UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN

CAMPUS DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Asignatura.

Manejo de Muestras Biológicas en Reservorios Vectores

de Zoonosis

Profesores.
Dr. Enrique Reyes Novelo
Dr. Hugo Antonio Ruiz Piña

Alumnos:
Jorge Manuel Castañeda Gómez
Arnulfo Cruz González Dzib
Flavio Antonio Abeytia Sánchez
Christian Prado

Tarea:

Protocolo de obtención, manejo, conservación y uso de muestras

biológicas.

Mérida, Yucatán a 2 de Octubre de 2012

Índice

Titulo………………………………………………………………………………………………....II
Introducción…………………………………………………………………………………………1
Objetivo………………………………………………….…………………………………………..3
Metodología…………………….……………………………………………...……………………4
1. Selección del sitio de muestreo……………..………..………………………………….4
2. Protocolo para trampeo y procesamiento de Zarigüeyas…………………………….4
2.1. Colocación y control de trampas………………………………………………..4
2.1.1. Preparación para la expedición de trampeo………………………………5
2.1.2. Colocación de trampas………………………………………………………5
2.1.3. Recolección de zarigüeyas capturadas……………………………………7
2.2. Recolección de ectoparásitos en Zarigüeyas…………………………………9
2.3. Liberación de zarigüeyas capturadas……………………...………………….11
3. Preparación y diagnóstico de la muestra biológica…………………………………..12
3.1. Preparación de garrapatas……………………………………………………..13
3.2. Disección…………………………………………………………………………13
3.3. Maceración……………………………………………………………………….14
3.4. Examen microscópico de macerado………………………………………..…14
3.5. Cultivo en medio BSK II………………………………………………………...14
3.6. Extracción de ADN: Amplificación de ADN específico (nested, PCR)…….15
3.7. Obtención de ácidos nucleicos………………………………………………...16
3.8. Amplificación y detección del ADN específico de B. burgdorferi……….….17

Nivel de bioseguridad requerido para el manejo de muestras……………………………...23

Bibliografía……………………………………………………………………..….…………..….25
Anexos……………………………………………………………………………………..….…..27
Anexo 1. Descripción de la enfermedad de Lyme……………………….….….……28

Anexo 2. Formato de registro de captura de zarigüeyas………………………...….30

Anexo 3. Claves de identificación de especies de zarigüeyas……….………...…..31

Anexo 4. Identificación de garrapatas machos y hembras…………………….…..34

Anexo 5. Técnicas de tinción……………………………………………………………41

Anexo 6. Elaboración del Medio BSK II………………………………………………..43

I
 Procedimiento metodológico de obtención y
manipulación de muestras biológicas para el diagnóstico
de la enfermedad de Lyme.

II
Introducción.

En años recientes, las zoonosis, enfermedades transmisibles comunes al hombre

y a los animales, han sido objeto de mayor atención en todo el mundo. Los cambios
sociales y demográficos también han intensificado la importancia de adquirir y difundir el
conocimiento sobre las zoonosis. Por ejemplo, a medida que las personas irrumpen en
ecosistemas con los cuales tenían poco contacto y cuya fauna quizá no sea bien
conocida, aumenta su exposición a los animales y a las infecciones que estos transmiten
(Acha Pedro & Szyfres Boris, 2003).

A nivel mundial destacan mas de 200 enfermedades zoonóticas, una de ellas es la

enfermedad de Lyme, esta es causada por una bacteria del grupo de las espiroquetas de
nombre Borrelia burgdorferi la cual es transmitida por la mordedura de garrapatas del
género Ixodes. La enfermedad de Lyme esta ampliamente distribuida en Europa, algunos
países de Asia, Estados Unidos, Canadá, Australia, Chile y Brasil (Gordillo-Pérez et al.,
2003; Gordillo Pérez & Solórzano Santos, 2010; Acha & Szyfres, 2003).

En México las zonas noreste y centro de la republica tienen alta prevalencia a esta
enfermedad (Gordillo Pérez & Solórzano Santos, 2010). En Tamaulipas, Nuevo león y el
Distrito Federal se ha encontrado esta bacteria en bancos de sangre (Skinner Taylor et
al., 2007; García Cruz et al., 2011), aunado a esto Gordillo Pérez & Solórzano Santos
(2010) mencionan la presencia de casos clínicos a enfermedad de Lyme adquiriéndose en
zonas forestales cercanas a la Ciudad de México.

En la Península de Yucatán se tiene identificado al vector, sin embargo, no hay registro

alguno de enfermedad de Lyme (García Cruz et al., 2011), el ciclo de transmisión
involucra animales silvestres como el venado cola blanca, ratones pertenecientes al
género Peromyscus, ardillas grises, zarigüeyas y mapaches, también animales
domésticos como perros, equinos y bovinos, los cuales permanecen asintomáticos,
asimismo, Reyes-Novelo et al., (2011) menciona que a pesar de no haber algún reporte
de borreliosis en humanos, se tiene conocimiento de este a partir de tres casos humanos
confirmados por pruebas de laboratorio y estudios clínicos en la región, los cuales afirma
mediante una conversación personal con Zavala-Castro en la cita antes descrita.

1
El diagnóstico de esta enfermedad se basaba exclusivamente en el cuadro clínico, sobre
todo en antecedentes de eritema crónico migratorio (ECM) y en datos epidemiológicos. El
diagnostico en animales es similar que en el humano. El tratamiento temprano con
antibióticos acorta la duración de ECM y puede prevenir o disminuir las manifestaciones
tardías de la enfermedad (Skinner Taylor et al., 2007).

Dado que los animales hospederos de esta enfermedad se presentan en la Península de

Yucatán, siendo el venado cola blanca el más propenso a adquirirla y la importancia de
las zarigüeyas por ser de características peridomésticas lo que las hace tener contacto
indirecto con las personas, particularidad que los hace organismos de importancia para la
transmisión de esta enfermedad. Por ello, éste trabajo tiene la finalidad de describir los
pasos que se tienen que seguir, desde la captura en estado silvestre y manipulación de
las muestras biológicas, incluyendo el procesamiento de las garrapatas en laboratorio
para verificar la presencia de Borrelia burgdorgeri para el diagnostico de la enfermedad de
Lyme.

2
Objetivo.

Describir los métodos a emplear en el diagnostico y manipulación de muestras biológicas

para la presencia de Borrelia Burgdorferi causante de la enfermedad de Lyme.

3
Metodología

1. Selección del sitio de muestreo

Realizar los muestreos en comunidades donde se hayan reportado casos de borreliosis, o

en su defecto donde se hayan reportado casos no identificados con una sintomatología
similar (consultar Anexo 1).

Dentro de las comunidades, colocar las trampas en el patio de las casas, esta área
corresponde al peridomicilio. Ver los apartados siguientes para sus criterios de
colocación.

2. Protocolo para trampeo y procesamiento de Zarigüeyas

2. 1. Colocación y control de trampas

Equipo y materiales

 Cebo (carne en descomposición y frutas).

 Guantes de goma gruesa
 Trampas Tomahawk
 Cinta o bandera deslindadora
 Bolso o mochila
 Bolsas de plástico para la recolección
 Jabón de manos
 Agua para lavar
 Tablilla para sostener papeles
 Lápices
 Papel
 Repelente de insectos
 Cinta adhesiva para rotular
 Marcadores indelebles
 Formularios para control de trampas
 Formularios de evaluación de hábitat

4
Procedimiento

Este procedimiento fue una modificación de un protocolo de trampeo y técnicas de

muestreo para pequeños mamíferos (Mills et al, 1998), adaptado para su aplicación en
Didelphis sp. en el domicilio y peridomicilio del estado de Yucatán.

2. 1. 1. Preparación para la expedición de trampeo

1. Con bastante anterioridad al inicio de la expedición de trampeo, se deberán obtener

los permisos necesarios y los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales;
esta información puede encontrarse en la Norma oficial Mexicana NOM-126-
SEMARNAT-2000, en la cual se establecen las especificaciones para la realización de
actividades de colecta científica de material biológico de especies de flora y fauna
silvestres y otros recursos biológicos en el territorio nacional. Habrá que obtener
anticipadamente información sobre especies en extinción o protegidas en el área de
trampeo y aprender a evitarlas o liberar a estos animales de la captura; Las especies
endémicas o que poseen algún grado de amenaza se encuentran registradas en la
NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010. También se contactará a los
propietarios de las tierras para obtener autorización para realizar el trampeo.
2. Preparar cebo. Se puede utilizar pescado o carne de animales domésticos en estado
de descomposición reciente, ya que al aumentar la intensidad del olor, aumenta la
eficacia del atrayente, frutas como sandía o melón también pueden ser efectivos.
3. El primer día, cargar el o los vehículos de campo de acuerdo a la lista de control de
carga. Todos los equipos deberán estar bien sujetos para evitar que se dañen por
derrame o deslizamiento de líquidos.

2.1. 2. Colocación de trampas

1. Habrá que planificar la salida para llegar al sitio de captura, colocar y cebar todas las
trampas antes de que oscurezca. Si las trampas se colocan varias horas antes de la
puesta del sol, o se dejan abiertas durante el día, habrá que revisarlas
frecuentemente, especialmente en época de calor, para la captura de animales
diurnos.
2. Colocar trampas, a intervalos de 250 m cada una, formando una cuadrícula que cubra
la zona muestrear.

5
3. Al colocar cada trampa, se controlará el mecanismo disparador para comprobar su
ajuste y sensibilidad.
4. Colocar el cebo. Debe estar después del mecanismo disparador con el fin de atrapar
al animal, pero no cerca de las paredes para evitar que la zarigüeya u otro animal
pueda extraer el alimento con sus patas.
5. Cuando sea posible, colocar las trampas cerca de pilas de leña, troncos caídos,
madrigueras, autos abandonados u otros lugares que provean refugio, en caso de no
contar con ninguno, camuflar la trampa (Figura 1). Cuando se colocan trampas dentro
o al lado de las viviendas, se pondrán paralelamente a las paredes u otras superficies
verticales, prestando especial atención a las áreas donde haya evidencias de actividad
de zarigüeyas.
6. Colocar cada línea de trampas en un solo tipo de hábitat (casa, alambrado, pastura,
forestación de pinos).
7. En estaciones calurosas, evitar colocar las trampas de manera que queden expuestas
al sol directo. Si esto es imposible, las trampas pueden cubrirse con una lona.
8. Completar el formulario de evaluación del hábitat para cada línea de trampas o grupo
de líneas de trampas en un hábitat distinto. Cuando esté disponible, usar un sistema
de posición global (GPS, del inglés Global Positioning System) para registrar la latitud
y longitud exactas.
9. Si es necesario conocer el sitio exacto de captura de una zarigüeya específico, es
bueno tener un esquema del sitio de trampeo y de la ubicación de las trampas. La
ubicación del sitio de trampeo puede registrarse sobre un mapa topográfico local
usando, si es posible, un GPS.

6
Figura 1. Colocación y camuflaje de una trampa Tomahawk. (Foto: A. Vail).

2. 1. 3. Recolección de zarigüeyas capturadas

1. Las trampas deberán revisarse lo más temprano posible en la mañana, especialmente

en tiempo cálido o cuando llueve.
2. Los miembros del equipo deberán usar ropa protectora, incluso pantalones largos y
camisa de manga larga, medias, zapatos pesados y guantes de goma gruesa. Cada
persona deberá llevar un marcador indeleble y papel para tomar notas.
3. Cada miembro del equipo de campo deberá controlar las trampas que él o ella haya
colocado para obtener una mayor eficiencia y reducir la pérdida de trampas.
4. Revisar cada trampa para ver si hubo captura o si fue visitada. Si una trampa parece
haber sido visitada, pero no activada (contiene orina, materia fecal o el cebo fue
ingerido), colocar la trampa en doble bolsa plástica para ser descontaminada y
verificar su funcionamiento adecuado. Remplazar la trampa por una limpia.

7
5. Si no hay captura o no hay evidencia de visita, controlar el ajuste de la trampa y
volverla a poner en la línea correspondiente. Si se captura una especie distinta de la
que se buscaba, cuidadosamente liberar al animal en el sitio de captura y luego volver
a colocar la trampa o colocarla en una bolsa para descontaminación.
6. Si la trampa contiene una especie de interés, proceder al apartado 2. 2.
7. Al mismo tiempo que se realiza el proceso anteriormente descrito, llenar el formulario
de captura según se vayan obteniendo datos de colecta (consultar Anexo 2). Los
datos a registrar, son:
 Tipo de clima.
 Tipo de vegetación.
 Localización.
 Coordenadas.
 Número de transecto.
 Fecha.
 Número de trampa.
 Colocación: Hora en que fue colocada la trampa.
 Revisión: Hora en que fue revisada la trampa.
 Estadio: Si el ejemplar capturado fue juvenil, adulto o subadulto, indicar sexo.
 Especie: Si fue Didelphis Virginianus, Didelphis marsupialis o Philander opossum
(véase Anexo 3 para identificación de especie).
 Otro: si se capturó otra especie, indicar cuál.
 Marca: Número de marca del ejemplar.
 Recaptura: Si el ejemplar fue recapturado, colocar número de marca.
 Ectoparásitos: Si poseía, y cuáles.
 Observaciones: cualquier peculiaridad en el ejemplar.
8. Si el éxito de trampeo fue razonable (10% o mejor), las trampas pueden dejarse en el
mismo lugar por una segunda noche; en caso contrario, pueden colocarse en otro
lugar.

NOTA: Si las trampas se dejarán en el lugar por una segunda noche, deberán
mantenerse cerradas durante el día o revisarse periódicamente (al mediodía y antes de
que oscurezca o más frecuentemente si las trampas están expuestas al sol o si hace
calor) por si han capturado animales diurnos. Si es posible, estos animales deberán ser

8
procesados inmediatamente. De lo contrario, se les puede proveer comida húmeda,
guardarlos durante la noche (al aire libre, lejos de la gente) y procesarlos al día siguiente.

2. 2. Recolección de ectoparásitos en Zarigüeyas.

La extracción de muestras se realiza a partir de las garrapatas que los parasitan. Para
extraer las garrapatas es necesario tener presente los hábitos de las diferentes especies y
grupos. Debe procurarse en cuanto sea posible recolectarlas en sus distintos estadios. De
igual forma es conveniente matarlas antes de que mueran contraídas.

Material requerido:

 Charola blanca
 Mesa desplegable
 Pinza entomológica
 Alcohol al 75%
 Éter
 Algodón
 Guantes de látex
 Frascos
 Etiquetas
 Plumón
 1 persona de auxiliar

Procedimiento

Procedimiento editado y tomado del libro,

Técnicas diagnósticas en parasitología
veterinaria, Rodríguez Vivas & Cob
Galera, 2005:

1. Colocar la mesa desplegable en un

área despejada que no dificulte la
manipulación, colocar encima la
charola para el retiro de ectoparásitos. Figura 2. Sujeción de un Zarigüeya.
(Foto: F. Abeytia).
Si el patio no cuenta con un lugar

9
 sombreado, techar el sitio de procesamiento con una lona.
2. Colocarse guantes.
3. El auxiliar también deberá ponerse guantes. Se requiere la presencia de otra persona,
para ayudar en la manipulación del animal mientras éste es revisado para presencia
de garrapatas.
4. Sujetar a la zarigüeya del cuello (Fig. 2), y retirarlo de la trampa. Lavar la trampa.
5. Se coloca la zarigüeya sobre la charola blanca, se recomienda someter agarrando del
cuello y parte de la cabeza con una mano y la otra mano colocarla a la altura de la
cintura pélvica, para evitar que el marsupial se levante.
6. Al hacer la recolección de las garrapatas se tendrá especial cuidado en hacer una
inspección de todas las regiones del cuerpo del animal.
7. Se impregna con éter un pedazo de algodón.
8. Se pasa por todo el cuerpo del animal en forma contraria del crecimiento del pelo, se
pone mucha atención a orejas y patas, ya que éstas son las partes preferidas por los
parásitos. Esto se hace con la finalidad de que las garrapatas se desprendan del
hospedero. Se recomienda hacer la revisión de dos a tres veces.
9. Localizados los parásitos, si están caminando se les retira sin problema alguno del
animal. En caso que el parasito se encuentre fijado fuertemente a la piel, no se debe
arrancar bruscamente. De hacerlo se romperían las piezas bucales, éstas se quedan
fijadas o separadas del cuerpo, o se desprende un pedazo de piel. En todos estos
casos, los ejemplares recolectados resultan defectuosos e impropios para su estudio.
En esta situación se recomienda se auxilie de la pinza entomológica, oprimiendo
suavemente el cuerpo de la garrapata, se ejerce pequeños estirones de las patas, y
movimientos en todos los sentidos para estresarlos y que voluntariamente se
desprendan de la zarigüeya.
 Si la garrapata de desprendió con ayuda del paso 7 haga caso omiso del paso 8, y
pase directamente al paso 9.
10. Se recomienda deje caer una o dos gotas de salol, bencina, gasolina, cloroformo o
éter en el punto de la piel donde se encuentren fijadas las garrapatas esto obliga a
que el animal retraiga sus piezas bucales y se desprenda.
11. Desprendidas las garrapatas y retiradas de la zarigüeya, se colocan en frascos que
contengan alcohol.
12. A los frascos se les colocan las etiquetas
13. Las etiquetas tendrán anotado fecha y alguna clave para su fácil estudio.

10
2. 3. Liberación de zarigüeyas capturadas

1. Antes de manipularlo, el investigador debe cerciorarse de llevar equipado todo el

equipo de seguridad.
2. Sujetar a la zarigüeya del cuello (Fig. 2) y soltarlo en el sitio de captura o cerca de él.
Si se desconfía del animal, colocarlo de nuevo en la trampa y estimular su escape
desde la parte cerrada de ésta (Fig. 3).

Figura 3. Liberación incitada de ejemplar de zarigüeya contenida en una trampa

Tomahawk. (Tomada de www.anam.gob.pa).

11
3. Preparación y diagnostico de la muestra biológica

Equipos y materiales para preparación y diagnostico de muestra:

Equipos Materiales Reactivos

Suero Fisiológico estéril diluciones al
Microscopio Caja de Petri
35%, 70%, 95%
Jarra de
Aguja hipodermica esteril Agua destilada
Anaerobiosis
Cámar de
Pinza esteril Tampón fosfato salino pH 8.2
electroforesis
Transluminador Portaobjetos Suero Inactivado de conejo
Jarra de
Cubreobjetos Rifampicina
Anaerobiosis
Centrifuga Mortero esteril Ciprofloxacino
Tubos de plástico 5- Fluorocitocina
Tubos de vidrio de tapón de
Proteinasa K
rosca
Tubos de Microcentrifuga Te (1mM Tris - CIH pH 8: 0.5mM
(Tubos Eppendorf) EDTA pH 7.5)
Fenol- Cloroformo - isomilalcohol
Pipeta Pasteur estéril.
25:24:1
Guantes Acetato amonico
Lentes Bromuro de etilo
Mascarilla de seguridad TBE (Trisborato (EDTA))
Bata de laboratorio Dodecilsulfato sódico
Etanol
Gel de Agarosa al 1%
tampón 10 mM Tris-ClH pH 8,5
250 mM KCl2
2,5 mM MgCl2
0,2 mM de dNTPs
1 μl del iniciador Bb1 (100 pmol)
iniciador Bb2 (100 pmol)

12
3.1 Preparación de garrapatas

1. Separar machos de hembras (véase Anexo 4 para su identificación).

2. Se separan varios lotes en los cuales deben de haber el mismo número de garrapatas,
respecto al número total de garrapatas colectadas.
3. Previamente a la disección y macerado de las garrapatas, descontaminar mediante
una solución alcohólica diluida en suero fisiológico estéril, introduciéndose
sucesivamente y durante un minuto en diluciones al 95%, 70% y 35%.
4. Ahogar mediante inmersión en agua destilada estéril durante 5 horas.
5. Lavar en tampón fosfato salino pH 8.2

3.2 Disección

Hembras:
1. Se colocan en Placa de Petri.
2. Realizar una incisión en el contorno del escudo con bisturí o mediante aguja
hipodérmica estéril. Retirándose el mismo por tracción mediante unas pinzas estériles.
3. Se obtendrán dos formaciones arracimadas y blanquecinas correspondientes a las
glándulas salivares, y un sistema tubular doble y negruzco identificado como los
intestinos medios
4. Emplear este par de estructuras dobles para la preparación de las diferentes
extensiones o para el cultivo bacteriológico, que en este caso se realiza de modo
inmediato a su obtención, debido a la labilidad de dichas estructuras.
Machos:
5. En el caso de los individuos machos se realiza la sección de la porción anterior y
medio anterior del escudo ya que contiene las glándulas salivales y los intestinos
medios. Este procedimiento de corte es requerido por la extrema dificultad de una
precisa disección debido al pequeño tamaño del macho y por abarcar el duro escudo
en todo el dorso del mismo. Las formaciones obtenidas son inmediatamente
procesadas, tanto para la realización de tinciones como para cultivos bacteriológicos.

13
3.3 Maceración

1. Lisar mediante tracción mecánica en mortero estéril, debido a su dura consistencia.

2. Con el producto resultante, recoger mediante la técnica de lavado de mortero con 2ml
de suero fisiológico estéril, se recoge con tubos estériles de plástico y conservados a
+4°C hasta su procesamiento, empleándose tanto para la realización de las distintas
extensiones en portaobjetos como para el cultivo en medio específico.

3.4 Examen microscópico de macerados.

1. En cada lote y con una porción del producto diluido y homogeneizado de los
macerados, proceder a la realización de extensiones en portaobjetos (de 5 a 10
portaobjetos) colocando una pequeña gota de la preparación en el centro de estos.
2. Con las estructuras resultantes de las disecciones, y tras obtener una emulsión
sanguinolenta del contenido de las mismas, se realiza igual número de extensiones.
3. Los portaobjetos con las extensiones se secan a temperatura ambiente, para
posteriormente realizar la fijación y tinción según los distintos métodos empleados. Se
emplean cinco procedimientos distintos de tinción en todas las preparaciones con el
fin de garantizar una adecuada observación microscópica.

NOTA: Los portaobjetos para tinción simple con azul de metileno y tinción de Gram se
fijan mediante calor. (Véase Anexo 5, Técnicas de tinción). En todos los casos se realiza
la tinción de acuerdo a los parámetros convencionales. El examen microscópico de todas
las preparaciones, se efectúa mediante microscopía óptica a 1000X.

3.5 Cultivo en medio BSK II

1. Posteriormente realizar un cultivo en Medio BSK II (ANEXO III) con una parte de los
macerados para la realización de los cultivos bacteriológicos en medio líquido de
Barbour- Stoenner-Kelly modificado (medio BSK II).
2. Mediante condiciones de esterilidad, preparar tubos de vidrio de tapón de rosca con
6ml de medio BSK II. Se inoculan con 1ml de muestra.
3. Después de 4 días de incubación a 37°C bajo condiciones de microaerofilia en jarra de
anarerobiosis. Los cultivos primarios son suplementados con suero inactivado de

14
 conejo al 6% para continuar su incubación en las condiciones previstas
anteriormente. (véase Anexo 6).
4. A la semana realizar subcultivos mediante la transferencia de 1ml de cultivo primario a
un nuevo tubo con 6ml de medio BSK II suplementando con suero de conejo (6%) y
conteniendo rifampicina (40 μg/mL); ciprofloxacino (0,4 μg/mL) y 5-fluorocitosina (230
μg/mL).
5. A partir de estos primeros subcultivos, realizar nuevos cultivos secuencialmente cada
semana, en las mismas condiciones referidas, hasta completar un periodo de
incubación de dos meses. Además, debido al lento crecimiento de Borrelia sp, el
cultivo primario debe ser subcultivado a los 15 y 30 días, por lo que cada una de las
muestras genera un total de 10 viales de cultivo (figura 4) como control de crecimiento
se utiliza en todos los ensayos la cepa B31 de B. burgdorferi (ATCC 35210). Para
determinar la presencia del microorganismo en cada uno de los cultivos, se efectúa
semanalmente una evaluación microscópica de una muestra homogeneizada de los
mismos mediante las tinciones diferenciales referidas previamente.

Figura 4. Procedimiento de cultivo de

fracciones de garrapatas en el medio BSK
II
3.6 Extracción de ADN: Amplificación de ADN específico (nested, PCR).

1. Posteriormente aplicar la Técnica de PCR (nested, PCR), para analizar la presencia

de ADN de Borrelia burgdorferi, en las garrapatas Ixódidos.
2. Realizar lotes de un número variable de individuos según su tamaño (lotes de 3, 4, 6,
8 y hasta 30 individuos cada uno) a fin de garantizar la presencia de ADN.
3. Para extraer el material genómico se lavan y preparan los ejemplares mediante el
procedimiento antes mencionado de maceración.

15
3.7 Obtención de ácidos nucleicos

1. Distribuir cada lote en tubos de microcentrifuga (Eppendorff) y descontaminarlo

empleando una solución alcohólica diluida en suero fisiológico estéril, introduciéndose
sucesivamente y durante un minuto en diluciones al 95%, 70% y 35%.
2. Posteriormente se lavan mediante inmersión en tampón salino pH 8.2, durante 5
horas.
3. Dejarlo secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
4. Lisar las garrapatas adicionando a cada tubo Eppendorff 100 μl de tampón TE (1 mM
Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH 7,5); 20 μl de dodecil sulfato sódico (10% p/v) y 200
μl de proteinasa K de una solución 200 μg/mL procediéndose a la incubación a 56ºC
en baño de agua durante 24 horas.
5. Completar la lisis de los ácaros mediante el maceramiento en el tubo Eppendorf con
una pipeta Pasteur estéril, realizar movimientos repetidos de aplastado durante 10-
15minutos, con el fin de romper todas las estructuras somáticas de la garrapata.
6. Al material obtenido adicionar 100 μl de TE (1 mM Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH
7,5).
7. Realizar 2 extracciones con fenol-cloroformo-isomilalcohol 25:24:1.
8. Al sobrenadante recuperado adicionar 125 μl de 7,5 M acetato amónico incubar en
hielo durante 30 minutos.
9. Precipitar el ADN presente mediante la adición de 2 volúmenes de etanol absoluto a -
20°C e incubar a -40°C durante 1 hora.
10. Recoger mediante centrifugación a 13 000 rpm durante 15 minutos.
11. Lavar el precipitado con etanol al 70% y volver a centrifugar a 13 000 rpm durante 15
minutos.
12. Secar al aire durante 45-60 minutos.
13. En caso de comprobar la existencia de un sedimento en el tubo Eppendorf
resuspender en 50 μl de TE (1 mM Tris-ClH pH 8,0; 0,5 mM EDTA pH 7,5).
14. Para obtener ADN de la cepa control de B. burgdorferi (ATCC 35210) seguir el mismo
procedimiento descrito anteriormente, utilizar la masa bacteriana obtenida en medio
BSK II tras centrifugación de 10 ml de medio líquido a 5.000 rpm y lavar el sedimento
con 5 ml de TE. El sedimento se debe resuspender en 500 μl de
15. tampón de lisis, incubar una hora a 37ºC.

16
16. Evaluar todas las extracciones mediante electroforesis horizontal de un volumen de 20
μl de muestra en gel de agarosa 1% y tampón 1X de TBE (Tris – borato – EDTA)
teñidos con una solución de Bromuro de etidio (5 μg/mL).
17. Visualizar en transluminador, con el fin de conocer la presencia y calidad del ADN
obtenido.

3.8 Amplificación y detección del ADN especifico de B. burgdorferi.

1. Amplificar mediante nested-PCR en los lisados de garrapatas, por su mayor

sensibilidad.
2. Utilizar dos genes diferentes para su amplificación, determinar una región especifica
dentro del gen que codifica la lipoproteína externa de membrana OspA y una
secuencia específica del gen que codifica la proteína denominada flagelina.
3. Para la región del gen OspA, los iniciadores que se emplean fueron los descritos por
Guttman et al. (1996) siendo para la primera amplificación los iniciadores Bb1 (23 mer
5´-AAA AAA TAT TTA TTG GGA ATA GG- 3´) y Bb2 (29 mer 5´-GTT TTT TTG CTG
TTT ACA CTA ATT GTT AA- 3´) cuyo producto es un fragmento de 702-bp. Los
iniciadores para la segunda amplificación fueron Bb3 (16 mer 5´-GGA GTA CTT GAA
GGC G- 3´) y Bb4 (18 mer 5´-GCT TAA AGT AAC AGT TCC- 3´) cuyo producto es un
fragmento de 345-bp. En la tabla 1 se muestra la secuencia de bases del gen OspA y
las posiciones de cada uno de los iniciadores señalados, con la región de
amplificación.

17
Tabla 1. Secuencia del gen OspA de B. burgdoferi, y localización de oligonucleótidos
cebadores.

4. Para la primera amplificación se debe determinar un volumen final de 50 μl, utilizar

una mezcla de reacción para cada una de las muestras compuesta por: 15 μl de agua
destilada desionizada; 5 μl del tampón 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 μl de
2,5 mM MgCl2, 1 μl de una solución 0,2 mM de dNTPs; 1 μl del iniciador Bb1 (100
pmol) y 1 μl del iniciador Bb2 (100 pmol) añadiéndose a la mezcla 20 μl de ADN total y
0,5U (2 μl) de Taq polimerasa.
5. Del producto de la primera amplificación tomar 20 μl para realizar la siguiente
amplificación para un volumen final de 50 μl.
6. Utilizar una mezcla de reacción para cada una de las muestras compuesta por: 15 μl
de agua destilada desionizada; 5 μl tampón de la enzima Taq polimerasa 10 mM Tris-
ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 μl de 2,5 mM MgCl2; 1 μl de una solución 0,2 mM de
dNTPs; 1 μl del iniciador Bb3 (100 pmol) y 1 μl del iniciador Bb4 (100 pmol)

18
 añadiéndose a la mezcla 20 μl de ADN total y 0,5 U (2 μl) de Taq polimerasa. las
reacciones de amplificación de las muestras y controles se realizan en un
termociclador.
7. Los parámetros empleados para dichas reacciones se muestran en la tabla 2.
8. De acuerdo a lo propuesto por Lebech et al. (1993) y en paralelo en todas las
muestras problema realizar un control interno de amplificación, añadir un volumen de
ADN de la cepa de B. burgdorferi B31, de modo que a 20 μl de cada una de las
mismas se adicionaron 15 μl de ADN control a una dilución 1:1000, manteniéndose el
volumen final de 50 μl por sustitución del volumen de agua.
9. El objeto de este control interno fue la determinación del papel de posibles inhibidores
presentes en los lisados de garrapatas.
10. Además, en todos los ensayos de amplificación se utilizará una muestra de ADN de la
cepa B31 a igual dilución.
11. Para la electroforesis de los amplificados se emplear geles de 2% de agarosa (Bio-
Rad 162-0125) en tampón 1X TBE pH 7,5 y un voltaje de 4,5 V/cm durante la primera
media hora, tras la cual se incrementó a 6 V/cm aplicados durante 60 min.
12. Los geles se visualizan mediante el transiluminador referido previamente y
fotografiados empleando el sistema Gelprinter (TDI)
13. Como marcadores de peso molecular se utilizó un patrón con 15 bandas de 8,5 a
0,35-kbp (DNA molecular weight VII Boehringer-Mannheim) y un patrón secuencial de
100 a 1000-bp (DNA molecular weight 100-bp ladder Boehringer-Mannheim).

19
 Tabla 2. Condiciones de amplificación dela secuencia del gen OspA

14. Para la amplificación de la secuencia génica que codifica la proteína flagelar de B.

burgdorferi emplear los iniciadores descritos por Lebech et al. (1993). Así, en la
primera amplificación se utilizaron los iniciadores F1 (21 mer) 5´-ATT AAC GCT GCT
AAT CTT AGT–3´ y F3 (20 mer) 5´- GTA CTA TTC TTT ATA GAT TC-3´ que
amplifican un producto de 791-bp. Para la segunda amplificación se utilizaron los
iniciadores F6 (25 mer) 5´-TTC AGG GTC TCA AGC GTC TTG GAC T-3´ y F8 (25
mer) 5´-GCA TTT TCA ATT TTA GCA AGT GAT G-3´, que produce un fragmento de
275-bp (Tabla 3).
15. Para la primera amplificación se determinó un volumen final de 50 μl, utilizando una
mezcla de reacción para cada una de las muestras compuesta por: 15 μl de agua
destilada desionizada; 5 μl del tampón 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 μl de
2,5 mM MgCl2; 1 μl de una solución 0,2 mM de dNTPs; 1 μl del iniciador F1 (100
pmol) y 1μl del iniciador F2 (100 pmol) añadiéndose a la mezcla 20μl de ADN total y
0,5U (2μl) de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim 1 647 679).

20
16. Del producto de la primera amplificación se tomaron 15 μl para realizar la siguiente
amplificación para un volumen final de 50 μl, utilizando una mezcla de reacción para
cada una de las muestras compuesta por: 20 μl de agua destilada desionizada; 5 μl
tampón de la enzima Taq polimerasa 10 mM Tris-ClH pH 8,5 y 250 mM KCl2; 5 μl de
2,5 mM MgCl2, 1 μl de una solución 0,2 mM de dNTPs; 1 μl del iniciador Bb3 (100
pmol) y 1 μl del iniciador Bb4 (100 pmol) (TIB MOLBIOL. Syntheselabor) añadiéndose
a la mezcla 20 μl de ADN total y 0,5 U (2μl) de Taq polimerasa. Las reacciones de
amplificación se realizaron en el termociclador indicado y empleando los parámetros
para dichas reacciones que se muestran en la Tabla 3.

NOTA: Las condiciones de electroforesis y marcadores de peso molecular empleados

fueron las mismas que las referidas previamente para el estudio de la lipoproteína OspA.

Tabla 3. Condiciones de las reacciones de amplificación de la secuencia del

gen de la flagelina.

17. Como en las amplificaciones de gen OspA, las muestras problemas fueron analizadas
por duplicado, conteniendo una de ellas un control interno compuesto por ADN
obtenido de la cepa de B. burgdorferi B31, de modo que a los 20 μl de cada una de las
muestras, se adicionaron 15 μl de ADN control a una dilución 1:1000, manteniéndose
el volumen final de 50 μl por sustitución del volumen de agua.

21
Tabla 4. - Secuencia del gen de la flagelina de B. burgdorferi y localización de
oligonucleótidos cebadores utilizados.

22
Nivel de bioseguridad requerido para el manejo de muestras.

Bioseguridad Nivel 2. (Tomado y editado de Manual de Procedimientos de Técnicas

para el Diagnostico del Dengue. Organización Panamericana de la Salud 2002).

Las prácticas de bioseguridad del nivel 2 son aplicables a laboratorios clínicos, de

diagnóstico, de docencia y en dependencias en las cuales se manipulan microorganismos
de amplio espectro, de moderado riesgo, presentes en la comunidad y asociados a
enfermedades humanas de diversa severidad, además de que:

a. El personal de laboratorio deberá poseer entrenamiento especifico en el manejo de

agentes patógenos, bajo la supervisión directa de un investigador competente.

b. El acceso al laboratorio estará limitado durante las horas laborables.

c. Deberán tomarse precauciones extremas con el material cortante contaminado.

d. Todo procedimiento que implique formación de aerosoles infecciosos o salpicaduras

deberá ser conducido en cabinas biológicas de seguridad o cualquier otro equipo de
contención física

Los procedimientos deben estar escritos y colocados en un lugar visible. El personal del
laboratorio debe conocer y entender claramente todas estas normas, y lo más importante
es seguirlas en cada momento. Una persona del laboratorio debe ser asignada para
vigilar el cumplimiento de las normas de bioseguridad y para dirigir las acciones a seguir
ante situaciones de accidentes, como exposición a algún agente patógeno.

Los trabajadores del laboratorio deben conocer la forma de transmisión de los agentes
con los que trabajan y los peligros de la manipulación de sustancias químicas y biológicas
para evitar y disminuir cualquier posibilidad de contagio. Se debe asumir que todo con lo
que se trabaja es potencialmente peligroso y mortal y que la seguridad es responsabilidad
de cada persona en el laboratorio.

Medidas de seguridad

 Limitar el acceso de personas ajenas al laboratorio.

 Descontaminar el área de trabajo antes y después de cada proceso técnico.

23
 No comer, tomar, fumar y aplicarse cosméticos dentro del laboratorio. Las comidas y
bebidas deben siempre estar fuera del laboratorio. La institución debe proveer lugares
adecuados para estos fines.
 No pipetear con la boca.
 Utilizar guantes para trabajar con todo tipo de muestras potencialmente infectadas.
 Utilizar batas, uniforme u otras prendas apropiadas.
 No llevar la ropa de trabajo a otras áreas fuera del laboratorio.
 Las jeringas y agujas deben ser desechadas en un recipiente de polietileno sólido.
 Lavarse las manos después de manipular material infeccioso o animales.
 Evitar la formación de aerosoles.
 El trabajo con material infeccioso debe realizarse en flujo laminar o gabinete de
seguridad.
 Los derrames deben limpiarse rápidamente cubriéndolos con un pedazo de papel
mojado en solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 0.1%).
 Las centrifugas deben estar equipadas con mecanismos de seguridad para que el
material infeccioso no se disemine.
 Usar respiradores o mascaras en los cuartos donde se mantienen animales
inoculados.
 Reportar derrames o accidentes. A las personas expuestas, se les debe dar un
seguimiento y tratamiento previo si es necesario y este está disponible.
 Debe existir un manual de prácticas de seguridad en cada laboratorio, las personas
deben ser adiestradas de acuerdo a este manual.
 Las puestas de laboratorio deben estar cerradas.
 Deben haber señales indicando el “potencial peligro de contaminación” a la entrada
del laboratorio y la indicación de “acceso restringido”.
 El estado de salud debe checarse periódicamente.

24
Referencias.

Acha Pedro & Szyfres Boris. (2003) Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al
hombre y a los animales. Vol. I Bacteriosis y Micosis. Tercera Edición.
Organización Panamericana de la Salud. Washington, DC. E.U.A. Pp. 94-99.

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immunohistochemical staining, and PCR for detection of Borrelia burgdorferi in
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25
Reyes-Novelo, E., Ruiz-Piña, H., Escobedo-Ortegón, J., Rodríguez-Vivas, I., Bolio-
González, M., Polanco-Rodríguez, A., Manrique-Saide, P. (2011) Situación actual y
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reemergentes y olvidadas en la Península de Yucatán, México. Tropical and
Subtropical Agroecosystems, Vol. 14. Pp. 35-54.

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veterinaria. Segunda Edición. Universidad Autónoma de Yucatán. México. Pp. 126-
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de la enfermedad de Lyme en una población de alto riesgo del noreste de México.
Medicina Universitaria. Vol. 9. Núm. 36. Pp. 105-111.

26
Anexos

27
Anexo 1. Descripción de la enfermedad de Lyme.

La enfermedad en el hombre. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades

transmisibles comunes al hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001).

La característica lesión cutánea, el eritema crónico migratorio (ECM), aparece de unos 3 a

20 días después de la picadura de la garrapata. Esta lesión se inicia por una mácula o
pápula roja que se va extendiendo. Los bordes están bien marcados, la lesión central
(*1)
palidece y se forma un eritema circinado . El eritema puede ser recurrente, con
aparición de lesiones secundarias en otras partes del cuerpo. Las lesiones cutáneas
pueden estar acompañadas durante varias semanas de malestar, fiebre, cefalalgia,
rigidez de la nuca, mialgias, artralgias o linfoadenopatía. El ECM constituye el primer
estadio o fase de la enfermedad, que dura unas semanas pero puede recurrir. En el
segundo estadio, transcurridas unas semanas o meses y con la diseminación del agente,
algunos pacientes manifiestan múltiples ECM, meningoencefalitis, neuropatías,
miocarditis, taquicardia atrioventricular. Los ataques de artritis de las grandes
articulaciones pueden presentarse y repetirse durante varios años, tomando a veces un
curso crónico. Meses o años después puede instalarse el tercer estadio, que se da en
algunos pacientes y se manifiesta a veces por acrodermatitis crónica atrófica y
alteraciones neurológicas y articulares.

La enfermedad en los animales. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades

transmisibles comunes al hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001).

No se conoce el efecto de la infección por la espiroqueta en animales silvestres, pero es

posible que se transmita de forma asintomática. El síntoma predominante en el perro es
una cojera debida a artritis en diferentes articulaciones, que puede ser migratoria. Las
artralgias se acompañan muchas veces de fiebre, anorexia, fatiga y linfadenitis. La artritis
generalmente es temporal, pero puede volverse crónica.

En los equinos infectados se han observado diferentes síntomas como artritis, encefalitis,
uveitis, dermatitis, y edema de los miembros, así como la muerte de potrillos asociada con
la infección natural de yeguas preñadas. Sin embargo, no se confirmó la infección en
ninguno de los casos descritos.

En los bovinos también se asoció la infección por B. burgdorferi con la presencia de cojera
(*2)
. En un estudio serológico por Western Blot, ELISA e inmunoflorescencia indirecta

28
realizado en 27 vacas lecheras de 17 rebaños de Minnesota y Wisconsin, se encontró
que los títulos serológicos altos estaban asociados con artritis.

Control. (Editado y tomado del libro, Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al

hombre y a los animales, Acha y Szyfres, 2001).

Las únicas medidas de prevención de la enfermedad consisten en evitar las áreas

endémicas y las picaduras de garrapatas. Las personas que se adentran en los focos
naturales deben usar calzado y ropa protectora, que no siempre es fácil de imponer; los
repelentes podrían dar cierta protección. Conviene inspeccionar el cuerpo con frecuencia
y eliminar las garrapatas adheridas mediante una tracción suave con una pieza que se
aplica lo mas cercana posible de la piel. Es recomendable usar guantes durante esta
operación.

Los perros deben inspeccionarse con frecuencia para eliminar las garrapatas; se debe
proceder con el mismo cuidado que para el hombre. El uso de acaricidas en forma de
polvo o collares es una buena medida preventiva. Se dispone actualmente de una vacuna
comercial inactivada para perros, que se administra en 2 dosis con 3 semanas de
intervalo y luego anualmente

(*1)
Circinado: se dice de las lesiones elementales de la piel cuando están agrupadas de tal
forma que dibujan fragmentos de círculo cuyo centro está relativamente ileso.

(*2)
Cojera: Defecto, lesión o enfermedad que impide andar con regularidad.

29
Anexo 2. Formato de registro de captura de zarigüeyas.

Procedimiento metodológico de obtención y manipulación de muestras

biológicas para el diagnóstico de la enfermedad de Lime.
Tabla de captura de zarigüeyas

Tipo de clima: Tipo de vegetación: Localización:________________________

Coordenadas:_____________________________Número de transecto:______________________Fecha:______________________________

Número de trampa Colocación Revisión Estadio Especie Otro Marca Recaptura Ectoparásitos Observaciones

30
Anexo 3. Claves de identificación de especies de zarigüeyas (Reid, 2009).

Didelphis marsupialis

Nombre común: Zarigüeya común, Tlacuache común.

HB 263-430 (13”), T 295-450 (14”), HF 42-69. E 45-60, Wt 0.6-2.4 kg (3 lb).

Descripción: De aspecto grande y desaliñado. Parte dorsal negruzca, grisácea y, en

menor grado, blancuzca, parte ventral amarilla, anaranjada o crema. Pelaje tupido y
grueso con base blanca, orejas sin pelo y completamente negras en los adultos. Cabeza
pálida con anillos oculares estrechos de color negro y una línea central; mejillas color
crema y amarillo anaranjado. Brillo ocular rojizo brillante. Todos los bigotes largos en el
hocico y las mejillas son de color negro, la cola es ligeramente más larga que la cabeza y
el cuello; su base posee el mismo pelaje que el resto del cuerpo, y la porción desnuda se
compone de 1/3 de color negro, y un 2/3 blanco, a veces la misma proporción de colores
o completamente negra. Las piernas y las patas son negras. El cuarto dedo de las patas
traseras es más largo que el segundo y el tercero. Fuerte olor corporal (Figura 1).

Especies similares: El “Tlacuache de Virginia” (Didelphis virginiana) tiene mejillas

completamente blancas y algunos bigotes largos de color blanco en el hocico y las
mejillas, generalmente su cola tiene una longitud menor a la de la cabeza y la cola; la
porción negra de la cola generalmente es más larga que la blanca.

Delantera Trasera
Figura 1. Didelphis marsupialis.

31
Didelphis viginiana

Nombre común: Zarigüeya común, Tlacuache común.

HB 374-451 (16”), T 282-370 (13”), HF 50-65, E 49-63, Wt 1.1-2.5 kg (3.5 lb).

Descripción: De aspecto grande y desaliñado, con una cola relativamente corta. Parte
dorsal gris o blancuzca, raramente negruzco. Parte ventral blanca, crema o amarillenta.
Pelo largo, tupido y grueso con base blanca. Orejas desnudas y negras, a veces con
puntas blancas estrechas. Cara de color blanco con anillos oculares estrechos de color
negro y una línea central. Mejillas completamente blancas, bigotes largos en el hocico y
mejillas color blanco y negro. Cola de la misma o menor longitud que la cabeza y la cola;
base de la cola con el mismo pelaje que el cuerpo, la porción desnuda es 2/3 negra y 1/3
blanca, a veces completamente negra. Piernas y patas negras. Dedos 3-5 de la pata
trasera de la misma longitud. Poco olor corporal (Figura 2).

Especies similares: Ver Didelphis marsupialis.

Figura 2. Didelphis virginiana.

Philander opossum

Esta especie es mucho menos común que D. virginiana y D. marsupialis, y se encuentra

predominantemente en hábitats con poca urbanización, pero puede ser encontrado en
jardines y huertos.

Nombre común: Tlacuache cuatro-ojos.

32
HB 253-315 (11”), T 273-329M (12”), HF 43-50, E 33-41, Wt 263-1400 g (1.7 lb).

Descripción: De tamaño mediano. Parte dorsal color café-gris oscuro a gris negruzco
salpicado con pelos blancos, ligeramente brillosa. Parte ventral y punta de las patas color
crema o amarillo. Pelo denso y ligeramente lanudo. Orejas negras, desnudas, con
parches de color crema en sus bases. Cabeza negruzca, con manchas color crema
encima de los ojos y mejillas crema. Brillo ocular rojizo brillante. El pelaje de la cola es
similar al del cuerpo por los 30-50 mm basales, después casi desnuda, compuesta por 2/3
de negro y el resto, que conforma la punta, de blanco (Figura 3).

Especies similares: Especies del género Metachirus y Chironectes, pero sólo este último
se encuentra en la región más sureña de la península, por el estado de Tabasco y parte
de Belice. Su aspecto poco desaliñado y sus manchas supraoculares lo distinguen de las
otras 2 especies mucho más abundantes en la península, D. virginana y D. marsupialis.

Delantera
Delantera Tra
Trasera

Figura 3. Philander opossum.

33
Anexo 4. Identificación de garrapatas machos y hembras.

Diagnosis.
Hembra: Poseen un escudo de menor tamaño que abarca 1/3 del cuerpo con poro genital
ventral. Cuernos y aurícula ausente; base capilar lateral inflada; fórmula dental 2/2; coxa I
robusta y bifurcada, espolón externo ligeramente curvado y muy afilada, y mucho más
largo que los cilíndricos interno, coxas II-IV con grandes espuelas externas, redondeado
apicalmente.
Machos: El escudo se extiende a lo largo de todo el dorso del cuerpo y con ausencia de
poro genital. Cuernos y aurícula ausente, base capilar lateral inflada; hipostoma similar a
la hembra, pero más pequeña, coxa I robusto y bifurcada, espolón externo mas agudo y
mucho mas largo que el interno; coxas II-IV esencialmente como las hembras.

Fotografías tomadas de artículo Examination of the Internal Morphology of the Ixodid Tick,
Amblyomma maculatum Koch, (Acari: Ixodidae); a “How-to” Pictorial Dissection
Guide.2009.

Garrapata hembra del Género Ixodes

(Autor: Joe MacGown)
34
 Garrapata macho del Género Ixodes
(Autor: Joe MacGown)

Claves dicotómicas para el género Ixodes.

Key to females.

1. Trochanters I-III with spurs.……………….........................................................................2

Trochanters I-III without spurs..............................................................................................3

2. Hypostome large, broad, denticles 6/6 apically, then 5/5, 4/4 and 3/3 to base; auriculae
distinct but rounded.............................................................................................. I. murreleti

Hypostome narrow, denticles 4/4 apically, then 3/3 and 2/2 to base; auriculae sharp-
edged………........................................................................................................ I. brunneus

3. Auriculae weakly developed or absent.……………………………………………………....4

Auriculae prominent, usually as distinct ridges or recurved horns……………....................14

35
4. In ventral view, basis capituli fl ared laterally but auriculae absent; coxa I robust and bifi
d, posterior margin between internaland external spurs curved...........................................5

Ventrally, basis capituli not fl ared laterally; coxa I not as above…………………………..6

5. Coxa I with spurs about equal in length............................................................. I. loricatus

Coxa I with external spur much longer than internal spur………........................... I. luciae

6. Palps elongate, length:width ratio generally greater than 3:1…………….…………..........7

Palps shorter, often thick and clublike, length:width ratio generally less than 3:1……...11

7. Auriculae present as slight lateral ridges….......................................................................8

Auriculae absent……………………………………….........................................................9

8. Cornua small but distinct; scutum almost circular, punctations larger

peripherally…………………………………………………………………….……… I. scapularis

Cornua absent; scutum oval with uniformly small punctations……………....... I. pacificus

9. Spurs of coxa I about equal in length; hypostome Christmas tree-shaped, not borne on
median extension of basis capituli, denticles 3/3……………………..……...…..... I. angustus

Apically, then 2/2 to base……………..............................................................................10

10. Internal spur of coxa I moderately long, overlapping anterior margin of coxa II; venter
of basis capituli broad and elongate; legs normal………………………..................... I. woodi

Internal spur of coxa I long, overlapping half or more of coxa II; venter of basis capituli
broad but not elongate; legs long, spiderlike………………………………….......... I. conepati

11. Basis capituli with prominent rounded hump on either side of

hypostome………………………………………………………………....................... I. texanus

Basis capituli without rounded hump on either side of hypostome................................12

12. Dorsally, posterior margin of basis capituli sinuous……………......................... I. dampfi

Dorsally, posterior margin of basis capituli nearly straight….……................................13

36
13. Cornua short but distinct; cervical grooves narrow and shallow but long, approaching
posterolateral margins of scutum………………........................................................ I. cookei

Cornua absent, but posterolateral corners slightly emphasized in some specimens;

cervical grooves shallow and short, visible only posterior to middle of scutum
……..................................................................................................................... I. rubidus

14. Hypostomal dentition 5/5 or 6/6...................................................................... I. dentatus

Hypostomal dentition less than 5/5…...........................................................................15

15. Auriculae as lateral saliences or ridges; scutum with conspicuous deep punctations
near posterior margin................................................................................................ I. affinis

Auriculae broadly rounded, or retrograde spurs or horns; scutum otherwise………….16

16. Palpal segment I ventrally with a short, sharp spur……………....................................17

Palpal segment I lacking a ventral spur .......................................................................19

17. Hypostomal dentition 4/4 apically; transverse suture distinct....................... I. spinipalpis

Hypostomal dentition 3/3 apically; transverse suture faint or absent……….................18

18. Anterior margin of genital aperture smoothly curved; internal spur of coxa I overlapping
anterior half of coxa II……………………………...................................................... I. sinaloa

Anterior margin of genital aperture notched; internal spur of coxa I overlapping anterior
margin of coxa II……………………...................................................................... I. tovari

19. Auriculae broadly rounded……………………………………..........................................20

Auriculae curved, retrograde horns...............................................................................22

20. External spurs absent on coxae I and II; scutal punctations chiefl y in lateral fi elds and
posteriorly.................................................................................................... I. guatemalensis

External spurs present on all coxae; scutal punctations evenly distributed……...........21

21. Hypostome relatively broad, dentition 4/4 apically, then 3/3 and 2/2 to
base……………................................................................................................. I. tamaulipas

37
 Hypostome relatively narrow, dentition 3/3 apically, then 2/2 to base........ I. tancitarius

22. Hypostome Christmas tree-shaped, attenuated and sharp; punctations distinct,

moderate in number, and more or less evenly distributed................................. I. mexicanus

Hypostome with sides almost parallel for much of length; punctations otherwise……23

23. Punctations small and scattered...................................................................................24

Punctations large and numerous or clustered near posterior scutal margin……..........25

24. Scutum widest near midlength, broadly rounded posteriorly…............ I. cuernavacensis

Scutum widest just anterior to midlength, narrowing posteriorly……................... I. eadsi

25. Punctations large, numerous and evenly distributed..................................... I. bequaerti

Punctations sparse and small over most of scutum, but with few to several large deep
ones near posterior scutal margin...................................................................... I. boliviensis

Key to males.

1. Trochanters I-III with small but distinct spurs………………………………….... I. brunneus

Trochanters I-III without spurs………...…………………………………………………….....2

2. Large, elongate, heavily sclerotized ticks with wide lateral body folds; in ventral view,
basis capituli fl ared laterally; coxa robust and bifi d, posterior margin between internal and
external spurs curved…………………………………………..................................................3

Body neither elongate nor heavily sclerotized; ventrally, basis capituli not fl ared
laterally; coxa I not as above….………………......................................................................4

3. External and internal spurs of coxa I equal or subequal in length……….......... I. loricatus

External spur of coxa I much longer than internal spur……….............................. I. luciae

4. Basis capituli dorsally with 8-9 deep punctations in lateral fi elds, suggesting porose
areas; coxa I with long, narrow internal spur but external spur absent; coxa II lacking
spurs…………………………….................................................................... I. guatemalensis

Without this combination of characters.............................................................................5

38
5. Hypostome with large, sharp lateral denticles, distinctly different from the smaller
median denticles, which are arrayed in diagonal or transverse rows of
crenulations………………………………………………………………………………...……….6

Lateral and median hypostomal denticles similar in structure…………...........................9

6. Central area of scutum posterior to pseudoscutum with a group of conspicuously large,

deep punctations…………………………................................................................... I. affinis

Scutal punctations arranged otherwise…………………....................................................7

7. Pseudoscutum present, somewhat darker in color, and indicated by smaller punctations;

larger punctations posteriorly............................................................................. I. spinipalpis

Pseudoscutum usually absent; scutal punctations uniformly small, numerous, evenly

distributed………………………….........................................................................................8

8. Spiracular plate oval; median plate with small punctations…………................ I. pacificus

Spiracular plate elongate; median plate with large punctations...................... I. scapularis

9. Internal spur of coxa I short or of only moderate length, barely reaching anterior margin
of coxa II………………………….........................................................................................10

Internal spur of coxa I long, extending to middle of coxa II or beyond…........................13

10. Large tick, scutum usually at least 3 mm long; pseudoscutum present, its posterior
margin indicated by an area devoid ofpunctations………………………................ I. conepati

Smaller tick, scutum usually < 2 mm long; pseudoscutum faint or absent....................11

11. Scutal punctations numerous, large and deep; scutal surface faintly
rugose……………………………………………………………………………………. I. texanus

Scutal punctations moderate in number and small, except in lateral areas……..........12

12. Dental formula 3/3, crenulations large, arranged in overlapping rows.……... I. angustus

Dental formula 4/4, crenulations small, arranged in nonoverlapping rows.......... I. woodi

13. Cornua prominent; hypostome elongate, pointed…………….............................. I. tovari

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 Cornua small or absent; hypostome not pointed………………......................................14

14. Scutal punctations numerous, moderately large and deep; punctations of median plate
numerous but small.................................................................................................. I. cookei

Larger scutal punctations confi ned to median and posterior areas; punctations of
median plate large………………….....................................................................................15

15. Apex of hypostome notched………………………………………........................... I. eadsi

Apex of……...................................................................................................................16

16. Hypostome with median crenulations arranged diagonally............................. I. dentatus

Hypostome with median crenulations arranged transversely........................ I. bolivensis

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Anexo 5. Técnicas de tinción.

Tinción de Gram:

1.- Sumergir el frotis fijado por calor en cristal violeta durante 1 minuto.

2.- Añadir una solución yodada durante 3 minutos.

3.- Decolorar brevemente con alcohol (unos 30 segundos)

4.- Contrateñir con safranina durante 1 ó 2 minutos.

Tinción de Giemsa:

Procedimiento gota gruesa:

1.- Se deja secar la lámina durante 20 minutos.

2.- Se deshemoglobiniza con Azul de Metileno Fosfatado, sumergiendo la lámina por 5

segundos y se lava varias veces con buffer fosfatado.

3.- Se deja secar la lámina.

4.- Realizar la Coloración de Giemsa preparando 1 gota de Colorante y 1ml de Buffer

(Aprox. 3ml por cada lamina). Se colorea la lámina 15 minutos boca abajo.

5.- Se lava con agua y se deja secar.

Procedimiento del extendido.

1.- Se deja secar la lámina durante 10 minutos.

2.- Se fija el extendido con alcohol metílico durante 3 a 5 minutos y se deja secar.

3.- Se realiza la Coloración de Giemsa añadiendo 2 gotas de Giemsa y 1ml de Buffer

Fosfatado (Aprox. 3 ml por cada lámina).

4.- Se colorea la lámina boca abajo durante 30 minutos y se lava con agua y se deja
secar.

La gota gruesa se usa para ver la concentración del parásito y el extendido para ver la
especie.

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Tinción de MAY GRÜNWALD-GIEMSA

1. Preparar una extensión muy fina y dejar secar al aire.

2. Fijarla con Metanol (Reag. Ph. Eur.) PA-ACS-ISO (cód. 131091) durante 3 minutos.
3. Diluir 1 ml de Eosina-Azul de Metileno solución según May Grünwald DC (cód. 251416)
con 1 ml de Tampón, Solución pH 7,2 DC (cód. 252164). Mezclar bien.
4. Cubrir la preparación con el colorante diluido, dejando actuar de 2 a 3 minutos.
5. Escurrir el exceso de colorante y, sin lavar, añadir Azur-Eosina-Azul de Metileno
solución según Giemsa (lento) DC (cód. 251338) diluido de 1:10 a 1:20 con Tampón,
Solución pH 7,2 DC (cód. 252164) durante 15 minutos.
6. Diferenciar en agua destilada por agitación durante 5 segundos.
7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

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Anexo 6. Elaboración del Medio BSK II.

El medio de Kelly modificado es la siguiente:

Agua destilada 900 ml
10 X CMRL 1066 sin glutamina y NaHC 100 ml
(GIBCO)
Neopeptona (Difco) 5 g/L
Fracción V Sérica de albúmina bovina 50 g/L
(Sigma)
Yeastolate (Difco) 2 g/L
Glucosa (Malinckrodt) 6 g/L
Citrato sódico (Sigma) 5 g/L
Piruvato sódico (Sigma) 0.7 g/L
N-Acetil glucosamina (Sigma) 0.4 g/L
Bicarbonato sódico (Sigma) 0.2 g/L

Disolver todos los componentes en agitación.

Ajustar el pH a 7.6 con NaOH 1N
Esterilizar el medio por filtración al vacío.
Utilizar un filtro de acetato de celulosa de Milipore con un tamaño de poro de 0.2 ɥm.
Suplementar con 70 g/L de gelatina.
Utilizar tubos de cristal estériles en los que se añadió 5mL del medio.
Una vez sembrada cada muestra, añadir al medio suero de conejo esterilizado por
filtración, filtros de 0.22 ɥm), para conseguir una solución al 6% de suero de conejo.
(Escudero, 1993).

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