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Manual de Laboratorio de Bioquímica OC
Manual de Laboratorio de Bioquímica OC
California
Facultad de Ciencias Marinas
Directorio
Introducción
Este manual está estructurado como material didáctico de apoyo para actividades de
laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Bioquímica, de la carrera de Oceanología
de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California. El contenido
del manual también podrá ser utilizado por estudiantes en carreras afines y en cursos de
bioquímica general con las adecuaciones que cada actividad de aprendizaje requiera para
coadyuvar en su formación disciplinaria.
Introducción
Con frecuencia se tiene la concepción que el desarrollo de las prácticas de bioquímica conlleva
un tiempo prolongado, métodos complejos y una diversidad de recursos materiales, por lo cual
puede parecer complicado el adecuar las actividades del laboratorio con el tiempo curricular
disponible, la habilidad y destreza de los estudiantes en la etapa que cursan la asignatura y los
recursos disponibles de la unidad académica. De aquí que la serie de experiencias prácticas que
se desarrollan se estima que coadyuvan en forma adecuada para alcanzar las competencias
establecidas en el programa de la unidad de aprendizaje, lo cual deberá ser una premisa
indispensable en el proceso de enseñanza-aprendizaje del estudiante, lo cual se reflejara en
que este adquiera los conocimientos y habilidades en bioquímica requeridos para las etapas
disciplinaria y terminal de su formación profesional. El manual de Bioquímica se ha preparado
con prácticas dirigidas a mostrar algunas de propiedades de las biomoléculas y de la dinámica
metabólica celular mediante procedimientos analíticos sencillos que no requieren de
equipamientos complejos y de alto costo..
Niveles de Desempeño
Los conocimientos, unidos a las habilidades y a los valores, permiten que se construyan
competencias. Para ello es necesario que el conocimiento se aplique de manera práctica en la
construcción o desempeño de algo, por lo cual el alumno deberá estar capacitado al finalizar
una etapa para desempeñar o producir lo establecido en su programa de estudio.
El nivel de desempeño del alumno estará asociado al desarrollo óptimo de actividades como: La
realización de las prácticas en forma y tiempo, lo cual le requerirá de un amplio dominio de
diferentes habilidades y conocimientos; la elaboración sistemática y estructurada de informes
por práctica, mediante disciplina y laboriosidad, así como el uso eficiente de herramientas
computacionales. El trabajo en el laboratorio deberá ser realizado en equipo, lo cual requiere
de una participación armónica en el trabajo de conjunto. El pensamiento crítico deberá ser
utilizado en forma óptima para realizar los diversos pasos de la actividad práctica. El reporte de
la práctica se deberá de entregar de acuerdo a un formato elaboración preestablecido, de
manera individual.
HC= Horas Clase; HL= Horas Laboratorio; HT= Horas Taller; HPC= Horas Practicas Campo; HE= Horas Ejercicios; CR=Créditos
Ámbito de
Tema Práctica o prácticas programadas Duración*
desarrollo
Revisión de reglas para el trabajo en el Laboratorio 3 horas
laboratorio. Semana 1
INTRODUCCIÓN Descripción del protocolo para elaborar un
reporte escrito de una práctica de
laboratorio
1.1. Practica 1: Espectrofotometría y ley de Laboratorio 3 horas
Beer-Lambert. Semana 2
1.2. Práctica 2: Determinación del contenido Laboratorio 3 horas
de proteína soluble. Semana 3
1.3. Práctica 3: Determinación del punto Laboratorio 3 horas
isoeléctrico de una proteína. Semana 4
1.4. Práctica 4: Efecto de la temperatura Laboratorio 3 horas
sobre la actividad enzimática. Semana 5
1.5. Práctica 5: Determinación de Laboratorio 3 horas
UNIDAD I: parámetros de cinética enzimática. Semana 6
BIOMOLÉCULAS 1.6. Práctica 6: Determinación de Laboratorio 3 horas
carbohidratos totales. Semana 7
1.7. Práctica 7: Aislamiento y cuantificación Laboratorio 3 horas
de glucógeno. Semana 8
1.8. Práctica 8: Extracción y cuantificación Laboratorio 3 horas
de lípidos. Semana 9
1.9. Práctica 9: Determinación de Laboratorio 6 horas
fosfoglicéridos. Semana 10 y 11
1.10. Práctica 10: Extracción y Laboratorio 3 horas
determinación de pigmentos algales. Semana 12
1.11. Práctica 11: Oxidación biológica y Laboratorio 3 horas
transporte de electrones. Semana 13
UNIDAD II: 1.12. Práctica 12: Actividad oxidativa de la Laboratorio 3 horas
METABOLISMO lactato deshidrogenasa. Semana 14
1.11. Práctica 13: Capacidad metabólica Laboratorio 6 horas
celular y actividad de citocromo-oxidasa. Semana 15 y 16
* Duración en horas para cada práctica, y semana del semestre en la que se realizará.
1.1.1. Introducción.
Los métodos ópticos de análisis pueden utilizares para determinar en forma precisa la
concentración de sustancias disueltas, dentro de estos la espectrofotometría es una de
las técnicas más comunes en análisis bioquímicos. Un espectrofotómetro mide cuanta
luz absorbe una solución, dicha absorción se puede usar para medir la concentración de
los solutos. La mayoría de los solutos absorben luz a una determinada longitud de onda,
y entre más concentrado es el soluto mas es la luz que se absorbe. El fenómeno es de
naturaleza exponencial y depende de la concentración del material absorbente de la luz,
del espesor de la capa de solución interpuesta en el trayecto del haz luminoso y de la
longitud de onda de la luz empleada en la determinación. Generalmente la longitud de
onda de la luz y el espesor de la capa que atraviesa, se mantienen constantes y la
intensidad de luz transmitida (I), se compara con la que transmite el solvente puro (I o).
La ley que relaciona la cantidad de luz transmitida por una solución con la concentración
del soluto que absorbe luz es la ley de Beer-Lambert la cual se expresa de la siguiente
forma:
Donde:
A: Absorbencia, magnitud adimensional,
Io: Intensidad de la luz incidente,
I: Intensidad de la luz trasmitida,
T: Transmitancia, I/Io,
: Coeficiente de extinción molar, en M-1 cm-1,
b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm,
C: Concentración del soluto, en moles/litro (M).
1.1.2. Competencia.
Evaluar la absorbencia de proteína en solución con base al fundamento de la ley de
Beer-Lambert, para elaborar una curva de calibración precisa, con organización y
disciplina.
1.1.3. Material.
1.1.3.1. Materiales.
Tubos de ensayo, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado,
termómetro, celdas para espectrofotómetro, gradilla, piseta.
1.1.3.2. Instrumental.
Agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotómetro.
1.1.3.3. Reactivos.
Solución estándar de albumina (10 mg/mL), reactivo de Biuret (3.75 g
CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua
destilada), solución problema.
1.1.4. Desarrollo.
1. Medir 1 mL de la solución de albúmina y colocar en un tubo de ensayo.
1.1.7. Bibliografía.
Holtzhauer, M., 2006. Basic Methods for the Biochemical Lab. 5th edition. Chapter 1:
Quantitative Methods. Springer-Verlag, Berlin, p. 1-21.
Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at practical classes for
students of pharmacy: a student-centered approach. Biochemistry and Molecular
Biology Education 28, 327-329.
Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed. Hélice,
Madrid, pp. 70-84.
1.2.1. Introducción.
1.2.2. Competencia.
1.2.3.1. Materiales.
1.2.3.2. Instrumental.
1.2.3.3. Reactivos.
Buffer salino (NaCl 0.15M, citrato de sodio 0.015M, pH 7), reactivo de Biuret (3.75 g
CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua destilada).
1.2.4. Metodología.
Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC
1. Realizar la disección del organismo de estudio, separar 2 tejidos y colocar cada
muestra en un vaso de precipitado en hielo.
2. Cortar cada tejido en trozos pequeños y pesar en una proporción de 0.2 g por mL de
buffer salino que se utilizará para su homogeneización.
5. Por duplicado, mezclar 0.2 mL del sobrenadante por tejido con 0.8 mL de agua
destilada, adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y agitar.
1.2.7. Bibliografía.
Janairo, G., Sy, M.L., Yap, L., Llanos-Lazaro, N., Robles, J. 2011. Determination of the
sensitivity range of Biuret test for undergraduate biochemistry experiments. e-Journal of
Science & Technology 5, 77-83.
Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed. Hélice,
Madrid, pp. 156-157.
1.3.1. Introducción.
1.3.2. Competencia.
Evaluar el punto isoeléctrico de una proteína mediante variación del pH del medio en el
cual esta disuelta, para relacionar este parámetro con las propiedades iónicas de la
estructura, con compromiso y disciplina.
1.3.3.1. Materiales.
1.3.3.2. Instrumental.
Potenciómetro
1.3.3.3. Reactivos.
Solución de caseína 5% en acetato de sodio 0.1N, ácido acético 0.01, 0.1 y 1N,
solución buffer pH 4 y 7.
1.3.4. Metodología.
TUBO
REACTIVO (mL)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína 5% en acetato
1 1 1 1 1 1 1 1 1
de sodio 0.1N
Agua destilada 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
CH3-COOH 0.01N 0.6 1.2 - - - - - - -
CH3-COOH 0.1N - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
CH3-COOH 1.0N - - - - - - - - 1.6
4) Tabular los resultados e indicar el grado de precipitación con los siguientes valores:
0 = ningún cambio.
1+ = turbidez.
2+ = notable turbidez.
3+ = precipitación.
4+ = marcada precipitación.
5+ = abundante precipitación.
1.3.7. Bibliografía.
Harris, D.C., 2007. Análisis Químico Cuantitativo. 6ª ed., Editorial Reverté, Barcelona, p.
217-219.
Morris, J., G. 1975. Fisicoquímica para Biólogos. 2ª ed., Editorial Reverté, Barcelona, pp.
163-165.
1.4.1. Introducción.
La actividad enzimática es afectada por la temperatura del medio en el cual ocurre. Los
puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Walls, que participan en la estabilización de
las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas, son muy sensibles a incrementos
en la temperatura, ya que aumenta el movimiento de las cadenas de aminoácidos y de
los grupos laterales y, por lo tanto la fuerza y las colisiones entre las enzimas y la
moléculas que las rodean. El aumento de las colisiones entre las moléculas de la enzima
y el sustrato favorece, por el contacto, las reacciones que estas catalizan. Sin embargo a
temperaturas muy elevadas, las colisiones son capaces de romper los puentes de
hidrógeno y las fuerzas de van der Walls que son relativamente débiles, a medida que
esto ocurre el rearreglo tridimensional de la enzima se modifica y se pierde su
estructura funcional. Los cambios característicos que se producen con el incremento de
temperatura en la actividad enzimática se muestran en siguiente la figura:
1.4.2. Competencia.
1.4.3.1. Materiales.
1.4.3.2. Instrumental.
Planchas de calentamiento.
1.4.3.3. Reactivos.
1.4.4. Metodología.
I) Ensayo enzimático.
1) Preparar y correr una serie de tubos de acuerdo a lo establecido en la siguiente tabla,
mezclar perfectamente al añadir cada reactivo.
2) El tubo 1 será el testigo negativo por lo que antes de añadir la enzima, se adicionara
1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico como inhibidor enzimático.
3) Al término del calentamiento en el baño de agua a ebullición, enfriar los tubos y leer
su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo 1 como blanco para ajustar el cero.
4) En caso de que las lecturas presenten valores altos de absorbencia se puede diluir la
mezcla final de reacción, en una proporción de 1 mL de solución con 5 mL de agua
destilada, para proceder a leer los valores por tubo. El contenido de glucosa liberada
en cada tubo de reacción se determinará mediante el uso de una curva de calibración
de glucosa.
1.4.7. Bibliografía.
Daniel, R.M., Danson, M.J., Eisenthal, R., Lee, C.K., Peterson, M.E., 2008. The effect of
temperature on enzyme activity: new insights and their implications. Extremophiles 12
(1), 51-59.
Daniel, R.M., Peterson, M.E, Danson, M.J., Price, N.C., Kelly, S.M., Monk, C.R., Weinberg,
C.S., Oudshoorn, M.L., Lee,C.K., 2010. The molecular basis of the effect of temperature
on enzyme activity. Biochemical Journal 425, 353–360.
1.5.1. Introducción.
1.5.2. Competencia.
1.5.3.1. Materiales.
1.5.3.2. Instrumental.
1.5.3.3. Reactivos.
1.5.4. Metodología.
• Gráfica de Michaelis-Menten.
• Gráfica de Lineweaver-Burk.
1.5.7. Bibliografía.
Grunwald, P., 1984. Imparting some biochemical fundamentals in the course of basic
education of chemistry students with the system urease/urea as an example.
Biochemical Education 12(4), 170-173.
Minch, M.J., 1989. Experiments in Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey, pp. 164-167,
182-184.
Sorensen, R., Novak, N., 1996. The use of Michaelis-Menten kinetics in cell biology and
physiology teaching laboratories. Biochemical Education 24(1), 26-28.
Tayyab, S., Qamar, S., 1992 A look into enzyme kinetics: some introductory experiments.
Biochemical Education 20(2), 116-118.
1.6.1. Introducción.
Los carbohidratos o sacáridos son compuestos de gran importancia para los seres vivos,
los cuales son muy abundantes en la naturaleza. Las unidades básicas de los
carbohidratos son los monosacáridos, los cuales no hidrolizables en unidades más
pequeñas. La glucosa es el monosacárido, aldohexosa, es el combustible principal para
la mayoría de los organismos. Los oligosacáridos contienen de dos a diez unidades de
monosacáridos unidas covalentemente. Por su parte, los polisacáridos están
constituidos por gran número de unidades de monosacáridos unidos covalentemente,
los cuales pueden alcanzar pesos moleculares de hasta 106 daltons. Los polisacáridos
desempeñan dos funciones biológicas principales: almacenar energía metabólica y
aportar elementos estructurales a la célula. Monosacáridos como la glucosa y sus
derivados, son piezas fundamentales en muchas rutas metabólicas esenciales para la
obtención de energía. La glucosa actúa en el organismo como combustible energético
de uso inmediato, mientras polisacáridos y grasas son biomoléculas de reserva que
deben ser catabolizadas antes de su aprovechamiento como fuentes de energía. Los
carbohidratos están ampliamente en organismos vegetales y animales con funciones
metabólicas y estructurales. En los vegetales la glucosa es sintetizada por fotosíntesis a
partir de CO2 y agua, y es almacenada como almidón o convertida en celulosa para
formar parte de la pared celular. Los animales obtienen sus carbohidratos
principalmente de fuentes vegetales, una forma de acumularlos es como glucógeno,
pero en casos de deficiencia pueden sintetizar algunos como la glucosa a partir de
fuentes de carbono derivadas de lípidos y proteínas.
Es frecuente que durante la transformación o el aislamiento de los carbohidratos se
requiere el cuantificar la cantidad total del producto obtenido. Un método para
cuantificar el contenido de carbohidratos totales, el cual incluye a los reductores y no
reductores, es mediante su reacción con un ácido fuerte y a alta temperatura, bajo
estas condiciones ocurre una deshidratación simple y la catálisis ácida da como
productos como furfural e hidroximetilfurfural que se reaccionan con compuestos como
el fenol para producir compuestos coloridos.
1.6.2. Competencia.
1.6.3.1. Materiales.
1.6.3.2. Instrumental.
1.6.3.3. Reactivos.
1.6.4. Metodología.
1.6.7. Bibliografía.
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3),
350-356.
Kochert, G., 1978. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric acid method. En:
Hellebust. J.A., Craigie, J.S., (eds.), Handbook of Phycological Methods. Physiological &
Biochemical Methods. Cambridge University Press, New York, pp. 95-97.
Masuoka, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S.I., Lee, Y.C., 2005.
Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical
Biochemistry 339, 69-72.
1.7.1. Introducción.
Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como
materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como
almidón, en los animales se presentan en forma de glucógeno. El glucógeno es una
biomolécula que está conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces
glucosídicos α(1-4) con ramificaciones mediante enlaces α(1-6).
1.7.2. Competencia.
1.7.3.1. Materiales.
1.7.3.2. Instrumental.
1.7.3.3. Reactivos.
KOH acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4 concentrado.
1.7.4. Metodología.
1.7.7. Bibliografía.
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3),
350-356.
Moraes, G., Choudhuri, J. V., Souza, R. H. S., Neto, C. S., 2004. Metabolic effects of
exercise in the golden fish Salminus maxillosus "dourado" (Valenciennes, 1849).
Brazilian Journal of Biology 64(3B), 655-660.
Ojea, J., Martínez, D., Novoa, S., Pazos, A. J., Abad, M., 2002. Contenido y distribución
de glucógeno en relación con el ciclo gametogénico de Ruditapes decussatus (L., 1758)
en una población natural de las lagunas de Baldaio (Galicia, noroeste de España). Boletín
Instituto Español de Oceanografía 18 (1-4), 307-313.
1.8.1. Introducción.
A diferencia de otras biomoléculas los lípidos son un grupo heterogéneo que no poseen
un grupo funcional característico. Los lípidos son sustancias presentes en tejidos
animales y vegetales que comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos
no polares, como benceno, hexano y cloroformo, éter, con escasa o nula solubilidad en
agua. Como consecuencia de ello, el término lípido abarca a un gran número de
compuestos orgánicos con estructuras muy diversas; no obstante, poseen algo en
común, la parte principal de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y ésta es la
razón de su carácter hidrófobo.
En general los lípidos pueden ser clasificados de acuerdo a sus propiedades en dos
grupos: No polares o lípidos neutros, los cuales comprenden triacilglicéridos,
diacilglicéridos, ceras, esteroles, terpenos; polares integrados por fosfolípidos y
glucolípidos. Los lípidos son una fuente muy importante de energía metabólica los
cuales aportan 9.5 kcal/g, en contraste con carbohidratos y proteínas, que generan 4.1 y
5.6 kcal/g, respectivamente. Los triacilglicéridos son los lípidos más abundantes en la
naturaleza, en tanto que los fosfolípidos son constituyentes principales de membranas
celulares.
Triacilglicérido Fosfolípido
R1, R2, R3: ácidos grasos; X: hidrógeno o radical (p.ej. etanolamina, colina, serina,
glicerol, mio-inositol)
Los lípidos pueden ser utilizados por los organismos animales como una fuente de
energía, a través del metabolismo oxidativo de ácidos grasos, de igual forma pueden
aportar ácidos grasos esenciales. Por presentar un estado de oxidación más reducido
con relación a carbohidratos o proteínas proporcionan mayor energía al oxidarse. Los
lípidos son componentes de reserva y estructurales de las células, aportan ácidos grasos
insaturados para el mantenimiento e integridad de membranas celulares, participan el
1.8.2. Competencia.
Extraer y cuantificar el contenido de lípidos en tejidos de un organismo acuático, para
evaluar su relación con la función metabólica tisular, con compromiso y disciplina.
1.8.3.1. Materiales.
1.8.3.2. Instrumental.
1.8.3.3. Reactivos.
Aveldaño, M.I., Horrocks, L.A., 1983. Quantitative release of fatty acids from lipids by a
simple hydrolysis procedure. Journal of Lipid Research 24, 1101-1105.
Robinson, J.E., Singh, R., Kays, S.E., 2008. Evaluation of an automated hydrolysis and
extraction method for quantification of total fat, lipid classes and trans fat in cereal
products. Food Chemistry 107, 1144–1150.
Serwata, R.D., 2007. Nutritional evaluation of rendered animal by- products and blends
as suitable partial alternatives for fish meal in diets for rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss). Thesis MPhil, University of Stirling, Stirling, Scotland. Chapter 2: General
materials and methods. 2.9.1. Determination of total lipid, p. 59.
1.9.1. Introducción.
Tipos de fosfoglicéridos:
Fosfatidilcolina (PC)
Fosfatidilserina (PS)
Fosfatidilinositol (PI)
Fosfatidilglicerol (PG)
1.9.2. Competencia.
1.9.3.1. Materiales.
1.9.3.2. Instrumental.
1.9.3.3. Reactivos.
1.9.4. Metodología.
1.9.7. Bibliografía.
Fried, B., 2003. Lipids. En: Sherma, J. Fried, B. (eds.), Handbook of Thin-Layer
Chromatography. 3rd edition. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 826-875.
Muciño Hidalgo, C. A., Sámano Nájera, J.B., 2008. Manual de prácticas de bioquímica
metabólica. Universidad Autónoma del Estado de México, Facultad de Química. Práctica
No 2: Separación de fosfolípidos por cromatografía en capa fina. México, pp. 17-19.
Peterson, B.L., Cummings, B.S., 2006. A review of chromatographic methods for the
assessment of phospholipids in biological samples. Biomedical Chromatography 20,
227–243.
1.10.1. Introducción.
Estructura de la clorofila a y b
Los carotenoides, por su parte, pueden dividirse en dos grupos: (a) Carotenoides sin
oxígeno como los -carotenos; (b) Carotenoides que contienen oxígeno, denominados
xantofilas. Entre las xantofilas se encuentran la violaxantina, anteraxantina, zeaxantina,
entre otras.
1.10.3.1. Materiales.
1.10.3.2. Instrumental.
1.10.3.3. Reactivos.
1.10.4. Metodología.
Clorofila a (mg/g peso fresco) = A x 11.9 mg/L x (volumen total del extracto/g de muestra)
1.10.5. Resultados a reportar.
Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC
• Espectro de absorción del extracto con pigmentos del vegetal.
1.10.7. Bibliografía.
Dawes, C.J., 1991. Botánica Marina. Editorial Limusa, Mexico, D.F., pp. 421-429.
Dunn, J.L., Turnbull, J.D., Robinson, S.A., 2004. Comparison of solvent regimes for the
extraction of photosynthetic pigments from leaves of higher plants. Functional Plant
Biology 31, 195-202.
Hagerthey, S.E., Louda, J.W., Mongkronsri, P., 2006. Evaluation of pigment extraction
methods and a recommended protocol for periphyton chlorophyll a determination and
chemotaxonomic assessment. Journal of Phycology 42, 1125-1136.
Schagerl, M., Künzl ,G., 2007. Chlorophyll a extraction from freshwater algae – a
reevaluation. Biologia 62(3), 270-275.
Vicente, E., De Hoyos, C., Sánchez, P., Cambra, J., 2005. Protocolos para el muestreo y
análisis para fitoplancton. Ministerio de Medio Ambiente, Confederación Hidrográfica
del Ebro, Zaragoza, pp. 25-27.
2.1.1. Introducción.
Los organismos animales son heterótrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia
energía, como lo hacen las plantas en la fotosíntesis, sino que deben ingerir esa energía
en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante
su oxidación mediante una serie de reacciones bioquímicas. La oxidación de los
compuestos orgánicos se asocia a la ganancia de oxígeno, perdida de hidrógeno o
perdida de electrones; en tanto que la reducción implica pérdida de oxígeno, ganancia
de electrones o ganancia de hidrógeno.
Las principales fuentes de energía para los animales son los carbohidratos, lípidos y
proteínas, el metabolismo energético de estos compuestos incluye reacciones como la
glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las células oxidan los compuestos
orgánicos para generar ATP, necesario para su trabajo útil. Es en la mitocondria donde
se llevan a cabo las reacciones oxidativas para la obtención de energía. En la
mitocondria se halla un conjunto de enzimas que hacen posible la oxidación de los
metabolitos en el ciclo de Krebs del cual se derivan electrones hacia la cadena
respiratoria, la cual se efectúa en la membrana interna de la mitocondria donde ocurre
un transporte de electrones para formar como producto final H2O.
2.1.2. Competencia.
2.1.3.1. Materiales.
2.1.3.2. Instrumental.
2.1.3.3. Reactivos.
Buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), succinato de sodio 0.01M (en buffer de
fosfatos), malonato de sodio 0.01M (en buffer de fosfatos), cianuro de potasio
0.01M, ferrocianuro de potasio 0.01M, ácido tricloroacético 10%.
2.1.4. Desarrollo
9. Centrifugar los tubos a 2000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante obtenido.
10. Leer la absorbencia de las soluciones a 420 nm. Ajustar la absorbencia del aparato a
cero con un blanco que contenga únicamente solución buffer.
11. Calculo del contenido de micromoles de ferrocianuro contenidas en cada serie de
reacción:
M Ferrocianuro = A/E*L= A/(1x10-3 mol-1 cm-1)*1 cm
2.1.7. Bibliografía
Devlin, T.M., 2004. Bioquímica. 4ª edición. Editorial Reverté, S.A., Barcelona, pp. 566-
575.
Hatefi, Y., 1985. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation
system. Annual Review of Biochemistry 54, 1015-1069.
Martínez Montes, J.M., 2011. Practica de bioquímica para veterinaria No 10. Oxidación
mitocondrial del succinato [en línea, fecha de consulta: 18 julio 2013]. Disponible en:
http://practicasdebioqumica.blogspot.mx/2010/11/practica-de-bioquimica-para-
veterinaria.html
2.2.1. Introducción
La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también
se encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y en mucho menor concentración en
páncreas y pulmón. A pH 7.3 – 7.8 el equilibrio de la reacción está desplazado hacia el
lactato, pero a pH más alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato;
la reacción puede ocurrir en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la
concentración de los sustratos que se encuentren presentes. Presenta un papel
importante en el metabolismo de carbohidratos, interviniendo en el último paso de la
glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeogénesis a partir de lactato.
Además, aporta combustible al ciclo de Krebs en tejidos consumidores de lactato como
el músculo cardiaco. La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues
puede actuar sobre otros α-ceto o α-hidroxiácidos estructuralmente similares al
pirúvico, como el α-cetobutírico. De igual forma, puede utilizar también el NADPH, como
coenzima, aunque las velocidad de reacción es mucho menor con relación al NADH. Su
peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un tetrámero
dispuesto tetraédricamente, en el que las subunidades van unidas por enlaces
hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Existen dos tipos distintos
de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles dan lugar a cinco formas
moleculares (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5) con actividad lactato deshidrogénica y con
características cinéticas y fisicoquímicas diferentes, que se han denominado isoenzimas.
En mamíferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporción que utiliza cada
órgano como fuente de combustible es variable. Durante una actividad física el
requerimiento energético del músculo esquelético y el corazón aumenta
considerablemente. En los dos primeros minutos de esta actividad el miocardio obtiene
esa energía a partir de glucosa tanto sanguínea como de sus propias reservas de
glucógeno, y aunque el consumo de oxígeno aumenta unas cuatro veces, un 50% del
piruvato formado se convierte en lactato (participación de la LDH 1 y LDH2), Este cambio
metabólico temporal le permite al corazón obtener la energía necesaria hasta que
Dr. Eduardo Durazo Beltrán Facultad de Ciencias Marinas de la UABC
adapte su metabolismo para lograr un incremento en el consumo de ácidos grasos. El
músculo esquelético utiliza (en los primeros segundos) la energía almacenada como
creatinafosfato hasta que se activa la degradación del glucógeno muscular para aportar
glucosa como fuente de energía. Aunque en este tejido durante una actividad intensa el
consumo de oxígeno aumenta unas veinte veces, gran parte del piruvato formado se
convierte en lactato (participación de la LDH5 y LDH4). Este cambio metabólico le
permite a este órgano obtener energía extra utilizando la glucólisis anaeróbica. El
cambio de piruvato a lactato es una vía de recuperación de NAD + para que la glucólisis
continúe. La mayor parte del lactato formado en esta etapa es recuperado lentamente y
reconvertido a glucosa en el hígado mediante un proceso que requiere el aporte de
energía (Ciclo de Cori). Aquí la oxidación de lactato a piruvato es favorecida por la baja
relación NADH/NAD+ y la escasa presencia de piruvato intracelular. La LDH es una
enzima cercana al equilibrio, regulada por la razón NADH/NAD + y por presentar formas
isoenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición por
sustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación de un
complejo NAD-piruvato que compite con el NADH por el centro activo del enzima.
Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo tricarboxílico:
oxalacetato y citrato.
2.2.2. Competencia.
2.2.3.1. Materiales.
2.2.3.2. Instrumental.
2.2.3.3. Reactivos.
Sacarosa 0.25M, buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), NADH 3.5 mM, piruvato de
sodio 21 mM.
2.2.4. Desarrollo.
2.2.7. Bibliografía
Crabtree, B., Newsholme, E. A., 1972. The activities of phosphorylase, hexokinase,
phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and the glycerol 3-phosphate
dehydrogenases in muscles from vertebrates and invertebrates. Biochemical Journal
126, 49-58
Živadinović, D., Nikčević, M., 2010. Kinetic properties of lactate dehydrogenase from
trout muscle. Archives of Biological Sciences, Belgrade, 62 (2), 297-300.
Sensabaugh, G.F., Nathan, O., 1972. Liver of gadoid fish lactate dehydrogenase specific
to the liver of gadoid fish. Journal of Biological Chemistry 247, 585-593.
2.3.1. Introducción
2.3.3. Material
2.3.3.1. Materiales
2.3.3.2. Instrumental
2.3.3.3. Reactivos
2.3.4. Desarrollo
I) Separación de fracciones.
1) Disecar peces recién sacrificados y remover el hígado y el corazón.
2) Pesar los órganos extraídos y mantenerlos en baño de hielo.
3) Picar finamente las muestras y preparar un homogeneizado por tejido con 9 mL de
KCl 0.15M frio por gramo de tejido.
4) Centrifugar el homogeneizado en frio, a 500 rpm por 15 minutos.
5) Decantar el sobrenadante en un recipiente limpio y frío y desechar el residuo.
6) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 3000 rpm por 15 minutos.
Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5
-Naftol 0.15% en etanol 10% 0.5 0.5 0.5 0.5
Dimetil-para-fenilendiamina 0.15% 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 1 1.5 1.5 0.5 2
Mezclar y calentar en baño de agua a 37C por 10 minutos
KCN 0.01% 0.5
Sobrenadante o suspensión del tejido 1 1 1 1
2.3.7. Bibliografía
Chance, B., Saronio, C., Leigh, J. S., 1975. Functional intermediates in the reaction of
membrane-bound cytochrome oxidase with oxygen. Journal of Biological Chemistry 250,
9226-9237.
Kuboyama, M., Yong, F.C., King, T.E., 1972. Studies on cytochrome oxidase . VIII.
Preparation and some properties of cardiac cytochrome oxidase. Journal of Biological
Chemistry 247, 6375-6383.
Anexos
Normas Generales de Seguridad e Higiene
17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con
agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia
ninguna persona.
18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del
laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser
siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella.
19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos,
bolsas, productos químicos vertidos.
20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar,
etc.
21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.
24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado
de uso.
25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo
con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.
26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas extractoras,
especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.
Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA
Anexos Página 69
Dar la alarma.
Ponerse a salvo.
Ayudar a las personas.
Luchar contra el fuego.
Avisar al responsable del departamento.
Evacuación del edificio en caso necesario.
Avisar a ambulancias, bomberos.
Fuego en el laboratorio
Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de
emergencia, sí la principal está bloqueada.
Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la
calma.
Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena
cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.
Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca
agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.
Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede
controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de
incendios y evacuar el edificio.
Fuego en el cuerpo
Quemaduras
Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUIMICA
Anexos Página 70
Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán
lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.
No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
Cortes
Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el
laboratorio.
Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos
como mínimo.
Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala
con una venda.
Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata.
Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos.
Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en
que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila.
Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible
mientras esté bajo la ducha.
Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la
extensión de la herida.
Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.
Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con
agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio
durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada
con linimento óleo-calcáreo o parecido.
Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con
agua corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona
afectada con una pomada de ácido tánico.
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo,
menos grave será el daño producido.
Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en
una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.
Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado
debajo de los párpados.
Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.