CUANTIFICACIÓN DE

MICROORGANISMOS

M. Sc. Ing. VIRGINIA JUDITH ROJAS

MERCADO

1
 CONTENIDO

1 OBJETIVO

2 MÉTODOS DE
CUANTIFICACIÓN

3 Métodos directos

4 Métodos indirectos
2

I Ms.Sc. Virginia Rojas M.

1.1 O B J E T I V O

▪ Aprender algunos métodos para la

cuantificación de microorganismos

INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

1.2 MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
▪ MÉTODOS DIRECTOS

▪ MÉTODOS INDIRECTOS
MÉTODOS DIRECTOS se basan en la medida de la
evolución del número de células
(técnicas de plaqueo) o del número de partículas
(técnicas microscópicas y de contadores de partículas).

MÉTODOS INDIRECTOS se basan en la medida de

algún parámetro del cultivo que nos permite deducir
información sobre la evolución del número de 4
microorganismos. Ms.Sc. Virginia Rojas M.
 MÉTODOS DIRECTOS
CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS

❖ Recuento microscópico de microorganismos

❖ Recuento en placa de microorganismos viables.

❖ Recuento microscópico de microcolonias.

❖ Contador electrónico de microorganismos totales.

CUANTIFICACIÓN DE LA MASA CELULAR

▪ Peso seco.

▪ Turbidimetría. 5

I Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 RECUENTO DIRECTO EN MICROSCOPIO
Se puede utilizar diversos tipos de cámaras..

DESVENTAJAS:
❖No distingue las células vivas de las muertas.
❖Es impreciso, se necesitan al menos 10 E6 bacterias/mL 6

I
RECUENTO DIRECTO EN MICROSCOPIO
CÁMARA DE PETROFF - HAUSER

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL LABORATORIO

RECUENTO DIRECTO EN MICROSCOPIO
CÁMARA DE PETROFF - HAUSER

Los cálculos se realizan

tomando en cuenta los cuadros
que se contaron y el volumen
de 0.02 mm3 8

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 Ms.Sc. Virginia Rojas M.

CÁMARA DE PETROFF - HAUSER

Excavación con 0.02 mm de profundidad;
área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados
pequeños.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre,se cuenta el número
de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los
cuadros grandes).
Se anota el número N de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer:
Nx 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.
N cel * 16 cuad peq * 25 cuad grande * 1000 mm3
16 cuad peq 1 cuad grande 1 mm2 * 0.02 mm 1 cm3 9
RECUENTO DE CÉLULAS EN CÁMARA DE NEUBAUER

https://www.youtube.com/watch?v=
29W913Mn2ec

10
 MÉTODO DIRECTO
DILUCIÓN O VERTIDO EN PLACA

11

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

MÉTODO DIRECTO

12

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO DIRECTO
MÉTODO DE EXTENSIÓN SUPERFICIAL

Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es

necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error
13
de la medida.
 INGENIERÍA BIOQUÍM
MÉTODO DIRECTO MILES Y MISRA Ms.Sc. Virgin

▪ Involucra la preparación de diluciones seriadas de una

suspensión bacteriana.
▪ Las placas son divididas en sectores separados. Se inocula
cada sector una gota empleando una Pipeta Pasteur calibrada o
bien micropipetas inoculando 0.02mL.
▪ Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura
adecuada (37ºC).
▪ Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC.
▪ El número de bacterias viables se obtiene calculando la
media de cada dilución en las repeticiones realizadas.

14
MÉTODOS RÁPIDOS
https://www.youtube.com/watch?v
=J4nusvL8gQE

15
 MÉTODO
DIRECTO

16

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO DIRECTO
CONTADORES ELECTRÓNICOS
Método basado en hacer pasar una a una las células de una
suspensión por un sistema de detección,
este sistema puede contener un detector capaz de medir
diferentes parámetros lo que permite identificar las bacterias
durante su paso por el detector.
VENTAJA.-
Es un sistema automatizado y rápido.
DESVENTAJA.-
Esta técnica sigue sin distinguir entre bacteria viables y no viables.

Mediante un contador automático de bacterias ¨- CONTADOR COULTER -

mide la diferencia de conductividad al pasar una bacteria por un orificio
estrecho conectado a dos electrodos. 17

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO DIRECTO

18

. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

MÉTODO DIRECTO TURBIDIMETRÍA
Estima la turbidez de una suspensión bacteriana mediante:
Espectrofotómetro: Mide la luz transmitida =
“La disminución de esta luz es proporcional a
la concentración de microorganismos”.

VENTAJAS.-
▪ Es más exacta y precisa, ya que se basa
en aspectos físicos y químicos de las bacterias.
▪ Es un método de recuento automatizado
DESVENTAJAS:
❑ La presencia de precipitados u otras sustancias producidas
por las bacterias puede aumentar la turbidez.
❑ No distingue células vivas de muertas.
❑ Es impreciso si el número de microorganismo es escaso. 19
 . Ms.Sc. Virginia
Rojas M.

ESPECTROFOTOMETRÍA

20
 MÉTODO DIRECTO
TURBIDIMETRÍA

21

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

https://www.youtube.com/w
atch?v=BHCMvTnzcxY&list
=LLroqFes6QauhyhIyz6pop
Bg&index=4901

22
 MÉTODO DIRECTO
TURBIDIMETRÍA – CURVA DE CALIBRACIÓN

A = + ß (Conc)

CONC (g/l) A

0 0

0.1

0.2

…..
= ordenada en el origen 23

ß = pendiente Ms.Sc. Virginia Rojas M. 2

 BUENAS PRÁCTICAS EN EL USO DEL
ESPECTROFOTÓMETRO
● 1. Efectuar la calibración del espectrofotómetro, cada
vez que se realiza el análisis de un grupo de muestras.
● 2. Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el
proceso de medición, para asegurar una lectura
adecuada.
● 3. Evitar reutilizar las cubetas desechables.
● 4. Utilizar únicamente cubetas de cuarzo, para efectuar
análisis por debajo de los 310 nm.
24
 BUENAS PRÁCTICAS EN EL USO DEL
ESPECTROFOTÓMETRO
● 5. Evitar el uso de cubetas plásticas, si se utilizan solventes orgánicos.
● 6.Utilizar cristalería de boro silicato de alta calidad para preparar los estándares.
● 7. Limpiar cuidadosamente las cubetas de vidrio después de utilizarlas. Desechar
aquellas que presenten rayones en la superficie pulida.
● 8. Utilizar en lo posible reactivos de alta calidad. Reactivos de baja calidad pueden
causar contaminación incluso en concentraciones muy bajas. Los diluyentes
utilizados agua o solventes deberán estar libres de impurezas.
● 9. Verificar que las muestras o estándares no se han desgasificado dentro de las
cubetas. Este fenómeno produce burbujas sobre la superficie interna de las
cubetas y errores en las lecturas.
25
 MÉTODO DIRECTO
POR FILTRO DE MEMBRANA
El sistema
consiste en la
filtración del
cultivo a
través de una
membrana
que retenga
las células y
su posterior
desecación
hasta peso
constante 26

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO DIRECTO
MÉTODO DE FILTRACIÓN
∆ se filtra un volumen dado
∆ Son filtros con un poro de 0,45 um que
retienen las bacterias.

∆ se coloca el filtro sobre una placa de medio de cultivo

apropiado, donde crecerán tantas colonias como bacterias
hayan quedado adheridas al filtro
VENTAJAS:
Nos permite poder separar las bacterias del medio acuoso.
DESVENTAJAS:
▪Hay la posibilidad de que no todas las bacterias se queden en el
filtro o sean transferidas. 27
▪ su sensibilidad es limitada. Ms.Sc. Virginia Rojas M.
 MÉTODO DIRECTO
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

28
 MÉTODO DIRECTO
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

29

Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 Ms.Sc. Virginia Rojas M.
FI LTRAC I Ó N

30
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

https://www.youtube.com/
watch?v=QcuYjK6Q7sc

31
 MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL LABORATORIO
M.Sc. Virginia Rojas M.

MÉTODO DIRECTO

Placas para determinación de microorganismos.

Las placas RIDA COUNT son medios listos para usar, cubiertos con
una combinación patentada de medio de cultivo deshidratado y
fibra que contiene aplicaciones beneficiosas en los ensayos
microbiológicos de rutina.
 DETERMINACIÓN DEL PESO HÚMEDO:
CENTRIFUGACIÓN
❑ Se tara un tubo de centrífuga;
❑ Se centrifuga el cultivo y se elimina el
sobrenadante;
❑ se determina el peso del sedimento.

INCONVENIENTES:
▪ Grandes errores, debido al líquido intercelular retenido,
cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de
agrupaciones de la cepa,
▪ Intensidad del empaquetamiento, etc. 33
 Ms.Sc. Virginia Rojas M.

DETERMINACIÓN DEL PESO SECO

Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de

ser pesado (105ºC, toda la noche, varias horas), hasta
peso constante.
Las medidas de peso seco suelen representar el 10
-15% de los valores de peso húmedo.

INCONVENIENTES:
método tedioso (requiere mucho tiempo) y con
bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con
exactitud en las balanzas habituales de laboratorio.
1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 34
 MÉTODO INDIRECTO
NÚMERO MAS PROBABLE (NMP)

35

INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

.

MÉTODO

INDIRECTO

36

INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO INDIRECTO
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA

37

INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO INDIRECTO

En general se
admite que la
decoloración es
más rápida cuanto
mayor es el
número de
microorganismos
38

INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB. Ms.Sc. Virginia Rojas M.

 MÉTODO INDIRECTO
Determinación del consumo de nutrientes
Se selecciona un nutriente que no se parezca a ningún
metabolito sintetizado como:
✔ Fuente de Carbono
✔ Oxígeno
✔ Fosfato, de
Determinación los Productos
Sulfato, Magnesio Formados
Esto depende del tipo de fermentación o producción de metabolitos:
✔ CO2
✔ Etanol
✔ Ácido Láctico
✔ Ácidos Orgánicos
✔ Colorantes
✔ Enzimas INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB.
39
Ms.Sc. Virginia Rojas M.
 BIOLUMINISCENCIA
El complejo enzimático luciferin-luciferasa convierte la energía
química del ATP (microbiano y no microbiano) en luz a través de
una reacción de óxido-reducción. La reacción bioluminiscente
catalizada por la luciferasa utiliza la energía química contenida en
la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa
de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la
producción de luz

La luz producida es
proporcional a la cantidad de
ATP presente.
Al medir la luz producida se
puede establecer una
correlación con la cantidad de
La cantidad de ATP presente en una célula varia
ATP presente, y por lo tanto, con
según diversos factores, que incluyen su tamaño y
la cantidad de materia orgánica
si es eucariota o procariota.
con ATP presente en el punto de 40
.
.

https://www.youtube.com/watch?v=ANARfIZm3
8A 41
 INGENIERÍA BIOQUÍMICA LAB.
Ms.Sc. Virginia Rojas M.

PRACTICA:

INVESTIGAR POR LO MENOS 5

METODOS DE CUANTIFICACION
DE CONCENTRACIÓN CELULAR
DIFERENTES A LOS CITADOS

42