Universidad San Carlos de Guatemala

Centro universitario del Suroccidente

Técnico en procesamiento de alimentos
Análisis de alimentos I
Inga. Aurora Carolina Estrada Elena

Grupo No. 4
Trabajo de Exposición
Análisis Proximal: Proteínas.

Francisco Daniel Matul Solares: 201642186

María Regina Letona Robles: 201640645
Margarita Mishelle Hoffens Yex: 201641592
María Eugenia Escobar López: 201843138
Luis Emilio Macal Espinoza: 201842957
Marco Antonio del Cid Chan: 201646372

Mazatenango, Suchitepéquez, marzo de 2020

 ii

Índice.
Índice......................................................................................................................................ii
Introducción............................................................................................................................1
Objetivos.................................................................................................................................2
General................................................................................................................................2
Especifícos...........................................................................................................................2
Proteínas..................................................................................................................................3
Funciones de las proteínas...................................................................................................4
Propiedades.........................................................................................................................4
Clasificación de las proteínas..............................................................................................5
Alimentos ricos en proteínas...............................................................................................6
Metodos de analisis de proteinas............................................................................................6
Kjeldahl...............................................................................................................................6
Dumas..................................................................................................................................6
Biuret...................................................................................................................................7
Caracteristicas metodos de analisis de proteinas....................................................................7
Kjeldahl...............................................................................................................................7
Dumas..................................................................................................................................8
Biuret...................................................................................................................................8
La ventaja del método dumas..............................................................................................8
Método y equipo para la obtención de proteínas en frutas y verduras....................................9
Método dumas.....................................................................................................................9
Método NIR.......................................................................................................................10
Equipo Dumas...................................................................................................................10
Equipo Kjedahl..................................................................................................................11
Equipo NIR........................................................................................................................11
Proteína de soja y concentrado de proteína de soja...........................................................11
Método de determinación de proteínas en cereales..............................................................12
Procedimiento por el método de Kjeldahl.........................................................................12
Material y aparatos............................................................................................................12
Reactivos...........................................................................................................................12
Procedimiento....................................................................................................................13
Cálculo...............................................................................................................................14
 iii

Descripción de Equipos.....................................................................................................15
Tipo Kjeldahl, de destilación.............................................................................................16
Determinación de proteínas en cárnicos...............................................................................18
Método de Kjeldahl...............................................................................................................18
Fundamento.......................................................................................................................20
Materiales y reactivos........................................................................................................21
Materiales..........................................................................................................................21
Reactivos...........................................................................................................................21
Aparatos e instrumentos....................................................................................................22
Procedimiento....................................................................................................................22
Expresión de resultados.....................................................................................................23
Método de biuret...............................................................................................................24
Método de destilación.......................................................................................................28
Método de absorción a 280 nm.........................................................................................29
Ventajas y desventajas de los principales métodos de determinación de proteínas (tabla 01)
...............................................................................................................................................30
Metódos para determinar la proteína en lacteos....................................................................31
Método kjeldahl.................................................................................................................31
Digestión...........................................................................................................................32
Destilación.........................................................................................................................33
Valoración.........................................................................................................................33
Metodo sorensen – walker.................................................................................................33
Metódo Dumas..................................................................................................................34
Conclusiones.........................................................................................................................36
Bibliografia...........................................................................................................................37
iv
 1

Introducción.

El análisis proximal comprende la determinación de los porcentajes de humedad, grasa,

fibra, cenizas, carbohidratos solubles y proteína en los alimentos. Las proteínas

desempeñan un papel importante en los seres vivos y son las biomoleculas más versátiles y

más diversas. Las proteínas están formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y

nitrógeno. Puede también contiene azufre y en algunos tipos de proteína fósforo, hierro,

magnesio, cobre y entre otros elementos.

La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados

con proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han desarrollado diferentes

métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en particular. Los métodos de

cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales tales como la medición

de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford y el ácido bicinconínico, así como

métodos alternativos como el de Lowry o novedosos ensayos desarrollados por los

proveedores comerciales.

La mayoría de los métodos se basan en el análisis de los constituyentes de lasproteínas

como el nitrógeno, ciertos aminoácidos o el enlace peptídico,asumiendo que la

cantidad de estos y el contenido proteico es constante.

 2

Objetivos

General

 Obtener un mejor conocimiento sobre las generalidades y el funcionamiento de las

proteínas.

Especifícos

 Determinar los métodos utilizados para obtención de proteínas en diferentes tipos de

alimentos.

 Conocer el equipo utilizado en el análisis de la obtención de las proteínas.

 3

Proteínas

Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un tipo de

enlaces conocidos como enlaces peptídicos. El orden y la disposición de los aminoácidos

dependen del código genético de cada persona.[ CITATION cui \l 4106 ]

Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el

grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes.

Las proteínas se ensamblan de diversas formas, lo que les permite participar como los

principales componentes estructurales de las células y los tejidos. Por este motivo el

crecimiento, la reparación y el mantenimiento del organismo dependen de ellas. [ CITATION

cui \l 4106 ]

Todas las proteínas están compuestas por:

 Carbono

 Hidrógeno

 Oxígeno

 Nitrógeno

Y la mayoría contiene además azufre y fósforo.

Las proteínas suponen aproximadamente la mitad del peso de los tejidos del organismo,

y están presentes en todas las células del cuerpo, además de participar en prácticamente

todos los procesos biológicos que se producen.

 4

Funciones de las proteínas

De entre todas las biomoléculas, las proteínas desempeñan un papel fundamental en el

organismo. Son esenciales para el crecimiento, gracias a su contenido de nitrógeno, que

no está presente en otras moléculas como grasas o hidratos de carbono. También lo son

para las síntesis y mantenimiento de diversos tejidos o componentes del cuerpo, como los

jugos gástricos, la hemoglobina, las vitaminas, las hormonas y las enzimas (estas últimas

actúan como catalizadores biológicos haciendo que aumente la velocidad a la que se

producen las reacciones químicas del metabolismo). Asimismo, ayudan a transportar

determinados gases a través de la sangre, como el oxígeno y el dióxido de carbono, y

funcionan a modo de amortiguadores para mantener el equilibrio ácido-base y la

presión oncótica del plasma. [ CITATION cui \l 4106 ]

Otras funciones más específicas son, por ejemplo, las de los anticuerpos, un tipo de

proteínas que actúan como defensa natural frente a posibles infecciones o agentes externos;

el colágeno, cuya función de resistencia lo hace imprescindible en los tejidos de sostén o la

miosina y la actina, dos proteínas musculares que hacen posible el movimiento, entre

muchas otras.

Propiedades

Las dos propiedades principales de las proteínas, que permiten su existencia y el

correcto desempeño de sus funciones son la estabilidad y la solubilidad.[ CITATION cui \l

4106 ]
 5

La primera hace referencia a que las proteínas deben ser estables en el medio en el que

estén almacenadas o en el que desarrollan su función, de manera que su vida media sea lo

más larga posible y no genere contratiempos en el organismo.

En cuanto a la solubilidad, se refiere a que cada proteína tiene una temperatura y un pH

que se deben mantener para que los enlaces sean estables.[ CITATION cui \l 4106 ]

Las proteínas tienen también algunas otras propiedades secundarias, que dependen de

las características químicas que poseen. Es el caso de la especificidad (su estructura hace

que cada proteína desempeñe una función específica y concreta diferente de las demás y de

la función que pueden tener otras moléculas), la amortiguación de pH (pueden comportarse

como ácidos o como básicos, en función de si pierden o ganan electrones, y hacen que el

pH de un tejido o compuesto del organismo se mantenga a los niveles adecuados) o la

capacidad electrolítica que les permite trasladarse de los polos positivos a los negativos y

viceversa.[ CITATION cui \l 4106 ]

Clasificación de las proteínas

Las proteínas son susceptibles de ser clasificadas en función de su forma y en función de

su composición química. Según su forma, existen proteínas fibrosas (alargadas, e insolubles

en agua, como la queratina, el colágeno y la fibrina), globulares (de forma esférica y

compacta, y solubles en agua. Este es el caso de la mayoría de enzimas y anticuerpos, así

como de ciertas hormonas), y mixtas, con una parte fibrilar y otra parte globular. [ CITATION

cui \l 4106 ]
 6

Alimentos ricos en proteínas

Están presentes sobre todo en los alimentos de origen animal como la carne, el pescado,

los huevos y la leche. Pero también lo están en alimentos vegetales, como la soja, las

legumbres y los cereales, aunque en menor proporción. Su ingesta aporta al organismo 4

kilocalorías por cada gramo de proteína. [ CITATION cui \l 4106 ]

Metodos de analisis de proteinas

Kjeldahl

El objetivo del procedimiento de digestión es romper todos los enlaces de nitrógeno de

la muestra y convertir todo el nitrógeno unido orgánicamente en iones amonio (NH4 +). El

carbono orgánico y el hidrógeno forman dióxido de carbono y agua[ CITATION Sca19 \l 3082 ]

Dumas.

Es un método de análisis químico para determinar el contenido de nitrógeno de una

sustancia química Se usa comúnmente para estimar el contenido de proteínas de los

alimentos. Los otros componentes mayoritarios como grasas y carbohidratos y otros

compuestos estructurales como la lignina no contienen nitrógeno, pero los aminoácidos de

las proteínas sí. Otras sustancias como las vitaminas también contienen nitrógeno, pero son

una parte muy pequeña y tienen una influencia insignificante en el resultado del análisis.

[ CITATION Sca19 \l 3082 ]

Biuret
 7

Es la técnica más simple para la determinación de las proteínas solubles. Las sustancias

que poseen 2 o más enlaces peptídicos forman un complejo coloreado purpura con sales de

cobre alcalinas. El desarrollo del color es diferente para cada proteína. La reacción del

biuret es una reacción violeta debido a la formación del complejo Cu en un medio alcalino

con compuestos que poseen grupos –co-NH. [ CITATION Wik20 \l 3082 ]

Caracteristicas metodos de analisis de proteinas

Kjeldahl

 En 2009, la Comisión Europea confirmó el método Kjeldahl como un método

oficial para el control de alimentos y piensos.

 Determina Nitrógeno basado en Nitrógeno orgánico y amoniaco.

 Una técnica de química húmeda inventada por Johan Kjeldahl en los laboratorios

Carlsberg en 1883, aunque las soluciones modernas de Kjeldahl son altamente

refinadas para el manejo de lotes, lo que hace posible manejar hasta 20 muestras a la

vez.

 El tamaño de la muestra no está limitado, por lo que es un método valioso para tipos

de muestra no homogéneos.[ CITATION Nal201 \l 3082 ]

Dumas.

 Un método relativamente nuevo para alimentos y productos agrícolas, pero muy

popular para alimentos y cada vez más definido en las normas.

 8

 Determina el nitrógeno total incluyendo las fracciones inorgánicas.

 Un método de combustión inventado en 1883 por Jean Baptiste Dumas en el que

una reacción exotérmica transforma instantáneamente cualquier material orgánico en

su elemento, sin productos químicos involucrados.

 Rápido y conveniente con análisis altamente automatizados de lotes de hasta 117

muestras a la vez, pero con un tamaño de muestra limitado debido al método de

combustión empleado.[ CITATION Wik201 \l 3082 ]

Biuret

 Bastante específico para las proteínas

 Muestra pocas interferencias

 Precio accesible

 Poca sensibilidad [ CITATION Wik20 \l 3082 ]

La ventaja del método dumas.

Analizamos cómo las características de automatización de los equipos de Dumas hacen

que consuma menos tiempo en comparación con el análisis de Kjeldah, por ejemplo, con

una automatización de lotes altamente eficiente que permite a los operadores cargar

muestras y luego pasar a otras tareas en el laboratorio. Dumas también es más rápido con el

resultado de la prueba disponible cinco minutos después de la preparación. [ CITATION

sca18 \l 3082 ]
 9

En resumen, un enfoque típico para el laboratorio puede ser utilizar el método Dumas

como primera opción para muestras de alto volumen bien conocidas y análisis de Kjeldahl

para muestras especiales. Además, como método de referencia establecido hace tiempo, los

clientes a menudo solicitan específicamente Kjeldahl. [ CITATION sca18 \l 4106 ]

Método y equipo para la obtención de proteínas en frutas y verduras.

Método dumas

 Un método relativamente nuevo para alimentos y productos agrícolas, pero muy

popular para alimentos y cada vez más definido en las normas.

 Determina el nitrógeno total incluyendo las fracciones inorgánicas.

 Un método de combustión inventado en 1883 por Jean Baptiste Dumas en el que

una reacción exotérmica transforma instantáneamente cualquier material orgánico en

su elemento, sin productos químicos involucrados.

 Rápido y conveniente con análisis altamente automatizados de lotes de hasta 117

muestras a la vez, pero con un tamaño de muestra limitado debido al método de

combustión empleado.

Método NIR

 Una técnica espectroscópica que hace uso del espectro electromagnético natural

definido por longitudes de onda entre 700nm y 2500nm.

 10

 Se introdujo en los años setenta y ochenta en algunas industrias agroalimentarias y

se ha vuelto indispensable para la determinación cuantitativa de los principales

constituyentes en la mayoría de los tipos de alimentos y productos agrícolas.

 Requiere una calibración de acuerdo con la aplicación, pero una vez que está en su

lugar, hay poca o ninguna preparación de muestra y no hay productos químicos o

consumibles involucrados. Es fácil de usar y rápido (30-60 segundos).

 El crecimiento en uso en línea con la disponibilidad de las calibraciones

prefabricadas avanza en el poder de computación y la tecnología de conectividad en

red.

Equipo Dumas.
 11

Equipo Kjedahl.

Equipo NIR.

Proteína de soja y concentrado de proteína de soja

Las semillas de soja contienen alrededor de un 40 por ciento de proteínas vegetales de

máxima calidad. De la mayoría de semillas se produce aceite de soja, que se usa como base

para producir alimentos o biodiesel. La proteína de soja puede extraerse como concentrado

o aislada.
 12

Proteína de guisantes

Los guisantes no solo son fuentes de proteína; además, desempeñan un papel

fundamental en la producción de almidón. Estas dos sustancias (proteína y almidón) deben

aislarse de una manera eficaz.

Método de determinación de proteínas en cereales

Procedimiento por el método de Kjeldahl

El contenido en proteína bruta de un producto es el resultado de multiplicar el contenido

en nitrógeno, determinado por el procedimiento Kjeldahl por un factor de transformación

del nitrógeno en proteína. Este método es aplicable a los granos, harinas y otros derivados

de los cereales. (Química cerealista, 2016)

Material y aparatos.

Matraces Kjeldahl de 500 a 800 ml.

Aparato de destilación y digestión (Kjeldahl).

Reactivos.

Ácido Sulfúrico 96%

Ácido Sulfúrico 0,05 mol/l

Agua

Cobre II Sulfato 5-hidrato

Etanol 96% v/v

 13

Potasio Sulfato

Rojo de Metilo solución 0,1%

Sodio Hidróxido solución 30% p/v

Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N)

Indicador Azul de Bromofenol

Ácido Sulfúrico 96%

Potasio Sulfato

Cobre II Sulfato 5-hidrato

Sodio Hidróxido solución 30% p/v

Ácido Sulfúrico 0,05 mol/l (0,1N

Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) indicador

Azul de BromofenolSV.

Disolución de indicador. Disolver 0,3 g de Rojo de Metilo solución 0,1% en 100 ml de

Etanol 96% v/v

Procedimiento.

1. Pesar un g de muestra, molida de forma que las partículas sean inferiores a 500 µ, e

introducirla en un matraz Kjeldahl.

 14

2. Añadir 10 g de Potasio Sulfato y 0,1 g de Cobre II Sulfato 5-hidrato. Agregar 20 ml

de Ácido Sulfúrico 96% y mezclar todo hasta que toda la sustancia esté mojada por

el ácido.

3. Iniciar el ataque a fuego lento, para evitar que la espuma arrastre el producto al

cuello del matraz. Cuando desaparezca la espuma, hacer hervir vigorosamente hasta

que la disolución quede limpia y prolongar todavía el ataque otros 30 minutos. Dejar

enfriar.

4. Añadir unos 200 ml de Agua. Agregar 80 ml de Sodio Hidróxido solución 30% p/v y

proceder al destilado. El líquido que destila se recoge en un vaso que contiene 20 ml

de Ácido Sulfúrico 0,05 mol/l (0,1N) y una gota de disolución de Rojo de Metilo,

añadiéndose nuevamente una cantidad conocida de Ácido Sulfúrico 0,05 mol/l

(0,1N) SV si virase de color durante la destilación.

5. La cantidad de destilado a recoger es de unos 150 ml, dándose por acabada la

destilación cuando el líquido que se destila no haga virar a azul el papel rojo de

tornasol. Acabada la destilación, valorar el exceso de Ácido Sulfúrico con disolución

valorada de Sodio Hidróxido 0,1 mol/l (0,1N) indicador Azul de Bromofenol.

Efectuar una prueba en blanco de destilación y valoración para controlar la pureza de

los reactivos.

Cálculo.

El porcentaje de proteína bruta sobre sustancia natural es:

 15

en la que:

V = volumen en ml de disolución de ácido sulfúrico 0,1N empleado para recoger el

nitrógeno amoniacal destilado.

f = factor de la disolución de ácido sulfúrico 0,1N.

V1 = volumen en ml de disolución de sodio hidróxido 0,1N necesario para neutralizar el

ácido sulfúrico existente al final de la destilación.

F1 = factor de la disolución de sodio hidróxido 0,1N.

F = factor de transformación de nitrógeno en proteína. Para el trigo y derivados es de 5,7 y

para los restantes cereales es de 6,25.

P = peso de la muestra.

El porcentaje de proteína bruta sobre sustancia seca se determina teniendo en cuenta el

contenido en humedad.

Dispersión de los resultados. Se considerarán concordantes las determinaciones duplicadas

cuando los resultados expresados en porcentaje difieran en menos de 0,25.

 16

Descripción de Equipos

 Tipo:

Tipo Kjeldahl, de destilación

 Material:

de vidrio borosilicato

 Otras características:

para titulación

 Volumen:

300 ml, 500 ml, 800 ml

Descripción

Estos frascos fueron desarrollados originalmente en el siglo XIX por Johan Gustav

Kjeldahl para su uso en su nuevo aparato para la determinación de nitrógeno. En ese

momento, Kjeldahl trabajaba para la empresa cervecera Carlsberg.

Para la determinación del nitrógeno por el método Kjeldahl

 17

Los cuellos extra largos actúan como condensadores de aire durante la etapa de digestión y

reducen el arrastre durante la etapa de destilación

Equipo Kjeldahl

Con 6 unidades de digestión y 6 unidades de destilación para matraces de 500 y 800 ml.

Diseñado para la determinación de proteína según el contenido de nitrógeno en productos

agrícolas.

Características

Para la digestión:

 Extractor de fibra de vidrio contra ácidos, con motor de 1/4 HP, con salida de tubo

de PVC con conexión a 6".

Para destilación:

 Un manifold para la circulación de agua con 6 tubos en acero inoxidable para la

caída de la muestra. Cuenta con termómetro. Conexión de entrada y salida de agua.

 18

Tamaño de la muestra: 0.5 a 5.0 gramos.

Controles de calentamiento infinito de 120V ó 220V

Indicador lumínico independiente.

Resistencia de nicromel a 600 watts.

Determinación de proteínas en cárnicos

Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una

amplia gama de estructuras y funciones. Las proteínas como un grupo de biomoléculas,

desempeñan una gran variedad de funciones, algunas participan en la contracción muscular

y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan moléculas pequeñas.

Los anticuerpos (moléculas que sirven para como protección inmunológica) son proteínas

al igual que las enzimas (catalizadores biológicos) y algunas hormonas. Las proteínas

pueden llevar a cabo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en

la composición y secuencia de aminoácidos.

Las proteínas también se clasifican según su composición, las que se forman solo de

residuos de aminoácidos y no tienen otras biomolecular son PROTEÍNAS SIMPLES; no

todas las proteínas son solubles en agua, de hecho las proteínas insolubles son esenciales

para dar soporte y mantener la integridad estructural de las células y organismos.

Método de Kjeldahl
 19

Determina la materia nitrogenada total (que incluye las no proteínas y las proteínas

verdaderas).

El método se basa en la determinación de la cantidad de nitrógeno orgánico contenido en

productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos

a) La descomposición  de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido

sulfúrico concentrado.

b)   El registro de la cantidad de amoniaco contenida en la muestra.

Durante la descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la materia orgánica

combinada con la oxidación de carbono.

Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor 6.25 el cual proviene de la

consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16%

de nitrógeno.

El método consta de las siguientes etapas:

Digestión:

1.- Pesar de 0.1-0.2g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldahl, y agregar 0.15g de

sulfato de cobre pentahidratado, 2.5g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 ml. de

ácido sulfúrico concentrado.

*Nota. No colocar el papel.

2.- Encender el aparato y precalentar a la temperatura de 360°C. Colocar los tubos en el

porta tubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calentamiento.

3.- Ajustar la unidad de evacuación de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de

digestión.

4.- Accionar la trampa de succión de gases antes de que se produzcan éstos. Calentar hasta
 20

total destrucción de la materia orgánica, es decir hasta que el líquido quede transparente,

con una coloración azul verdosa

5.- Una vez finalizada la digestión, sin retirar la unidad de evacuación de gases, colgar el

Porta tubos para enfriar.

 *Nota. Tener la precaución de colocarlo adecuadamente, de lo contrario se podría caer.

6.- Después del enfriamiento, terminar la digestión con la tecla  y desconectar la trampa.

Fundamento

Es un método confiable para la determinación de nitrógeno y proteínas en productos

cárnicos, por ejemplo, fiambres, jamón ahumado y salchicha de carne hervida. Las

muestras se digieren utilizando el KjelDigester K-449. La destilación y la titulación del

ácido bórico se realizan utilizando el sistema KjelMaster K-375 / K-376. Equivalente a la

norma internacional, el método de medición de la titulación de ácido bórico es

colorimétrico. Por lo tanto, se agrega un indicador mixto según Sher a la solución de ácido

bórico y es sensado por el KjelMaster K-375. La combinación del KjelDigester, el sistema

KjelMaster K-375 / K-376 y el novedoso modo de titulación "en línea" aumenta el

rendimiento de la muestra hasta 120 muestras por día de trabajo (9 h).

Este método se basa en la descomposición de los compuestos de nitrógeno orgánico por

ebullición con ácido sulfúrico. El hidrógeno y el carbón de la materia orgánica se oxidan

para formar agua y bióxido de carbono. El ácido sulfúrico se transforma en SO 2, el cual

reduce el material nitrogenado a sulfato de amonio.

 21

El amoniaco se libera después de la adición de hidróxido de sodio y se destila recibiéndose

en una disolución al 2% de ácido bórico. Se titula el nitrógeno amoniacal con una

disolución valorada de ácido, cuya normalidad depende de la cantidad de nitrógeno que

contenga la muestra. En este método de Kjeldahl-Gunning se usa el sulfato de cobre como

catalizador y el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la

digestión.

Materiales y reactivos

 Materiales

 El equipo de vidrio empleado debe cumplir con los requisitos que establece la

NMX-BB-014.

 Matraces Kjeldahl de 500 y/o 800 cm3

 Material común de laboratorio

Reactivos
 22

Los reactivos que se mencionan a continuación, deben ser grado analítico, cuando se

indique agua, debe entenderse agua destilada.

 Ácido sulfúrico concentrado

 Sulfato de cobre pentahidratado

 Zinc granulado

 Hidróxido de sodio: Disolver con 500 cm3 de agua 500 g de hidróxido de sodio.

 Sulfato de sodio anhidro

 Ácido bórico al 2%

 Solución de ácido clorhídrico 0.1 N

 Indicador Shiro Tashiro: Disolver 0.2 g de rojo de metilo en 60 cm 3 de alcohol y

aforar a 100 cm3 con agua. Disolver 0.2 g de azul de metileno y aforarlos a 100 cm3

con agua. Mezclar 2 partes de rojo de metilo y una de azul de metileno.

Aparatos e instrumentos

 Digestor y destilador Kjeldahl

 Balanza analítica con ± 0.1 mg de sensibilidad

Procedimiento

1. Determinar la masa, en la balanza analítica, de aproximadamente un gramo

de muestra y pasarla cuantitativamente a un matraz Kjeldahl, añadirle 2 g de

 23

sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25 cm 3 de ácido sulfúrico

y unas perlas de vidrio.

2. Colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja

temperatura hasta que todo el material esté carbonizado, aumentar

gradualmente la temperatura hasta que la disolución esté completamente

clara y dejar por 30 minutos más a esa temperatura.

3. Enfriar y añadir de 400 a 450 cm3 de agua para disolver completamente la

muestra, agregar 3 ó 4 gránulos de zinc, un poco de parafina cuando sea

necesario y 50 cm3 de hidróxido de sodio 1:1.

4. Inmediatamente conectar el matraz a un sistema de destilación, el cual

previamente se le ha colocado en la salida del refrigerante un matraz

Erlenmeyer de 500 cm3 que contenga 50 cm3 de ácido bórico y unas gotas

del reactivo Shiro Tashiro como indicador.

5. Destilar hasta que haya pasado todo el amoniaco, que unas gotas de

destilado no den alcalinidad con el papel tornasol, aproximadamente 300

cm3.

NOTA: Las primeras gotas de destilado deben hacer virar el color del indicador de violeta a

verde.

6 Retirar el matraz recibidor y titular el destilado con ácido clorhídrico 0.1 N.

Expresión de resultados

.El Nitrógeno presente en la muestra, expresado en por ciento se calcula mediante la

siguiente fórmula:
 24

                           V x N x 0.014 x 100

% de nitrógeno =                               

                   m

En donde:

V = Volumen de ácido clorhídrico empleado en la titulación, en cm3

N = Normalidad del ácido clorhídrico.

m = Masa de la muestra en g.

0.014 = miliequivalente del nitrógeno.

El por ciento de proteínas se obtiene multiplicando el por ciento de nitrógeno obtenido por

el factor correspondiente 6.25.

 El contenido de nitrógeno en diferentes proteínas es aproximadamente de 16% por lo que

multiplicando el por ciento de nitrógeno obtenido por el factor 6.25 se obtiene la cantidad

de proteínas presentes en el alimento. Sin embargo, en algunos productos, la relación

nitrógeno-proteínas varía en forma transcendente por lo que es necesario utilizar los

factores que en ese caso se señalen:

5.7 Pan y trigo

5.95 Arroz

6.31 Germen de trigo

6.25 Maíz

6.71 Soya
 25

5.70 Cereales y pastas

6.38 Leche

Método de biuret

El método comprende un ensayo calorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación

de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta

característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la

coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en

la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el

establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de

los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de

cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario

considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración

tris y amoniaco. (Nollet, 1996)

 26

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros

compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

Está hecho de hidróxido potásico y sulfato cúprico  junto con tartrato de sodio y potasio. El

reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se

combina con  polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la

reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite

determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía

ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm. (Para detectar el ion Cu2+).

Método de lowry
 27

Se basa en la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau que es una mezcla de ácidos

fosfomolibdico y fosfotungstico por la oxidación de tirosina, triptofano, cisterna, cistina de

las cadenas polipeptídicas. El proceso de oxido-reducción se acompaña de la formación de

un color azul característico. Quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la

transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromógeno ácido. Este

método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una disolución. El

desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10

y 10.5. (Nollet, 1996)

Combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos

fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina, triptófano, cisteína, cistina de

las cadenas polipeptídicas. El proceso de óxido-reducción se acompaña de la formación de

un color azul característico. Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de

una proteína en una disolución.

El desarrollo de color es dependiente del pH, que debe mantenerse entre 10 y 10.5

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que

más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la

cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y

teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una

proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de

métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes.

 28

La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo

conocida.

Se desarrolla en las siguientes fases:

1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu 2+, en presencia de tartrato

para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose

un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico.

2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteu para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico),

que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol)

presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide

colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos

máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra

depende de la concentración proteica de la muestra estudiada.

Método de destilación

1.- En un matraz Erlenmeyer de 250 ml. adicionar (según se indique) 50 ml. de HCl 0.1N y

unas gotas de indicador rojo de metilo .1% o bien 50 ml. de ácido bórico 4% con

indicadores.

2.- Conectar el equipo de destilación y esperar unos instantes para que se genere vapor.

3.- Colocar el tubo de digestión con la muestra diluida y las sales disueltas en un volumen
 29

no mayor de 10 ml. de agua destilada, en el aparato de destilación cuidando de introducir la

alargadera hasta el fondo de la solución.

4.- Presionar el botón blanco para adicionar sosa al 36% (hasta 40 ml. aproximadamente).

5.- Colocar la palanca de vapor en posición “ON” hasta alcanzar un volumen de destilado

en el matraz Erlenmeyer de 100-150mL, lavar la alargadera con agua destilada, recoger el

agua de lavado sobre el destilado. Una vez finalizada la destilación, regresar la palanca de

vapor a la posición original.

6.- Titular el exceso de ácido (en el caso de recibir el destilado en HCl 0.1N) con una

solución de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con ácido bórico, con una solución de HCl

0.1N.

7.- Calcular el % de proteína considerando las reacciones que se llevan a cabo.

Método de absorción a 280 nm

Este método se basa principalmente, en que la mayoría de las proteínas tienen una

absorción a 280nm., la cual se atribuye al grupo fenólico y al grupo indólico de algunos

aminoácidos aromáticos.

La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo

fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano. La cuantificación de proteínas

 30

basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar

reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la

absorción del disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre

interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una

comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Mollet,

1996)

Ventajas y desventajas de los principales métodos de determinación de proteínas

(tabla 01)
Método Ventajas Desventajas

_ Es apropiado para varios

tipos de productos
_ Su alta confiabilidad y
disponibilidad
_ Está incluido en los
métodos aprobados por
las organizaciones
Método de Kjeldahl internacionales
_ Llega haber interferencia de
compuestos nitrogenados no proteicos
_ Durante la digestión se produce
demasiado humo
_ Uso de catalizadores caros o tóxicos
_ Baja sensibilidad
_- Tarda demasiado tiempo

Absorción a 280nm _ Rápida y no destructiva _ La interferencia de otros compuestos

que absorban en UV
_ No se necesitan reactivos
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_ Alta sensibilidad
_ Baja dependencia de la
respuesta de la señal a la
composición del
aminoácido
_ Baja interferencia de
_ Se necesita usar muestras limpias y
ácidos nucleicos y
nucleótidos Lámparas relativamente nuevas

_ No hay interferencia de
aminoácidos libres
_ Pequeña influencia de la
composición del
aminoácido en el desarrollo
de color
_ Interferencia de amoniaco, buffer,
_ La operación es simple y
detergentes
se puede manejar número
Método de Biuret grande de muestras _ Baja sensibilidad

_ Dependencia del color con la

composición del aminoácido
_ Interfieren un buen número de
compuestos
_ Alta sensibilidad _ Inestabilidad del reactivo Folin-
_ Fácil de operar Ciocalteau a pH alcalino
_ Fácil de manejar un gran _ La curva estándar no es lineal para
Método de Lowry número de muestras altas concentraciones de proteínas
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Metódos para determinar la proteína en lacteos

Método kjeldahl

El método Kjeldahl o digestión de Kjeldahl se usa comúnmente para estimar el

contenido de proteínas de los alimentos.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación

del nitrógeno en una amplia gama de muestras. La determinación del nitrógeno Kjeldahl se

realiza en alimentos y bebidas, lacteos, carne, piensos, cereales y forrajes para el cálculo del

contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de

nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

El método Kjeldahl ahora abarca la leche de otras especies, así como los productos

lácteos que son objeto de comercio internacional y están regulados por las normas del

Codex. La norma estándar ISO 8968-1:2014 (IDF 20-1:2014) confirma el papel crucial del

método Kjeldahl en la armonización del comercio, y aumenta las garantías de protección de

los consumidores. Juega un papel fundamental en el comercio nacional e internacional, por

ejemplo, en el cálculo de los pagos justos de la leche a los productores de leche, el control

de procesos de fabricación y el control reglamentario.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

El método Kjeldahl podrá ser aplicado a un amplio rango de productos, además de la

leche entera de vaca, el método puede ahora ser aplicado a la leche de vaca con un

contenido reducido de grasa, a la leche entera de cabra, la leche entera de oveja, el queso, la

leche en polvo y los productos lácteos en polvo, incluyendo los preparados para lactantes a
 33

base de leche, el concentrado de proteína de leche, el concentrado de proteína de suero de

leche, la caseína y los caseinatos.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

El método Kjeldahl consta de tres etapas:

Digestión

El objetivo del procedimiento de digestión es romper todos los enlaces de nitrógeno de

la muestra y convertir todo el nitrógeno unido orgánicamente en iones amonio (NH4 +). El

carbono orgánico y el hidrógeno forman dióxido de carbono y agua. En este proceso la

materia orgánica se carboniza dando lugar a la formación de una espuma negra. Durante la

digestión, la espuma se descompone y finalmente se convierte en un líquido claro que

indica que la reacción química ha terminado. Para ello, la muestra se mezcla con ácido

sulfúrico a temperaturas entre 350 y 380 ºC. Cuánto más alta sea la temperatura, más rápido

será el proceso de digestión. La digestión también se puede acelerar con la adición de sales

y catalizadores. Se añade sulfato de potasio para aumentar el punto de ebullición del ácido

sulfúrico y se añaden catalizadores para aumentar la velocidad y la eficiencia del

procedimiento de digestión. También se pueden añadir agentes oxidantes para mejorar aún

más la velocidad. [ CITATION Nal20 \l 3082 ]

Destilación

Durante el proceso de destilación los iones amonio (NH4 +) se convierten en amoniaco

(NH3 ) mediante la adición de un álcali (NaOH). El amoniaco (NH3 ) es arrastrado al vaso

receptor por medio de una corriente de vapor de agua. [ CITATION Nal20 \l 3082 ]
 34

Valoración

La concentración de los iones amonio capturados puede determinarse por medio de dos

tipos de valoración: 1.) Cuando se utiliza el ácido bórico como solución absorbente,

posteriormente se lleva a cabo una valoración ácido-base utilizando una solución

estandarizada de ácido sulfúrico o clorhídrico y una mezcla de indicadores. El rango de

concentración de la solución utilizada varía entre 0,01N a 0,5N dependiendo de la cantidad

de iones amonio presentes. El punto final de la valoración también se puede determinar

potenciométricamente con un electrodo de pH. Esta valoración se llama valoración directa.

2.) Cuando se utiliza una solución valorada de ácido sulfúrico como solución absorbente, el

ácido sulfúrico residual (es decir, el exceso que no reacciona con NH3 ) se valora con una

solución estandarizada de hidróxido sódico y la cantidad de amoniaco se calcula por

diferencia. Esta valoración se llama valoración indirecta o por retroceso. [ CITATION Nal20 \l

3082 ]

Metodo sorensen – walker

Está técnica determina el contenido en proteínas de la leche mediante una valoración

ácido-base, ya que tras la adición de formol a la muestra, el formaldehido se une a los

grupos amino de los aminoácidos de las proteínas dejando los grupos carboxilos libres. Este

hecho produce cambios en la acidez titulable de la leche siendo valorada con hidróxido

sódico. La cantidad de hidróxido sódico utilizado en la neutralización es utilizado para

calcular la cantidad de proteínas presente en la muestra.

Este método es usado como un método rápido en la determinación de proteínas enleche

fresca. De acuerdo con la FAO (2007), al adicionar CH2O a la muestra en exceso (la leche
 35

ya ha sido previamente neutralizada), este reacciona con cada grupo amino de lisina y

arginina (grupo metilenoimino– N=CH2), dejando libre a los grupos carboxilos, por lo que

habrá ganado acidez la leche, debido al exceso deformol, por lo que se neutraliza con un

exceso de álcali estándar (NaOH), el cual setitula, y se relaciona con el contenido de

proteína presente en la muestra (Del Ángelet al., 2013). El contenido proteico se obtiene

multiplicando el valor obtenido en latitulación por un factor empírico, y a su vez, para

obtener el % Caseína se multiplica por su respectivo factor empírico:

Las proteínas de la leche se clasifican en dos grandes grupos: caseínas (80 %)

y proteínas séricas (20 %). [ CITATION FAO07 \l 3082 ]

Metódo Dumas

El método de combustión Dumas es un método completo que sirve para determinar el

contenido total de nitrógeno en una matriz habitualmente orgánica. La muestra se

combustiona a una temperatura alta en una atmósfera de oxígeno. A través de subsiguientes

tubos de oxidación y reducción, el nitrógeno se convierte cuantitativamente en di nitrógeno

el resto de los productos volátiles de la combustión se aíslan o se separan. Un detector de

conductividad térmica mide el gas nitrógeno. Los resultados se indican en forma de

porcentaje o en mg de nitrógeno, que se puede convertir en proteínas mediante el uso de

factores de conversión.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

Durante la década de los 90, el método Dumas ganó en reconocimiento en comparación

con el método Kjeldahl tradicional, que fue el método dominante para el análisis de la

proteína cruda durante más de 100 años.[ CITATION Nal20 \l 3082 ]

 36

Conclusiones.

  La función principal de las proteínas es ayudar a fabricar, regenerar y mantener

nuestros tejidos Como la piel, las uñas, los tendones, etcétera. cuando la ingesta

de hidratos de carbono y grasas procedentes de la dieta sea insuficiente para cubrir

 37

las necesidades energéticas, en caso de un ayuno prolongado, la degradación de

proteínas (aminoácidos) cubrirá estas carencias. El organismo puede llegar a

obtener hasta 4 kilocalorías de energía por cada gramo de proteínas.

 La determinación de la cantidad de proteína de un alimento no es sencilla y el valor

obtenido en cada caso depende del método utilizado. Muchos ensayos dependen de

la presencia de una determinada cadena lateral aminoácido como lo es Biuret. Los

resultados analíticos se verán condicionados por la proporción de aminoácido en

cuestión en las proteínas sometidas al ensayo y necesitaran ser referidos a alguna

proteína estándar, otros métodos se basan en la determinación del contenido de

nitrógeno total como Kjeldahl.

 En los equipos utilizados para la determinación de proteínas podemos incluir al

KJELTEC 8400 este sistema de destilación y titulación totalmente autorizado según

el método oficial kjeldahl.

Bibliografia.

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https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/proteinas.html

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Métodos de la Asociación Internacional de Química Cerealista (I.C.C.).
 NMX-F-068-S-1980. ALIMENTOS. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
FOODS. DETERMINATION OF PROTEINS. NORMAS MEXICANAS.
DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.
 Manual de fundamentos y técnicas de análisis de alimentos 2007-2008