UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL - EPIP 1

MICROBIOLOGÍA GENERAL

ALUMNA:

Pomalaza Guerrero, Lynda Criss

ESCUELA:

Escuela de Ingeniería Pesquera

CURSO:

Muestreo y Control de Calidad

TEMA:

Análisis microbiológico de pescado fresco

PROFESOR:

Ing. Edmundo Guzmán

GRADO:

3 ero

AÑO:

2011
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1. OBJETIVO:

1.1. Objetivo General:

 Análisis microbiológico de pescado fresco.
1.2. Objetivo Especifico:
 Determinar que esté libre de patógenos.
 Determinación del agente microbiano “Aerobios Mesófilos”.
 Analizar quela especie tenga baja carga de m.o alterantes.
 Determinación del Gram.

2. INTRODUCCIÓN:

2.1. ANALÍSIS MICROBIOLÓGICO DEL PESCADO FRESCO:

Sirve para catalogar a estos productos (pescado o marisco fresco), como acto
para el consumo humano, este análisis tiene que cumplir los siguientes requisitos:

 Que esté libre de patógenos ( m.o ):

El primer requisito es difícil de cumplir por la amplia diversidad de m.o
patógenos, por lo que se ha optado a seleccionar grupos de organismos
indicadores que adviertan la posible presencia de m.o patógenos. Los m.o
indicadores de mayor importancia en productos frescos son los siguientes:

LAS ENTEROBACTERIAS
LOS COLIFORMES
Escherichia coli
Enterococus fecalis CONTAMINACIÓN FECAL
Clostridium sulfito reductores
Staphylococcus aureus CONTAMINACIÓN POR
MANIPULACIÓN

 Que tenga baja carga de m.o alterantes:

La norma sanitaria estipula los siguientes criterios microbiológicos de
calidad sanitaria e inocuidad para alimentos y bebidas para el consumo
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humano ha seleccionado los siguientes grupos de m.o que para cada

grupo de alimentos y los limites que separan los tipos de calidad:

XI.1 Productos microbiológicos crudos (frescos,refrigerados,congelados,

salpresos)

LIMITE POR
AGENTE CATEGORÍA CLASE n c gr
m M
MICROBIANO S
Aerobios 2 3 5 2 5,0x10 106
5
Mesófilos

2.2. ESPECIE DONCELLA:

Hábitat:
Las doncellas viven en áreas arenosas o pobladas de escombros; durante la
noche, las doncellas de menor tamaño duermen bajo los escombros de arena; las
de mayor tamaño descansan en cuevas o bajo las salientes.

Distribución:
Las doncellas viven en las regiones cálidas del océano Pacífico y el mar Rojo.

Alimentación:
La Doncella se alimentan de camarones, almejas, caracoles y erizos de mar
ocultos. Cuando atrapan una presa, la trituran con los dientes faríngeos o muelas
de la garganta.

Reproducción:
Las doncellas nacen como hembras o machos. Estos peces son hermafroditas
protóginos, lo cual significa que pueden nacer como hembras y luego
transformarse en machos. El cambio de sexo asegura que siempre haya una
hembra para un macho, para que así suceda la reproducción.

2.3. GRAM:
Las Gram se dividen en dos grupos:
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Bacteria Gram positiva:

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se

tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-
positivas" o también "grampositivas".[] Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como
taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria.[] Las restantes son las bacterias Gram
negativas.
La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana
citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que
rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante
moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a
estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A
diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda
membrana lipídica externa a la pared celular y esta pared es mucho más gruesa.
[

Bacteria Gram negativa:

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se

tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue:
de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también "gramnegativas". [1] Esta característica
está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo
natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y
cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Negibacteria.[2] Las restantes
son las bacterias Gram positivas.
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se
localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-
positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptiglicano es mucho más
gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram[.]
]

3. MATERIALES:

MUESTRA NATURAL:
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 Doncella

MATERIALES BÁSICOS:

 Vaso de licuadora y sus  1 pinza

partes esterilizada  1 asa de kolle
 Matraz  Fósforo
 3 tubos de ensayo  1 plumón indeleble
 4 placas petri  Mechero Bunsen
esterilizadas  Porta objetos
 1 gradilla  Algodón
 1 tijera esterilizada  Aceite de inmersión

EQUIPOS:

 Incubadora  Microscopio
 Motor de licuadora

SOLUCIONES:

 Solución salina peptonada  Lugol.

 PCA

INDICADORES:

 Violeta cristal  Safranina

 Alcohol-acetona

4. METODOLOGÍA:
4.1. TOMA DE MUESTRA:

1. Sacar una muestra representativa y guardarlo en una bolsa estéril, siguiendo la

técnica aséptica.
2. Guardar en refrigeración a 0°C ó -4°C para el transporte.
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3. Analizar lo más rápido posible.

4.2. PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES:

1. Ensamblar un vaso de licuadora estéril

2. Pesar 50 gr de muestra
3. Agregar 450 cm3 (450 mL) de SSP.
4. Triturar a máxima velocidad por 2 minutos.
5. Dejar reposar por 5 minutos para obtener el líquido.
6. Vaciar un poco de líquido sobrenadante al matraz de SSP y considerando como la
dilución de 10-1.
7. Tomar 1 mL de la dilución de 10-1y llevarlo aún tubo de 9mL de SSP, para obtener
la dilución 10-2.
8. Tomar 1 mL de la dilución de 10-2y llevarlo aún tubo de 9mL de SSP, para obtener
la dilución 10-3.
9. Hacer otras diluciones siguiendo el mismo procedimiento del paso anterior para
obtener diluciones 10-4,10-5,10-6 de hecho como se considere necesario.
10. Sembrar en diversos indicadores.

4.3. SIEMBRAS:
Sembrar en Agar (PCA) para determinar el # total de m.o aerobios viables
siguiendo el procedimiento siguiente:

4.3.1. M. Inclusión en placas:

1. Sembrar alícuota de 1 mL, de cada dilución, en placas estériles y vacías,

empezando por la dilución más enrarecida. (Ejm: 10-4).
2. Agregar aproximadamente 15mL de PCA, que se tiene fundido y temperado a
45°C-50°C.
3. Homogenizar con movimientos rotarios en forma de 8.
4. Dejar dosificar (5min).
5. Incubar a 35°C durante 48 a 72 horas.
6. Contar el # de colonias (30- 300 especialmente).
7. Expresar el resultado en UFC/gr, usando notación decimal.
8. Cotejar el resultado con lo especificado por la norma y opinar sobra la calidad.
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4.4. LECTURAS:

1. Sacar las placas y ordenarlas en forma decreciente a las diluciones.

2. Apreciar la coherencia del crecimiento.
3. Contar el # de UFC/gr.
4. Expresar el resultado en notación decimal.
5. Cotejar el resultado con la norma.
6. Criticar el estado microbiológico de la muestra y poner calificativo de aceptación o
rechazo.

4.5. COLORACIÓN GRAM:

4.5.1. Preparación del frotis:

1. Limpiar una lámina porta objetos con alcohol 75°.

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2. Esterilizar el asa de Kolle.

3. Coger una gota de agua y ponerlo en el centro de la lámina.
4. Hacer una emulsión microbiana, con una pequeña masa de cultivo .
5. Extender en 1cm2de área.
6. Dejar secar al aire.
7. Fijar el calor, haciendo pasar 3 veces por la llama de mechero.

4.5.2. Coloración:

1. Anegar con cristal de violeta por 1 minuto.

2. Lavar con agua corriente.
3. Anegar con solución de Lugol por 1 minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Decolorar con alcohol-acetona por 30 segundos.
6. Lavar con agua corriente.
7. Anegar con safranina durante 30 segundos.
8. Lavar con agua corriente.
9. Secar
10. Observar con el objetivo de 100x y aceite de inmersión.
11. Mirar si son bacterias azules(Gram+) y rojas( Gram - )
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5. RESULTADOS:

CONTAJE:

10-1 10-2 10-3 10-4

INFINITO INFINITO 400 40
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AEROBIOS MESOFILOS VIABLES:

TIPO DE
ESPECIE DILUCIONES RESULTADO
S

(UFC/gr)
PLACAS
10-1 10-2 10-3 10-4
DONCELL INFINITO INFINITO 400 40 4,0X10-5(*)
A
(*) CALCULOS:

10-4-------------------40

100---------------------X X= 4,0X10 5

X=400000

GRAM:

En el microscopio se pudo observar que las bacterias tenían forma de bastón y de

coloración violeta azulada, entonces se puede decir que las bacterias observadas al
microscopios son Gram + .

LIMITE POR gr
AGENTE CATEGORÍA CLASES n c m M
MICROBIANO
Aerobios Mesófilos 2 3 5 2 5,0x105 106
6. INTERPRETACIÓN:

BASE: RESOLUCIÓN MINISTERIAL N° 591-2008/MINSA

RESULTADO:
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TIPO DE
ESPECIE DILUCIONES RESULTADOS

(UFC/gr)
PLACAS
10-1 10-2 10-3 10-4
DONCELLA INFINITO INFINITO 400 40 4,0X105(*)

La muestra de la especie Doncella se encuentra entre el parámetro establecido de control

de calidad, el resultado que mostro en el análisis de esta especie fue de 4,0x10 5 y según
la norma para la frescura de un producto hidrobiológico se encuentra entre 5,0x10 5 y 106,
entonces podemos concluir que esta especie es de buena calidad, y que está apto para el
consumo humano porque dio un resultado mínimo al límite menor microbiológico, por eso
se puede concluir que es fresco y es apto para el consumo.

7. CONCLUSIÓN:

El objetivo de esta práctica es el análisis microbiológico del pescado fresco, para este
trabajo nosotros realizamos diferentes técnicas para la obtención de los resultados que
queramos llegar, el primer paso para el análisis es hacer la toma de muestra, luego la
preparación de las diluciones decimales, siembra en la cual utilizamos el método de
inclusión de placas y por ultimo hacer las lecturas( contaje manual) para el análisis
microbiológico del pescado fresco y también determinar la calidad de frescura de la
especie hidrobiológico. Por último también en esta práctica tratamos de evidenciar la
presencia del Gram (+ ó -), entonces después de realizar los siguientes procesos,
podemos concluir que esta especie es de buena calidad, y que está apto para el consumo
humano porque dio un resultado mínimo (4,0X105) al límite menor microbiológico
( 5,0X105)según la norma de control de calidad , por eso se puede concluir que es fresco
y es apto para el consumo.

8. BIBLIOGRAFÍA:
 RESOLUCIÓN MINISTERIAL N° 591-2008/MINSA “Editorial El Peruano”
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 http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_negativa
 http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_positiva
 www.gram-commercial.com