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Facultad de Ingeniería
Ingeniería Química
Laboratorio Bioquímica Sección 02
Mgtr. Ana Guillermina Velarde
Contenido Páginas
i. ÍNDICE ........................................................................................................................................ i
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... i
2. FUNDAMENTO ........................................................................................................................ 1
2.1 FUNDAMENTO TEÓRICO ............................................................................................. 1
2.1.1 CROMATOGRAFÍA.................................................................................................. 1
2.1.2 FENÓMENO DE ADSORCIÓN (Cromatografía de adsorción) ......................... 2
2.1.3 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN .................................................................... 3
2.1.4 PROPIEDAD DE RETENCIÓN .............................................................................. 3
2.1.5 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA ..................................................................... 4
2.1.6 ACTIVACIÓN DE LA PLACA .................................................................................. 6
2.1.7 HUMEDAD RELATIVA EN CROMATORGAFÍA DE CAPA FINA .................... 6
2.1.8 ELUCIÓN, SOPORTES Y REVELADORES PARA CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA ................................................................................................................................ 7
2.1.9 FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA ..................................................................................... 7
2.1.10 AMINOÁCIDOS ........................................................................................................ 7
2.2 PREGUNTAS PRE-LABORATORIO........................................................................... 12
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 12
3.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 12
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 12
4. METODOLOGÍA..................................................................................................................... 13
4.1 HOJAS DE SEGURIDAD-MSDS ................................................................................. 13
4.2 DIAGRAMA DE PROCESO .......................................................................................... 21
A. DIAGRAMA NO. 1: ACTIVACIÓN DE PLACAS CROMATOGRÁFICAS .............. 21
B. DIAGRAMA NO. 2: PREPARACIÓN DE LA CÁMARA CROMATOGRÁFICA ..... 21
C. DIAGRAMA NO. 3: APLICACIÓN EN LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS. 22
D. DIAGRAMA NO.4: DESARROLLO CROMATOGRÁFICO .................................. 23
E. DIAGRAMA NO. 5: CÁLCULOS A EFECTUAR EN LA PRÁCTICA ...................... 24
4.3 REACCIONES ................................................................................................................ 24
5. REFERENCIAS ...................................................................................................................... 25
5.1 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 25
5.2 E-GRAFÍAS........................................................................................................................... 26
1. INTRODUCCIÓN
El día jueves, 30 de mayo del 2019, se llevará a cabo la Práctica de laboratorio No. 1 “Separación e
identificación de aminoácidos por cromatografía de capa fina” con el objetivo general de separar
aminoácidos a través de la técnica de cromatografía de capa fina para identificarlos en una solución
desconocida. Los objetivos específicos se basarán en calcular los factores de retardo de cada uno de
los aminoácidos a través del desarrollo de una cromatografía de capa fina, comparar los factores de
retardo obtenidos a través de mediciones, para lograr diferencias e identificar la identidad de los
aminoácidos a analizar e identificar los aminoácidos presentes en una muestra de aminoácidos
desconocidos empleando la técnica de cromatografía de capa fina.
i
2. FUNDAMENTO
2.1 FUNDAMENTO TEÓRICO
2.1.1 CROMATOGRAFÍA
La técnica de cromatografía se basa en el principio general de distribución de un compuesto entre dos
fases, una fija y otra móvil; es una técnica que se emplea para separar los componentes de una mezcla,
también es empleada como criterio para la identificación de la pureza de los compuestos (Galagovsky,
2002).
La característica que distingue a la cromatografía de otros métodos físicos y químicos de separación
es que se ponen en contacto dos fases inmiscibles entre ellas, dichas fases son denominadas como
fase estacionaria y fase móvil.
➢ Fase estacionaria: Es la fase en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a
través de la cual fluye la fase móvil arrastrando a los mismos.
➢ Fase móvil: Es la fase que fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los
compuestos de la mezcla.
Fuente: (ULPGC, 2017).
Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene
una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan repartos entre la fase móvil
y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de
la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil (García, 2002).
Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase
estacionaria. El componente menos retardado se visualiza primero, el retenido más fuertemente se
visualiza de último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas
y/o químicas de los componentes de la muestra (García, 2002).
TIPO DEFINICIÓN
Se basa en la separación de un soluto entre una fase sólida de
Cromatografía de adsorción
adsorbente y una fase móvil.
Es la cromatografía en la que la fase estacionaria es un segundo
Cromatografía de partición
líquido que es inmiscible en la fase líquida móvil.
Cromatografía de filtración El sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que
con geles o exclusión retiene a las moléculas de soluto según su tamaño.
El sólido es un cambiador de iones (fuerzas electroestáticas); la
Cromatografía de separación por cromatografía de intercambio iónico depende de la
intercambio iónico adsorción reversible de una molécula de soluto cargada a un grupo
de intercambiadores iónicos inmovilizados de carga opuesta.
(Galagovsky, 2002)/ (Skoog, 2015)
1
Ilustración 1 Clasificación de los métodos cromatográficos
2
2.1.3 CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Es aquella en la que la cromatografía se da por la partición del soluto entre dos fases líquidas, es decir
que se fundamenta en las solubilidades relativas del compuesto en una fase con respecto a la otra, por
tanto, es que las sustancias se ven retenidas en la fase en la que presentan mayor solubilidad (Ramírez,
2011)
Las técnicas empleadas comúnmente para este tipo de cromatografía son:
➢ C.C.D con fase fija de celulosa
➢ Columnas con fase de celulosa
➢ Papel, en sus variantes, analítica o preparativa.
(Galagovsky, 2002)
3
2.1.5 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
En la cromatografía de capa fina, un adsorbente está depositado formando una delgada capa sobre
una placa de vidrio, papel de aluminio u otros materiales, por la que ascienden, arrastradas por un
disolvente (eluyente), una o más sustancias que se pretenden separar o identificar. Con la ayuda de un
capilar de vidrio, una pequeña cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del
extremo inferior de la placa (Ramírez, 2011).
En pocas palabras es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas mediante un
disolvente que se mueve sobre un soporte solidó adsorbente.
La cromatografía en capa fina presenta ciertas ventajas, las cuales se presentarán a continuación:
VENTAJAS DESVENTAJAS
• Análisis químico de materias orgánicas complejas • Las propiedades de la fase
• Separación e identificación de compuestos o mezclas estacionaria pueden
• Identificación en cantidades del orden en microgramos alterarse mediante la adición
• No se requieren cantidades grandes de muestra. disoluciones tamponadoras
• Sencillo, barato y con una pureza alta para mantener el pH
• El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es deseado.
mucho menor y la separación es generalmente mejor • Susceptible a resultados
• Resultados son fácilmente reproducibles afectados por temperatura,
• En la preparación de las placas también se pueden adicionar contaminación, etc.
indicadores fluorescentes o aglomerantes.
Fuente: (UAM, 2017)
Como se estableció con anterioridad, se establece en la cromatografía, en general, se presentan dos
tipos de fases, la fase estacionaria y la fase móvil, en donde la fase móvil es la fase que fluye a través
de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla (ULPGC, 2017) y la fase
estacionaria es la fase en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a través de la cual
fluye la fase móvil arrastrando a los mismos. Por lo que es de suma importancia, establecer algunos
ejemplos de fase móvil y fase estacionaria a utilizar:
• Entre los eluyentes más comunes para la fase móvil de la cromatografía de capa fina se
encuentran:
✓ Hexano ✓ Acetato de etilo
✓ Ciclohexano ✓ Acetona
✓ Tolueno ✓ Isopropanol
✓ Dietil-éter ✓ Etanol
✓ T-buti-éter ✓ Metanol
✓ Cloroformo ✓ Ácido acético
✓ Cloruro de metileno ✓ Éter de petróleo
Fuente: (Ramírez, 2011)
4
• Entre los principales sorbentes (fase estacionaria) a utilizar en cromatografía en capa fina se
encuentran:
Ilustración 2 Fase estacionar a utilizar según las sustancias que se desean separar
CARACTERÍSTICA DESCRIPCIÓN
Dicha característica depende de la preparación del adsorbente, ya
que dependiendo de la cromatografía que se llevará a cabo, es la
Poder del adsorbente
cantidad de ligantes que cada una conlleva, dichos ligantes
contribuyen a una mejor adherencia al soporte.
Es una característica considerable ya que se debe tener precaución
La inercia química con las probables reacciones químicas entre los compuestos y el
adsorbente.
Es importante ya que una gran superficie implica una mayor
adsorción, es decir, mejor resolución. Cuando se utiliza el
El tamaño del gránulo del
adsorbente de grano más fino en el espacio entre los gránulos es
adsorbente
más pequeño, el equilibrio adsorción-desorción se establece más
rápido.
Hace referencia a la homogeneidad en el armado de la fase fija, ya
El empaquetamiento
que es primordial un espesor parejo de la capa adsorbente.
Fuente: (Galagovsky, 2002)
5
Considerando el material de la fase estacionaria, es de suma importancia la correcta elección del
solvente a utilizar en este tipo de cromatografía, ya que uno de los factores que más influyen en la
polaridad de los compuestos a identificar y, por ende, a la polaridad del solvente. Se reconoce que un
solvente apolar, arrastra con mayor facilidad compuestos apolares y que un solvente polar, lo realiza
con compuestos polares. Por lo que una fase estacionaria apolar (Fase reversa) atraerá
mayoritariamente compuestos apolares y una fase estacionaria polar (Fase normal), compuestos
polares (Velásquez, 2013).
Tabla 4 Características de la separación por polaridad
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2.1.8 ELUCIÓN, SOPORTES Y REVELADORES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA
Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así, hay
varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.
• Una mala fabricación de las placas, en amabas placas, tanto las comerciales y las fabricadas
en laboratorio.
• Contaminación con suciedad, la suciedad puede ser arrastrada por el eluyentes y afectar los
resultados
• La pureza del disolvente elegido como eluyentes puede afectar los resultados
• La temperatura, ya que a menor temperatura se favorece la adsorción.
Fuente: (Ramírez, 2011)/ (Galagovsky, 2002)
2.1.10 AMINOÁCIDOS
El término aminoácido define a cualquier molécula que contiene un grupo amino y un grupo ácido; este
término casi siempre se designa a α-aminoácidos. En cuanto a la estructura, los aminoácidos comunes
tienen cadenas laterales sustituidas en el átomo de carbono α con lo cual este carbono tendría sus
cuatro posibles enlaces ocupados por grupos distintos, dispuestos en una estructura tetraédrica
(Morrison, 1998).
Los alfa-aminoácidos, presentan isomería óptica, de modo que tienen dos conformaciones posibles
dependiendo de la disposición de sus grupos en el espacio, una L (Levo, Izquierda) y otra D (Dextro,
derecha), también llamados enantiómeros. Para una mejor comprensión, si se dispusiera la molécula
con el grupo carboxilo en su parte superior y su cadena variable hacia abajo, habría dos posiciones
posibles de los otros dos grupos. Si el grupo amino está a la izquierda sería L, y si el grupo amino está
a la derecha, sería D, todos los aminoácidos que aparecen en las proteínas son L (Joaquín, 2018). A
continuación se presentarán ejemplificaciones de los dos tipos isoméricos de los aminoácidos, para
comprender a totalidad el momento en donde un aminoácido es L o D.
7
Ilustración 3 Estereoquímica de los aminoácidos
8
✓ Punto isoeléctrico de un aminoácido
Un aminoácido tiene una carga positiva en una disolución ácida y una carga negativa en una disolución
básica. Debe haber un pH intermedio donde el aminoácido esté balanceado de igual manera entre las
dos formas, este pH se le llama pH isoeléctrico o punto isoeléctrico (pI) (Wade, Química Orgánica,
2017). En pocas palabras el punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas
positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula.
En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoácidos los grupos
ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos. Se debe considerar que es
necesario que para evitar la desprotonación del segundo grupo ácido de un aminoácido con isoeléctrico
ácido, una disolución lo suficientemente ácida, de igual forma con un isoeléctrico básico (Wade,
Química Orgánica, 2017).
2.1.10.2 CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS
Tabla 5 Clasificación de los aminoácidos
CLASIFICACIÓN CONCEPTO
Son los aminoácidos proteicos que no sintetiza el cuerpo y, por tanto,
deben ser ingeridos a través de la dieta son los siguientes.
Son reguladores de las endorfinas. Entre sus funciones más
destacadas se encuentran la reducción del exceso de
apetito y la minoración del dolor.
Fenilalanina La fenilalanina también está implicada en la síntesis de las
catecolaminas adrenalina, dopamina y noradrenalina, por lo
que promueve el estado de alerta, mejora la memoria y el
aprendizaje e incrementa la vitalidad.
Es uno de los 3 aminoácidos de cadena ramificada (BCAA)
junto a la isoleucina y valina, que están implicados en la
Isoleucina síntesis proteica. Es un potente estimulador de la insulina,
es necesario para la cicatrización de las heridas y la
curación de huesos. Modula la liberación de encefalinas,
que son analgésicos naturales.
Inhibe el desarrollo de los virus dentro del organismo y,
como resultado, se utiliza en el tratamiento de los Herpes,
Aminoácidos Lisina así como los virus asociados con el síndrome de fatiga
esenciales crónica. La lisina participa en la síntesis de L-carnitina junto
a la vitamina C.
La treonina es necesaria para la formación de colágeno y
ayuda en la producción de anticuerpos. También es
Treonina necesaria para el funcionamiento normal del tracto
gastrointestinal y puede convertirse en glicina. un
neurotransmisor del sistema nervioso central.
Uno de los aminoácidos más conocidos por los psicólogos,
Triptófano puesto que está implicado en la síntesis de serotonina y
melanina.
Este aminoácido compite con la tirosina y el triptófano al
cruzar la barrera hematoencefálica. Cuanto más alto es el
Valina
nivel de valina, más bajos son los niveles de los otros dos
AA en el cerebro.
La arginina es esencial para la actividad normal del sistema
inmune y para la cicatrización de heridas. También participa
Arginina
en la liberación de la hormona del crecimiento e incrementa
la liberación de de insulina y glucagón. Es precursor de
9
GABA, disminuye el tamaño de los tumores y es necesaria
para la espermatogénesis.
Útil en el tratamiento de la anemia debido a su relación con
la hemoglobina. Es precursor de la histamina y por tanto se
Histidina ha empleado para tratar la alergia. Ayuda a mantener el pH
adecuado de la sangre y también se ha utilizado para tratar
la artritis reumatoide
Participa activamente en la descomposición de grasas y
permite reducir el colesterol en la sangre. Ayuda a prevenir
Metiotina
trastornos del cabello, piel y uñas. Es antioxidante y
participa en la síntesis de ARN y ADN.
Los aminoácidos esenciales, es decir, los sintetizados por el organismo
humanos
El ácido aspártico aumenta la resistencia y el rendimiento
físico y es bueno para la fatiga crónica. Es uno de los los
Ácido dos principales aminoácidos excitatorios, el otro es el ácido
aspártico glutámico). Ayuda a proteger el hígado, participa en el
metabolismo del ADN y del ARN y mejora el sistema
inmunológico
Otro de los aminoácidos excitatorios, junto con el anterior,
por lo que comparten muchas de las funciones. Mejora el
Ácido
rendimiento físico y la reduce la fatiga. Es esencial para la
Glutámico
síntesis de ADN y del ARN y ayuda a proteger el organismo
y mejora el sistema inmunológico.
La alanina es importante para el crecimiento muscular y es
una gran fuente de energía para el músculo. Interviene en
Alanina el metabolismo del azúcar, aumenta el sistema
inmunológico mediante la producción de anticuerpos y es
esencial para el tejido conectivo.
La asparagina es la unión de ácido aspártico con ATP
(trifosfato de adenosina). Está implicada en el proceso de
Aminoácidos no Asparagina
memoria a corto plazo, ayuda a eliminar el amoniaco del
esenciales
cuerpo, disminuye la fatiga y participa en la síntesis de ADN.
La cisteína es un antioxidante y protege contra la radiación,
la contaminación, la luz ultravioleta y otros fenómenos que
causan la producción de radicales libres. Actúa como
“detox” natural, y es esencial para el crecimiento,
Cisteína
mantenimiento y reparación de la piel y el cabello. Es
precursor del aminoácido taurina y del sulfato de
condroitina. Este último es el principal componente del
cartílago.
Forma parte de la estructura de la hemoglobina, y es uno
de los dos principales neurotransmisores inhibitorios del
sistema nervioso (el otro es GABA). También forma parte
Glicina
de los citocromos, que son enzimas involucradas en la
producción de energía. Participa en la producción de
glucagón, que ayuda al metabolismo del glucógeno.
La glutamina es precursor de dos de los neurotransmisores
más importantes del SNC: el glutamato y el GABA. Permite
Glutamina mantener los niveles normales y constantes de azúcar en la
sangre y está involucrado en la fuerza muscular y la
resistencia. Esencial para la función gastrointestinal
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Componente esencial del cartílago, y por tanto es clave
para la salud de las articulaciones, tendones y ligamentos.
Ayuda a mantener el corazón fuerte. El principal precursor
Prolina
de la prolina es el glutamato. Una de sus funciones más
destacadas es que mantiene la piel y las articulaciones
saludables.
articipa en la mejora del sistema inmunológico ayudando en
la producción de anticuerpos e inmunoglobulinas y participa
Serina
en el desarrollo de vaina de mielina. La serina es necesaria
para el crecimiento y mantenimiento del músculo.
Fuente: (Joaquín, 2018)
2.1.10.3 REACCIONES DE AMINOÁCIDOS
A continuación, se presentarán las reacciones más comunes que presentan los aminoácidos:
REACCIÓN DESCRIPCION
De la misma forma que los ácidos
carboxílicos monofuncionales, los aminoácidos se esterifican
mediante el tratamiento con gran exceso de un alcohol y un
Esterificación del grupo carboxilo catalizador ácido (generalmente HCL generoso). En estas
condiciones ácidas, el grupo amino se encuentra en su
forma protonada, por lo que no interfiere en la esterificación de
un aminoácido
Un agente acilante transforma el grupo amino en una amida.
La acilación del grupo amino se suele llevar a cabo para
protegerlo de reacciones nucleofílicas no deseadas. Para
Acilación del grupo amino: la acilación se utiliza una amplia variedad de cloruros de ácido
formación de amidas y de anhídrido. El cloroformiato de bencilo acila al grupo amino
para dar lugar a un derivado benciloxicarbonílico, que con
frecuencia se utiliza como grupo protector en la síntesis de
péptidos.
La ninhidrina es un reactivo común para visualizar las manchas
o bandas de los aminoácidos que se han separado por
cromatografía o electroforesis. Cuando la ninhidrina reacciona
con un aminoácido, uno de los productos es de color violeta
Reacción con Nihidrina intenso, anión estabilizado por resonancia denominado púrpura
de Ruhemann. La ninhidrina produce el mismo colorante
púrpura, independientemente de la estructura del aminoácido
original. La cadena lateral del aminoácido se pierde en forma
de aldehído.
La unión de dos o más aminoácidos (AA) mediante enlaces
amida origina los péptidos. En los péptidos y en las proteínas,
estos enlaces amida reciben el nombre de enlaces peptídicos y
son el resultado de la reacción del grupo carboxilo de un AA con
Formación de enlaces peptídicos
el grupo amino de otro, con eliminación de una molécula de
agua. El enlace peptídico (-CO-NH-) se representa
normalmente como un enlace sencillo. Sin embargo, posee una
serie de características que lo aproximan más a un doble enlace
Fuente: (Wade, Química Orgánica, 2017)/(Joaquín, 2018)
11
Durante la práctica de laboratorio, será de utilidad el empleo de la reacción con Nihidrina con los
aminoácidos, para llevar a cabo la detección de estos en la placa cromatográfica y realizar los
respectivos cálculos, por lo que a continuación se presentará la reacción general entre los aminoácidos
y la nihidrina:
Ilustración 6 Reacción general de un aminoácido con nihidrina
3. OBJETIVOS
12
4. METODOLOGÍA
4.1 HOJAS DE SEGURIDAD-MSDS
Tabla 6 Hoja de seguridad de la Lisina
13
Tabla 7 Hoja de seguridad del Ácido Acético
14
Tabla 8 Hoja de seguridad del agua
15
Tabla 9 Hoja de seguridad la Cisteína
16
Tabla 10 Hojas de seguridad de la Nihidrina
17
Tabla 11 Hoja de seguridad del alcohol n-butílico
18
Tabla 12 Hoja de seguridad del ácido glutámico
19
Tabla 13 Hoja de seguridad de la Metionina
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4.2 DIAGRAMA DE PROCESO
Fuente: propia
Fuente: propia
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C. DIAGRAMA NO. 3: APLICACIÓN EN LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Fuente: propia
22
D. DIAGRAMA NO.4: DESARROLLO CROMATOGRÁFICO
Fuente: propia
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E. DIAGRAMA NO. 5: CÁLCULOS A EFECTUAR EN LA PRÁCTICA
Fuente: propia
4.3 REACCIONES
24
3. Reacción entre la lisina y la ninhidrina
5. REFERENCIAS
5.1 BIBLIOGRAFÍA
1. Galagovsky, L. (2002). Química Orgánica, Fundamentos teórico-prácticos para el laboratorio.
Buenos Aires.: Editorial Universitaria de Buenos Aires.
2. García, R. (2002). Cromatografía. México: Sin editorial.
3. Guarnizo, A. (2009). Experimentos de Química Orgánica. Colombia: ELIZCOM S.A.S.
4. Hart, H. (1995). Química Orgánica (Novena ed.). México: McGRAW-HILL.
5. McMurry, John (2008). Química Orgánica (Séptima ed.). México: CENAGE
6. Morrison, R. (1998). Química Orgánica (Quinta Edición ed.). México: PEARSON.
7. Ramírez, P. (2011). Cromatografía en Placa Fina. Sin editorial.
8. Sánchez, V. (1996). Fraccionamiento pro-Cromatografía en Capa Fina. México: Sin Editorial.
9. Skoog. (2015). Fundamentos de Química Analítica (Novena edición ed.). CENGAGE.
10. Velásquez, E. R. (29 de noviembre de 2013). Cromatografía líquida. Sin editorial.
11. Wade, L. (2004). Química Orgánica (Quinta ed.). Madrid: Pearson Educación. Recuperado el
10 de Octubre de 2018
12. Wade, L. (2017). Química Orgánica (Vol. 2). México: Pearson.
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5.2 E-GRAFÍAS
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