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Propuesta de Investigación C+DT+I
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Investigador Principal
VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES
Código FPI-11 v.01
Propuesta de Investigación C+DT+I
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UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
Línea estratégica:
Descriptores/Palabras claves: Vespa mandarinia, Apis miellifera, Gen, IRP30, cebadores, ADN.
2. RESUMEN.
Las invasiones biológicas constituyen una de las mayores amenazas para la biodiversidad, y
los polinizadores no están exentos de dicha amenaza. Curiosamente, los Himenópteros
poseen un conjunto limitado de genes inmunes en comparación con otros insectos. Los
genes inmunes no canónicos de la avispa Vespa mandarinia son de interés porque pueden
proporcionar una mayor comprensión de la naturaleza peculiar del sistema inmunitario de
este insecto social. Los análisis previos de la hemolinfa de abeja en el desafío bacteriano
identificaron una nueva proteína repetida rica en leucina denominada IRP30. Aquí
caracterizamos el gen y ADN genómico que codifica esta proteína. Aquí revisamos de
manera específica si dicho gen en V. mandarinia como especie invasora, tiene alguna
diferencia evolutiva que sugiera algún tipo de cambio o adaptación superior en comparación
los polinizadores específicamente la abeja Apis miellifera.
ABSTRACT.
Biological invasions constitute one of the greatest threats to biodiversity, and pollinators are
not exempt from this threat. Interestingly, Hymenoptera possess a limited set of immune
genes compared to other insects. The non-canonical immune genes of the Vespa mandarinia
wasp are of interest because they can provide a better understanding of the peculiar nature
of the immune system of this social insect. Previous analyzes of the bee hemolymph in the
bacterial challenge identified a new leucine-rich repeat protein called IRP30. Here we
characterize the gene and genomic DNA that encodes this protein. Here we specifically
review whether said gene in V. mandarinia, as an invasive species, has any evolutionary
difference that suggests any type of change or superior adaptation compared to pollinators,
specifically the bee Apis miellifera.
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El gen IRP30 en un Himenóptero como Vespa mandarina japónica en comparación con Apis
miellifera del mismo orden, podría sugerir diferencias dentro del alineamiento de ambos
genes que pueda conllevar a mostrar molecularmente como especie invasora ampliamente
tiene mayor respuesta inmune demostrando mayor plasticidad.
JUSTIFICACIÓN.
Vespa mandarinia es una plaga importante de los colmenares en Japón. Apis mellifera es la
especie más común, la cual no ha desarrollado defensas contra V. mandarinia. Los ataques
a una colmena de A. mellifera por los avispones gigantes asiáticos causan daño a decenas
de miles de colmenas de A. mellifera cada año por V. mandarinia (Matsuura, 1988;
Yanagawa et al., 2007) al ser dos especies constantemente enfrentadas por medio de un
alineamiento de un gen especifico se busca comparar y evidenciar el grado de similaridad
que tiene ambas especies en relación al gen IRP30 encargado de la respuesta inmune de
estas especies.
Dentro de Vespoidea se data que Vespa mandarinia es la única especie de avispa eusocial
que realiza ataques grupales contra colmenas y otros nidos de avispas eusociales causando
en la actualidad un gran furor no solo por su papel como especie invasora y a futuro los
daños que esta ocasionaría a nivel ecológico, si no en si como competencia directa de Apis
miellifera y otras abejas de gran valor ecológico.
Vespa mandarinia
Tamaño: 1.5 - 2 pulgadas de largo (3.5 cm a 5 cm). Reina: puede superar los 5 cm, con una
envergadura que puede superar los 7,6 cm. Obreras y machos: más pequeños que las
reinas (3.5 a 3.9 cm de longitud corporal). Las reinas y las obreras solo difieren en tamaño.
Morfología: reinas y obreras tienen anatomía reproductiva,
aunque las obreras no se reproducen. Los machos de esta
especie son morfológicamente similares a las hembras,
pero carecen del aguijón. La coloración es la misma entre
sexos.
Al ser la Vespa mandarinia originaria de otro continente, se considera una especie exótica,
la cual por su comportamiento dominante y depredador se convertiría, muy posiblemente, en
una especie invasora, ya que afectaría el ecosistema en el continente americano, trayendo
como consecuencia el desplazamiento o extinción de especies nativas o endémicas de
abejas y avispas de la región, en caso que llegue a establecerse.
IRP30.
La proteína inmune sensible 30 (IRP30) es una glucoproteína que se encuentra en una amplia gama
de especies de himenópteros sociales, incluidas las abejas melíferas, abejorros, avispas y hormigas
( Randolt et al. 2008 , Fujiyuki et al. 2009 , Albert et al. 2011 ) . El IRP30 (también conocido como
HP30, proteína de hemolinfa 30) se identificó por primera vez a partir de la hemolinfa de las abejas
inmuno-desafiadas y recibió su nombre por su peso molecular de proteína, 30 kDa ( Randolt et al.
2008 ). Los motivos clásicos de la cremallera de leucina en IRP30 sugieren que juega un papel
importante en las funciones inmunes del organismo. Además, el nivel de expresión más alto de IRP30
ocurre bajo desafío bacteriano, lo que demuestra que IRP30 tiene una inducción fuerte y simultánea
en respuesta a infecciones microbianas (Randolt y col. 2008 ). Hasta la fecha, se ha encontrado que el
gen IRP30 está asociado con respuestas inmunes en especies de himenópteros sociales; sin embargo,
su función precisa no ha sido verificada ( Albert et al. 2011 ). Por lo tanto, la función de la proteína
IRP30 requiere una mayor exploración.
5. OBJETIVO GENERAL
dos especies avispas ( Vespa mandarinia ) y abejas melíferas ( Apis mellifera L.) para
buscar si presentaban similaridad hay pertenecer a un mismo orden ambas especies.
6. METODOLOGÍA
COLECCIÓN DE MUESTRAS.
Los protocolos de extracción de ADN convencionales (Jobes et al., 1995; Cheng et al., 2003)
requieren grandes cantidades de tejido (en gramos) para ser molido (con un mortero y una
maja), y los kits son generalmente caros o no están disponibles, especialmente para
investigadores en países en desarrollo y subdesarrollados en todo el mundo (Kotchoni y
Gachomo, 2009). Se utilizó el protocolo de extracción de acidos nucleicos planteado por T.
Y. Wang, L. Wang, J. H. Zhang y W. H. Dong.
REACTIVOS Y QUIMICOS
Tampón de extracción:
Búfer de unión
Tampón de lavado: EtOH al 70% complementado con tampón NaCl TE 10 mM: tampón Tris-
HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, reactivos de PCR: Taq ADN polimerasa, dNTP
(TaKaRa).
A. Tejidos: se maceró el tejido hasta obtener un polvo bajo nitrógeno líquido o en un baño de
hielo, se debe trabajar a temperaturas bajas para evitar que las enzimas que degradan del
material genético se encuentren activas. Se transfirieron hasta 50 mg de tejido a un tubo de
microcentrífuga de 1.5 o 2.0 ml. Se agregó el tampón de extracción y se guardó durante 5-
10 minutos a temperatura ambiente.
DISEÑO DE CEBADORES.
Antes de explicar cómo se hace el diseño de cebadores, creo que es importante introducir
primero que son y para que se usan.
Los cebadores fueron diseñados manualmente software tales como Textpand el cual
permitió pasar las secuencias del gen IRP30 de las dos especies a alinear a formato FASTA,
cabe resaltar que se llevó a cabo un alineamiento global, se basa en alinear y mostrar dónde
calzan en forma perfecta o casi perfecta las secuencias (Needleman y Wunsch, 1970). Una
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vez ya alineada cada muestra con su forward y reverse, se ejecuta en todas las secuencias
editadas siendo necesario ejecutar estas con el algoritmo ClustalW Multiple Alignment.
Lo anterior era necesario para que posteriormente se pudiese visualizar dicho alineamiento
en Bioedit que es un editor de alineamiento de secuencias (Hall, 1999) el cual permitió crear
una secuencia consenso que pudiese ser leída por Oligoexplorer (Kuulasmaa Javed and
Muthusammy, 2004) el cual que permiten valorar las propiedades de los oligonucleótidos
seleccionados, en la selección de parejas de cebadores se trató que cumpliesen con los
siguientes criterios:
Temperatura de meelting 55 – 60 C
Porcentaje de GC mayor a 50
La PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 50 μl, que contenía 50 ng de ADN
molde (ADN genómico CHO extraído como se describe anteriormente), 0. 25 U Taq ADN
polimerasa, dNTP 2.0 mM, 1X Taq ADN polimerasa tampón (Mg+2 plus) y 20 Μm de
cebadores. Las secuencias de los cebadores diseñados fueron las siguientes:
Secuencia (5′ – 3 ′)
TTGGCTACGTGTTTCGCAGC
TATTTCGTTCAACCCCTCGC
SECUENCIACIÓN.
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El método de Maxam y Gilbert fue muy popular en sus inicios; sin embargo, con la
descripción del método enzimático didesoxi, o de terminación de cadena, esta técnica quedó
en desuso, ya que involucra el uso de sustancias químicas peligrosas y cantidades elevadas
de ADN marcado radiactivamente, además de ser técnicamente más complejo. Por ello, en
la actualidad los procedimientos de secuenciación automatizada están basados en el
método enzimático de Sanger, que suple el marcaje radiactivo con métodos
quimioluminiscentes con el uso de fluorocromos.
moldes. Con este robot se resuelven más de 450 bases en secuenciación automática de
ADN, protocolo que es aplicable tanto a marcaje radiactivo como fluorescente. En estos
sistemas automatizados el fragmento de ADN fluorescente pasa por el punto de tensión del
secuenciador automático, y estas señales se envían a una computadora con un programa
especial. Así, un golpe de láser excita la tinción fluorescente, la señal de fluorescencia
emitida se digitaliza y es captada por detectores que una computadora analiza y descifra, y
pueden observarse los resultados obtenidos en tiempo real. En minutos, este programa
procesa la imagen del gel capilar. Para cada muestra secuenciada se crean curvas de
cuatro colores, uno por cada nucleótido, y debajo de cada pico de la secuencia se identifica
la secuencia de nucleótidos correspondientes al fragmento analizado. La secuenciación por
terminación fluorescente es un método para el análisis de la secuencia del ADN mediante
automatización parcial. Es una variante modificada en la cual el marcaje se realiza con un
fluoróforo unido de forma covalente en el oligonucleótido iniciador utilizado. En esta opción
se utiliza un color diferente para cada fluoróforo de cada reacción específica para
nucleótidos A, C, G o T, marcándolos como terminadores reversibles mediante la unión del
fluoróforo a la base en el grupo 3’-OH, de tal forma que la ADN polimerasa aún la puede
reconocer como sustrato. Después, las mezclas de reacción se combinan en una
electroforesis en un mismo gel, y la información de la secuencia se lee directamente
mediante una computadora. Cuando el fluoróforo se agrega en la terminación de la cadena,
se tiene la ventaja de que este último método puede llevarse a cabo en una sola reacción en
lugar de en cuatro, como en el método en que se marca el iniciador. En esta reacción los
ddNTP se marcan con fuorocromos de diferente color para cada base, con lo cual la
terminación de cada cadena determinará el color y, por ende, el NTP respectivo.
7. RESULTADOS/PRODUCTOS ESPERADOS
A pesar de los estudios previos centrados en los cambios en IRP30 de diferentes insectos
sociales en diversos entornos, se dispone de muy poca información sobre el patrón de
expresión preciso y la función biológica de esta proteína. En este estudio, aclaramos las
características estructurales y los del gen IRP30 en la avispa Vespa mandarinia y su
participación en la respuesta inmune IRP30.
La proteína de respuesta inmune 30 es una proteína que contiene LRR. Una sección
representativa de LRR está presente en IRP30 de las avispas; se ha demostrado que los
LRR proporcionan un marco estructural para la formación de interacciones proteína-proteína
( Gay et al. 1991 , Enkhbayar et al. 2004 ) y que las funciones principales de los miembros
de la familia de proteínas LRR están en la respuesta inmune ( Zhu et al. 2010) y
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En el alineamiento fue notable que ambas especies no tenían una similaridad alta (Identity:
566/1694 (33.4%), Similarity: 566/1694 (33.4%) para pertenecer a un mismo orden, lo cual
al tener los resultados de la secuencias podría confirmar algún tipo de cambio en las
proteínas producidas por el mismo que quizás sugieran mayor respuesta inmune en Vespa
mandarinia esto la hace una especie más competente y reforzaría su capacidad de
adaptarse como especie invasora, como se ve en la actualidad, de igual manera si se
analiza mejor el gen en Apis miellifera quizás muestre algún tipo de desventaja que la hace
más vulnerable a factores ambientales y menos competente al exponerse a condiciones de
estrés tales como la depredación, enfermedades entre otros.
Finalmente, queda la pregunta si este gen IRP30 ha desarrollado un papel y función clave
en la vida social de este tipo dentro del Orden himenóptera no solo en función del sistema
inmune.
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