en las fotos mostradas a continuación.
RWPE-1 LNCaP PC3
3.1.2.2 Animales de experimentación
Para los experimentos in vivo se utilizan ratones macho desnudos

atímicos (nu/nu) de 5 semanas de Harlan Ibérica (Barcelona, España), como el
que se muestra en la imagen inferior. Los ratones se mantuvieron en la sala
protegida libre de patógenos (SPF) del Centro de Experimentación Animal de la
Universidad de Alcalá, distribuidos en grupos de 4 ratones por jaula, expuestos
a ciclos constantes de luz y oscuridad (12 h-12 h), con agua y comida estériles ad
libitum. Todos los experimentos con animales se realizan cumpliendo las
normativas actuales para el uso y cuidado de animales de experimentación,
según los criterios de la Unión Europea para la investigación animal, y con la
aceptación del Comité de Ética de la Universidad de Alcalá.
- 70 -
3.2 MÉTODOS
3.2.1 CÉLULAS
3.2.1.1 Ácidos nucleicos
Aislamiento de RNA
La extracción del RNA se lleva a cabo mediante el uso del reactivo comercial
TRI Reagent®. El RNA se aisla a partir de líneas celulares, tras los diferentes
tratamientos, se retira el medio y se añade 1 ml de TRI Reagent por cada 2-2,5
millones de células. A continuación, se añade cloroformo para permitir la
disociación de ácidos nucleicos y proteínas. Se mantiene durante 5-15 min a
temperatura ambiente y se centrifuga a 12.000 x g para conseguir una
separación completa en fases. Se recoge la fase acuosa que es la que tiene el
RNA, descartando el resto y se añade isopropanol (1:1 vol/vol) para
precipitarlo. Finalmente, se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min para separar
el precipitado, que se lava con etanol 70% dos veces centrifugando entre cada
lavado. El precipitado se resuspende en agua estéril tratada con 0,1% DEPC,
que evita la actividad de las ribonucleasas. Por último, se determinó la cantidad
y la calidad del RNA midiendo la relación de absorbancias a 260 y 280 nm. Para
ver el grado de pureza se utilizó la relación de la absorbancia 260/280,
utilizando muestras con una relación superior a 1,8.
Retrotranscripción de RNA (RT)
La reacción de retrotranscripción se realiza con la enzima transcriptasa

reversa M-MuLV (“Moloney Murine Leukemia Virus”) y 2 µg de RNA de la
muestra previamente desnaturalizado. Dicha mezcla contiene:
- 71 -
• Tampón de reacción 5x (Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), KCl 37,5 mM, MgCl2

1,5 mM)
• Desoxirinucleótidos trifosfato (dNTPs) 10 µM
• Transcriptasa reversa M-MuLV 10 U/µl
• Oligo-dT 0,1 µg/µl
• Ditiotreitol (DTT) 5 mM
• Inhibidor de RNasa 0,5 U/µl
• Agua DEPC hasta un volumen final de 20 µl
La reacción se lleva a cabo en un termociclador (“MiniCyclerTM”) que se

programa a 37 ºC durante 1 h y posteriormente, 15 min a 70 ºC, para conseguir
la inactivación de la enzima.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación del DNA se lleva a cabo a partir de 4 µl de producto final

obtenido en la reacción de retrotranscripción, utilizando los siguientes reactivos:
• Tampón de reacción de PCR 10x (Tris-HCl 75 mM (pH 9), KCl 150 mM,
(NH4)2SO4 20 mM, MgCl2 2mM)
• dNTPs 10 µM
• Taq polimerasa recombinante modificada de la homónima de la bacteria
Thermus thermophilus, 1 U/µl
• Agua tratada con DEPC hasta un volumen final de 30 µl.
• Cebadores específicos elegidos mediante el programa Primer3 v.0.4.0. del
gen a amplificar, detallados a continuación en la tabla:
- 72 -
mRNA Secuencia 5’3’ Nºciclos

GHRH Sentido AATTGGAGAGCTCCTGGTG 40
Antisentido CCAGTTGCATTTTGGCTACA
GHRH-R Sentido CCTGATCCCACTCTTTGGAA 35

Antisentido CCTCTTGGTTGAGGAAGCAG
CD44 Sentido AAGGTGGAGCAAACACAACC 35

Antisentido ACTGCAATGCAAACTGCAAG
Ciclina D1 Sentido TTCGGGATGATTGGAATAGC 35

Antisentido TGTGAGCTGGTTCATTGAG
c-Myc Sentido AGCGACTCTGAGGAGGAACA 35
Antisentido CTCTGACCTTTTGCCAGGAG
p53 Sentido AGGCCTTGGAACTCAAGG 35
Antisentido TGAGTCAGGCCTTCTGTCT
p21 Sentido AGGTGAGGGGACTCCAAAGT 35
Antisentido ATGAAATTCACCCCCTTTCC
MMP2 Sentido ACCTGGATGCCGTCGTGGAC 30
Antisentido TGTGGCAGCACCAGGGCAGC
MMP9 Sentido TGGGCTACGTGACCTATGACA 30
Antisentido TGTGGCAGCACCAGGGCAGC
TIMP1 Sentido CTTCCACAGGTCCCACAACC 38
Antisentido TCCAGGGAGCCACGAAACT
TIMP2 Sentido CCTCTGTGACTTCATCGTGCC 38
Antisentido AGCGCGTGATCTTGCACTC
TIMP3 Sentido TGCCCCATGTGCAGTACATCA 38
Antisentido TAGACGCGACCTGTCAGCA
β-actina Sentido AGAAGGATTCCTATGTGGGCG 25
Antisentido CATGTCGTCCCAGTTGGTGAC
- 73 -
El protocolo a seguir en la reacción de PCR emplea las siguientes

condiciones de tiempo y temperatura: 5 min a 94 ºC y durante el nº de ciclos
especificados en la tabla anterior, 1 min a 95 ºC, 1 min a 57-60 ºC, 1 min a 72 ºC
y 10 min a 72 ºC.
A los productos de PCR se les añade el tampón de carga que contiene:

azul de bromofenol (0,04%), xileno cianol FF (0,04%) y glicerol (5%). La
separación de las bandas correspondientes a los genes amplificados se realiza
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizan con una tinción
con Gel RedTM y posterior exposición a luz UV, usando el sistema de imagen
Gel Doc TM XR (BioRad).
3.2.1.2 Proteínas
Aislamiento de proteínas totales
Se siembran células RWPE-1 (500.000 células/pocillo), LNCaP (300.000

células/pocillo) y PC3 (300.000 células/pocillo) en placas P-6. Tras los
diferentes tratamientos, las células se lavan con PBS, a 4 ºC y se levantan con un
raspador. Se centrifugan a 500 x g, a 4 ºC, durante 5 min. El precipitado se
resuspende con tampón lisis 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM de EDTA; 0,5
M de NaCl; 2 mM de PMSF; 5 µg/ml de inhibidores de proteasas (aprotinina,
leupeptina y pepstatina), durante 30 min en hielo y con agitación ocasional. Tras
la incubación, se centrifugan a 4.000 x g, 5 min a 4 ºC y se recoge el
sobrenadante que se guarda a -80 ºC para su posterior utilización. La
concentración de proteínas obtenida se valora mediante el método de Bradford.
- 74 -
Aislamiento de citosoles y núcleos
Se siembran células PC3 (300.000 células/pocillo) en placas P-6. Una vez

realizados los diferentes tratamientos, las células se lavan con PBS a 4 ºC, se
levantan con un raspador y se centrifugan a 500 x g a 4 ºC durante 5 min. A
continuación, se emplea un kit comercial NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic
Extraction Reagents de Thermo Scientific. Una vez eliminado el PBS se añade a
cada muestra 50 µl de tampón de extracción citoplasmática I (CER I), y se
mantienen a 4 ºC durante 10 min, con agitación ocasional. Tras la incubación, se
añaden 2,3 µl de tampón de extracción citoplasmática II (CER II), y se deja a 4
ºC, durante 1 min. La suspensión de células se centrifuga a 16.000 x g, 5 min a 4
ºC, obteniéndose en el sobrenadante el extracto citosólico. A continuación, el
precipitado se resuspende en 25 µl de tampón de extracción nuclear (NER), y se
incuba a 4 ºC durante 40 min, con agitación cada 5 min. Tras este periodo, se
centrifuga a 16.000 x g, 10 min, obteniendo el sobrenadante que corresponde
con la fracción nuclear. Ambas fracciones se guardan a -80 ºC para su posterior
utilización. La concentración proteica se valora utilizando el método de
Bradford.
Inmunodetección de proteínas
Las proteínas totales aisladas (20-50 µg) se mezclan con tampón de carga
que contiene, 50 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% v/v de glicerol, 3% p/v de
SDS, 0,01% de azul de bromofenol y 0,7 M de β-mercaptoetanol, y se
desnaturalizan durante 5 min, a 95º C. A continuación, se separan por
electroforesis utilizando geles de acrilamida/bisacrilamida en geles al 8%, 10% ó
12%, en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), a temperatura ambiente.
Finalmente, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa durante toda la
noche, a 4 ºC y 25 V o a 70 V, durante 1,5 h. La membrana se incuba, 5 min, con
- 75 -
una solución con rojo Ponceau al 0,25% mezclada con TCA al 5% para verificar
la correcta transferencia de proteínas del gel a la membrana, y a continuación, se
lava para retirar el exceso con PBS.
La membrana se incuba con el tampón de bloqueo TBS (pH 7,6) o PBS,

5% leche desnatada y 0,05% Tween-20, para evitar las uniones inespecíficas a la
misma, durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el bloqueo se incuba con el
anticuerpo primario durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante toda la
noche a 4 ºC. Transcurrido el tiempo, la membrana se lava con PBS y se incuba
con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de
rabano (1:4.000), 1 h a temperatura ambiente. Por último, se lava de nuevo la
membrana y se incuba con el sustrato de la peroxidasa del sustrato de
quimioluminiscencia, durante 1 min. A continuación, se expone la membrana
con películas fotográficas CURIX. El análisis densitométrico de las bandas se
realiza con el programa Quantity One (BioRad). Los datos se normalizan con la
cantidad de β-actina, utilizada como control de carga. Las concentraciones de los
anticuerpos primarios, así como el anticuerpo secundario correspondiente
aparecen en la siguiente tabla:
Anticuerpo 1º Dilución 1º Anticuerpo 2º

STAT3 (F-2) 1:100 Ratón
p-STAT3 (F-2) 1:100 Ratón
β-catenina 1:2.000 Ratón
Bcl2 (100) 1:1.000 Ratón
Bax (N-20) 1:500 Conejo
EGFR (sc-3) 1:1.000 Conejo
HER-2 (sc-284) 1:500 Conejo
p-HER2 (Tyr1248) 1:1.000 Conejo
- 76 -
p-EGFR (Tyr1173) 1:500 Ratón

PKC-α (C-20) 1:500 Conejo
PKC-βI (C-16) 1:500 Conejo
PKC-βII (C-18) 1:500 Conejo
PKC-ζ (C-20) 1:500 Conejo
PKC-δ 1:250 Ratón

TACE (C-15) 1:500 Conejo
p-Src (Tyr416) 1:2.000 Conejo
p44/42 (Erk1/2) 1:1.000 Conejo
p-p44/42 (Erk1/2) 1:1.000 Ratón
(Thr202/Tyr204)
p53 1:2.000 Conejo
GHRH 1:100 Conejo
p-GHRH-R 1:2.000 Conejo
SVs (SV1-SV2-SV4) 1:2.000 Conejo
MMP9 1:5.000 Conejo
MMP2 1:2.000 Conejo
PCNA 1:10.000 Ratón
E-cadherina 1:2.000 Ratón
β-actina 1:20.000 (Toda la noche) Ratón
1:8.000 (1 h)
Inmunocitoquímica
Se siembran 40.000-60.000 células/pocillo sobre cristales tratados y

estériles de 12 mm2, colocados en placas P-24, y se mantienen durante 24 h para
- 77 -
que se adhieran. Se realizan los diferentes tratamientos y, a continuación se

retira el medio de cultivo de los pocillos y se lavan con PBS. Para fijar las
células a los cristales, se utiliza p-formaldehido al 4% (pH 7,4) durante 25 min a
temperatura ambiente. Una vez fijadas, se lavan con PBS y se permeabilizan con
Tritón X-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se
lavan con PBS y se procede a la inmunodetección con los anticuerpos
específicos. Las células se someten a un bloqueo con BSA al 3%, en PBS a 37 ºC,
para prevenir las uniones inespecíficas. Tras el bloqueo, se incuba con los
anticuerpos primarios frente a p-GHRH-R y SVs (dilución 1:500) durante 2 h, a
37 ºC, en atmósfera húmeda.
Seguidamente, se realizan lavados con PBS y se incuban con el anticuerpo

secundario anti-conejo conjugado con Alexa 488 durante 1 h en oscuridad y en
las mismas condiciones que los anticuerpos primarios. A las muestras que se
utilizan como control negativo no se les añade el anticuerpo primario. Una vez
finalizada la inmunodetección, los cristales se colocan en un portaobjetos
adheridos con líquido de montaje con DAPI (4´,6´-diamino-2-fenilindol)
Fluorsave ReagentTM de Invitrogen, que se une al DNA y tiñe los núcleos de
color azul. Las preparaciones se visualizan en un microscopio confocal de
fluorescencia Leica TCD SP5 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania)
para su posterior análisis.
Zimografía
Se siembran 50.000 células/pocillo en placas P-6. Transcurridas 24 h, se

retira el medio, se les añade medio condicionado y se realizan los diferentes
tratamientos. Una vez finalizados, el medio secretado se recoge y se guarda a –
80 ºC hasta su uso.
- 78 -
A continuación, se realiza una electroforesis de acrilamida/bisacrilamida

SDS-PAGE al 10% con 3 µg de proteínas, cuyo gel se copolimeriza con 0,1% de
gelatina (Sigma Aldrich). Posteriormente, se realizan cuatro lavados del gel para
conseguir eliminar el SDS: dos de 30 min cada uno, con Tris- HCl 50 mM (pH
7,4) y 2,5% de Tritón X-100 y dos lavados de 10 min cada uno, con Tris-HCl
50 mM. Una vez finalizados, el gel se incuba toda la noche a 37 ºC, en agitación,
con un tampón de incubación que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), CaCl2 10
mM, NaCl 0,15 M, 0,1% de Tritón X-100 y 0,02% de azida sódica. Después de la
incubación, los geles se tiñen durante 30 min con 0,25% de azul Coomassie R-
250, y se destiñen con la solución de destinción que contiene 7,5% de ácido
acético y 20% de metanol, apareciendo las bandas blancas sobre un fondo azul,
donde las enzimas han degradado la gelatina. El análisis densitométrico de la
actividad de las metaloproteasas 2 y 9 se realiza con el programa Quantity One
(BioRad).
ELISA para valorar VEGF
Se siembran 40-80.000 células/pocillo en placas P-24. Una vez

finalizados los diferentes tratamientos, se recoge el medio de cultivo y se
procede a cuantificar los niveles de VEGF165. Para ello, se emplea un kit de
ELISA (R&D system), donde se incuba el anticuerpo primario en una placa de
96 pocillos, durante toda la noche a temperatura ambiente, para que se adhiera a
la base. A continuación se lava con PBS y Tween-20 al 0,05%; los lavados se
deben repetir después de cada uno de los pasos del ELISA. A continuación, se
procede al bloqueo de las uniones inespecíficas incubando, durante 1 h, con BSA
al 1% en PBS. Para cuantificar los niveles de expresión se realiza una curva
patrón cuyo rango oscila entre 0-4.000 pg/ml siguiendo las indicaciones del
fabricante. Una vez finalizado el bloqueo y los sucesivos lavados, se añaden las
diluciones conocidas del patrón y las muestras a analizar. Todos los ensayos se
- 79 -
realizan por duplicado. Tras 2 h de incubación, se lavan los pocillos y se añade el

anticuerpo secundario conjugado con biotina, que reconocerá a la isoforma
VEGF165, durante 2 h. A continuación y en ausencia de luz, se añade el complejo
estreptavidina-peroxidasa durante 20 min. Una vez finalizado este tiempo, se
añade la solución sustrato de la enzima peroxidasa durante 1 h, que contiene
H2O2 y ABTS (2,2´-acinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]) que
permite visualizar la reacción. La absorbancia se mide a 405 nm en un
espectofotómetro.
3.2.1.3 Ensayo de incorporación de la bromodesoxiuridina
La bromodesoxiuridina (BrdU), es un derivado de uridina que se puede

incorporar al DNA en lugar de timidina. Para la realización de la técnica se
siembran 300.000 células/pocillo en placas P-6. Una vez adheridas a la placa, las
células se deprivan de suero durante 24 h. Transcurrido ese tiempo, a las células
se aplican los diferentes tratamientos en medio sin suero. Para medir la
proliferación se añade BrdU 10 µM, 1 h antes de finalizar el tratamiento.
Posteriormente, las células se lavan con PBS, se levantan con tripsina y se
centrifugan a 500 x g durante 5 min, para eliminar el sobrenadante. Las células
se fijan con etanol absoluto frío, a -20 °C, durante 30 min, o a 4 ºC 24 h.
Transcurrido este tiempo, se centrifugan de nuevo y se lavan con PBS. Las
células se incuban, durante 30 min, a temperatura ambiente, con 2 N de HCl,
con el fin de desnaturalizar el DNA. Este paso es imprescindible, ya que el
anticuerpo Anti-BrdU se une a las moléculas de BrdU incorporadas cuando el
DNA es de cadena sencilla. A continuación, se centrifugan y se lavan dos veces
con PBS, y una tercera vez con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (pH 7,4) y
0,1% de BSA. Finalmente, las células se incuban con 20 µl de anti-BrdU,
anticuerpo monoclonal con FITC (BD Bioscience), en condiciones de oscuridad,
durante 30 min como mínimo y pasado el tiempo de incubación, se realiza un
- 80 -
último lavado y se centrifuga para retirar el sobrenadante, quedando las células

en el precipitado. Las células se tiñen con una solución de PBS, que contiene 50
mg/ml de ioduro de propidio (IP) y 10 µg/ml de RNasa, antes del análisis por
citometría de flujo con el FACSCalibur de BD Biosciences. La cantidad deBrdU
incorporada al DNA celular se analiza con el programa Cyflogic v 1.2.1. Se
muestra a continuación una imagen de la localización en un dot plot de las células
que han incorporado BrdU.
Células que han

incorporado la BrdU
BrdU
PI
3.2.1.4 Ensayo de viabilidad con MTT
El ensayo MTT, es un método basado en la capacidad de las

deshidrogenasas mitocondriales de las células vivas para reducir la sal de
tetrazolio, MTT (Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazol).
Este compuesto es una sal amarilla y soluble, que se reduce en cristales
insolubles de formazán de color azul oscuro retenidos en el interior celular. La
cantidad de MTT reducido se puede medir colorimétricamente, presentando su
máximo de absorción a 570 nm.
Para realizar el experimento, se siembran 25.000 células/pocillo en

placas P-96, y una vez adheridas, se deprivan con medio sin suero durante 24 h.
Posteriormente, se realizan los distintos tratamientos, y 1-1,5 h antes de
- 81 -
finalizar se incuban con 0,3 mg/ml de MTT, a 37 ºC y en condiciones de

oscuridad. Los cristales obtenidos se solubilizan con 50-100 µl de isopropanol
frío y agitación suave. Posteriormente, se procede a su lectura en un
espectrofotómetro a 570 nm, a la cual restaremos la obtenida a 620 nm como
“fondo”.
3.2.1.5 Ensayo de ciclo celular
Se siembran 75.000-100.000 células/pocillo en placas P-6 y se mantienen

durante 24 h para conseguir su adherencia, momento en el que se deprivan con
medio sin suero, durante 24 h. Transcurrido este tiempo, se realizan los
distintos tratamientos y después, las células se lavan con PBS, se levantan con
tripsina y se centrifugan. El precipitado de células se fija y se permeabiliza con
etanol frío al 70%, durante 30 min a -20 ºC. Después, las células se centrifugan
para retirar el etanol y se lavan con PBS. Finalmente, se resuspenden en una
solución de tinción que contiene PBS, 50 mg/ml de IP y 10 µg/ml de RNasa,
antes del análisis por citometría de flujo con FACSCalibur. La cantidad de DNA
que se distribuye en las diferentes fases del ciclo celular se analiza con el
programa Cyflogic v 1.2.1., obteniendo el siguiente perfil en un ciclo normal:
G1
SubG0
Nº de eventos
G2/M
S
PI
- 82 -
3.2.1.6 Ensayo de adhesión
Previamente a la realización del ensayo de adhesión, las células se

deprivan de suero durante 24 h. A continuación, se levantan por tripsinización
que se neutraliza con medio sin suero suplementado con 0,1% de inhibidor de
tripsina. Las células se centrifugan a 500 x g, durante 5 min y se resuspenden en
medio sin suero suplementado con 0,1% de BSA, hasta alcanzar una
concentración de 250.000 células/ml. Las células se mantienen en suspensión,
durante 1 h, antes de realizar los diferentes tratamientos.
La suspensión de células se separa en varias fracciones que dependerán del

número de tratamientos a realizar y se mantienen en suspensión, durante 1 h, a
37 ºC, con agitaciones cada 5 min. Por otro lado, se preparan las placas con el
colágeno que actúa como matriz. Se añaden 100 µl de colágeno tipo I (8 µg/cm2)
diluido en ácido acético 10 mM/pocillo, en placas de 96 pocillos, durante 1 h, a
37 ºC en atmósfera seca para conseguir una fijación completa al pocillo. Pasado
ese tiempo, se aspira el colágeno y se lava tres veces la placa con PBS. Se
adicionan 100 µl de la suspensión celular previamente tratada a cada pocillo y se
aspira el medio en el tiempo correspondiente. Finalmente, se continúa la
valoración de las células adheridas al colágeno mediante un ensayo de MTT,
donde se añaden 100 µl de medio sin suero y 0,3 mg/ml de MTT a cada pocillo.
3.2.1.7 Ensayo de migración
Se basa en un ensayo de cierre de heridas o “wound healing” que se

realiza sobre una monocapa de células confluentes. Las células se siembran en
placas P-24 y se dejan hasta que alcancen la confluencia, momento en el que se
llevan a cabo los diferentes tratamientos. La herida se realiza mediante una
incisión con un raspador manual, como se indica en la imagen. Para valorar la
migración celular, se realizan fotos de la herida, desde el momento en el que se
produce, en un microscopio invertido acoplado a una cámara Nikon (40x). El
- 83 -
seguimiento se distribuye en diferentes tiempos (0-24 h), hasta conseguir el

cierre completo de la herida y se mide al espacio sin cerrar, para comparar
respecto al tiempo cero de cada tratamiento.
3.2.2 RATONES
3.2.2.1 Inducción de tumores con células PC3
Para la obtención de los xenoinjertos se prepara una suspensión de

células PC3 (5 x 106 células/ratón) mezclada con la membrana basal sintética,
MatrigelTM Matrix (1:1, v/v), a 4 ºC. La mezcla se inyecta subcutáneamente en el
flanco derecho del animal. Tras 10 días de crecimiento de los tumores, se
establecen los grupos de trabajo en cada experimento:
• Experimento 1: se establecen 3 grupos de animales para evaluar los

tratamientos con los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38. El
experimento finaliza a los 52 días de la inoculación de las células.
- 84 -
Inicio
tratamiento
CONTROL
0,1% DMSO +10% PG/día
Grupo I
5 x106 10 ratones
células PC3
Formación JMR-132: 10 µg/día
tumor Grupo II
8 ratones
JV-1-38: 20 µg/día
Grupo III
7 ratones
• Experimento 2: se establecen 4 grupos de animales para evaluar el

antagonista de GHRH MIA-690; el inhibidor de EGFR, Gefitinib y;
ambos en combinación. El experimento finaliza a los 52 días de la
inoculación de las células.
CONTROL
0,1% DMSO +10% PG/día
Grupo I
15 ratones
5 x106
células PC3 MIA-690: 5 µg/día
Grupo II
Formación 9 ratones
tumor
GEFITINIB
(3 mg/día)
Fin
tratamiento
Descanso
Grupo III 5 días 2 días 5 días
9 ratones
GEFITINIB
(3 mg/día) Fin
tratamiento
Descanso
Grupo IV 5 días 2 días 5 días
9 ratones
- 85 -
Al finalizar el tratamiento, se procede a la extracción de la sangre del

animal y a su posterior sacrificio por dislocación cervical. Finalmente, se
recogen los tumores, se pesan y una parte se almacena a -80 ºC para la posterior
utilización de los mismos, otra parte se prepara para inmunohistoquímica.
3.2.2.2 Inducción de tumores con células RWPE-1
En primer lugar, se forman dos grupos de células RWPE-1, el grupo I

control que no recibe tratamiento, y el grupo II cuyas células se incuban con
GHRH 0,1 µM durante 24 h. Tras el tratamiento se realiza una suspensión con
1 x 107 células/ratón mezclada con la membrana basal sintética, MatrigelTM
Matrix (1:1, v/v), a 4ºC. La mezcla se inyecta subcutáneamente en el flanco
derecho del animal. El experimento finaliza a las 11 semanas del inicio del
mismo.
1 x107 células RWPE-1
Grupo I
7 ratones
24 h CONTROL
GHRH 0,1 µM 1 x107 células RWPE-1
Grupo II
7 ratones 24 h
3.2.2.3 Seguimiento de los experimentos de tumorigenicidad
En todos los experimentos, se hace un examen visual de la salud de los

ratones y se pesan dos veces a la semana, anotando además cualquier anomalía
en su comportamiento. El estado de los animales se evalúa mediante las hojas de
- 86 -
evaluación de la severidad en oncología para la eficacia de nuevos fármacos

antitumorales entregadas por el Centro de Experimentación Animal,
estableciendo de esta forma los criterios de punto final.
El volumen del tumor se mide con un microcalibrador y se calcula con la

fórmula: Volumen= Alto x Ancho x Profundo x 0,5236 (Tomayko y col., 1989).
3.2.2.3 Aislamiento de RNA y RT-PCR
Se toma un pequeño trozo del tejido tumoral, se trocea y homegeniza con

un Potter añadiendo 200 µl de Tri Reagent®. A continuación, se sigue con el
protocolo de aislamiento y de RT-PCR utilizado para las células (apartado
3.2.1.1).
3.2.2.4 Inmunohistoquímica
Las piezas reservadas para inmunohistoquímica se lavan con suero

fisiológico y se fijan con formol al 10% durante 1 día. Tras lavar con PBS
durante 1 h, las piezas se deshidratan mediante su inmersión en concentraciones
crecientes de etanol: 50º 1 h, 70º toda la noche, 80º 1 h, 90º 1 h y 100º 1 h; y por
último las piezas se dejan en una solución de butanol. A continuación se pasan
por tres soluciones de parafina durante 1, 12 y 3 h. Los bloques se realizan con
moldes de 2x1x1 cm donde se pone parafina nueva y se incluye la pieza,
manteniéndolos a temperatura ambiente hasta que se enfrían. Se realizan
secciones de 5-7 µm con un micrótomo MICROM HM 30. Los cortes se montan
sobre portaobjetos pretratados con 3-aminopropil-trietoxixylane (TESPA) al
1% en acetona. A continuación, se desparafina y rehidrata el tejido. Para
exponer los antígenos, los cortes se incuban en tampón citrato 0,01 M (pH 6)
durante 2 min en una olla exprés convencional y se dejan enfriar en la olla sin
- 87 -
destapar durante 20 min y se lavan durante 5 min con agua destilada. La

actividad peroxidasa endógena se inhibe, incubando los cortes durante 20 min,
con H2O2 al 0,3% a temperatura ambiente y se lavan de nuevo 5 min con agua
destilada. Se continúa con dos lavados con PBS de 10 min. Las uniones
inespecíficas se bloquean al incubar los cortes en TBS con un 3% de NDS y 0,5%
de Triton X-100 durante 1 h. Posteriormente, se incuban con el anticuerpo
primario diluido en el tampón de bloqueo diluido (0,3% NDS y 0,05% Tritón X-
100), durante toda la noche, siguiendo las siguientes diluciones:
Anticuerpo 1º Dilución
p-HER2 (Tyr1248) 1:100
p-EGFR (Tyr1173) 1:100
GHRH 1:50
p-GHRH-R 1:2.000
SVs (SV1-SV2-SV4) 1:2.000
MMP9 1:200
MMP2 1:100
PCNA 1:300
E-cadherina 1:500
HIF-1α 1:100
Las muestras se lavan dos veces con TBS durante 10 min, y se incuban
con el anticuerpo secundario universal unido a biotina (Dako) durante 20 min y
se vuelven a lavar. Finalmente, la detección se realiza mediante la técnica clásica
de marcaje con el complejo de estreptavidina-biotina peroxidasa (LSAB -kit,
Dako). Para revelar se utiliza diamino-benzidina con el método de
intensificación de la glucosa oxidasa. Se comprueba la tinción con el microscopio
y, cuando se obtiene una señal intensa, la reacción se detiene con tampón
- 88 -
acetato. Por último, se deshidratan, se limpian con xileno y se procede al

montaje de la preparación en DePex (Probus). Como controles positivos se
utilizan secciones de la piel, la glándula suprarrenal y riñón de rata.
3.2.2.6 Tricrómico de Masson
Tras desparafinar y rehidratar los cortes realizados de los tumores

incluidos en parafina, se someten a una tinción con hematoxilina férrica de
Weigert, durante 5 min, seguido de un lavado en agua durante 4 min. Los cortes
se tienen con fucsina acida-Ponceau (33% de Fucsina ácida y 66% de Ponceau)
durante 8 min y se aclaran con agua acética al 1%. A continuación se sumergen
en una solución de Orange G (2,5% de ácido fosfomolíbdico y 2% de Orange G)
durante 5 min, volviendo a aclararlos con agua acética al 1%, y se sumergen en
una solución de verde luz (0,2% de verde luz y 0,2% de acético), volviendo a
lavar tras 3 min de inmersión. Por último se vuelven a deshidratar y se montan
con Entellán para su posterior visualización.
3.2.2.7 Lisados de tejido tumoral y “Western blotting”
Se trocea y homogeniza con ayuda de un Polytron PT-20 una pequeña

parte del tejido tumoral en hielo con un tampón que contiene: Tris-HCl 1M (pH
7,4), NaCl 150 mM, Nonidet-P40 1%, Ortovanadato 2 mM, y leupeptina,
aprotinina y pepstatina 5 µg/ml. El homogenado se incuba 30 min, a 4 ºC.
Posteriormente, se centrifugan a 17.000 x g, durante 30 min, a 4 ºC, y el
sobrenadante se recoge y almacena a -80 ºC, para su posterior utilización en
ensayos de inmunodetección según aparece en el apartado 3.2.1.2.
- 89 -
3.2.2.8 Estudio de la expresión de VEGF y de la actividad gelatinolítica de

MMPs
Se toma una parte del tejido tumoral extraido y se homogeniza con un

Potter a 4 ºC en un tampón que contiene Tris –HCl (pH 7,6) a 50 mM, Tritón
X-100 al 1%, NaCl a 200 mM y CaCl2 a 10 mM e inhibidores de proteasas:
PMSF 0,5 mM y 2 µg/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Todo ello se
mantiene durante 30 min, a 4 ºC, con agitaciones ocasionales. Pasado el tiempo,
se centrifuga a 12.000 x g durante 20 min, se recoge el sobrenadante y se
conserva a -80 ºC hasta su uso posterior para los ensayos de ELISA de VEGF y
de zimografía (apartado 3.2.1.2.).
3.2.2.9 Aislamiento de membranas y núcleos
Se trocea y homogeniza con ayuda de un Polytron PT-20 una pequeña

parte del tejido tumoral en hielo con PBS e inhibidores de proteasas (PMSF 0,1
mM y 10 µg/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina). El homogenado se filtra
con una gasa doble para eliminar restos de tejido, y se centrifuga a 500 x g 10
min, a 4 ºC. El sobrenadante se mezcla a partes iguales con un tampón que
contiene 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT,
0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF 0,1 mM y 10 µg/ml de
aprotinina, pepstatina y leupeptina. Tras 10 min de incubación se centrifuga a
1.000 x g 15 min a 4ºC:
• Sobrenadante: se utiliza para aislar las membranas. Se centrifuga a 50.000

x g 30 min a 4 ºC. El precipitado obtenido se resuspende en un tampón
que contiene 50 mM TEA (trietanolamina) (pH 7,4), 0,5 mM sacarosa, 1
mM EDTA, 20 mg/l de bacitracina e inhibidores de proteasas: PMSF 0,1
mM y 10 µg/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. La mezcla se
- 90 -
centrifuga a 100.000 x g 20 min a 4 ºC, el precipitado se resuspende en el

tampón anterior y se conserva a -80 ºC.
• Precipitado: se emplea para la extracción de núcleos. El precipitado se
resuspende en un tampón que contiene 0,3 mM HEPES (pH 7,9), 1,5 mM
KCl, 0,03 mM MgCl2, 0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF
0,1 mM y 10 µg/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Tras 10 min de
incubación se centrifuga a 2.000 x g, 15 min, a 4 ºC. El precipitado se
resuspende en un tampón que contiene 20 mM HEPES (pH 7,9), 25% de
Glicerol, 0,42 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA,
0,5 mM DTT, 0,2 mM Na3VO4 e inhibidores de proteasas: PMSF 0,5 mM
y 10 µg/ml de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Se centrifuga a 20.000
x g 15 min a 4 ºC. El sobrenadante es la fracción nuclear y se conserva a -
80 ºC.
3.2.2.10 Sonda 2-desoxi-D-glucosa
Previo al sacrificio de los animales se procede a realizar el ensayo con la

sonda 2-desoxi-D-glucosa (IRDye 800CW 2DG Optical Probe) que se
encuentra unida a un fluorocromo que emiten a 800 nm. Las células tumorales
presentan un elevado metabolismo glucosídico y captan glucosa del medio con
avidez. La sonda 2-desoxi-D-glucosa entra por el mismo transportador de
membrana que la glucosa, pero no es metabolizada por la vía glucolítica, de esta
forma la sonda se va acumulando en dichas células, lo que nos permite
detectarlas con un escaner de fluorescencia para animales. Un día antes de
valorar la presencia de fluorescencia, se inyecta de forma intravenosa 20 nmoles
de la sonda 2-desoxi-D-glucosa en la vena de la cola de los ratones. Al día
siguiente los ratones se mantienen en ayunas durante 6 h, pasado este tiempo se
anestesia a los animales y se les escanea con el sistema de análisis Licor Odissey
de LI-COR. En el análisis de las imágenes, el color azul representa una baja
- 91 -
presencia de la sonda en el animal, y el color rojo indica una elevada presencia

de la misma.
3.2.2.11 Rayos X
Una vez extraído el tejido tumoral de los animales se procede a realizar

radiografías de los cuerpos enteros de los ratones con X-ray system (Faxitron
Bioptics, Tucson, AZ). Las radiografías obtenidas fueron analizadas gracias a la
colaboración del Servicio de Traumatología del Hospital Universitario Príncipe
de Asturias. Posteriormente, se clasifican los animales según una serie de
estadios realizados atendiendo al número y localización de dichas lesiones
metastásicas:
 Estadio 0: Sin cambios
 Estadio 1: Pequeños focos metastásicos
 Estadio 2: Focos metastásicos en hueso o pulmón
 Estadio 3: Focos metastásicos en hueso y pulmón
- 92 -
3.2.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los análisis estadísticos se realizan con el programa GraphPad Prism,

utilizando el test de Bonferroni para comparaciones múltiples después de
realizar un análisis de varianza (ANOVA). El resultado obtenido se considera
significativo a partir de p<0,05.
- 93 -
4. RESULTADOS
Universidad de Alcalá Resultados
4.1 ESTUDIO DE LOS RECEPTORES DE GHRH EN CÉLULAS

PROSTÁTICAS HUMANAS
En este apartado se analiza la expresión de GHRH, así como, los niveles

y localización de los receptores de GHRH en células de epitelio prostático
humano, RWPE-1, de carcinoma prostático humano en estadio temprano al ser
dependiente de andrógenos, LNCaP, o en estadio avanzado, independiente de
andrógenos, PC3.
4.1.1 EXPRESIÓN DE GHRH
En primer lugar se valoran los niveles proteicos de GHRH por

inmunodetección. Los resultados se representan en la figura 21, indican que las
tres líneas celulares de próstata expresan GHRH con un patrón diferente según
el tipo celular. Así, las células tumorales tienen mayores niveles de GHRH que
la no tumoral, un 38% y un 45% mayor para LNCaP y PC3, respectivamente.
GHRH
β-Actina
150 ***
***
Niveles de proteína
(% vs. RWPE-1)
100
50
0
RWPE-1 LNCaP PC3
Figura 21. Expresión GHRH en las líneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3
medida por ensayos de “Western blot”. Los resultados se representan como el
porcentaje de expresión respecto a la expresión en RWPE-1. Los datos corresponden a
la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; ***, p<0,001.
- 97 -
Resultados Universidad de Alcalá
4.1.2 EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE GHRH
La valoración de la expresión de los receptores de GHRH se realiza

mediante inmunodetección con anticuerpos específicos para el receptor
hipofisario, p-GHRHR, y sus variantes de “splicing”, SVs (Figura 22). Los
resultados obtenidos indican que los niveles de expresión para el p-GHRHR
son un 24% más elevados en el caso de la línea celular LNCaP, y un 34%
menores para la línea celular PC3, con respecto a la expresión en células
controles RWPE-1. Por el contrario, los receptores SVs presentan una mayor
expresión en PC3 (40%), y una menor expresión en LNCaP (19%) respecto a la
expresión en RWPE-1.
p-GHRHR SVs
β-Actina β-Actina
150 ***
*
(% vs RWPE-1)
100
*
**
50
Figura 22. Expresión de los receptores p-GHRH y SVs en las líneas celulares
RWPE-1, LNCaP y PC3 medida por ensayos de “Western blot”. Los resultados se
representan como el porcentaje de expresión respecto a la expresión en RWPE-1. Los
datos corresponden a la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05;
**, p<0,01; ***, p<0,001.
- 98 -
4.1.3 LOCALIZACIÓN DE LOS RECEPTORES DE GHRH
La localización subcelular de los receptores de GHRH se determina por

inmunocitoquímica. Las imágenes obtenidas por microscopia de fluorescencia de
la figura 23, indican que en las tres líneas celulares hay expresión de los dos
tipos de receptores, p-GHRHR y SVs, y están localizados en membrana
plasmática y citoplasma. Las células RWPE-1 tienen una expresión menor de
ambos receptores comparando con las células tumorales. Las LNCaP presentan
para el receptor p-GHRHR una mayor intensidad de fluorescencia que para los
receptores SVs. En cambio, en la línea celular PC3 se observa una expresión
mayor de los receptores SVs. Resultados concordantes con los observados en la
figura 22.
p-GHRHR SVs Negativo
RWPE-1
LNCaP
PC3
Figura 23. Inmunocitoquímica de los receptores p-GHRH y SVs en las líneas

celulares RWPE-1, LNCaP y PC3. Como control negativo se realizan preparaciones
en ausencia de anticuerpo primario. Las imágenes son representativas de cuatro
experimentos independientes. Imágenes aumentadas 1000 veces.
- 99 -
4.1.4 EFECTO DE LOS ANTAGONISTAS DE GHRH SOBRE LA

EXPRESIÓN DE SUS RECEPTORES
Como se menciona en la introducción, los antagonistas de GHRH

reducen la expresión de novo de GHRH, sin embargo, no se han comprobado sus
efectos sobre los receptores de GHRH. En este sentido, se evalúa la expresión
del mRNA en función del tiempo de todas las variantes de los receptores de
GHRH tras el tratamiento con sus antagonistas, JMR-132 y JV-1-38. La figura
24 indica como el tratamiento con los antagonistas incrementa la expresión de
mRNA de manera tiempo-dependiente en las células PC3, llegando hasta casi
un 100% de aumento en su expresión
A) B)
JMR-132 JV-1-38
GHRHR
β-Actina
*** 200 ***

200 *** **
**
* **
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
150 *
150
(% vs. 0 min)
(% vs. 0 min)
100 100
50 50
0 0
0 5 15 30 60 120 0 5 15 30 60 120
Tiempo (min) Tiempo (min)
Figura 24. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, sobre la

expresión de mRNA de los receptores de GHRH en la línea celular PC3. Los
resultados se obtienen mediante ensayos de RT-PCR, y se representan como el
porcentaje de expresión respecto a la expresión a los 0 min. Los datos corresponden a la
media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***
p<0,001.
- 100 -
4.2 EFECTO DE GHRH Y SUS ANTAGONISTAS EN PROCESOS

IMPLICADOS EN LA PROGRESIÓN DEL CÁNCER DE
PRÓSTATA
Para determinar el efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la

progresión del cáncer prostático se estudia su papel sobre los siguientes
procesos:
 Viabilidad celular
 Proliferación
 Ciclo celular y apoptosis
 Adhesión celular
 Migración
 Degradación de la matriz extracelular
 Neurodiferenciación
 Angiogénesis
Además, para cada uno de los fenotipos estudiados se analizan las

variaciones producidas en diferentes proteínas marcadoras de cada proceso.
4.2.1 VIABILIDAD CELULAR Y CITOTOXICIDAD
En este apartado se estudia el efecto de GHRH y sus antagonistas sobre

la viabiblidad de células RWPE-1, LNCaP y PC3, mediante ensayos de MTT.
En primer lugar, se determina la concentración óptima de los péptidos a

utilizar en posteriores estudios; para ello, se ensaya el efecto de diferentes
concentraciones (0,001-0,1 µM) de GHRH y de sus antagonistas, tras 24 h de
tratamiento, sobre la actividad metabólica en la línea celular control, RWPE-1,
y la tumoral más agresiva, PC3. Los resultados (Figura 25A y 25B) indican que
- 101 -
GHRH produce un aumento de la viabilidad celular dosis-dependiente en ambas

líneas celulares. Se elige para posteriores tratamientos una concentración de 0,1
µM para GHRH, ya que es la única concentración ensayada que aumenta la
viabilidad de ambas líneas celulares. En cambio, en el ensayo con los
antagonistas se observa un efecto citotóxico dosis dependiente. Se elige como
concentración óptima de antagonista 0,1 µM, ya que provoca una reducción
importante de la actividad metabólica de las células tumorales sin ser
excesivamente citotóxica para las células no tumorales.
A)
**
120 120 120
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100
(% vs. Control)
100 100
(% vs. Control)
(% vs. Control)
* *** ***
80 80 80 *** *** ***
***
60 60 60
40 40 40 ***
20 20 *** 20
0 0 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
GHRH (M) JMR-132 (M) JV-1-38 (M)
120 120 120

Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100 100 100

(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
80
* ** 80 * 80 **
60 60 *** *** 60
*** ***
***
40 40 40
***
20 20 20 ***
***
0 0 0
MIA-602 (M) MIA-606 (M) MIA-690 (M)
B)
120 *** **
*** 120 120
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100
(% vs. Control)
100
(% vs. Control)
100
(% vs. Control)
80 * * ** ***
80 80
*
60 60 60
40 40 40 ***
20 20 20
0 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0
Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Control 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
GHRH (M) JMR-132 (M) JV-1-38 (M)
120 120 120

Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
100 100 100

(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
80 *** 80 ** 80
*** ***
60 *** *** 60 *** 60 *** ***
***
40 40 *** 40 ***
*** ***
20 20 20
0 0 0
MIA-602 (M) MIA-606 (M) MIA-690 (M)
Figura 25. Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la viabilidad celular en

células RWPE-1 (A) y PC3 (B) valorado por ensayo MTT. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a la media ±
E.S.M. de diez experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 102 -
La figura 26 muestra de manera conjunta el resultado de la viabilidad en

las tres líneas celulares con cada uno de los péptidos. Tras el tratamiento con
GHRH (0,1 µM) se produce un incremento de la viabilidad en los tres tipos
celulares (10-19% frente al control), siendo mayor en las células PC3. Por el
contrario, cuando se incuban las células solo con los antagonistas de GHRH la
viabilidad celular disminuye de forma significativa. En el caso de las RWPE-1,
el antagonista MIA-606 es el que produce el mayor efecto, en torno a un 43% de
disminución del metabolismo celular. Para la línea celular LNCaP los
antagonistas de GHRH producen una reducción en su viabilidad celular en
torno a un 27%, excepto el antagonista JV-1-38 con el que no se obtiene
resultados significativos. La línea celular PC3, tras el tratamiento con los
antagonistas, muestra una reducción significativa, destacando el antagonista
MIA-690 con el que se consigue una reducción de un 44%.
RWPE-1 LNCaP PC3

125 125 125
** * ***
Viabilidad celular
Viabilidad celular
Viabilidad celular
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100 100

*** *** ***
*
75
*** 75 *** *** *** 75 *** ***
*** ***
*** ***
50 50 50
25 25 25
0 0 0
Figura 26. Efecto de 0,1 µM de GHRH y 0,1 µM de antagonistas de GHRH sobre

la viabilidad celular de las tres líneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3, valorado
por ensayo MTT. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control.
Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de diez experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 103 -
4.2.2 PROLIFERACIÓN CELULAR
En este apartado se compara como afecta el tratamiento con GHRH,

JMR-132, JV-1-38, MIA-602, MIA-606 y MIA-690 a la proliferación de
células prostáticas. Para ello se utiliza la técnica de incorporación de BrdU en
las líneas celulares RWPE-1, LNCaP y PC3, tras 24 h de tratamiento con los
distintos péptidos. Posteriormente, se mide el efecto sobre el PCNA, proteína
nuclear requerida para la síntesis de DNA y, por ende, marcadora de la
proliferación celular.
4.2.2.1 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en la proliferación en

células RWPE-1, LNCaP y PC3
En primer lugar se realiza un ensayo dosis-respuesta en células PC3 y así

poder comprobar que la concentración de GHRH elegida en el ensayo de MTT
es la adecuada para valorar el nivel de incorporación de BrdU. En la figura 27,
se observa que la concentración 0,1 µM provoca un aumento significativo de un
25% en la incorporación de BrdU en las células tumorales PC3, corroborando la
concentración óptima elegida en el anterior apartado.
40
Incorporación de BrdU
(% del total de células)
*** **
30
20
10
Control 10-9 10-7 10-5
GHRH (M)
Figura 27. Efecto de GHRH en la incorporación de BrdU en células PC3. Los

resultados se expresan en porcentaje respecto al control. Los datos corresponden a la
media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 104 -
La comparación del efecto de GHRH y antagonistas sobre la proliferación

en las tres líneas celulares se representa en la figura 28; en ella se observa que el
tratamiento con la hormona incrementa la incorporación de BrdU en las tres
líneas, siendo el efecto significativamente mayor en las células no tumorales
respecto a su control (72%). Por otro lado, el tratamiento con los antagonistas
ocasiona un efecto diferente sobre la proliferación de cada línea celular. En las
células RWPE-1, el tratamiento con los antagonistas JMR-132, JV-1-38, MIA-
606 y MIA-690 no produce cambios en el porcentaje de incorporación de BrdU
de esta línea celular. Sin embargo, el antagonista MIA-602 provoca una
reducción del 42%. En el caso de las LNCaP, todos los antagonistas disminuyen
significativamente el porcentaje de incorporación de BrdU entre 26-40%, siendo
el antagonista MIA-690 el que provoca la mayor reducción. El tratamiento con
cada uno de los antagonistas en las células PC3, provoca una reducción en la
proliferación, destacando los antagonistas MIA-602 y MIA-690 al provocar una
disminución de hasta un 50% frente a su valor control.
RWPE-1 LNCaP PC3

40 40 40
***
***
30 30 30
**
**
20 20 20 ***
** *** ***
** *** *** *** *** ***
10 10 10
Figura 28. Efecto de GHRH y sus antagonistas en la incorporación de BrdU en

células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
control tras 24 h de tratamiento. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cinco
experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 105 -
4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la proliferación

inducida por GHRH en células PC3
Para poder estudiar con que magnitud los antagonistas bloquean el efecto
producido por GHRH sobre la proliferación celular, se realiza un pre-
tratamiento de 1 hora con 0,1 µM de GHRH en células PC3, y a continuación se
trata con concentraciones crecientes de los antagonistas de GHRH y se mide
la incorporación de BrdU, tras 24 h de tratamiento. Los resultados se
representan en la figura 29, en ella se observa que los antagonistas bloquean
totalmente el efecto de GHRH sobre la incorporación de la BrdU desde 0,01
µM. Además, a partir de 0,1 µM los resultados muestran una disminución de la
proliferación con respecto al valor control (sin tratar con GHRH), lo que indica
que los antagonistas tienen también un efecto independiente de GHRH. Otro
dato interesante es el que se observa con los antagonistas de la serie MIA, ya
que estos provocan el bloqueo total a partir de 0,001 µM, concentración menor
que la de los otros antagonistas.
- 106 -
Pre-tratamiento GHRH 0,1 µ M Pre-tratamiento GHRH 0,1 µ M

40 40
***

***
30 ++ ++ 30
+++ +++ +++
+++
20 +++ 20 +++ +++
10 10
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0 10 -9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento JMR-132 (M) Tratamiento JV-1-38 (M)
Pre-tratamiento GHRH 0,1 µM Pre-tratamiento GHRH 0,1 µ M

40 40
*** (% del total de células) ***

30 +++ +++ +++ 30 +++

+++ +++ +++
+++
20 20
+++
+++
10 10
0 0
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento MIA-602 (M) Tratamiento MIA-606 (M)
Pre-tratamiento GHRH 0,1 µ M

40
***
30
+++ +++
+++
+++
20
10 +++
0
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
Tratamiento MIA-690 (M)
Figura 29. Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la incorportación de BrdU

en células PC3 pretratadas con GHRH. Los resultados se expresan en porcentaje
respecto al valor control, tras 1 h de pre-tratamiento con GHRH (0,1 μM) y 24 h de
tratamiento con los antagonistas a distintas concentraciones. Los datos corresponden a
la media ± E.S.M. de seis experimentos independientes; ***, p<0,001 con respecto al
control; ++, p<0,01; +++, p<0,001 con respecto a GHRH.
- 107 -

PCNA en células RWPE-1, LNCaP y PC3
A continuación, se evalúa como varía la expresión de una molécula

implicada directamente en la proliferación celular, PCNA, tras el tratamiento
con GHRH y sus antagonistas, en las tres líneas celulares.
En primer lugar, se realiza un ensayo tiempo-respuesta del tratamiento

con GHRH (0,1 µM) en las tres líneas celulares. Los resultados se muestran en
la figura 30; en ella se observa que las células no tumorales, RWPE-1,
incrementan la expresión de PCNA un 53%, a las 8 h; LNCaP lo hace a partir de
las 4 h, presentando un valor máximo de expresión, a las 8 h, de un 47% más
respecto a su valor control; y las células PC3 presentan una expresión de PCNA
más temprana, siendo significativo a partir de tan solo una hora de tratamiento
y manteniéndose hasta las 8 h, el valor máximo de la expresión (65%) se observa
a las 4 h.
RWPE-1
PCNA
β-Actina
175
***
**
150
(% vs. Control)
125
100
75
50
0 1 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
LNCaP PC3
PCNA PCNA
β-Actina β-Actina
175 175
***
150 *** 150 ***

(% vs. Control)
(% vs. Control)
***
125 125 **
100 100
75 75
50 50
0 2 4 8 16 24 0 1 2 4 8 16 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
- 108 -
Figura 30. Estudio cinético del tratamiento de GHRH (0,1 μM) sobre la
expresión de PCNA en células RWPE-1, LNCaP y PC3. Se realiza un ensayo de
“Western blot”. Los resultados se expresan en porcentaje respecto a su correspondiente
valor control, tras 24 h de tratamiento. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de
cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuación se determina como afectan los antagonistas a la expresión

de PCNA tras 8 h de tratamiento. Los resultados se representan en la figura 31,
en ella se observa que en las células no tumorales, RWPE-1, la expresión de
PCNA se reduce significativamente un 22% al realizar el tratamiento con el
antagonista MIA-690. En la línea celular LNCaP, el antagonista MIA-690
provoca un 32% menos de expresión del PCNA, el resto de antagonistas no
inducen cambios significativos en la proteína; sin embargo, todos los
antagonistas provocan cambios en la expresión del PCNA en las células PC3,
donde el mayor descenso se observa para el tratamiento con MIA-690, un 37%,
con respecto a su valor control.
RWPE-1 LNCaP PC3

PCNA
β-Actina
*** * ***
150 150 150
(% vs. Control)
(% v s. Control)
(% vs. Control)
100 100 100

* *
* * *
***
50 50 50
0 0 0
Figura 31. Efecto de GHRH (0,1 μM) y de sus antagonistas (0,1 μM) sobre la
expresión de PCNA en células RWPE-1, LNCaP y PC3. El efecto fue evaluado por
ensayos de “Western blot”. Los resultados se expresan en porcentaje respecto a su
correspondiente valor control tras 8 h de tratamiento. Los datos corresponden a la
media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 109 -
4.2.3 CICLO CELULAR Y APOPTOSIS EN PC3
En este apartado se estudia si GHRH o sus antagonistas provocan

variaciones en las distintas fases del ciclo celular, para a continuación
determinar si tiene efecto sobre la muerte celular por apoptosis, ambos estudios
se realizan en células de CP independiente de andrógenos, PC3. Se valora
también su efecto sobre las proteínas nucleares p53 y p21, y sobre proteínas
mitocondriales pro- y anti-apoptóticas, Bax y Bcl2, respectivamente.
4.2.3.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular
Las variaciones producidas por el neuropéptido y sus antagonistas sobre

el ciclo celular, se determinan mediante ensayos de citometría de flujo, tras
tratamientos de 8 h. En este ensayo se estudia el contenido de DNA de la célula
mediante una tinción con yoduro de propidio, de este modo, las células en fase
G1 son diploides (2n), en fase G2/M, son tetraploides (4n), la fase S es
intermedia a G1 y G2/M y por último la fase SubG0 está formada por las
células muertas con dotación menor a 2n. Los resultados de la figura 32
muestran que el tratamiento con GHRH provoca una disminución en el
porcentaje de células en fase G1 de un 28%, así como un incremento en la fase
G2/M de un 27%. En el caso de los antagonistas se observa un cambio en todas
las fases del ciclo, el más importante en la fase SubG0, donde el número de
células muertas aumenta hasta 5 veces y en la fase G2/M donde las células se
reducen algo más de la mitad, comparando con las células sin tratar. Además las
células de la fase G1 disminuyen un 20% y las de la fase S aumentan hasta un
100%. Estos interesantes resultados muestran que los antagonistas de GHRH
provocan por si solos un aumento de la muerte celular y una parada de ciclo en
la fase S, lo que justifica en parte, la disminución de la proliferación mostrada en
la figura 28.
- 110 -
G1
CONTROL G1 GHRH
130
130
SubG0
SubG0 G2/M
G2/M S
S
FL2A FL2A
130
130
G1 JMR-132 G1 JV-1-38
SubG0 SubG0
S S
G2/M G2/M
FL2A FL2A
130
130
130
MIA-602 G1
MIA-606 G1 MIA-690
G1
SubG0 SubG0 SubG0
S S S
G2/M G2/M G2/M
FL2A FL2A FL2A
SubG0
60 G1
S
*** *** *** G2/M
***
%Células / fase
*** ***
40
***
*** *** *** *** ***
20
*** *** *** *** *** ***
*** *** *** ***
0
Control GHRH JMR-132 JV-1-38 MIA-602 MIA-606 MIA-690
Figura 32. Estudio del ciclo celular tras los tratamientos con 0,1 μM GHRH y con
0,1 μM de los antagonistas de GHRH, a las 8 h. El estudio se realiza mediante
ensayos de citometría de flujo. Los resultados que aparecen en la gráfica inferior se
expresan en porcentaje de células presentes en cada fase del ciclo celular. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; ***, p<0,001
en comparación con los valores control.
- 111 -
4.2.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre el factor de

transcripción p53 en PC3
Como se ha visto en la introducción, una de las proteínas más

importantes implicadas en ciclo celular es p53. Para comprobar si las
variaciones producidas en el ciclo celular por GHRH y sus antagonistas se
deben a variaciones en los niveles de p53, se analiza su expresión tras los
correspondientes tratamientos en células PC3. Los resultados representados en
la figura 33A muestran que GHRH produce una disminución de los niveles de
mRNA de un 15% tras 30 min de tratamiento. Asimismo, se reduce un 30% la
expresión proteica de p53 tras 45 min de tratamiento, siendo mayor a los 60 min
de tratamiento (42%) (Figura 33B), comparando con los valores de células sin
tratar.
A) B)
p53 p53
β-Actina β-Actina
100
100
Niveles mRNA
(% vs. 0 min)
(% vs 0 min)
** 75 ***
80 ***
50
60
25
0 5 15 30 45 60 0 5 15 30 45 60
Figura 33. Estudio del mRNA (A) y de los niveles proteicos (B) de p53 tras el
tratamiento con 0,1 μM GHRH a diferentes tiempos en células PC3. El estudio se
realiza mediante ensayos de RT-PCR y “Western blot”, respectivamente. Los resultados
se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a la media ±
E.S.M. de cuatro experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuación, se estudia cómo afecta a los niveles de p53 el tratamiento

con los antagonistas en células PC3. En la figura 34A, se observa como solo los
- 112 -
tres antagonistas de la serie MIA producen un incremento significativo del

mRNA de p53 a los 30 min. Asimismo, JMR-132, MIA-606 y MIA-690
incrementan significativamente los niveles proteicos de p53 tras 45 min (Figura
34B).
A) B)
p53 p53
β-Actina β-Actina
150 150
* ** **
* * *
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100
50 50
0 0
Figura 34. Estudio de los niveles de mRNA (A) y proteicos (B) de p53 tras el
tratamiento con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH a 30 y 45 min,
respectivamente, en células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR y
“Western blot”, respectivamente. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
valor control. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos
independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.3.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre p21 en PC3
Se sabe que p53 regula directamente los niveles del mRNA de p21,
influyendo así sobre proteínas implicadas en ciclo celular. En este apartado se
valoran los niveles de mRNA de p21 tras el tratamiento con GHRH y sus
antagonistas, mediante ensayos de RT-PCR. Los resultados de la figura 35A
muestran que el neuropéptido disminuye un 27% los niveles de p21 tras 2 h de
tratamiento. Por el contrario, los antagonistas JV-1-38 y MIA-690
incrementan un 38% los niveles de p21 tras 2 h de tratamiento (Figura 35B).
- 113 -
A) B)
p21 p21
β-Actina β-Actina
150
** ***
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
100
50
Figura 35. Efecto de los tratamientos con 0,1 μM de GHRH (A) a diferentes
tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, sobre los niveles
de mRNA de p21 en células PC3 El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.3.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre las proteínas Bcl2 y

Bax implicadas en apoptosis en PC3
La variación del número de células observada en los estudios de

proliferación y ciclo celular tras tratar con los antagonistas apunta como una
posible causa a la muerte programada (apoptosis). Por ello, en este apartado se
estudia si el tratamiento con GHRH o con sus antagonistas afecta a la apoptosis
celular, analizando los niveles de expresión de las proteínas Bax (pro-
apoptótica) y Bcl2 (anti-apoptótica), en células PC3.
Los resultados de la figura 36A muestran que tras 16 h de tratamiento

con el neuropéptido disminuyen los niveles de Bax y aumentan los de Bcl2.
Además, el ratio de ambas moléculas (Bax/Bcla2) es menor lo que supone una
disminución de la apoptosis. Por el contrario, el tratamiento con los
antagonistas (Figura 36B) induce una disminución en la expresión de Bcl2
- 114 -
junto con un aumento de Bax, provocando un incremento en el valor del ratio

Bax/Bcl2, lo que indica un aumento en la apoptosis celular.
A) Bax B) Bax
Bcl2 Bcl2
β-Actina β-Actina
2,0
***
**
Ratio BAX / BCL2

1,5
*
1,0
0,5
tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 16 h, sobre los
niveles de Bax y Bcl2 en células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de
“Western blot”. Los resultados se expresan como ratio de Bax/Bcl2. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001, respecto a tiempo 0 (A) y al control (B).
4.2.4 ADHESIÓN CELULAR
Otro proceso importante en el estudio de la progresión tumoral es la

adhesión celular, que mide la capacidad que presentan las células para adherirse
a la matriz extracelular e impedir su migración. Para evaluar este fenotipo se
realizan ensayos tiempo-respuesta de adhesión a un fondo de colágeno tipo I,
tras los diferentes tratamientos. Se estudia además el efecto sobre las proteínas
E-cadherina y β-catenina, marcadoras del fenotipo de adhesión.
- 115 -
4.2.4.1 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la adhesión celular de

RWPE-1, LNCaP y PC3
Los resultados de la figura 37 muestran que el tratamiento con GHRH

provoca una disminución de la adhesión en las tres líneas celulares. El valor de
la absorbancia encontrado solo es significativo para la línea celular PC3, donde
se reduce en un 42% desde los 10 min de tratamiento. Por otro lado, los
tratamientos con los antagonistas provocan, en las tres líneas celulares, un
incremento significativo de la adhesión a colágeno, de modo tiempo-
dependiente, alcanzando un valor máximo a los 80 min. (Densidad óptica vs. Control)
(Densidad óptica vs. Control)
Control Control
0,15 0,15
GHRH MIA-602
Adhesión celular
Adhesión celular
JMR-132 MIA-606
***
0,10 *** *** JV-1-38 0,10 *** ** MIA-690
*** GHRH
***
RWPE-1 *** ** *** ***
***
0,05 *** 0,05 *** *
*** ***
****** ***
*
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
*** Control Control

0,15 0,15 ***
GHRH GHRH
Adhesión celular
*** ***
Adhesión celular
* JMR-132 MIA-602
0,10 JV-1-38 0,10 *** MIA-606
***
LNCaP *** MIA-690
**
0,05 0,05
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
CTRL
0,15 GHRH ***

0,15
JMR132 Control
***
Adhesión celular
*** *** JV-1-38

*** *** GHRH
***
Adhesión celular
*** MIA-602
0,10 *** ***
*** 0,10 *** *** MIA-606
PC3 ***
** ** MIA-690
***
0,05 *** ***
0,05
*** *** ***
*** *** *** *** ***
***
****** *** ***
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (min)
Tiempo (min)
- 116 -
Figura 37. Efecto de GHRH (0,1 μM) y sus antagonistas (0,1 μM), sobre la
adhesión celular a colágeno en células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto a su correspondiente valor control. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de diez experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
A modo comparativo se muestra en la figura 38 el efecto sobre la

adhesión de las tres líneas celulares, tras el tratamiento con los péptidos durante
80 min. Los datos indican que las células RWPE-1 son las que presentan mayor
adhesión celular con el antagonista JV-1-38 (96%), seguido de cerca por el resto
de antagonistas (entre 58 y 86% de aumento en la adhesión celular con respecto
al control). Los resultados en las LNCaP indican que el tratamiento con los
antagonistas de GHRH provoca un aumento de la adhesión celular entre 47% y
87%, siendo el antagonista JV-1-38 el que presentó un mayor incremento, al
igual que ocurre con los resultados obtenidos en las células RWPE-1. Para las
PC3 las diferencias entre las células tratadas y no tratadas fueron de hasta un
84% de incremento en la adhesión celular, obteniendo el mayor valor tras el
tratamiento con el antagonista MIA-690.
RWPE-1 LNCaP PC3

0,15 0,15 *** *** ***

*** 0,15
*** ***
*** *** *** *** ***
Adhesión celular
Adhesión celular
***
Adhesión celular
** ** ***
0,10 0,10 0,10
0,05 0,05 0,05 ***
0 0 0
Figura 38. Efecto de GHRH (0,1 μM) y sus antagonistas (0,1 μM) en la adhesión a
colágeno de células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto a su correspondiente valor control tras 80 min de tratamiento. Los
datos corresponden a la media ± E.S.M. de diez experimentos independientes; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
- 117 -
4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de E-

cadherina en células RWPE-1, LNCaP y PC3.
Tras comprobar las variaciones en la adhesión celular producidas por

GHRH y sus antagonistas, se estudia si dichas variaciones afectan a E-
cadherina, proteína marcadora de la adhesión, en sentido inverso, es decir, que
un aumento de E-cadherina supone una menor adhesión, y viceversa.
Se tratan las células a diferentes tiempos con GHRH (0,1 μM), y se

valoran los niveles de E-cadherina por “Western blot”. Los resultados
representados en la figura 39 indican que la línea celular no tumoral, RWPE-1,
no presenta variación en la expresión de la proteína E-cadherina para ninguno
de los tiempos examinados. Sin embargo, las líneas celulares tumorales, LNCaP
y PC3, muestran una disminución significativa de los niveles de E-cadherina.
Las primeras sufren una reducción del 38% a las 4 h de tratamiento que se
mantiene hasta las 8 h. En las PC3, la hormona provoca a partir de las 2 h una
mayor disminución, llegando hasta un 70% a las 8 h, comparando con los
valores controles.
- 118 -
RWPE-1
E-cadherina
β-Actina
100
80
(% vs. 0 h)
60
40
20
0
0 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
LNCaP PC3
E-cadherina E-cadherina
β-Actina β-Actina
100 100
*
80 * 80
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
** *
60 60
***
40 40 ***
20 20
0 0
0 2 4 8 16 24 0 2 4 8 16 24
Figura 39. Efecto de GHRH (0,1 μM) en la expresión de la proteína E-cadherina

en células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados medidos por “Western blotting” se
expresan en porcentaje respecto al valor del tiempo cero para cada línea celular. Los
datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuación, se evalúa el efecto sobre la expresión de E-cadherina, tras

el tratamiento con los antagonistas, a los tiempos en los que GHRH provoca un
mayor descenso en los niveles de E-cadherina. Los resultados que se observan
en la figura 40 muestran que en las células RWPE-1, tras 8 h de tratamiento,
solamente el antagonista MIA-690 provoca un aumento significativo de un 25%.
Las células LNCaP muestran un incremento significativo de los niveles de E-
cadherina, tras 4 h de tratamiento con JMR-132 y MIA-690 (18% y 22%,
respectivamente). En las células PC3, el incremento de la E-cadherina es
- 119 -
bastante acusado llegando a un 72% para células tratadas con el MIA-690, por
encima de los niveles de la proteína en células sin tratar, tras 8 h de tratamiento.
RWPE-1 LNCaP PC3
E-cadherina
β-Actina
200 200 200

***
150 ** **
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
150 150
* ** **
100 ** 100 ** 100
50 50 50
***
0 0 0
Figura 40. Efecto de GHRH (0,1 μM) y sus antagonistas (0,1 μM) en la expresión de
la proteína E-cadherina en células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados medidos por
“Western blotting” se expresan en porcentaje respecto al valor control para cada línea
celular. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos
Por último, se analiza a diferentes tiempos el comportamiento del

antagonista con mayor efecto, MIA-690, sobre la expresión de la E-cadherina.
En la figura 41, se muestra que en las células no tumorales, RWPE-1, el
antagonista provoca un aumento significativo (24%) en los niveles de E-
cadherina a las 8 h de tratamiento. En las LNCaP se produce un 26% de
incremento en la expresión de la proteína a las 4 h que prácticamente se
mantiene hasta las 24 h. El efecto más acusado se observa en las células PC3
donde se produce un aumento de hasta un 43% a las 24 h del tratamiento con
MIA-690, en comparación con los valores controles.
- 120 -
RWPE-1
E-cadherina
β-Actina
LNCaP PC3
E-cadherina E-cadherina
β-Actina β-Actina
Figura 41. Estudio cinético del tratamiento con el antagonista MIA-690 (0,1 μM)
sobre los niveles de expresión de la proteína E-cadherina en células RWPE-1,
LNCaP y PC3. Los resultados medidos por “Western blotting” se expresan en
porcentaje respecto al valor control para cada línea celular. Los datos corresponden a la
media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de β-

catenina en células RWPE-1, LNCaP y PC3.
Como se ha visto en la introducción, E-cadherina está directamente

relacionada con β-catenina en el interior celular. La reducción que provoca
GHRH sobre los niveles de E-cadherina puede afectar a la localización de β-
catenina. Para poder estudiar esta posible interacción, se valora la expresión de
- 121 -
β-catenina por “Western blot”, realizando un ensayo tiempo-respuesta con

GHRH (0,1 μM) en las tres líneas celulares.
Los resultados representados en la figura 42 muestran los niveles de

expresión de β-catenina tras distintos tiempos de tratamiento con 0,1 μM de
GHRH en lisados celulares totales. En ellos se observa que la expresión de la
proteína no varía significativamente en el caso de las células RWPE-1 en
ninguno de los tiempos evaluados. Por el contrario, los niveles de β-catenina
aumentan significativamente en ambas líneas celulares tumorales a partir de las
2 h de tratamiento. En LNCaP el valor máximo en la expresión de la proteína se
produce a las 8 h (21%), mientras que en PC3 es a las 2 h de tratamiento (29%),
en comparación con los valores controles, correlacionándose estos efectos con la
disminución producida en la E-cadherina.
RWPE-1
β-catenina
β-Actina
LNCaP PC3
β-catenina β-catenina
β-Actina β-Actina
- 122 -
Figura 42. Estudio cinético del tratamiento con GHRH (0,1 μM) sobre los niveles
de expresión de β-catenina en células RWPE-1, LNCaP y PC3. Los resultados
medidos por “Western blot” se expresan en porcentaje respecto al valor control para
cada línea celular. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos
A continuación, se valora el efecto de los antagonistas sobre la expresión

de β-catenina a las 8 y 2 h, para LNCaP y PC3, respectivamente. Como se
observa en la figura 43, todos los antagonistas reducen la expresión de β-
catenina en ambas líneas celulares. En las células LNCaP los antagonistas JMR-
132 y JV-1-38 provocan la mayor reducción de hasta un 37%. Por otro lado, en
PC3, los antagonistas de la serie MIA reducen más acusadamente la expresión
de la proteína alrededor de un 42%, comparando con los valores controles.
LNCaP PC3
β-catenina
β-Actina
100 100
** ** * *
(% vs. Control)
(% vs. C ontrol)
*
*** *** *** *** ***
50 50
0 0
Figura 43. Efecto del tratamiento con los antagonistas de GHRH (0,1 μM) sobre
los niveles de β-catenina en células LNCaP y PC3. Se realizan ensayos de “Western
blot”, tras 8 y 2 h de tratamiento en LNCaP y PC3, respectivamente. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control para cada línea celular. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
- 123 -
La localización subcelular de la β-catenina es clave en su señalización

celular, por ello se analiza su expresión en citosol y en núcleo tras el tratamiento
con GHRH y sus antagonistas. Para este objetivo se selecciona la línea celular
PC3, en la que se produce un mayor incremento de la expresión de β-catenina
tras el tratamiento con GHRH. Los resultados de la figura 44A, muestran como
a medida que disminuye la expresión citosólica de β-catenina aumenta la
nuclear, tras el tratamiento con el neuropéptido. Por otro lado, se analiza si los
antagonistas son capaces de realizar la acción contraria, tras 8 h de tratamiento.
Como se muestra en la figura 44B, exceptuando al MIA-606, los antagonistas
provocan un aumento de la expresión citosólica junto con una disminución de la
nuclear.
A) Citosoles Núcleos
β-catenina
β-Actina
150 150 ***

** * *
125 125
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
100 100
** *** ***
75 75
50 50
0 0,5 1 2 4 8 16 24 00,51 2 4 8 16 24
B) Citosoles Núcleos
β-catenina
β-Actina
150 150
*** ***
** **
(% vs. Control)
(% vs. Control)
100 100
*** *** ** ***
50 50
0 0
- 124 -
Figura 44. Efecto de los tratamientos con 0,1 μM GHRH (A) a diferentes tiempos
y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 8 h, sobre la localización
subcelular de la proteína β-catenina en células PC3. Los resultados medidos por
“Western blotting” se expresan en porcentaje respecto al valor control para cada línea
celular. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cinco experimentos

CD44, c-Myc y Ciclina D1 en células PC3.
El aumento de β-catenina en el núcleo de las células PC3 puede inducir la

transcripción de genes diana como CD44, c-myc y ciclina D1. Por ello, se analizan
los níveles de mRNA de dichos genes mediante un ensayo de RT-PCR tiempo-
respuesta tratando las células PC3 con GHRH (0,1 µM). Los resultados
representados en la figura 45A muestran que tras el tratamiento se produce un
aumento tiempo-dependiente en los niveles de mRNA de los tres genes
evaluados, siendo máximo para CD44 y ciclina D1 a las 2 h (22-24%). Hay que
destacar que los niveles de c-myc varían de una forma más notable tras el
tratamiento con el neuropéptido. Así, se observa un incremento en los niveles de
mRNA a partir de los 15 min, con un 46% como valor máximo a las 6 h.
A continuación, se estudia el efecto de los antagonistas sobre los genes

diana tras 2 h de tratamiento (Figura 45B). En los resultados se observa que los
antagonistas reducen los niveles de mRNA de los tres genes diana de manera
muy significativa. El tratamiento más efectivo fue con el antagonista MIA-690
que disminuye los niveles de los tres genes por debajo de un 50%, comparando
con los valores control.
- 125 -
A)
CD44 c-myc ciclina D1
β-Actina β-Actina β-Actina
150 ** 150
150
*
Nivel de mRNA
* *
Nivel de mRNA
Nivel de mRNA
* *
(% vs. 0 h )
* * *
(% vs. 0 h )
(% vs. 0 h )
100 100 100
50 50 50
0 0,25 0,5 1 2 4 6 0 0,25 0,5 1 2 4 6 0 0,250,5 1 2 4 6
Tiempo (h) Tiempo (h) Tiempo (h)
B)
CD44 c-myc ciclina D1
β-Actina β-Actina β-Actina
100 100
100
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
Niveles demRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
**
**
* * * *** ***
50 50 50 ***
** ** ***
*** ***
0 0 0
tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, sobre los niveles
de mRNA de CD44 , c-myc y ciclina D1 , en células PC3. El estudio se realiza
mediante ensayos de RT-PCR. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al
valor control para cada línea celular. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de
cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.5 MIGRACIÓN CELULAR.
La migración celular es uno de los procesos más importantes en la

progresión tumoral prostática. Por ello, evaluamos la capacidad migratoria de
las células RWPE-1 y PC3 tras ser tratadas con GHRH y sus antagonistas,
mediante un ensayo de cierre de heridas tal como se indica en materiales y
métodos. Los resultados mostrados en la figura 46, indican como en las células
no tumorales, RWPE-1, GHRH provoca un cierre de herida más rápido que en
las células no tratadas, y todos los antagonistas retrasan el cierre de la herida.
- 126 -
En las células PC3 (Figura 47) el efecto de los tratamientos es más

acusado. Tras 24 h en presencia del neuropéptido se produce un cierre total,
mientras en las células no tratadas se mantiene casi un 25% de la herida sin
cerrar. Por el contrario, el tratamiento con los antagonistas provoca un mayor
retraso en la migración de las células PC3, dejando alrededor de un 50% de la
herida sin cerrar tras 24 h.
- 127 -
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
75 **
Control
(% vs. 0 h)
***
50
25
Control ***
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
75 ***
(% vs. 0 h)
GHRH 50 ***
25
GHRH
0 ***
0h 4h 8h 24 h
100
**
Migración celular
75 ***
(% vs. 0 h)
JMR-132 50 ***
25 JMR-132
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migración celular
75 ***
(% vs. 0 h)
JV-1-38 50 ***
25 JV-1-38
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migración celular
75 ***
(% vs. 0 h)
MIA-602 50 ***
25 MIA-602
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migración celular
75
(% vs. 0 h)
***
MIA-606 50 ***
25 MIA-606
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
75 ***
MIA-690
(% vs. 0 h)
***
50
25 MIA-690
0
0h 4h 8h 24 h
0h 4h 8h 24 h
100 100 100 100
Migración celular
*
(% vs. Control)
80
Migración celular
Migración celular
Migración celular
75
(% vs. Control)
75 *
(% vs. Control)
75
(% vs. Control)
* * *
60 ***
50 ***
50 50 ** * *
40
25 25 25
20
0 0 0 0 ***
Figura 46. Microfotografías representativas del cierre de herida producido tras los
tratamientos con 0,1 μM de GHRH y con 0,1 μM de sus antagonistas, a diferentes
tiempos en células RWPE-1. Las fotografías se toman en un microscopio invertido
(20X). En la parte de la derecha se representan los porcentajes de cierre de la herida que
cada tratamiento provoca a distintos tiempos. En la parte inferior de la figura se
- 128 -
comparan los diferentes tratamientos realizados en cada uno de los tiempos evaluados.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control o el valor a las 0 h.
Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de seis experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
** ***
75
Control
(% vs. 0 h)
50
Control ***
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
75 **
(% vs. 0 h)
GHRH 50
GHRH
25
***
0
0h 4h 8h 24 h
100
*
Migración celular
75
(% vs. 0 h)
***
JMR-132 50
JMR-132
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
**
75
(% vs. 0 h)
50 ***
JV-1-38 25 JV-1-38
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
**
75
(% vs. 0 h)
50 ***
MIA-602 25 MIA-602
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
75
(% vs. 0 h)
***
MIA-606 50
MIA-606
25
0
0h 4h 8h 24 h
100
Migración celular
**
75
MIA-690
(% vs. 0 h)
***
50
25
MIA-690
0
0h 4h 8h 24 h
0h 4h 8h 24 h
100 100 100 100
Migración celular
Migración celular
Migración celular
Migración celular
80
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
(% vs. Control)
75 75 75
60 *
50 50 50
40
25 20 25 25
***
0 0 0 0
- 129 -
Figura 47. Microfotografías representativas del cierre de herida producido tras los
tratamientos con 0,1 μM de GHRH y con 0,1 μM de sus antagonistas, a diferentes
tiempos en células PC3. Las fotografías se toman en un microscopio invertido (20X).
En la parte de la derecha se representan los porcentajes de cierre de la herida que cada
tratamiento provoca a distintos tiempos. En la parte inferior de la figura se comparan los
diferentes tratamientos realizados en cada uno de los tiempos evaluados. Los resultados
se expresan en porcentaje respecto al valor control o el valor a las 0 h. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de seis experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001.
4.2.6 DEGRADACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR.
Las metaloproteasas son las encargadas de degradar la matriz

extracelular y así las células tumorales inician el proceso metastásico. En este
apartado, se valora la actividad gelatinolítica y la expresión de dos de las
metaloproteasas más implicadas en dicho proceso, MMP9 y MMP2, en la línea
celular PC3, representativa del estadio más avanzado del CP. La actividad
gelatinolítica se determina mediante ensayos de zimografía y, la expresión de
mRNA mediante RT-PCR, en ambos casos tras el tratamiento con GHRH o sus
antagonistas.
Los resultados de la figura 48A, muestran un incremento en la actividad

gelatinolítica de ambas metaloproteasas tras 2 h de tratamiento con GHRH. La
pro-MMP9 aumenta hasta un valor máximo de 43% a las 2 h, mientras que, la
pro-MMP2 lo hace hasta un 90% a las 4 h de tratamiento, comparando ambas
con los valores controles. Por otro lado, en la figura 48B se observa que se
reduce la actividad gelatinolítica de ambas pro-MMPs tras 2 h de tratamiento
con los antagonistas. MIA-690 es el antagonista de GHRH que provoca una
disminución más acusada en ambas pro-MMPs, de hasta un 40%. Las formas
activas de las MMPs no se aprecian lo suficiente como para analizar posibles
variaciones de las mismas.
- 130 -
A)
Pro-MMP9 Pro-MMP2
***
175 200
Actividad gelatinolítica
**
150 ***
** * ***
(% vs. 0 h)
150
(% vs. 0 h)
125
100 100
75
50
50
0 2 4 8 16 24
0 2 4 8 16 24
Tiempo (h)
Tiempo (h)
B)
Pro-MMP9 Pro-MMP2
100 100
* *
** ***
(% vs. Control)
***
(% vs. Control)
*** *** *** ***

50 50
0 0
Figura 48. Actividad gelatinolítica tras los tratamientos con 0,1 μM de GHRH (A)
a diferentes tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 2 h, en
células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de zimografía. Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control para cada línea celular. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05;
**, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuación se estudian los niveles de mRNA de ambas

metaloproteasas tras el tratamiento con GHRH y se compara el efecto de sus
antagonistas. Los resultados mostrados en la figura 49A muestran que tras el
tratamiento con GHRH se produce un significativo incremento a los 45 min
para el mRNA de MMP9 y MMP2, y a los 15 min para MMP2. Por el
contrario, tras 45 min de tratamiento con los antagonistas el mRNA de ambas
- 131 -
metaloproteasas disminuye (Figura 49B), siendo, de nuevo, el MIA-690 el

tratamiento más efectivo.
A)
MMP9 MMP2
β-Actina β-Actina
B)
MMP9 MMP2
β-Actina β-Actina
100 100
**
Niveles de mRNA
Niveles de mRNA
**
(% vs. Control)
(% vs. Control)
** ** ***
50 50
0 0
tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 45 min, sobre los
niveles de mRNA de MMP9 y MMP2 en células PC3. El estudio se realiza mediante
ensayos de RT-PCR. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control.
Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *,
p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 132 -
4.2.7 NEURODIFERENCIACIÓN.
La neurodiferenciación es un proceso implicado en la progresión del CP

hacia la independencia androgénica. Por ello, en este apartado evaluamos como
puede afectar a dicho proceso GHRH y su antagonista más efectivo, MIA-690.
Para este estudio se utilizan las células LNCaP, ya que se conoce que se
diferencian morfológicamente y es fácilmente reconocible mediante la
visualización de neuritas.
Para evaluar si el tratamiento con GHRH y MIA-690 provoca

alteraciones en la morfología de las células LNCaP, se realizan microfotografías
tras 1 h de tratamiento con GHRH y MIA-690, y se contabilizan las neuritas
que tengan el doble de la longitud del cuerpo de la célula sobre un total de 200
células. En los resultados de la figura 50 se observa como GHRH induce la
formación de neuritas en un 90% de las células. Sin embargo, el antagonista
MIA-690 no provoca la alteración morfológica de las células. Además, se realiza
un pre-tratamiento de 1 h con GHRH y a continuación se trata con MIA-690
1 h, observando la aparición de un 10% de neuritas lo que indica que el
antagonista produce un bloqueo de la neurodiferenciación inducida por el
neuropéptido. Las células LNCaP se neurodiferencian en ausencia de suero, lo
que se utiliza como control positivo.
- 133 -
CONTROL GHRH
MIA-690 GHRH+MIA-690
-FBS 24 h
Figura 50. Efecto del tratamiento con 0,1 μM de GHRH y 0,1 μM de MIA-690,
sobre la neurodiferenciación en células LNCaP. Se incluye un control positivo de la
neudiferenciación ya conocido como es mantener las células sin suero durante 24 h. Las
microfotografías se toman en un microscopio invertido (20X). Las imágenes son
representativas de un total de tres experimentos.
- 134 -
4.2.8 ANGIOGÉNESIS
El VEGF es uno de los factores pro-angiogénicos más importantes

implicados en progresión tumoral; por ello, se estudia el efecto que producen
GHRH y sus antagonistas sobre la producción y liberación de este factor en
células PC3 de cáncer avanzado de próstata. En primer lugar, se valoran
mediante ELISA los niveles de VEGF165 liberado por las células al medio
extracelular tras el tratamiento con GHRH a diferentes tiempos. En la figura
51A se muestra como la hormona provoca un incremento de hasta un 52% de
VEGF liberado por las células a las 24 h, comparando con el valor control. A
continuación se valora el efecto que ejercen los antagonistas de GHRH sobre la
liberación de VEGF tras 24 h de tratamiento. Los resultados de la figura 51B
indican que solo los antagonistas de GHRH reducen los niveles de VEGF con
respecto al valor control, entre un 17% y un 29%.
A) B)
*** 100
160
VEGF165 (% vs. 0 h)
**
***
(% vs. Control)
*** *** ***

140
VEGF165
120 50
100
80 0
0 4 8 16 24 48 72
Tiempo (h)
Figura 51. VEGF165 secretado tras los tratamientos con 0,1 μM de GHRH (A) a
diferentes tiempos y con 0,1 μM de los antagonistas de GHRH (B) tras 24 h en
células PC3. El estudio se realiza mediante ELISA. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto al valor control para cada línea celular. Los datos corresponden a la
media ± E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001.
- 135 -
4.3 EFECTO DE GHRH Y SUS ANTAGONISTAS SOBRE LA VÍA

DEL EGF.
La importancia de los miembros de la familia HER en la tumorigénesis

está muy bien documentada actualmente. En este apartado se estudia la
interconexión entre GHRH y dos de los miembros más importantes de la
familia HER, EGFR y HER2, evaluando la posible transactivación de ambas
vías entre sí, en la línea celular PC3 de cáncer de próstata independiente de
andrógenos.
4.3.1 EXPRESIÓN Y ACTIVACIÓN DE EGFR Y HER2.
La valoración del efecto de GHRH sobre la expresión y activación de

HER2 y EGFR se realiza mediante ensayos de “Western blot” en células PC3 a
diferentes tiempos. Los resultados de la figura 52 muestran como la expresión
de los receptores aumenta tras el tratamiento con el neuropéptido a los 30-60
min, para EGFR, y a los 45-120 min, para HER2. Además, GHRH incrementa
la fosforilación de HER2 y EGFR a los 30 s (activación temprana) y 30 min
(activación tardía) de tratamiento, comparando con los valores controles de
células sin tratar.
EGFR HER2
p-EGFR p-HER2
β-Actina β-Actina
#
150 ** 150 ** ##
** *** #
125 125
(% vs. 0 h)
(% vs. 0 h)
#
100 100
75 EGFR 75 HER2
p-EGFR p-HER2
50
50
0,5 5 15 30 45 60 120
0,5 5 15 30 45 60 120
Tiempo (min)
Tiempo (min)
- 136 -
Figura 52. Efecto del tratamiento con 0,1 μM de GHRH a diferentes tiempos
sobre los niveles de HER2 y EGFR, y su fosforilación en células PC3. El estudio se
realiza mediante ensayos de “Western blot”. Los resultados se expresan en porcentaje
respecto al correspondiente valor control. Los datos corresponden a la media ± E.S.M.
de cinco experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, para EGFR y HER2; #,
p<0,05; ##, p<0,01, para p-EGFR y p-HER2.
A continuación se comprueba si los antagonistas de GHRH, JMR-132 y

JV-1-38, y el más efectivo de la serie MIA, el MIA-690, bloquean la
transactivación inducida por GHRH. Los resultados muestran que los
antagonistas bloquean totalmente la fosforilación inducida por el neuropéptido a
los 30 s y 30 min para ambos receptores, EGFR y HER2 (Figura 53A y B,
respectivamente).
- 137 -
p-EGFR
30 s
30 min
β-Actina
150 ** **
30 s
(% vs. C ontrol)
125 30 m
#
100 ##
### ### ## ###
75
50
25
0
0,1 µM GHRH - + - - - + + +
0,1 µM JMR-132 - - + - - + - -
0,1 µM JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 µΜ MIA-690 - - - - + - - +
p-HER2
30 s
30 min
β-Actina
150
*****
30 s
30 m
(% vs. Control)
# ###
100 ###
### ### ###
50
0
0,1 µM GHRH - + - - - + + +
0,1 µM JMR-132 - - + - - + - -
0,1 µM JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 µΜ MIA-690 - - - - + - - +
Figura 53. Efecto producido por los antagonistas JMR-132, JV-1-38 y MIA-690 en
la transactivación de EGFR (A) y HER2 (B) inducida por GHRH en células PC3.
Las células se pre-tratan durante 30 min con 0,1 μM de los antagonistas, y luego se
tratan con 0,1 μM de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
ensayos de “Western blot”. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor
control en los correspondientes tiempos. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de
cinco experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al control; #,
p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001, respecto a las células tratadas con GHRH.
- 138 -
4.3.2 HETERODIMERIZACIÓN DE EGFR-HER2.
Los receptores de la familia HER dimerizan cuando son activados por sus
ligandos; por ejemplo, se sabe que EGFR suele dimerizar con HER2. Por tanto,
es posible que GHRH transactive a EGFR y este a su vez fosforile a HER2
activándolo, formándose así el heterodímero. Para comprobarlo, se pre-tratan
las células con un inhibidor de EGFR, AG-1478 (10 μM) o de HER2, AG-825
(10 μM), durante 30 min; después, se estimulan las células durante 30 s y 30 min
con GHRH, y se realiza la inmunodetección de HER2 fosforilado.
En la figura 54 se observa que la inhibición de EGFR hace que el

tratamiento con GHRH no sea capaz de activar HER2, con lo cual se deduce que
GHRH primero activa a EGFR y este, a su vez, activa a HER2. Además, tras
inhibir de forma específica HER2, el neuropéptido es capaz de incrementar el
nivel de HER2 fosforilado, posiblemente a través de la activación de EGFR.
p-HER2
30 s
30 min
β-Actina
150
** *** 30 s
30 min
### ##
(% vs. Control)
100
50 *** ***
0
0.1 µM GHRH - + - - + +
10 µM AG1478 - - + - + -
10 µM AG825 - - - + - +
- 139 -
Figura 54. Efecto de 0,1 μM de GHRH sobre la heterodimerización de EGFR y

HER2 en células PC3. Las células se pre-tratan durante 30 min con 0,1 μM de los
inhibidores de EGFR, AG-1478 (10 μM), y de HER2, AG-825 (10 μM), durante 30 min,
y luego se tratan con 0,1 μM de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza
mediante ensayos de “Western blot” con un anticuerpo específico de HER2 fosforilado.
Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control a los tiempos
correspondientes. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos
independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, comparando con el valor control; ##, p<0,01;
###, p<0,001, respecto a los valores de células tratadas con AG-825.
4.3.3 VÍAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN LA

TRANSACTIVACIÓN DE EGFR Y HER2 MEDIADA POR GHRH
Como se ha visto en la introducción, los receptores de la familia HER

pueden ser transactivados siguiendo distintas vías de señalización que pueden
ser dependientes o no de ligando. En este apartado se analiza la posible vía de
señalización que sigue GHRH en la transactivación de los receptores de la
familia HER.
4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivación de EGFR y

HER2 por GHRH
Entre los mediadores intracelulares que pueden estar implicados en la

transactivación independiente de ligando se encuentran PKA y Src. Para
evaluar si estas moléculas están implicadas en la transactivación de EGFR y
HER2 inducida por GHRH, se emplea un inhibidor de PKA, H89 (10 μM), y de
Src, PP2 (10 μM), durante 15 min y 90 min, respectivamente.
Las células se pre-tratan con H89 durante 15 min o PP2 durante 90 min,
y se incuban con GHRH (0,1 μM) durante 30 s y 30 min, y posteriormente se
analiza la activación de EGFR y HER2. Como se observa en la figura 55, la
activación de EGFR y HER2 producida por GHRH es inhibida por H89 y PP2 a
los 30 s de tratamiento, pero no a los 30 min. Estos resultados implican a PKA y
- 140 -
Src en la activación temprana de EGFR y HER2. Los inhibidores H89 y PP2,

por sí solos, no provocaban cambios en los niveles de fosforilación de ambos
receptores.
p-EGFR
30 s
30 min
β-Actina
**
150 **
(% vs. Control)
30 s
100 #
## 30 min
50
0
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM H89 - - + - + -
10 µM PP2 - - - + - +
p-HER2
30 s
30 min
β-Actina
150
** ***
30 s
(% vs. Control)
30 min
100 ###
###
50
0
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM H89 - - + - + -
10 µM PP2 - - - + - +
Figura 55. Efecto del pre-tratamiento con los inhibidores de PKA y Src sobre la
activación de EGFR y HER2 producida por GHRH (0,1 μM) a los 30 s y 30 min en
células PC3. Las células se pre-tratan con 10 μM de H89 durante 15 min, y con 10 μM
de PP2 durante 90 min, y luego se tratan con 0,1 μM de GHRH durante 30 s y 30 min.
El estudio se realiza mediante ensayos de “Western blot” con un anticuerpo específico
- 141 -
contra EGFR y HER2 fosforilados. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al

valor control a los tiempos correspondientes. Los datos corresponden a la media ±
E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al valor
control de células sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001, respecto a los valores de
células tratadas con GHRH.
4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activación de

pSrc
Como hemos visto en el anterior apartado, Src es una de las moléculas

implicada en la vía de transactivación de EGFR y HER2 mediada por GHRH.
Por ello, mediante un ensayo de “Western blot”, con un anticuerpo específico
contra Src fosforilado en la Tyr 416, evaluamos si el neuropéptido activa dicha
proteína.
Los resultados de la figura 56 muestran que GHRH incrementa los

niveles de p-Src desde los 30 s, con una estimulación máxima a los 30 min y 2 h
de tratamiento.
- 142 -
0,1 mM GHRH. Tiempo

Control 0,5’ 5’ 15’ 30’ 45’ 60’
p-Src
β-Actina
Control 2 h 4h 8h
p-Src
β-Actina
Control 16 h 24 h
p-Src
β-Actina
Figura 56. Efecto de 0,1 μM de GHRH sobre la activación a diferentes tiempos de

Src en células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de “Western blot” con un
anticuerpo específico contra Src fosforilado en la Tyr 416. Los resultados se expresan en
porcentaje respecto al valor de células no tratadas. Los datos corresponden a la media ±
E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.
A continuación, se estudia la participación de los receptores de GHRH en

la activación de Src, mediante el bloqueo de los mismos con los antagonistas
JMR-132, JV-1-38 y MIA-690, a los 30 s y 30 min, tiempos a los que GHRH
transactiva EGFR y HER2. Los resultados de la figura 57 indican que los
antagonistas utilizados bloquean la activación de Src mediada por GHRH,
implicándolos directamente en dicha activación.
- 143 -
p-Src
30 s
30 min
β-Actina
150
** 30 s
* 30m
(% vs. Control)
100
# ## ## ## ##
##
50
0
0,1 µM GHRH - + - - - + + +
0,1 µM JMR-132 - - + - - + - -
0,1 µM JV-1-38 - - - + - - + +
0,1 µM MIA-690 - - - - + - - +
Figura 57. Efecto de los antagonistas de GHRH (0,1 μM) sobre la activación de
Src producida por GHRH (0,1 μM) a los 30 s y 30 min de tratamiento en células
PC3. Las células se pre-tratan durante 30 min con 0,1 μM de los antagonistas, y luego
se tratan con 0,1 μM de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
ensayos de “Western blot” con un anticuerpo específico contra Src fosforilado en la Tyr
416. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de cuatro experimentos independientes; *, p<0,05; **,
p<0,01, respecto al valor control de células sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01, respecto a
los valores de células tratadas con GHRH.
4.3.3.3 Implicación de las metaloproteasas en la transactivación de

EGFR y HER2 por GHRH.
En relación a la vía de transactivación dependiente de ligando se sabe que

las metaloproteasas son capaces de liberar pro-ligandos que se unen a los
receptores de EGFR y HER2 activándolos. Para comprobar si este mecanismo
puede estar implicado en la transactivación de EGFR y HER2 inducida por
- 144 -
GHRH, se emplea un inhibidor general de metaloproteasas, GM6001 (10 μM),

y uno específico de las ADAMs, TAPI-1 (10 μM), durante 1 h para ambos
inhibidores.
Para estudiar dicho proceso, las células se pre-tratan con los inhibidores
durante 1 h, luego se tratan con GHRH (0,1 μM) durante 30 s y 30 min, y
posteriormente se analiza la activación de EGFR y HER2. En la figura 58
observamos que GM6001 y TAPI-1 inhiben la activación de los receptores
producida por GHRH a los 30 min, sin encontrar cambios a los 30 s de
tratamiento. Estos resultados indican que GHRH induce la transactivación
tardía a través de las MMPs. Los inhibidores GM6001 y TAPI-1, por sí solos,
no provocaban cambios en los niveles de fosforilación de ambos receptores.
- 145 -
p-EGFR
30 s
30 min
β-Actina
**
150 ** 30 s
30 min
(% vs. Control)
# ##
100
50
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM GM6001 - - + - + -
10 µM TAPI-I - - - + - +
p-HER2
30 s
30 min
β-Actina
150 *** 30 s
** 30 min
(% vs. Control)
100
###
###
50
0
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM GM6001 - - + - + -
10 µM TAPI-I - - - + - +
Figura 58. Efecto del pre-tratamiento con los inhibidores de MMPs y ADAMs
sobre la activación de EGFR y HER2 producida por GHRH (0,1 μM) a los 30 s y
30 min en células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de “Western blot” con
un anticuerpo específico contra EGFR y HER2 fosforilados. Los resultados se expresan
en porcentaje respecto al valor control a los tiempos correspondientes. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de seis experimentos independientes; **, p<0,01; ***,
p<0,001, respecto al valor control de células sin tratar; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###,
p<0,001, respecto a los valores de células tratadas con GHRH.
- 146 -

TACE/ADAM17.
Los resultados del apartado anterior indican la implicación de las MMPs,

en concreto de las ADAMs, en la transactivación tardía de EGFR y HER2
inducida por GHRH. Por ello, se estudia si GHRH es capaz de incrementar los
niveles de las ADAMs, y para ello se analiza TACE/ADAM17 (una de las
ADAMs más estudiadas en la transactivación de la familia de los HER), después
del tratamiento con GHRH (0,1 μM) a diferentes tiempos.
Los resultados mostrados en la figura 59 indican que GHRH incrementa

de forma significativa los niveles de TACE a partir de los 5 min, presentando
unos valores máximos de expresión a los 15 min y 8 h después del tratamiento
con la hormona.
- 147 -
0,1 µM GHRH, Tiempo
Control 1’ 5’ 15’ 30’ 60’

TACE
β-Actina
Control 2 h 4h 8h
TACE
β-Actina
Control 16 h 24 h
TACE
β-Actina
Figura 59. Efecto de 0,1 μM de GHRH sobre la expresión de TACE/ADAM17 a

diferentes tiempos en células PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de
“Western blot”. Los resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los
p<0,05; **, p<0,01.
4.3.3.5 Implicación de la transactivación de EGFR y HER2 inducida

por GHRH en angiogénesis, adhesión y migración celular.
Los receptores de la familia HER intervienen en el desarrollo de procesos

implicados en la progresión tumoral, como son angiogénesis, adhesión y
migración celular. En este bloque de resultados se analiza en qué medida el
efecto de GHRH sobre dichos procesos se ejerce a través de la transactivación
- 148 -
de EGFR y HER2 que el mismo induce. Para comprobarlo se emplea un

inhibidor específico de la actividad tirosina quinasa de EGFR, AG-1478 (10
μM), y de HER2, AG-825 (10 μM). Las células se pre-tratan con cada uno de los
inhibidores durante 30 min, después se incuban con GHRH (0,1 μM) durante 30
s y 30 min, y se estudian las variaciones en adhesión, angiogénesis y
migración celular.
Como comprobamos anteriormente el tratamiento con GHRH provoca

una disminución de la adhesión celular a una matriz de colágeno. Los resultados
de la figura 60A muestran que tras la inhibición de HER2, GHRH no es capaz
de disminuir los niveles de la adhesión celular en ambos tiempos; sin embargo,
la inhibición de EGFR no provoca ningún cambio. Esto indica que el receptor
HER2 está implicado en la disminución de la adhesión celular provocada por
GHRH.
Por otro lado, se estudia si la transactivación de los HER influye sobre la

secreción de VEGF inducida por GHRH. En la figura 60B se comprueba que al
inhibir la fosforilación del receptor de EGFR, el tratamiento con el
neuropéptido no incrementa los niveles de VEGF secretado para ninguno de los
tiempos. Sin embargo, al inhibir la fosforilación de HER2, GHRH si produce el
incremento de VEGF. Por ello se deduce que la transactivación de EGFR está
implicada en la secreción de VEGF producida por GHRH.
- 149 -
A)
100
#
30 s
Adhesión celular
#
(% vs. Control)
** 30 min
50 ***
0
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM AG-1478 - - + - + -
10 µM AG-825 - - - + - +
B)
150
VEGF165 (% vs. Control)
100 # 30 s
###
30 min
50
0
0,1 µM GHRH - + - - + +
10 µM AG-1478 - - + - + -
10 µM AG-825 - - - + - +
Figura 60. Efecto de los inhibidores de la fosforilación EGFR y HER2 sobre la

adhesión celular (A) y la secreción de VEGF (B) producidos por GHRH en células
PC3. Las células se pre-tratan durante 30 min con 0,1 μM de los inhibidores de EGFR,
AG1478 (10 μM), y de HER2, AG825 (10 μM), durante 30 minutos para ambos, y luego
se tratan con 0,1 μM de GHRH durante 30 s y 30 min. El estudio se realiza mediante
- 150 -
ensayos de adhesión celular a colágeno (A) y ELISA de VEGF165 (B). Los resultados se
expresan en porcentaje respecto al valor control a los tiempos correspondientes. Los
p<0,05; **, p<0,01; *** p<0,001, comparando con el valor control; #, p<0,05; ###,
p<0,001, respecto a los valores de células tratadas con GHRH.
A continuación se evalúa si, de la misma forma que en la adhesión celular

y en la secreción de VEGF, la transactivación de EGFR y HER2 actúa sobre
el aumento que GHRH provoca sobre la migración celular en PC3. Para ello,
las células se pre-tratan con los inhibidores durante 30 min, después se incuban
con GHRH y se realizan microfotografías a tiempo 0 y 24 h. En las imágenes de
la figura 61 se observa que, al igual que ocurría con la secreción de VEGF, la
inhibición de EGFR impide el efecto migratorio que induce el neuropéptido en
condiciones normales. Por el contrario, la inhibición de la fosforilación de HER2
no provoca ningún cambio en el efecto producido por GHRH sobre la migración
celular.
AG-825 AG-1478
Control GHRH AG-825 AG-1478 + +
GHRH GHRH
0h
24 h
Figura 61. Efecto de los inhibidores EGFR y HER2 fosforilados sobre la

migración celular producida por GHRH en células PC3. Las células se pre-tratan
durante 30 min con 0,1 μM de los inhibidores de EGFR, AG-1478 (10 μM), y de HER2,
AG-825 (10 μM), y luego se tratan con 0,1 μM de GHRH durante 24 h. El estudio se
realiza mediante ensayos de migración celular. Las fotografías se toman en un
microscopio invertido (20X).
- 151 -
4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidérmico, EGF, sobre la

expresión de GHRH y sus receptores.
Existen trabajos que hablan de transactivaciones cruzadas entre

receptores de la familia HER y GPCRs. Por ello, se estudia el efecto de EGF
sobre la expresión de GHRH y sus receptores. Las células se tratan con EGF
(100 ng/ml) a diferentes tiempos y, a continuación, se valoran los niveles de
GHRH y sus receptores mediante ensayos de RT-PCR. En la figura 62 se
observa como tras el tratamiento con EGF, los niveles de mRNA de GHRH se
incrementan según transcurre el tiempo de tratamiento, alcanzando un aumento
del 45% a las 8 h. En el caso del mRNA de los receptores de GHRH también se
observa un incremento, con un valor máximo a las 2 h un 35% mayor,
comparando con los valores de células sin tratar. Estos resultados podrían
indicar una transactivación de GHRH mediada por EGFR.
GHRH GHRH-R
β-Actina β-Actina
Figura 62. Efecto EGF (100 ng/ml) sobre el mRNA de GHRH y GHRHR a
diferentes tiempos en de PC3. El estudio se realiza mediante ensayos de RT-PCR. Los
resultados se expresan en porcentaje respecto al valor control. Los datos corresponden a
la media ± E.S.M. de tres experimentos independientes; *, p<0,05; **, p<0,01; ***,
p<0,001.
- 152 -
4.4 ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS ANTAGONISTAS DE GHRH

EN UN MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO DE CÁNCER DE
PRÓSTATA HUMANO.
Los ensayos en modelos in vivo permiten hacer una aproximación a un

posible papel terapéutico en humanos (ensayo preclínico), valorando los posibles
efectos adversos del tratamiento, y corroborando los resultados obtenidos en los
ensayos in vitro. Por ello, en este apartado de resultados se miden los efectos de
los antagonistas de GHRH en tejido tumoral prostático obtenido tras la
inoculación de PC3 en ratones inmunodeprimidos.
4.4.1 EFECTO DE JMR-132 Y JV-1-38 EN EL CRECIMIENTO DE

TUMORES IN VIVO .
En este primer experimento in vivo se prueba el efecto antitumoral de los

antagonistas JMR-132 y JV-1-38, en comparación con el grupo control que solo
recibe la solución vehículo.
4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad.
El crecimiento tumoral se mide dos veces a la semana, durante 41 días y

los resultados se representan en la figura 63. En las medidas finales del
volumen tumoral se observa que el antagonista JMR-132 (319,3 ± 115 mm3)
inhibe el volumen tumoral un 58% (Figura 63A), y JV-1-38 (224,3 ± 88 mm3)
un 70% (Figura 63B), comparándolo con el volumen tumoral de los ratones sin
tratar (750,2 ± 74,56 mm3). Además, es importante destacar que dos de los
tumores tratados con JMR-132 y uno con JV-1-38, reducen totalmente su
volumen tumoral.
- 153 -
A)
B)
Figura 63. Evolución del crecimiento tumoral de los ratones tras el tratamiento
con 10 µg/día de JMR-132 (A) y 20 µg/día de JV-1-38 (B). Los resultados se
expresan en volumen calculado con la fórmula: largo x alto x ancho x 0.5236. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al
grupo control.
Se valoran otros parámetros como el peso del tumor de cada grupo

(Tabla 6), y se observa que los tumores de los grupos tratados con JMR-132 y
JV-1-38 pesan un 68% y 64% menos respectivamente, que el grupo control. El
peso de los ratones tras los tratamientos no sufre ninguna variación con
- 154 -
respecto al grupo sin tratar (datos no mostrados). La relación entre el peso del
tumor y el peso del ratón disminuye en los grupos tratados, lo que confirma que
los antagonistas reducen el peso del tumor independientemente del peso del
ratón. Además, en cuanto al tiempo que tarda la masa tumoral en duplicarse, los
grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38 presentan un incremento de dicho
valor de un 46% y 20%, respectivamente.
Tabla 6. Efecto del tratamiento con los antagonistas JMR-132 (10 µg/día) y de JV-
1-38 (20 µg/día) sobre el peso del tumor, su relación con el peso del ratón y el
tiempo de duplicación del tumor para cada grupo. Los datos corresponden a la media
± E.S.M.; *, p<0,05, respecto al grupo control.
Tiempo de Duplicación del

Grupo de Peso del tumor, mg Peso del tumor (mg) / Peso del ratón (g )
Tumor (TDT)
ratones (% reducción) (% reducción)
(% incremento)
Control (n=10) 756 ± 101 24.59 ± 3.26 11,45 ± 6,169
JMR-132 (n=6) 235 ± 140 (68)* 10.15 ± 4.08 (58)* 16,76 ± 0,7 (46)*
JV-1-38 (n=6) 270 ± 102 (64)* 8.40 ± 3.08 (66)* 13,65 ± 1,58 (20)
4.4.1.2 Expresión de GHRH y sus receptores.
El examen histológico de los tumores mediante tinción con tricrómico

de Masson (Figura 64AA-C), indica que la masa tumoral está rodeada de tejido
conjuntivo. En su interior hay mezcla de células tumorales grandes de contorno
poligonal con células de un tamaño menor y zonas con infiltrados de linfocitos
cercanas a los vasos sanguíneos. En las secciones histológicas de los tumores del
grupo control se observa una disposición más compacta entre las células que en
los grupos tratados con los antagonistas.
El estudio de la expresión de GHRH y sus receptores se realiza

mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para cada uno de
- 155 -
ellos. Las imágenes de la figura 64AD-F muestran como GHRH tiene una menor
presencia en los grupos tratados con los antagonistas, lo cual se confirma con
los resultados obtenidos de los niveles proteicos y de mRNA de GHRH (Figura
64B y C). Además, las secciones de los tumores tratados con los antagonistas
presentaron una mayor expresión de ambos receptores de GHRH, presente
sobre todo en células endoteliales (Figura 64A G-L).
A) Control JMR-132 JV-1-38

A B C
Tricrómico
de Masson
GHRH
SVs
p-GHRHR
- 156 -
B) C)
GHRH GHRH
β-Actina
β-Actina
100
100
Niveles de mRNA
(% vs. Control)
(% vs. Control)
75 **
*** 75
50 *
50
**
25 25
0 0
Control JMR-132 JV-1-38 Control JMR-132 JV-1-38
Figura 64. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 µg/día) y de JV-1-
38 (20 µg/día) sobre la expresión de GHRH y de sus receptores. (A) Tinción con
tricrómico de Masson (A-C) e inmunohistoquímica de GHRH (D-F) y sus receptores (G-L).
(B) Niveles de mRNA medidos por RT-PCR y (C) de proteína por “Western blotting”
de GHRH. Las imágenes son representativas de cada grupo y presentan un aumento
300X. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones en el grupo control y 6
ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001,
respecto al grupo control.
4.4.1.3 Proliferación celular.
Tras estudiar la evolución del crecimiento tumoral, se analiza el efecto de

los antagonistas sobre la expresión de proteínas implicadas en vías de
proliferación celular como PCNA, STAT3 y la quinasa, p44/42. PCNA se
analiza mediante inmunohistoquímica, representada en la figura 65A, donde se
observa una reducción en el número de células positivas de un 58% y un 48% en
los grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente (Figura 65 A).
Además, en la figura 65B, se muestra como en los grupos tratados con los
antagonistas la relación pSTAT/STAT se reduce en un 36%, y 19% para el
grupo tratado con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente. Adicionalmente se
puede observar como el ratio entre p-p44/42 y p44/42 (Figura 65C) disminuye
- 157 -
un 30% y 39%, para los grupos tratados con JMR-132 y JV-1-38,

respectivamente.
A)
Control JMR-132 JV-1-38
PCNA
B) C)
STAT p44/42
p-STAT p-p44/42
β-Actina β-Actina
Ratio p-p44/42 / p44/42
Ratio pSTAT3/STAT3
100
100
*
**
*
**
50 50
0 0
38 (20 µg/día) sobre la expresión de PCNA (A), así como la expresión y
fosforilación de STAT3 (B) y p44/42 (C) con la representación del ratio
correspondiente. Se evalúa por técnicas de inmunohistoquímica (A) y “Western blot”
(B y C). Las imágenes presentan un aumento 300X. Los resultados de la figura son
representativos de 10 ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos
tratados.
4.4.1.4 Ciclo celular y apoptosis
- 158 -
Una vez conocido el hecho de que los antagonistas reducen el

crecimiento tumoral y la presencia de algunas proteínas importantes en dicho
proceso, se evalúa si se ve alterada la expresión de proteínas de ciclo celular
como p53, y de apoptosis como Bcl2 y Bax. En la figura 66A se observa
como en los grupos tratados con los antagonistas aumenta de forma
significativa la expresión de p53, un 47% para el grupo del JMR-132 y un
31% para el grupo del JV-1-38. Los resultados de la figura 66B indican como,
la proteína pro-apoptótica, Bax, aumenta y la proteína anti-apoptótica Bcl2
disminuye en los tumores tratados con los antagonistas. Además, el ratio de
ambas proteínas se incrementa en un 57% y 45% para los grupos JMR-132 y
JV-1-38, respectivamente.
A) B)
Bax
p53
Bcl2
β-Actina
β-Actina
** ***
150 1,5 ***

Ratio Bax/Bcl2
*
(% vs. Control)
100 1,0
50 0,5
0 0
38 (20 µg/día) sobre la expresión de p53(A), Bax y Bcl2 (B). Se analiza mediante
ensayos de “Western blot”. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones en
el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01;
***, p<0,001, respecto al grupo control.
4.4.1.5 Adhesión celular
- 159 -
A continuación, se evalúan diferentes moléculas participantes en la

adhesión celular. Al igual que en células, se estudia como varían los niveles de
E-cadherina, β-catenina y sus genes diana, CD44, ciclina D1 y c-myc . Los
resultados de la figura 67B muestran como los niveles de la proteína E-
cadherina disminuyen en los grupos tratados con JMR-132 (38%) y JV-1-38
(15%). Los estudios de inmunohistoquímica revelan la presencia de E-cadherina
en la membrana plasmática (Figura 67A) correlacionandose con los resultados
obtenidos por “Western blotting”. También se evalúa la localización subcelular
(núcleo o membrana) de β-catenina, observando que en los grupos tratados con
JMR-132 y JV-1-38 dicha proteína disminuye un 54% y un 18%,
respectivamente, en el núcleo. En relación a este resultado, se observa que los
niveles de mRNA de sus genes diana, CD44, ciclina D1 y c-myc disminuyen en
los grupos tratados con JMR-132 (16-35%) y JV-1-38 (27-70%).
Además, se analiza la proteína de adhesión a la matriz extracelular, βIG-

H3, implicada en la proliferación y diferenciación celular. Para su estudio se
realizan ensayos de ELISA, los resultados que se recogen en la figura 67C
muestran que los grupos tratados con los antagonistas presentan un 66% menos
de βIG-H3.
- 160 -
E-Cadherina
B)
1 ± 0,01 0,65 ± 0,01 * 0,12 ± 0,005*** 1 ± 0,005 0,84 ± 0,02 * 0,73 ± 0,06**
E-Cadherina CD44
1 ± 0,005 1,37 ± 0,01 * 1,75 ± 0,02*** 1 ± 0,06 0,86 ± 0,08 0,3 ± 0,03**
M ciclina D1
β-Catenina
1 ± 0,007 0,46 ± 0,008** 0,82 ± 0,006* 1 ± 0,07 0,65 ± 0,03 * 0,48 ± 0,1**
N c-myc
β-Actina β-Actina
C)
100
(% vs. Control)
β IG-H3
50 ***
***
0
38 (20 µg/día) sobre la localización de E-cadherina (A), expresión de E-cadherina,
β-catenina, CD44 , ciclina D1 y c-myc (B), y βIG-H3 (C). Se analiza por ensayos de
inmunohistoquímica (A), de “Western blotting” (B) y ELISA (C). Las imágenes
presentan un aumento 300X. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones
en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **,
p<0,01; ***, p<0,001, respecto al grupo control.
- 161 -
4.4.1.6 Degradación de la matriz extracelular
Otro proceso que se analiza es la degradación de la matriz extracelular

mediante el estudio de expresión y actividad de las metaloproteasas 9 y 2, así
como los niveles de sus inhibidores endógenos TIMP1, 2 y 3. En la figura 68A
se muestra que la expresión de la MMP9 se reduce en un 50% en ambos grupos
de antagonistas, y los niveles de MMP2 se reducen un 50% y 90% en los grupos
tratados con JMR-132 y JV-1-38, respectivamente. Estos resultados se
corroboran con los obtenidos por inmunohistoquímica, donde un menor número
de células expresan ambas MMPs (Figura 68C). En cuanto a su actividad
gelatinolítica (Figura 68B), la forma activa de ambas MMPs se reduce en torno
al 50%, comparando con el grupo control.
A) B)
MMP9 MMP2 Pro-MMP9 Pro-MMP2
β-Actina β-Actina MMP9 MMP2
125 300
Actividad gelatinolética
***
100 Pro-MMP
Nivel de proteína
(% vs. Control)
(% vs. Control)
MMP activa
200
75
** **
*
***
50
100 ***
*** *** ***
25
***
0 0
MMP9 MMP2 MMP9 MMP2
C) Control JMR-132 JV-1-38
MMP9
MMP2
- 162 -
Figura 68. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 mg/día) y de JV-1-
38 (20 mg/día) sobre la expresión (A y C) y actividad (B) de las MMP2 y 9. Se
analiza por ensayos de “Western blot” (A), de zimografía (B) e inmunohistoquímica (C).
Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones en el grupo control y 6
ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001,
respecto al grupo control.
A continuación, se valoran los niveles de los inhibidores de las

metaloproteasas, TIMP1, 2 y 3, y RECK (Figura 69). Los resultados muestran
un incremento de inhibidores TIMP1 y 3, y RECK en los tumores tratados con
los antagonistas, mientras que los niveles de TIMP2 no varían.
1 ± 0,05 1,35 ± 0,03 *** 1,25 ± 0,02***

TIMP1
1 ± 0,01 1,05 ± 0,02 1,05 ± 0,03

TIMP2
1 ± 0,005 1,25 ± 0,07 ** 1,23 ± 0,05**

TIMP3
1 ± 0,02 1,31 ± 0,1 *** 1,14 ± 0,02

RECK
β-Actina
Figura 69. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 mg/día) y de JV-1-
38 (20 mg/día) sobre la expresión de mRNA de TIMP1, 2 y 3, y RECK. Se analiza
por ensayos de RT-PCR. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones en
el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01;
***, p<0,001, respecto al grupo control.
- 163 -
4.4.1.7 Angiogénesis.
El nivel de vascularización de los tumores se observa mediante

fotografías de la masa tumoral antes de ser extraída. Las imágenes de la figura
70A muestran como el tratamiento con los antagonistas visualmente indica una
menor cantidad de vasos sanguíneos. El grado de hipoxia producida en el tumor
se estudia por los niveles del factor HIF-1α mediante inmunohistoquímica
(Figura 70B), observándose un menor número de células positivas en los grupos
tratados con los antagonistas. Para completar el estudio sobre angiogénesis, se
analizan los niveles del factor proangiogénico VEGF165 en los tumores (Figura
70C), encontrando una disminución de un 50% en los grupos tratados con los
antagonistas.
B) Control JMR-132 JV-1-38
HIF-1α
- 164 -
C)
VEGF 165 (pg/ml)

200
** **
100
0
Figura 70. Efecto de los antagonistas de GHRH, JMR-132 (10 µg/día) y de JV-
1-38 (20 µg/día) sobre la angiogénesis. Se analizan fotografías representativas de
cada grupo de tumores (A), además se realizan ensayos de inmunohistoquímica de
HIF-1α (B), y de ELISA de VEGF165 (C). Las imágenes (B) presentan un aumento
300X. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10 ratones en el grupo control
y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; **, p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.1.8 Metástasis
La capacidad metastásica de las células tumorales provoca la elevada

mortalidad en la enfermedad cancerígena. Este proceso hace que las células se
separen de su lugar de origen dirigiéndose hacia un órgano sano, comenzando
allí su proceso proliferativo. En este apartado, se realiza un estudio preliminar
del potencial antimetastásico de los antagonistas de GHRH mediante el estudio
de radiografías de todos los ratones. La presencia de focos metastásicos se
determina en el Servicio de Traumatología del Hospital Universitario Principe
de Asturias. Posteriormente, se establece un estadiaje atendiendo al número y
localización de dichas lesiones metastásicas. En la figura 71A se observan las
imagenes representativas de los diferentes estadios utilizados para clasificar el
grado de metástasis:
- 165 -
 Estadio 0: Sin cambios

 Estadio 1: Pequeños focos metastásicos
 Estadio 2: Focos metastásicos en hueso o pulmón
 Estadio 3: Focos metastásicos en hueso y pulmón
Teniendo en cuenta estos estadios se clasifican los tumores de los tres

grupos, los resultados obtenidos se representan en la figura 71B, donde se
observa que los grupos tratados presentan hasta un 75% menos de mestástasis
que el grupo control. En el estudio histológico (Figura 71C) de la columna de
uno de los animales del grupo control, se observa la presencia de células
tumorales en la médula ósea.
A) ESTADIO 0 ESTADIO 1 ESTADIO 2 ESTADIO 3
- 166 -
B) C)
3
Estadio metastásico
**
1 **
0
Figura 71. Imágenes representativas de las metástasis generadas en los ratones.

Se analizan radiografías de los ratones de cada grupo y se clasifican según su estadio
y se señalan con flechas blancas los focos metastásicos en pulmón y/o estructura ósea
(A). La gráfica (B) representa el análisis de los estadios de cada grupo de ratones. Se
realiza un estudio histológico (C) de la columna vertebral de un animal del grupo
control, donde se observa la presencia de células tumorales en la medula ósea
señaladas con flechas negras. Los datos corresponden a la media ± E.S.M. de 10
ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados; **,
p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.1.9 Expresión de EGFR, HER2 y Src.
Tal como vimos en la experimentación realizada in vitro, GHRH

transactiva EGFR y HER2 provocando la activación de procesos tumorales. Por
ello, evaluamos la expresión de EGFR y HER2, así como la proteína quinasa,
Src. En la figura 72A se observa que los grupos tratados con los antagonistas
muestran un menor número de células positivas para p-EGFR, siendo incluso
nula para algunos tumores del grupo JMR-132. Sin embargo, los tumores de los
grupos tratados muestran un mayor número de células positivas a p-HER2,
estando dicho receptor presente bajo la membrana de las células tumorales
examinadas.
- 167 -
Además en la figura 72B se analizan los niveles de EGFR y HER2

mediante “Western blot” y RT-PCR. Los resultados revelan una menor
expresión de los RTKs en los tumores de los grupos JMR-132 y JV-1-38, al
compararlo con el valor del grupo control. Los niveles de Src (Figura 72C)
analizados por ensayos de “Western blot” disminuyen un 28% en el grupo JMR-
132, y un 44% en el grupo JV-1-38.

a b c
p-EGFR
d e f
p-HER2
B) mRNA Proteína
1 ± 0,06 0,69 ± 0,1 * 0,62 ± 0,005* 11 ±± 0,08
0,08 0,71 0,06 **
0,71 ±± 0,06 0,66 0,07*
0,66 ±± 0,07*
EGFR
1 ± 0,05 0,73 ± 0,05 * 0,78 ± 0,07* 1 ± 0,06 0,78 ± 0,06 * 0,70 ± 0,07*
HER2
β-actina
C)
p-Src
β-actina
100
(% vs. Control)
*
50
0
- 168 -
38 (20 µg/día) sobre la expresión de EGFR, HER2 y Src. Se analiza mediante
inmunohistoquímica las formas fosforiladas de EGFR y HER2 (A), asi como la expresión
de mRNA y proteína de EGFR, HER2 (B) y pSrc (C) mediante RT-PCR y “Western
blotting”. Las imágenes presentan un aumento de 300X. Los resultados son
representativos de 10 ratones en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos
tratados
4.4.1.10 Expresión de diferentes isoformas de PKCs
La PKC es una familia de proteínas kinasas que están implicadas en

multiples procesos que llevan a la progresión tumoral. Por ello, se valora la
expresión de algunas de sus isoformas más representativas en los tumores
obtenidos. Los resultados de la figura 73 muestran como el antagonista JV-1-38
reduce de forma significativa los niveles de las isoformas α, βI y βII. Sin
embargo, el antagonista JMR-132 solo reduce de forma significativa la isoforma
βII. En cambio, los niveles de las isoformas δ y ζ, aumentan en los grupos
tratados con cada uno de los antagonistas. Estos resultados avalan la
implicación de PKC en los efectos de los antagonistas JMR-132 y JV-1-38, y
ponen de manifiesto un papel diferencial para cada una de las isoformas.
- 169 -

1 ± 0,01 0,81 ± 0,04 0,5 ± 0,04**
PKC-α
1 ± 0,08 0,44 ± 0,11** 0,34 ± 0,07**

PKC-βI
1 ± 0,06 0,77 ± 0,06* 0,60 ± 0,03*
PKC-βII
1 ± 0,055 2,14 ± 0,14** 1,38 ± 0,16
PKC-δ
1 ± 0,07 1,86 ± 0,13* 3,06 ± 0,3**

PKC-ζ
β-Actina
38 (20 µg/día) sobre la expresión de las isoformas α, βI, βII, δ y ζ. Se analiza por
ensayos de “Western blot”. Los resultados de la figura son representativos de 10 ratones
en el grupo control y 6 ratones en cada uno de los grupos tratados con los antagonistas
de GHRH.
4.5 EFECTO DE MIA-690 Y GEFITINIB EN EL CRECIMIENTO

DE TUMORES IN VIVO .
En los resultados anteriormente analizados, se observa como GHRH

provoca la transactivación de EGFR y HER2 y con ello multitud de procesos
pro-cancerígenos, y además, todo ello es bloqueado con los antagonistas de
GHRH. En este segundo experimento in vivo se estudia el efecto del
antagonista MIA-690, ya que es el más efectivo según nuestros resultados, por
si solo y en combinación con un inhibidor de EGFR utilizado en clínica,
Gefitinib.
- 170 -
4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad.
El crecimiento tumoral se mide dos veces a la semana, durante 36 días y

los resultados se representan en la figura 74. En las medidas finales del volumen
tumoral se observa que el antagonista MIA-690 (493 ± 180 mm3) inhibe el
volumen tumoral un 70%, Gefitinib (591 ± 174 mm3) un 63 %, y ambos
tratamientos (410 ± 65 mm3) un 75%, comparándolo con el volumen tumoral de
los ratones sin tratar (1578 ± 190 mm3).
1500
Volumen tumor (mm3)
CONTROL
MIA-690
1000 Gefitinib
MIA-690 + Gefitinib
***
***
500 ** *** *** ***
0
01 5 8 12 15 19 22 26 29 33 36
Tratamiento (Días)
Figura 74. Evolución del crecimiento tumoral de los ratones tras el tratamiento
con 5 µg/día de MIA-690, 100 mg/kg x día de Gefitinib y ambos en combinación.
Los resultados se expresan en volumen calculado con la fórmula: largo x alto x ancho x
0,5236. Los datos corresponden a la media ± E.S.M.; ** p<0,01; ***, p<0,001, respecto
al control.
En la tabla 7 se relacionan otros parámetros, como los pesos tumorales,

la relación del peso del tumor y peso del ratón, y el tiempo de duplicación del
tumor. Se observa que los pesos de tumores de los ratones tratados con MIA-
690 y Gefitinib son un 42% y 50% menores respectivamente, y el grupo tratado
- 171 -
con la combinación de ambos compuesto lo reduce aún más, un 58%, al

compararlos con el grupo control. Por otro lado, la relación entre el peso del
tumor y el peso del ratón disminuye en todos los grupos tratados, lo que apoya
la reducción del tumor vista en los grupos tratados. Cabe mencionar que los
pesos de los ratones tratados no sufrieron variación con respecto al grupo
control. En cuanto al tiempo que tarda la masa tumoral en duplicarse, los
grupos tratados con MIA-690 y Gefitinib presentan un incremento en el tiempo
de un 48% y 51%, respectivamente, y la combinación de ambos tratamientos lo
aumenta más aún, llegando a un 63%.
Tabla 7: Efecto del tratamiento con 5 µg/día de MIA-690, 100 mg/kg x día de
Gefitinib y ambos en combinación sobre el peso del tumor, su relación con el peso
del ratón y el tiempo de duplicación del tumor para cada grupo. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01, respecto al grupo control.
Peso del tumor, mg Peso del tumor (mg) / Peso del Tiempo de Duplicación del Tumor
Grupo de ratones
(% reducción) ratón (g ) (% reducción) (TDT) (% incremento)
Control
1630 ± 160 52,5 ± 9,65 9,13 ± 1
(n=15)
MIA-690
960 ± 61 (42)** 36,9 ± 8.11 (30)* 13,6 ± 0,8 (48)*
(n=9)
Gefitinib
830 ± 80 (50)** 28,0 ± 5.21 (47)* 13,8 ± 2,05 (51)*
(n=9)
MIA-690 + Gefitinib 14,9 ± 1,5 (63)*
690 ±150(58)** 30,1 ± 7.18 (43)*
(n=9)
4.4.2.2 Angiogénesis
El nivel de vascularización de los tumores se observa mediante

fotografías de la masa tumoral después de ser extraída. Las imágenes de la
figura 75A muestran como los tratamientos reducen la presencia de vasos
sanguíneos en el tumor. Además se analizan los niveles de VEGF165 en los
tumores (Figura 75B), encontrando una disminución de un 35% en los grupos
- 172 -
tratados con MIA-690 y Gefitinib, y un 48% en el grupo tratado con la

combinación de ambos compuestos.
A) MIA-690
Control MIA-690 Gefitinib +
Gefitinib
B)
3000
VEGF165 (pg/ml)
* *
2000
**
1000
0
Control - - - -
MIA-690 - + - +
Gefitinib - - + +
Figura 75. Efecto del antagonista MIA-690 (5 µg/día), Gefitinib (100 mg/kg x
día) y ambos en combinación sobre la angiogénesis. Se presentan fotografías
representativas de cada grupo de tumores (A), y ELISA de VEGF165 (B). Los datos
corresponden a la media ± E.S.M. de 15 ratones en el grupo control y 9 ratones en cada
uno de los grupos tratados; *, p<0,05; **, p<0,01, respecto al grupo control.
4.4.2.3 Metástasis
Las células de los tumores tienen una elevada actividad metabólica, en

concreto, se ha visto que presentan una glucolisis muy activa. En este apartado
de resultados se utiliza la 2-desoxi-D-glucosa unida a una sonda fluorescente
- 173 -
para valorar la actividad de las células tumorales, tanto en la masa tumoral

como en otras zonas del animal. La intensidad del color indica el nivel de la
actividad glucolítica de las células del animal, en ayunas. Como se observa en la
figura 76 el control presenta mayor actividad glucolítica repartida en diversos
focos, algunos alejados de la masa tumoral, lo que nos podría indicar supuestos
focos metastásicos. Por el contrario, los ratones de los grupos tratados
presentaron una baja intensidad de glucolisis.
MIA-690
Negativo Control MIA-690 Gefitinib +
Gefitinib
- Glucolisis +
Figura 76. Efecto del antagonista MIA-690 (5 µg/día), de Gefitinib (100

mg/kg x día) y ambos en combinación sobre la generación de metástasis. Se
inyecta a cada ratón una sonda fluorescente de 2-desoxi-D-glucosa y se escanean los
ratones para valorar la fluorescencia emitida a 790 nm. Las imágenes son
representativas de cada grupo de ratones.
4.4.3 EFECTO DE GHRH SOBRE LA INDUCCIÓN DE TUMORES.
Los resultados obtenidos en anteriores apartados sobre el efecto de

GHRH en diversos procesos como proliferación, adhesión y migración en la
- 174 -
línea celular no tumoral prostática, sugieren que el neuropéptido puede tener la

capacidad de transformar las células no tumorales en células malignas. Por ello,
se estudia si después de tratar las células RWPE-1 con GHRH durante 24 h, e
inocularlas en ratones atímicos se inducen tumores. Se realiza un seguimiento
semanal del volumen de los ratones y tras un periodo de 11 semanas se finaliza
el experimento. Los resultados recogidos muestran que de los ocho ratones
inoculados con células tratadas, siete de ellos generan una masa tumoral cuya
evolución se muestra en la figura 77. Sin embargo, ninguno de los ratones del
grupo control muestra la formación de tumores. Además, ninguno de los
ratones del experimento sufrió variaciones importantes en su peso.
A) B) Control GHRH
Volumen tumoral (mm3)
100 *** Control

GHRH
***
* ** ** **
50
0
1 7 14 21 28 35 42 49
Tratamiento (Días)
C)
Figura 77. Evolución del crecimiento tumoral en ratones atimicos de células

RWPE-1 tratadas con 0,1 µM de GHRH (A), fotografías de un ratón
representativo del grupo control (izquierda) y del grupo tratado (derecha) (B), y
fotografías de los 6 tumores generados (C). Los resultados (A) se expresan en
volumen calculado con la fórmula: largo x alto x ancho x 0.5236. Los datos
corresponden a la media ± E.S.M.; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001, respecto al
grupo control.
- 175 -
5. DISCUSIÓN
Universidad de Alcalá Discusión
La evolución del CP hacia un cáncer insensible a andrógenos, también

denominado, resistente a castración (CPRC), depende de un entramado sistema
de señalización en el que participan multitud de moléculas cuya expresión
diferencial desencadena fenotipos que llevan a las células prostáticas a proliferar,
evadir la apoptosis, aumentar su capacidad migratoria e invasiva, estimular la
angiogénesis, etc. En definitiva, a extender la enfermedad y hacerla incurable.
Solamente en la Unión Europea se estiman 71.000 muertes por cáncer de
próstata para el año 2014 (Malvezzi y col., 2014). Actualmente, si se detecta el
CP de forma precoz existen tratamientos muy eficaces; el problema surge
cuando la enfermedad progresa hacia una situación de independencia
androgénica, ya que las opciones terapéuticas son limitadas y se necesitan
tratamientos más eficaces, lo que hace imprescindible estudiar en profundidad
cada uno de los procesos responsables de su mal pronóstico. En este sentido,
nuestro grupo de investigación tiene una trayectoria dilatada en el estudio del
papel del neuropéptido VIP en la progresión tumoral del cáncer de próstata
(Collado y col., 2007; Fernández-Martínez y col., 2009). El péptido GHRH
pertenece a la familia del VIP y se ha relacionado con diversos tumores: mama,
endometrio, ovario, próstata, colón, riñón, pulmón y glia (Barabutis y Schally,
2010). En este trabajo de investigación se ha tratado de profundizar en el papel
de GHRH sobre los diferentes procesos que llevan a la progresión del CP,
además de evaluar el posible papel de sus antagonistas como fármacos con
potencial terapéutico.
En el transcurso de esta Tesis Doctoral se ha confirmado la implicación

directa de GHRH y de sus receptores, en el desarrollo de fenotipos que
promueven la progresión tumoral en el CP. Para ello, se han usado dos
estrategias experimentales, estudios in vitro y estudios in vivo . En los estudios
in vitro, se han utilizado tres líneas celulares de epitelio prostático humano
representativas de un estado no tumoral, RWPE-1; de un estadio intermedio
dependiente de andrógenos, LNCaP; y de un estadio avanzado independiente de
- 179 -
Discusión Universidad de Alcalá
andrógenos, PC3. Los estudios in vivo, se han llevado a cabo con ratones
inmunodeprimidos, xenotransplantados con células prostáticas. En concreto, se
ha demostrado la participación de GHRH en los procesos de proliferación,
adhesión, migración, angiogénesis y neurodiferenciación, y en la expresión de
moléculas biomarcadoras de cada uno de ellos. Además, se ha puesto de
manifiesto la existencia de un mecanismo de transactivación entre los receptores
de GHRH y de EGF, y se han desvelado algunas de las vías implicadas en dicha
interacción. El trabajo se completa de forma paralela con un estudio sobre la
acción de los antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38, y los MIA-602, 606
y 690, estos últimos pertenecen a una nueva serie de antagonistas con efectos
más potentes que los anteriores sobre la progresión tumoral.
El primer objetivo planteado en este trabajo pretende valorar la presencia

endógena de GHRH en las tres líneas celulares prostáticas, RWPE-1, LNCaP y
PC3, como paso previo para su implicación en el CP. GHRH está presente en
los tres tipos celulares, observándose una mayor expresión en las líneas
celulares tumorales, y dentro de ellas en las más agresivas, señalando su
importancia en el avance del CP ya que sus niveles aumentan según la
enfermedad se vuelve más agresiva. A continuación, se valora si este incremento
se refleja en la expresión y localización subcelular de las diferentes variantes de
los receptores de GHRH. En los resultados se muestra que el receptor pGHRH
y sus variantes, SVs, se localizan en los tres tipos celulares presentando un
patrón diferente en cada una de ellas. Así, pGHRH-R se encuentra más
expresado en células LNCaP; mientras que las variantes SVs se expresan
mayoritariamente en las células PC3. Ambos receptores se encuentran
localizados principalmente en membrana plasmática y citoplasma. La presencia
de estos receptores en tejido y células de CP, dependiente e independiente de
andrógenos, ha sido previamente descrita por el grupo del Dr. Schally (Halmos
y col., 2002), y en tejido prostático no tumoral por diferentes grupos (Gallego y
col., 2005; Havt y col., 2005), pero todavía no se ha descrito en líneas celulares
- 180 -
de próstata no tumoral. Para las isoformas SVs han sido descritos niveles
mayores en tejido tumoral prostático de pacientes en estado avanzado (etapa III
y IV), en comparación con el tejido de tumores que presentan un estadio menos
agresivo (Halmos y col., 2002), por lo tanto, nuestros resultados apuntan en la
misma dirección y sugieren que las isoformas SVs pueden tener un papel
predominante en la independencia androgénica del CP. En cambio, la mayor
presencia de GHRH en los tumores prostáticos, con independencia de su estadio
tumoral (Halmos y col., 2002), indica la importancia de GHRH y sus receptores
en el desarrollo de la enfermedad, señalándolos como una posible diana
terapéutica.
Los estudios in vivo con ratones xenotransplantados con células PC3

muestran que los antagonistas JV-1-38 y JMR-132 regulan de forma negativa
la expresión de GHRH en los tumores de los grupos tratados con dichos
antagonistas, si los comparamos con los tumores del grupo no tratado. Así
mismo, en ensayos in vitro, el tratamiento con dichos antagonistas resulta en un
incremento del mRNA de los receptores de GHRH. Por tanto, los antagonistas
activan la transcripción de GHRH-R con el objetivo de incrementar los sitios de
unión para los mismos, y por tanto, sus posibles efectos. Este hecho no había
sido descrito hasta la fecha y puede explicar parte del efecto directo de los
antagonistas de GHRH sobre los diferentes procesos (proliferación, ciclo
celular, adhesión, migración y angiogénesis) que llevan al fenotipo metastásico.
Nuestro segundo objetivo ha consistido en analizar la implicación de

GHRH y sus antagonistas en los diferentes procesos que median el inicio y
progresión del CP. Para ello, en primer lugar se busca la concentración óptima
de GHRH y de los antagonistas para los estudios in vitro.
En una primera aproximación, evaluamos el efecto que produce GHRH

en la viabilidad de las células prostáticas. Los resultados obtenidos confirman
que GHRH incrementa significativamente la viabilidad de las tres líneas
- 181 -
celulares, provocando una mayor respuesta en la línea celular de CP avanzado.

Resultados similares se han obtenido en células de cáncer de pulmón (Kiaris y
col., 1999) y de mama (Siriwardana y col., 2006). A su vez, los cinco
antagonistas empleados en este estudio reducen la viabilidad en las tres líneas
celulares, siendo los antagonistas de la serie MIA los que producen el mayor
efecto. En este sentido, el grupo del Dr. Schally ha descrito la reducción de la
viabilidad en células tumorales PC3 con el antagonista JMR-132 (Rick y col.,
2012a), así como, en otros tipos celulares por diversos antagonistas de GHRH
(Bellyei y col., 2010; Guo y col., 2010; Pozsgai y col., 2011), lo que se atribuye a
la presencia de GHRH endógena existente en las líneas celulares, descrita en los
resultados del primer objetivo, y cuya acción es bloqueada por los antagonistas.
El aumento de actividad metabólica que produce GHRH y que se bloquea

con los antagonistas puede deberse a cambios mitogénicos, por ello se realizaron
ensayos de proliferación en las tres líneas celulares. Los resultados obtenidos
indican que GHRH incrementa la proliferación celular, siendo especialmente
importante el aumento producido en células no tumorales, lo que podría deberse
a la mayor presencia de pGHRH-R en las células RWPE-1, como demostramos
previamente. Este sorprendente resultado, nos llevó a analizar si GHRH
presenta capacidad transformante en las células no tumorales, mediante estudios
in vivo. Las células RWPE-1 son células no tumorigénicas, pero tras una
estimulación con GHRH, y posterior inoculación en ratones atímicos, son
capaces de generar pequeños tumores. Trabajos previos de nuestro grupo
demostraron que el VIP, un péptido de la familia de GHRH, era capaz de
generar tumores en ratones atímicos tras la inoculación de dichas células
previamente tratadas con el neuropéptido (Fernández-Martínez y col., 2010).
Estos datos señalan a GHRH como un agente capaz de transformar células
no tumorales en malignas, aportando más información sobre los procesos
oncológicos en los que se ve implicado.
- 182 -
Por otro lado, los antagonistas de GHRH reducen la proliferación en

las líneas celulares tumorales, y no en las células no tumorales, con la
excepción del antagonista MIA-602, que disminuye la proliferación de todas
ellas. Estos efectos muestran una acción selectiva por parte de los antagonistas
por las células cancerígenas, algo que puede explicarse, en parte, por la
reducción de la actividad metabólica previamente descrita. Sin embargo, en las
células no tumorales se reduce la actividad metabólica pero no la proliferación,
lo que puede deberse a que los antagonistas provoquen una parada de ciclo
celular, que aplaca la proliferación en este tipo celular. Además, tras un pulso
previo de GHRH en células de CP avanzado los antagonistas son capaces de
bloquear el efecto mitogénico provocado por GHRH. En paralelo, los estudios in
vivo revelaron una importante reducción del crecimiento tumoral en los grupos
tratados con los antagonistas, JV-1-38, JMR-132 y MIA-690, apoyando
firmemente su capacidad antitumoral. Resultados similares han sido descritos
por el grupo del Dr. Schally en el desarrollo de otros tipos de cáncer (Buchholz
y col., 2007; Rick y col., 2012b).
Los cambios que GHRH y sus antagonistas producen sobre la

proliferación celular pueden reflejarse en la modulación de la expresión del
factor PCNA regulador de este complejo proceso. Tras el estímulo de las tres
líneas celulares con GHRH se incrementaban los niveles de PCNA, mostrando
una respuesta rápida y de mayor magnitud en las células más agresivas, en
comparación con lo observado en las otras dos líneas celulares, lo que puede
deberse al metabolismo más activo de las células tumorales. La mayoría de los
antagonistas de GHRH provocan una importante disminución de la
expresión de PCNA solo en células PC3, reafirmando el bloqueo de GHRH
endógeno producido en la línea celular de CP avanzado. En este sentido, en
2010, el grupo del Dr. Schally observó que el antagonista JMR-132 reducía la
expresión de PCNA en células de hiperplasia benigna de próstata (Siejka y col.,
2010b). En los estudios que hemos realizado in vivo, el análisis tumoral de las
- 183 -
moléculas implicadas en proliferación incluye a STAT3 y p44/42,

biológicamente activas tras su fosforilación, además de la estudiada in vitro,
PCNA. El tratamiento con los antagonistas JMR-132 y JV-1-38 reduce
considerablemente la expresión y activación de los tres biomarcadores
examinados, y a su vez, puede provocar la reducción de moléculas
protoncogénicas con las que están relacionadas, como c-myc o ciclina D1, que
modulan el ciclo celular. La reducción observada de PCNA es mayor que la
producida por los antagonistas en los ensayos in vitro, lo que puede provocar
una disminución de la procesividad de la DNA polimerasa δ y/o que no pueda
iniciar la replicación celular.
Como vimos en la introducción, el ciclo celular fija la secuencia de pasos

para que las células proliferen. Los resultados recogidos tras analizar el efecto
de GHRH y sus antagonistas en el ciclo celular se correlacionan con las
conclusiones obtenidas de los ensayos de proliferación en células de cáncer de
próstata avanzado. GHRH incrementa el número de células en mitosis, y, por el
contrario, tras el tratamiento con los antagonistas de GHRH, aparecen células
apoptóticas y además se aprecia una parada de ciclo en la fase S, con lo que se
puede explicar la disminución de la viabilidad y proliferación celular que
provocan. En la misma dirección están los hallazgos encontrados en células de
cáncer de colon en presencia de JMR-132 (Rick y col., 2012b). Este antagonista
provoca un daño en el DNA, que activa la maquinaria de parada de ciclo y
entrada en apoptosis de las células, a través de la activación de p53, p21 y Bax,
así como, la represión de la proteína antiapóptotica Bcl2 (Hohla y col., 2009). En
este sentido, quisimos comprobar si en nuestra línea celular se producían los
mismos efectos sobre estos biomarcadores. Así, nuestros resultados indican que
los efectos de GHRH sobre el ciclo celular se podrían deber a la disminución de
p21, p53 y Bax sumado al incremento de Bcl2, lo que hace que el balance de
moléculas proapoptóticas/antiapoptóticas se reduzca y pueda impedir el inicio
de un proceso apoptótico. Los cambios en estos marcadores señalan a GHRH
- 184 -
como un factor antiapoptótico y, precisamente, el cáncer es el principal

escenario donde se reduce la apoptosis haciendo que las células tumorales no
mueran (Ouyang y col., 2012). En sentido opuesto, encontramos los efectos
producidos por los antagonistas de GHRH sobre los niveles de estas moléculas
en los estudios in vitro e in vivo. En células de CP avanzado destacan los efectos
de MIA-690, único antagonista capaz de modular los cuatro marcadores
analizados provocando el inicio de un proceso apoptótico y de una parada del
ciclo celular. Los resultados de los estudios in vivo muestran un incremento de
p53, p21 y Bax, así como, la disminución de la proteína antiapoptótica Bcl2, del
mismo modo que se ha descrito en cáncer de pulmón con los antagonistas MZ-J-
7-114, MZ-J-7-118 y RC-3940-II (Kanashiro y col., 2007). Al igual que ocurre
con la proliferación tumoral, se observan mayores efectos en los estudios in vivo
en comparación con los estudios in vitro sobre los niveles de los marcadores de
ciclo celular y apoptosis, resaltando la importancia de los antagonistas de
GHRH en el tratamiento del CP in vivo.
En el tejido normal, las células epiteliales se encuentran unidas entre sí y

a la matriz extracelular. Sin embargo, las células tumorales “rompen” estas
uniones para independizarse del resto de células y “conseguir escapar” del nicho
tumoral hacia otros lugares del organismo, dando lugar a la metástasis. Por
tanto, el primer paso para independizarse es la pérdida de adhesión celular,
convirtiéndose en uno de los procesos clave para el estudio de la progresión
tumoral. En este sentido, nuestros resultados demuestran la implicación de
GHRH en la reducción de la adhesión de células tumorales de CP avanzado, sin
afectar significativamente a las células no tumorales ni a las tumorales
representativas de un estadio menos agresivo. En sentido opuesto, nuestros
resultados indican que los antagonistas de GHRH bloquean los niveles
endógenos de la hormona, y con ello, provocan un interesante aumento en la
adhesión de las tres líneas celulares. La unión de las células por E-cadherina
inhibe la motilidad celular y mantiene el fenotipo epitelial normal (Arya y col.,
- 185 -
2006), por lo que a la E-cadherina se la considera una proteína anti-migratoria.

Además, los cambios en los niveles de E-cadherina se han visto asociados a
procesos de EMT y MET en cáncer metastásico (Onder y col., 2008). Estos
hechos indican la importancia de la reducción de E-cadherina que provoca
GHRH solamente en células tumorales, como se observa en nuestros resultados,
lo que podría mostrar el inicio del proceso EMT. Además, los antagonistas de
GHRH son capaces de revertir el efecto, incluso en las células no tumorales
(para el caso del MIA-690), impidiendo la reducción de E-cadherina que se
produce en los primeros pasos del proceso metastásico, señalando a dichos
compuestos como inhibidores de los pasos iniciales en el desarrollo de la
metástasis. Resultados similares se han descrito tras el tratamiento con el
antagonista MIA-602 en células de cáncer de mama (Bellyei y col., 2010). Por
otro lado, en nuestros ensayos in vivo, los antagonistas JMR-132 y JV-1-38
provocan un incremento en los niveles de E-cadherina en los tumores. En este
sentido, se sabe que la E-cadherina disminuye conforme avanza el proceso
metastásico (Onder y col., 2008), lo que podría indicar que los tumores de los
ratones tratados con los antagonistas quedan bloqueados en una fase
inicial de la metástasis, mientras que los tumores no tratados se encuentran en
un estadio más avanzado.
La molécula β-catenina sirve de puente entre E-cadherina y otras

cateninas, con el fin de estabilizar el citoesqueleto (Thakur y Mishra, 2013). En
células epiteliales, su asociación con E-cadherina evita la liberación de β-
catenina al citoplasma y su posterior translocación al núcleo, donde puede
activar la transcripción de diferentes genes que favorecen la progresión tumoral
(Orsulic y col., 1999). Al igual que ocurre con E-cadherina, GHRH aumenta la
expresión de β-catenina solo en células tumorales, con una respuesta mayor
en las células representativas de CP avanzado. Por el contrario, la exposición de
las células tumorales a los antagonistas de GHRH reduce los niveles totales de
β-catenina y la mayor respuesta se obtiene en células de CP avanzado. En
- 186 -
paralelo, se observa que GHRH incrementa la presencia de β-catenina en el

núcleo y que los antagonistas, reducen sus niveles nucleares. Resultados
similares se han descrito en células de glioblastoma, cáncer de mama y de ovario
en presencia del antagonista MIA-602 (Bellyei y col., 2010). La mayor presencia
nuclear de β-catenina provocada por GHRH activaría la transcripción de los
genes diana, c-myc , CD44 y ciclina D1, al contrario que los efectos
producidos por los antagonistas de GHRH, según observamos en nuestros
experimentos in vitro. En este sentido, los cambios producidos en c-myc por
GHRH y sus antagonistas tienen una relación inversa con los producidos en
p21, este hecho puede explicarse sabiendo que c-Myc reprime la transcripción
de p21 al unirse a una región próxima a su promotor lo que puede tener
consecuencias en el control de la proliferación y la progresión del ciclo celular,
del mismo modo que ocurre en células de cáncer de colon (van de Wetering y
col., 2002). La importancia biológica de la reducción producida por los
antagonistas en los niveles de ciclina D1 y CD44 reside en la capacidad de estas
moléculas de reducir la adhesión celular e incrementar la proliferación tumoral
(Chang y col., 2013; Ripple y col., 2014). Los efectos in vitro producidos por los
antagonistas se reflejan de igual modo en los estudios in vivo realizados con
JMR-132 y JV-1-38, indicando de nuevo la relevancia de dichos compuestos en
la modulación de moléculas que provocan una parada de ciclo celular, asi como,
el inicio de un proceso apoptótico en nuestros modelos experimentales de CP.
Cuando las células tumorales pierden su capacidad adherente son capaces

de migrar degradando a su paso la matriz extracelular que las rodea, invadiendo
el sistema vascular y colonizando otros tejidos. La degradación de la matriz
extracelular es producida por enzimas proteolíticas, principalmente, MMP9 y
MMP2, que se encuentran altamente expresadas en tejido tumoral prostático en
estadio avanzado (Gong y col., 2014b). Nuestros resultados indican que GHRH
incrementa la capacidad migratoria de células no tumorales y tumorales en
estadio avanzado, y, por el contrario, los antagonistas de GHRH reducen la
- 187 -
motilidad en ambas líneas celulares. Esta reducción de la capacidad migratoria

puede provocar un bloqueo de los posteriores pasos del proceso metastásico,
impidiendo la invasión de vasos sanguíneos, así como, la colonización de otros
tejidos. Los cambios producidos por GHRH y sus antagonistas en la migración
celular se ven reflejados, de igual modo, en la expresión de las MMPs
implicadas en dicho proceso, por lo tanto, GHRH incrementa los niveles de
mRNA y proteína de las MMP2 y MMP9, y los antagonistas de GHRH
reducen dichos niveles. Resultados semejantes se han descrito al tratar con
MIA-602 células de cáncer de mama, ovario y glioblastoma (Bellyei y col.,
2010). En la misma dirección, pero de una manera más notable, encontramos los
resultados de nuestros estudios in vivo, donde, JMR-132 y JV-1-38 reducen los
niveles de ambas metaloproteasas en su forma inactiva y activa. Además, los
antagonistas aumentan la expresión de sus inhibidores endógenos TIMP1,
TIMP3 y RECK, lo que puede reducir la actividad de las MMPs tal como se
observa en los resultados (Sun, 2010). Estos resultados demuestran que GHRH
altera la expresión de las moléculas que controlan la degradación de la matriz
extracelular, MMPs y sus inhibidores endógenos, y sus antagonistas por el
contrario lo restauran, pudiendo concluir que los antagonistas de GHRH
pueden inhibir la capacidad migratoria de las células de CP avanzado.
En los últimos años se están llevando a cabo diversos estudios sobre la

importancia de la proteína βIG-h3 o TGFBI en la migración de células
tumorales. Esta proteína presente en la matriz extracelular es inducida
transcripcionalmente por TGF-β y además se ha descrito su sobreexpresión en
cáncer de pulmón (Sasaki y col., 2002), riñón (Yamanaka y col., 2008), piel
(Lauden y col., 2014) y próstata (Lee y col., 2013), por ello decidimos evaluar su
expresión en nuestro estudio in vivo. Los niveles de βIG-h3 disminuyen en los
tumores de los grupos tratados con los antagonistas JMR-132 y JV-1-38,
avalando los resultados anteriores, reduciendo moléculas implicadas en la
- 188 -
degradación de la matriz extracelular, lo que señala de nuevo a los antagonistas

de GHRH como compuestos anti-metastásicos en el CP.
Las células tumorales precisan oxígeno y nutrientes para poder

proliferar, por lo que la vascularización del tumor es un paso fundamental en
el desarrollo tumoral. Como hemos visto en este trabajo, GHRH favorece
diferentes procesos que promueven la progresión tumoral (proliferación,
adhesión y migración); además, nuestros resultados demuestran que GHRH
puede incrementar la angiogénesis en células de CP agresivo, ya que
provoca un aumento los niveles de VEGF liberados por las células. Una vez
más, los antagonistas de GHRH producen el efecto contrario a GHRH
reduciendo los niveles de la molécula pro-angiogénica, VEGF, in vitro e in vivo,
con lo cual, podemos concluir que son compuestos anti-angiogénicos. Los
efectos descritos por los antagonistas MZ-J-7-118 y RC-3940-II, en células de
CP avanzado avalan los resultados obtenidos en nuestro trabajo (Stangelberger
y col., 2005a). Se ha visto que bajo condiciones de hipoxia, como sucede en el
interior tumoral, se produce un incremento de MMP9 y MMP2 que regula
positivamente los niveles de VEGF (Gong y col., 2014a; Hollborn y col., 2007),
hecho que puede explicar los resultados obtenidos en nuestros modelos
experimentales. En nuestro estudio in vivo, los grupos tratados con los
antagonistas muestran una reducción importante en los niveles de HIF-1α, lo
que puede provocar la reducción de los niveles de las MMPs y del VEGF
observada en los tumores. A su vez, se ha descrito que la actividad de HIF-1α es
potenciada por la β-catenina (Kaidi y col., 2007); por lo tanto, la disminución del
contenido de dicha proteína provocada por los antagonistas de GHRH podría
estar directamente implicada en la reducción del HIF-1α, que a su vez podría
reducir VEGF y MMPs, y con ello la vascularización de los tumores.
La diferenciación neuroendocrina es una característica típica del

carcinoma prostático humano, presente en el 5% de las células que forman el
- 189 -
tumor (Conteduca y col., 2014). La neurodiferenciación hace que las células

generen de forma autónoma neuropéptidos y factores de crecimiento que activan
vías de señalización potenciadoras de la progresión tumoral, participando en la
evolución del CP hacia la independencia androgénica (Conteduca y col., 2014;
Surcel y col., 2014). Nuestro grupo de investigación tiene estudios previos de
diferenciación neuroendocrina en CP utilizando células LNCaP, mostrando que
el neuropéptido VIP es capaz de inducir dicho proceso (Gutierrez-Cañas y col.,
2005; Collado y col., 2004; Juarranz y col., 2001). Al pertenecer ambos péptidos
a la misma familia, quisimos comprobar si GHRH era capaz de favorecer la
aparición de neuritas al igual que el VIP, concluyendo que, GHRH induce la
neurodiferenciación de las células LNCaP a tiempos cortos, y este hecho es
parcialmente bloqueado por el antagonista MIA-690. Este efecto nos indica que
GHRH podría inducir la progresión tumoral hacia un estado de
independencia androgénica a través de la neurodiferenciacion en células
dependientes de andrógenos, así como, los antagonistas podrían bloquear
esa progresión al reducir dicha neurodiferenciación.
A modo de resumen podemos afirmar que GHRH activa la

proliferación, progresión del ciclo celular, migración, angiogénesis y
neurodiferenciación e impide la adhesión celular, promoviendo la
progresión tumoral llevando a las células tumorales prostáticas a un
fenotipo prometastásico, que es bloqueado por los antagonistas de GHRH.
Además, hemos estudiado, los biomarcadores representativos de cada proceso
que pueden relacionarse entre sí directa e indirectamente por intermediación de
varias moléculas. En este sentido, las PKCs se han descrito como moléculas
esenciales que median en la señalización conducente al fenotipo metastásico
(Kang, 2014). Por ello, valoramos su participación en estos procesos y su
relación con los efectos producidos in vivo por los antagonistas JMR-132 y JV-
1-38. El grupo del Dr. Schally ha descrito los cambios producidos en algunas
isoformas de PKC tras el tratamiento con diversos antagonistas de GHRH en
- 190 -
cáncer de mama, pulmón y endometrio (Kanashiro y col., 2004; Stangelberger y

col., 2005b; Wu y col., 2010). Así, se ha descrito la sobreexpresión de PKC-α, -βI
y -βII en CPRC (Cornford y col., 1999; O'Brian, 1998), y se ha comprobado que
favorecen el crecimiento tumoral, inhiben la apoptosis, y en el caso de PKC-β,
también inhibe la angiogénesis (Kang, 2014; Kim y col., 2008). Nuestros
resultados indican que los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38,
disminuyen la expresión de las isoformas α, -βI y -βII en tumores PC3
xenotransplantados, de forma similar a los efectos producidos por los
antagonistas MZ-J-7-118 y RC-J-29-18 (Stangelberger y col., 2005b). En
cambio, los antagonistas JMR-132 y JV-1-38 inducen la expresión de PKC-δ,
una isoforma anti-proliferativa y pro-apoptótica que actúa a través de MAPK y
p53 (Gonzalez-Guerrico y col., 2005; Perletti y Terrian, 2006). Resultados
similares a los nuestros se han descrito en células de cáncer de endometrio (Wu
y col., 2010). Los altos niveles de PKC-δ producidos por los antagonistas de
GHRH, JMR-132 y JV-1-38, en los tumores PC3 podrían explicar el aumento
de expresión de p53 y p21, factores de transcripción reguladores de apoptosis y
ciclo celular. Se ha descrito que la PKC-ζ, es oncosupresora en el CP inhibiendo
a c-myc (Kim y col., 2013), nuestros resultados muestran que los antagonistas
incrementan los niveles de PKC-ζ, a la vez que reduce los de c-myc, y estos
hechos estarían relacionados entre sí. Los efectos producidos por los
antagonistas de GHRH sobre los niveles de las diferentes isoformas de PKC,
apoyan la idea de la compleja señalización que emplean los antagonistas para
producir sus efectos, siendo necesario profundizar en los mecanismos
moleculares implicados.
Una vez demostrado que GHRH favorece la progresión del CP hacia un

estadio metastásico, el siguiente objetivo que nos planteamos fue estudiar una de
las cascadas de señalización más implicadas en esta progresión, la vía del EGFR
- 191 -
(Berger y col., 2006). Resultados previos de nuestro grupo muestran que el

neuropéptido VIP provoca la transactivación de los receptores de EGF a
diferentes tiempos en las células de cáncer de próstata y de mama avanzado
(Sotomayor y col., 2007; Valdehita y col., 2009). En nuestro estudio GHRH
modula la activación de EGFR y HER2 en células PC3 a través del
incremento en su expresión y fosforilación, con una respuesta rápida a los
30 s y otra más tardía a los 30 min, al igual que se ha descrito en presencia de
VIP (Sotomayor y col., 2007). En la respuesta temprana están implicadas las
moléculas de EGFR y HER2 ya presentes en la célula, sin embargo, en la más
tardía pueden estar implicadas también moléculas sintetizadas de novo de estos
receptores generadas a raíz de la primera respuesta. Por el contrario, los
antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38 y MIA-690, bloquean tanto la
respuesta temprana como la tardía generadas por la hormona. Resultados
similares se obtienen en el estudio in vivo de los niveles de EGFR activado. Por
el contrario, los niveles de HER2 activado se encuentran aumentados en los
tumores tratados con los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, si bien su
localización se focaliza exclusivamente bajo la membrana. Este hecho podría
indicar el proceso de internalización de los receptores HER2, ya que se ha
descrito que este receptor sufre un proceso de internalización más rápido al
formar heterodimeros y cuando se encuentra en presencia de ligandos de EGFR
(Hendriks y col., 2003), aunque habría que estudiar dicho proceso para poder
constatar que los receptores están siendo retirados para su posterior
degradación.
HER2 es el receptor preferido para heterodimerizar con el resto de

receptores de la familia EGF y producir potentes señales mitogénicas (Yen y
col., 2002), asi como para potenciar la progresión hacia CPCR (Berger y col.,
2006). En nuestro estudio, si EGFR es inhibido, GHRH no es capaz de activar a
HER2. Por el contrario, al inhibir HER2 sí se consigue activar a EGFR en
presencia de la hormona. Por lo tanto, podemos concluir que GHRH activa
- 192 -
EGFR y este dimeriza con HER2 provocando su activación. Además, la

fosforilación de EGFR podría activar otros miembros de la familia HER y que a
su vez ellos activen a HER2.
Los GHRH-R están acoplados a proteínas G, y su activación puede

inducir la formación de cAMP que, a su vez, activa a PKA, esta activación se ha
descrito que es fundamental para la progresión tumoral en ausencia de
andrógenos (Csernus y col., 1999a). En nuestro trabajo se demuestra que
GHRH transactiva a los receptores EGFR y HER2 a través de PKA en
tiempos cortos de exposición a la hormona. Diversos estudios han señalado a
la familia de la tirosina quinasa Src como mediador intracelular de la
transactivación de los receptores de EGF (Delcourt y col., 2007; El Zein y col.,
2010). En este estudio se confirma que Src media la transactivación temprana
de EGFR y HER2 producida por GHRH, y que esta, además, incrementa los
niveles de activación de Src a tiempos cortos (<1 h) y largos (>2 h). Por otro
lado, los antagonistas de GHRH, JMR-132, JV-1-38 y MIA-690 son capaces de
bloquear la activación de Src producida por GHRH. Con estos resultados
podemos concluir que GHRH es capaz de activar a PKA y Src que fosforilan
a EGFR induciendo la transactivación de un modo temprano e
independiente de ligando. Además, la activación de Src podría ser
consecuencia directa de la activación de PKA provocada por GHRH.
La transactivación de la familia EGFR puede ser dependiente de la unión

de un ligando a dichos receptores. Esta vía de activación se lleva a cabo
mediante ligandos (HB-EGF, AR, TGF-α, etc) anclados a la membrana que son
liberados por la acción de diversas metaloproteasas (Higashiyama y col., 2011).
En nuestro estudio se muestra como a tiempos largos GHRH transactiva los
receptores EGFR y HER2 a través de las metaloproteasas, y entre ellas, se ha
comprobado que TACE/ADAM17 es una de las implicadas en dicha activación.
Además, GHRH incrementa los niveles de TACE a partir de los 5 min de
- 193 -
exposición a la hormona. En resumen, estos resultados nos indican que a

tiempos largos GHRH induce una transactivación de EGFR dependiente
de ligando a traves de metaloproteasas. En este sentido, y una vez
comprobado que GHRH activa a Src a diferentes tiempos, éste podría activar a
TACE y así iniciar la vía dependiente de ligando.
Los resultados obtenidos con GHRH apuntan en la misma dirección que

los estudios realizados con VIP, el cual se ha descrito que induce la
transactivación de los receptores EGFR y HER2 dependiente e independiente
de ligando en células PC3 (Sotomayor y col., 2007). Otros estudios han
demostrados la capacidad de los GPCRs para transactivar a miembros de la
familia del EGFR, como el receptor de prostaglandina E2 en células renales
(Fernández-Martínez y Lucio., 2013) y el receptor sensible a Calcio (CaR) en
células prostáticas, que activan a EGFR (Yano y col., 2004).
Por otro lado, la activación de receptores tirosina quinasa inducida por

factores de crecimiento provoca la liberación extracelular de algunos ligandos
de GPCRs, que se unen y activan el receptor correspondiente de forma
autocrina/paracrina (Delcourt y col., 2007; Mira y col., 2001). En una primera
aproximación para comprobar este hecho, se estudia si EGF afecta a los niveles
de expresión de GHRH y GHRH-R, observando un aumento de los niveles de
los mRNA para ambos en células de cáncer de próstata independientes de
andrógenos. Estos resultados muestran que entre GHRH y EGF existe una
interrelación en cáncer de próstata avanzado que podría retroalimentar los
efectos biológicos de ambas vías de señalización.
La familia del EGFR está implicada en procesos que favorecen la

progresión tumoral como son proliferación, adhesión, migración y angiogénesis.
Como hemos comprobado anteriormente GHRH transactiva EGFR y HER2,
por ello, quisimos comprobar si los efectos que ejerce la hormona sobre la
progresión tumoral, pueden deberse a dicha activación. Nuestros resultados
- 194 -
indican que la transactivación de EGFR inducida por GHRH es, en parte,

responsable del incremento de VEGF y de la migración celular provocada
por la hormona en células PC3, y por el contrario, la transactivación de HER2
es la responsable de la disminución en la adhesión celular provocada por
GHRH. Este último resultado, junto con el hecho de que GHRH no transactiva
directamente a HER2, nos lleva a pensar que este receptor puesde estar siendo
activado por otros miembros de la misma familia, mediante heterodimerización.
La importancia de los resultados analizados en este trabajo, nos llevó al

diseño de un estudio in vivo en tumores PC3 sobre el efecto combinado del
antagonista de GHRH con mejores resultados, MIA-690, y de un inhibidor
reversible de EGFR, Gefitinib, agente quimioterapéutico aprobado para el uso
clínico en el cáncer de pulmón (Melosky, 2014). El tratamiento combinado de
ambos agentes provoca una mayor reducción en el crecimiento tumoral que el
efecto producido usando cada compuesto por separado, incrementando de forma
importante el tiempo de duplicación del tumor. Además, un análisis preliminar
del nivel angiogénico en los tumores generados indica que la combinación de
ambos compuestos potencian la disminución del factor proangiogénico VEGF.
Por otro lado, el estudio de la actividad glucolítica tumoral en los animales, nos
indica la reducida presencia de focos metastásicos en el grupo tratado con la
combinación de ambos compuestos. A falta de un análisis más exhaustivo de los
tumores extraidos, podemos apuntar que la combinación de MIA-690 y de
Gefitinib reduce el crecimiento tumoral y metástasis de tumores PC3,
apoyando el posible uso terapéutico de la combinación ambos compuestos.
La terapia combinada con ambas moléculas hará que, por un lado, MIA-690
inhiba la vía de GHRH, asi como, la activación de EGFR y HER2 que provoca
la hormona, y por otro lado, Gefitinib inhiba la activación de EGFR inducida
por otras moléculas (bloquea el sitio de unión al ATP).
- 195 -
En resumen, los resultados presentados en esta tesis señalan a GHRH

como una molécula capaz de inducir procesos requeridos para el desarrollo
de un fenotipo metastásico en el CP, convirtiéndose de esta forma en una
diana terapéutica para la cura de esta enfermedad. En este sentido, los
antagonistas de GHRH quedan definidos como perfectos inhibidores de la
acción neoplásica de dicha hormona, siendo avalados por los ensayos in vivo. Los
antagonistas de GHRH deben ser considerados para su uso en futuras
estrategias terapéuticas por sí solos o en combinación con inhibidores de
EGFR en el CP avanzado.
- 196 -
6. CONCLUSIONES
Conclusiones Universidad de Alcalá
1. Las tres líneas celulares prostáticas, RWPE-1, LNCaP y PC3 sintetizan

GHRH, siendo mayores sus niveles proteicos en las células tumorales con
respecto a las no tumorales, y dentro de ellas en las representativas del
estadio más avanzado de la enfermedad.
2. Los receptores de GHRH se localizan en la membrana plasmática y

citoplasma, y están diferencialmente expresados, p-GHRH-R es
mayoritario en la línea celular LNCaP, y las variantes de splicing SVs, en
células PC3. Además, los antagonistas de GHRH incrementan los niveles
de mRNA de los receptores de GHRH en células PC3.
3. GHRH incrementa, y sus antagonistas disminuyen, la viabilidad de las

tres líneas celulares, con mayores efectos sobre las células representativas
del CP avanzado.
4. GHRH incrementa la proliferación celular de las tres líneas prostáticas,

mostrándose significativamente mayor para las células RWPE-1. En
paralelo, GHRH provoca un incremento del marcador de proliferación
PCNA, de forma más rápida y contundente en las células representativas
de un estadio de CP agresivo. Los antagonistas de GHRH provocan el
efecto contrario, y además en presencia de GHRH boquean su acción sobre
las células PC3.
5. GHRH provoca un incremento de células en fase mitótica, y sus

antagonistas inducen parada del ciclo celular y apoptosis en células de
CP avanzado, mediados por la disminución de los niveles de p21, p53 y
Bax/Bcl2. Los antagonistas de GHRH ejercen in vitro el efecto opuesto
sobre dichas moléculas.
- 199 -
Universidad de Alcalá Conclusiones
6. GHRH disminuye la adhesión de células prostáticas a una base de

colágeno, a la vez que reduce los niveles de E-cadherina e incrementa los
niveles de β-catenina en el núcleo, así como la expresión de sus genes diana
CD44, c-myc y ciclina D1. Los antagonistas de GHRH ejercen un efecto
opuesto al de GHRH sobre células prostáticas.
7. GHRH incrementa la migración de células RWPE-1 y PC3, acompañada

de un incremento de los niveles de expresión y actividad gelatinolítica de
las MMP2 y 9. Los antagonistas de GHRH reducen la migración en ambas
líneas celulares, al igual que los niveles de las MMPs.
8. GHRH aumenta los niveles de VEGF en células de CP agresivo, mientras

que sus antagonistas reducen dichos niveles.
9. GHRH aumenta la diferenciación neuroendocrina en células LNCaP a

tiempos cortos, lo que es bloqueado parcialmente por el antagonista MIA-
690.
10. GHRH induce la capacidad tumorigénica de las células epiteliales

prostáticas RWPE-1, llegando a desarrollar tumores en un modelo
experimental in vivo.
11. Los antagonistas de GHRH, JMR-132 y JV-1-38, en un modelo in vivo

de CP avanzado reducen el volumen tumoral, y modulan la expresión de
diferentes biomarcadores lo que lleva a un efecto pro-apoptótico,
antimitogénico, anti-angiogénico, anti-migratorio y anti-invasivo.
12. GHRH transactiva EGFR, y este heterodimeriza con HER2, que puede
ser activado por otros miembros de la familia del EGFR. Dicha
transactivación puede ser de respuesta temprana o independiente de
- 200 -
Conclusiones Universidad de Alcalá
ligando a través de PKA y Src; y tardía o dependiente de ligando por la

acción de metaloproteasas como ADAM17. La transactivación de EGFR y
HER2 producida por GHRH es, en parte, responsable de los efectos
ejercidos por la hormona sobre la adhesión, migración y angiogénesis.
13. El antagonista de GHRH, MIA-690 en combinación con el inhibidor de

EGFR, Gefitinib, reducen el volumen de tumores PC3 en ratones
inmunodeprimidos con mayor magnitud que usando cada tratamiento por
separado.
En conclusión, los resultados mostrados en este trabajo proponen a

GHRH como agente protumoral, activando diferentes vías de señalización
implicadas en los procesos favorecedores de la progresión tumoral, lo que nos
lleva a señalar a sus receptores como dianas terapéuticas en el tratamiento del
cáncer de próstata. En este sentido, los antagonistas de GHRH se presentan
como posibles agentes terapéuticos por sí solos o en combinación con otros
agentes antineoplásicos utilizados actualmente en clínica, para la cura de esta
enfermedad.
En la figura 77 se muestra un esquema de la interacción de GHRH con
diferentes elementos celulares, bloqueada por la intermediación de los
antagonistas de GHRH.
- 201 -
Universidad de Alcalá Conclusiones
A) Antagonistas
de GHRH
GHRH
α β γ
p53
HIF-1α
STAT3 E-Cadherina
p21
ERK1/2
Bax Bcl2 β-Catenina
p21 MMP9 y 2
PCNA
ciclina D1 CD44 VEGF
c-myc
S
G1
M G2
Apoptosis Perdida de adhesión
Proliferación celular Ciclo celular Angiogénesis
y migración celular
B) Antagonistas
de GHRH
Ligandos
GHRH EGFR EGF
ADAM
GHRH-R EGFR HER2
α β γ α βγ
PKA
p Src
GHRH
GHRH-R
EGFR GHRH
HER2 GHRH-R
Figura 77. Efectos de GHRH y sus antagonistas sobre moléculas y fenotipos

implicados en la progresión del CP (A). Transactivación de EGFR y HER2
mediada por GHRH en células de CP avanzado (B). (EP)
- 202 -
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- 232 -
8. SUMMARY
Universidad de Alcalá Summary
Prostate cancer (PC) is the second most common malignancy

worldwide, and one of the most common cancer-specific cause of mortality in
men. Therefore this disease represents a major international social, health and
economic problem. Currently, the treatment modalities for the disease in
localized tumour or androgen-dependent stage yield good results in most
patients. However, such treatments are only palliative in the advanced
androgen-independent stage. The main problem is that once PC has progressed
to androgen independence, cancer cells acquire invasive capability and
metastasize to lymph nodes and distant tissues, mainly bone tissue. Therefore,
research is needed to find new therapeutic targets and contribute to the design
of effective treatments.
Growth hormone releasing-hormone (GHRH) is a hypothalamic

peptide that has also been found in other extra-hypothalamic tissues (placenta,
ovary, gastrointestinal tract, neuroendocrine tissue, and testis) and in various
tumour malignancies (breast, prostate, lung, endometrium, ovary, kidney and
lymphomas). GHRH regulates the secretion of growth hormone (GH) at the
anterior pituitary after binding to its receptor p-GHRHR, which belongs to the
family of G protein-coupled receptors (GPCRs). GH stimulates the production
of insulin-like growth factor I (IGF-1), which plays a crucial role in the
progression of malignancy in various tumours. Moreover, 4 splice variants
(SVs) of pituitary GHRH receptor have been discovered. Among these
receptors, SV1 is the main SV that mediates the effect of GHRH and its
antagonists in tumour tissues. Since 1994, the group of Dr. A. V. Schally has
synthesized GHRH antagonists, for therapeutic use in the management of
various tumours. In vitro and in vivo studies have demonstrated that GHRH
antagonists suppress the growth of several experimental cancers.
In our study, we demonstrate the presence of GHRH in tumour and non-

tumour prostate cells, with a greater expression in more advanced stages of PC.
- 237 -
Summary Universidad de Alcalá
Similarly, GHRH receptors are present in all prostate cell lines tested, with
increased expression of p-GHRHR in non-tumour cells and SVs in advanced
PC cells. Moreover, the expression of GHRH receptors was increased after
GHRH antagonists treatment in advanced PC cells.
Present results demonstrate that GHRH increases the viability and

proliferation in tumour and non-tumour prostate cells, and the expression of the
cell proliferation marker, PCNA. Conversely, GHRH antagonists inhibit the
viability and proliferation of these cell lines, and block the effect of GHRH on
these phenotypes. Additionally, GHRH helps to cycle progression and causes an
anti-apoptotic effect in advanced PC cells. These effects are produced by
decreasing the expression of p21, p53 and the ratio Bax/Bcl2. Treatment with
GHRH antagonists shows opposite results, causing an arrest cycle cell in S
stage and an activated apoptotic process, due to an increase in expression levels
of p21, p53 molecules and the ratio Bax/Bcl2
The start of the metastatic process is related to a loss of tumoral

adhesion (cell-cell or cell-extracellular matrix). Our results indicate that GHRH
reduces adhesion in tumour and non-tumour prostate cells, which activates the
first step of the metastatic phenotype. This activation is achieved by a reduction
in the E-cadherin levels and an increase of nuclear expression of β-catenin, and
its target genes CD44, c-myc and cyclin D1. GHRH antagonists exert an
opposite effect on adhesion and expression of marker molecules.
When tumour cells lose their adhesive properties, they can degrade the
extracellular matrix to migrate and invade the vascular system and other
tissues. In this regard, migration capability and both expression and activation
levels of MMP9 and MMP2 were increased by GHRH in non-tumour and
tumour cells. Furthermore, GHRH increased proangiogenic factor VEGF levels
in advanced PC cells. Conversely, GHRH antagonists reduced the migration
ability of cells, and the expression and activity levels of MMPs and VEGF.
- 238 -
Universidad de Alcalá Summary
Neuroendocrine differentiation promotes tumour progression and

evolution of PC towards androgen independence stage. GHRH causes
neuroendocrine differentiation in androgen-dependent PC cells, and this effect is
blocked by GHRH antagonists.
In vivo assays have shown that GHRH is an agent that transform non-
tumour prostate cells into tumour prostate cells, and these cells can induce a
tumour in experimental animals. Furthermore, we have observed a significant
reduction of PC tumour in the groups treated with GHRH antagonists. In this
regard, we have been found that GHRH antagonists modulate molecules
involved in tumour progression, exerting pro-apoptotic, anti-mitogenic, anti-
angiogenic, anti-migration and anti-invasive effects.
The EGFR pathway is one of the most important signalling cascades

involved in PC progression. In our study, we found that GHRH transactivates
EGFR and HER2 receptors in advanced PC cells. This transactivation was
early or ligand-independent through PKA and Src; and late or ligand-
dependent by the action of metalloproteinases such as ADAM17. In addition,
we found that EGFR and HER2 transactivation produced by GHRH is partly
responsible for the effects exerted by the hormone on cell adhesion, migration
and angiogenesis. These relevant results led us to perform in vivo assays to test
the effect of the GHRH antagonist, MIA-690, EGFR inhibitor, Gefitinib, and
combined treatment with both agents. Combined therapy improves the
reduction of the tumour size and diminishes the presence of metastatic foci.
The results of this study support GHRH as a potential therapeutic target

for PC, due to the important modulation of molecules and signalling pathways
that induce the progression of PC. In this regard, GHRH antagonists, alone or
in combination with other compounds, could be considered for the development
of new therapies for advanced prostate cancer.
- 239 -
9. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
Universidad de Alcalá Producción científica
El resultado de esta Tesis Doctoral ha permitido la publicación de las

siguientes publicaciones internacionales y capítulos de libro nacionales:
Muñoz-Moreno L, Arenas MI, Carmena MJ, Schally AV, Prieto JC, Bajo
AM. New insights into the inhibitory action of antagonists of growth hormone-
releasing hormone in androgen-independent prostate cancer tumors. (2014)
Mol Cell Endocrinol. (Enviado)
Muñoz-Moreno L, Prieto JC, Carmena MJ y Bajo AM. Transactivación

de EGFR y HER2 inducida por la hormona liberadora de la hormona del
crecimiento (GHRH) en cáncer de próstata avanzado. (2014)
Libro: V Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Universidad de Alcalá.
(Aceptado)
Muñoz-Moreno L, Arenas MI, Carmena MJ, Schally AV, Prieto JC, Bajo
AM. Growth hormone-releasing hormone antagonists abolish the
transactivation of human epidermal growth factor receptors in advanced
prostate cancer models. (2014) Invest New Drugs. 32: 871-882
Muñoz-Moreno L, Arenas MI, Schally AV, Fernández-Martínez AB,

Zarka E, González-Santander M, Carmena MJ, Vacas E, Prieto JC, Bajo
AM. Inhibitory effects of antagonists of growth hormone-releasing hormone on
growth and invasiveness of PC3 human prostate cancer. (2013) Int J Cancer.
132:755-765
- 243 -
Producción científica Universidad de Alcalá
Muñoz-Moreno L, Prieto JC y Bajo AM. Efecto de los antagonistas de la

hormona liberadora de la hormona del crecimiento, JMR-132 y JV-1-38, en
modelos experimentales de cáncer de próstata. (2013) Vol.1. Pgs. 389-397
Libro: IV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Universidad de
Alcalá. I.S.B.N.:978-84-15834-15-1.
Igualmente durante la realización de esta Tesis Docotral he contribuido

activamente con otras líneas de investigación. Fruto de ello es la publicación de
varios artículos internacionales y la presentación de una patente a nivel
nacional:
Benabdelouahab Y, Muñoz-Moreno L, Frik M, de la Cueva-Alique I, El

Amrani MA, Contel M, Bajo AM, Cuenca T, Royo E. Self-aggregation and
anticancer properties of water soluble p-cymene Ru(II) compounds with chiral
amino-oxime ligands derived from R-limonene. (2014) Organometallics.
(Enviado)
Vacas E, Muñoz-Moreno L, Fernández-Martínez AB, Bajo AM,

Sánchez-Chapado M, Prieto JC, Carmena MJ. Signalling pathways involved
in antitumoral effects of VIP in human renal cell carcinoma A498 cells: VIP
induction of p53 expression. (2014) Int J Biochem Cell Biol Cancer. 53: 295-
301
Vacas E, Arenas MI, Muñoz-Moreno L, Bajo AM, Sánchez-Chapado M,

Prieto JC, Carmena MJ. Antitumoral effects of vasoactive intestinal peptide in
human renal cell carcinoma xenografts in athymic nude mice. (2013) Cancer
Letters. 336: 296-303
- 244 -
Universidad de Alcalá Producción científica
Sotomayor S, Muñoz-Moreno L, Carmena MJ, Schally AV, Sánchez-

Chapado M, Prieto JC, Bajo AM. Regulation of HER expression and
transactivation in human prostate cancer cells by a targeted cytotoxic bombesin
analog (AN-215) and a bombesin antagonist (RC-3095) (2010) Int J Cancer.
127: 1813-1822
Patente Nacional. Complejos areno de Ru(II) con ligandos oxima con

actividad anticancerígena
Inventores: Universidad de Alcalá, Université Abdelmalek Essaadi,
Laura Muñoz Moreno, Eva Royo Cantalabrana, Ana María Bajo
Chueca, Tomás Cuenca Agreda, Yosra Benabdelaouahab.
N.º de solicitud: P201300949 Fecha de prioridad: 10/10/2013
País de prioridad: España (En revisión)
- 245 -
10. FINANCIACIÓN
Universidad de Alcalá Financiación
Esta Tesis Doctoral se ha realizado gracias a la financiación de

organismos públicos, a través de los proyectos que se detallan a continuación:
Efecto del antagonista de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento

(GHRH), JMR-132, en la progresión hacia la metástasis ósea del cáncer de
próstata. CCG08/UAH/BIO-3782
Comunidad de Madrid/Universidad de Alcalá. 21.093 euros
Investigador principal: Ana M. Bajo Chueca
Efecto de antagonistas de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento

(GHRH), en la progresión del cáncer de próstata. PPII10-0189-3222
Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha. 65.000 euros
Programa de Incentivación de la Incorporación e Intensificación de la Actividad

Investigadora (PI3)-Financiación I3.
MEC/Universidad de Alcalá. 39.000 euros
Efectos de los nuevos antagonistas de la hormona liberadora de la hormona de

crecimiento (GHRH) en la progresión del cáncer de mama. Efecto de los
antagonistas en el cáncer de mama triple negativo. FIB-PI13-04
Fundación de Investigación del Hospital Universitario Príncipe de
Asturias. 4.000 euros.
Durante la realización de esta Tesis Doctoral he disfrutado de una beca

de Formación del Profesorado universitario (FPU) de la Universidad de
Alcalá.
- 249 -

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Programa de Doctorado en Señalización Celular

Tesis Doctoral presentada por

LAURA MUÑOZ MORENO

Tesis Doctoral presentada por

LAURA MUÑOZ MORENO

DRA. ANA MARÍA BAJO CHUECA

DRA. MARÍA JOSÉ CARMENA SIERRA

Alcalá de Henares, 2014

ANA MARÍA BAJO CHUECA y MARÍA JOSÉ CARMENA SIERRA

Que el trabajo presentado por Laura Muñoz Moreno, titulado “HORMONA

Dra. Ana Mª Bajo Chueca Dra. Mª José Carmena Sierra

ANTONIO JIMÉNEZ RUIZ, como Director del Departamento de Biología de

Que Tesis Doctoral que lleva como título: “HORMONA LIBERADORA DE

Dr. Antonio Jiménez Ruiz

No podía comenzar sin agradecer a Juan Carlos por acogerme en su laboratorio,

de “autógrafos”…He aprendido muchísimo de ti durante estos años.

Todavía recuerdo el primer momento que llegué al laboratorio para

apoyo, por escucharme y ayudarme a nivel personal.

Como olvidarme de mi querida Co-directora Maria José, tantos años planificando

experimentos, proyectos y congresos, inventándonos “que hacer”, y peleándonos con cada

darme alguna oportunidad como docente, no cambies nunca, eres increíble!

siempre juntas, peleando por hacernos un hueco en el maravilloso mundo de la

nombramiento como profesora titular, porque te lo mereces, pero prometo no equivocarme

posible, siempre me han dado todo lo que necesitaba, gracias!.

Toño, mi farmacéutico particular, eres un tío increíble de verdad, no olvidaré esas

estos años tendrá una gran recompensa.

Mis antecesoras…Valdehita, he tenido la suerte de disfrutar de ti durante unos

meses, y de esas charlas y consejos a la hora de la comida, ojalá se vuelvan a repetir, te

“Prietas” que últimamente está complicado. A mis posibles predecesoras…Bea, Isabel y

Mali, Pablo, Ester, Carmen…

Agradecer la compañía en esas eternas prácticas de los técnicos Miguel y Luis, a

A todos los profesores del departamento, en especial a Eduardo y Miguel Ángel

las chicas de la academia, que me han acompañado durante estos años.

especialmente a mis peques que adoro, Diego y Martita.

α-SMA: Actina de músculo liso α EGFR: Receptor del factor de crecimiento

HGPIN: Neoplasia prostática intraepitelial de OMS: Organización Mundial de la Salud

SVs: Variantes de splicing

1.1.6.3 Dependencia/Independencia androgénica……...………… 16

3.2.2.9 Aislamiento de membranas y núcleos……..……………… 90

4.2 Efecto de GHRH y de sus antagonistas en procesos implicados en la

4.2.1 Viabilidad celular y citotoxicidad…….……………………….…101

4.2.2.2 Efecto de los antagonistas de GHRH sobre la

4.2.2.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la.expresión de

4.2.3 Ciclo celular y apoptosis en PC3.…….……………………….… 110

4.2.4 Adhesión celular.…….……………………………………….…. 115

4.2.4.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de.

4.2.4.3 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de

4.2.4.4 Efecto de GHRH y sus antagonistas en la expresión de,

4.2.5 Migración celular.……….……………………………..………. 126

4.3.3.1 Mediadores intracelulares de la transactivación de EGFR

4.3.3.2 Efecto de GHRH y sus antagonistas sobre la activación

4.3.3.3 Implicación de las metaloproteasas en la transactivación

4.3.3.5 Implicación de la transactivación de EGFR y HER2

4.3.3.6 Efecto del factor de crecimiento epidérmico, EGF, sobre

4.4 Estudio del efecto los antagonistas de GHRH en un modelo

4.4.1 Efecto de JMR-132 y JV-1-38 en el crecimiento de tumores

4.4.1.1 Ensayos de tumorigenicidad………………………………. 153

4.4.2.1 Ensayos de tumorigenicidad…………….………………… 171

En 1853, J. Adams, un cirujano inglés realiza la primera descripción del

1.1 CÁNCER DE PRÓSTATA

La próstata es una glándula del aparato reproductor masculino que aporta

• Zona anterior: exclusivamente fibromuscular.

Próstata Uretra Zona central