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Temuco, Chile.
3 Laboratorio de Biotecnología Microbiana, Facultad de Farmacia, Universidad de
RESUMEN
El uso extensivo de s- Los herbicidas de triazina en diversos países causan preocupación ambiental y de salud. Simazina y
atrazina son s- triazinas ampliamente utilizadas en agricultura y silvicultura. Aunque, la disipación natural de s- Se han
descrito triazinas en suelos por procesos fisicoquímicos, el mecanismo principal para su eliminación es la degradación
biológica por microorganismos. La biorremediación es una estrategia exitosa para la eliminación de s- triazinas en el suelo.
Para procesos de bioacumulación, s- Se requieren bacterias degradantes de triazina, cuyo aislamiento de los suelos
agrícolas se describió en este informe. Estudios de s- La adsorción de triazina y la lixiviación en el suelo son útiles para
determinar la biodisponibilidad de estos herbicidas. La detección de s- Se presentó actividad catabólica que degrada la
triazina por número más probable (NMP) y la reducción del indicador de respiración cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio
(TTC). Las abundancias relativas de s- Los genes catabólicos de triazina en el suelo se analizaron mediante la técnica
MPN-PCR. Los métodos moleculares independientes del cultivo, como FISH, T-RFLP y las bibliotecas de clones, son
útiles para estudiar los efectos de la aplicación de herbicidas y la bioacumulación en las comunidades microbianas del
suelo y su dinámica. Estos métodos experimentales permiten el diseño de estrategias biotecnológicas para la limpieza de s-
suelos contaminados con triazina.
20 Biorremediación de herbicidas en suelos, Hernández et al.
RESUMEN
El empleo masivo de herbicidas s- Triazinas en diversos países tienen problemas ambientales y de salud.
Simazina y atrazina hijo s- triazinas utilizadas en la agricultura y en predios forestales. La disipación natural de s-
triazinas en suelos pueden ocurrir por procesos físicoquímicos. Sin embargo, el mecanismo principal de
remoción de estos herbicidas es la degradación mediada por microorganismos. La biorremediación es una
estrategia eficiente para la remoción de s- triazinas del suelo. Para establecer procesos de bioaumentación, se
buscarán bacterias degradadoras de s- triazinas, cuyo aislamiento desde suelos agrícolas se describe en esta
revisión. Estudios de adsorción y lixiviación de s- Las triazinas en suelos permiten determinar la
biodisponibilidad de estos herbicidas. La actividad catabólica de microorganismos degradadores de simazina
en suelo puede ser cuantificada por el método número más probable (NMP) y reducción del indicador de
respiración cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC). La abundancia relativa de genes catabólicos de s- triazinas
en suelo fue analizada mediante la técnica NMP-PCR. Ténicas moleculares de cultivo independiente,
cuentos como FISH, T-RFLP y librerías de clones, son útiles para estudiar los efectos de la aplicación de
herbicidas y de la bioaumentación sobre la estructura de las comunidades microbianas del suelo y su
dinámica. Los métodos experimentales específicos en esta revisión permiten el diseño de estrategias
biotecnológicas eficientes para la recuperación de suelos contaminados con s- triazinas
INTRODUCCIÓN
s- Los herbicidas de triazina, como la simazina y la atrazina, se (Instituto Nacional de Estadísticas, Chile,
han utilizado ampliamente para controlar las malezas de hojas 2007. Censos Agropecuarios 1997 - 2007. www.ine.cl).
y hierbas (Radosevich La atrazina y la simazina son los
et al. 1995). Debido a la creciente producción agrícola en el s- herbicidas de triazinas más utilizados en Chile, con una
mundo, se han aplicado grandes cantidades de estos aplicación anual de 181 y 169 toneladas, respectivamente
herbicidas. Estos agroquímicos, utilizados principalmente (Servicio Agrícola Ganadero, 2004. Declaración de ventas
como herbicidas pre y post emergentes, interfieren en la de plaguicidas de uso agrícola. Ministerio de Agricultura.
cadena fotosintética de transporte de electrones en Santiago, Chile). La simazina se aplica en viñedos,
plantas susceptibles al unirse a la proteína de unión a la plantaciones de aguacate, manzana y maíz, así como en
quinona en el fotosistema II (Fuerte plantaciones de pino y eucalipto (Cooman et al. 2005).
Aplicación continua de s- Las triazinas en suelos chilenos son
et al. 2002). La movilidad de s- La triazina en el suelo ha motivo de creciente preocupación debido a su posible
contribuido a la contaminación de las aguas superficiales y contaminación de las aguas superficiales y subterráneas.
subterráneas en varios países (Mandelbaum et al. 1995; Sin embargo, solo unos pocos informes describen s- Contaminación
Radosevich por triazinas en Chile. En los suelos, la simazina puede
et al. 1995). Frecuentemente, s- Se han detectado herbicidas filtrarse a una profundidad de 90 cm, dependiendo de las
de triazina que exceden los niveles máximos aceptables de condiciones climáticas y las propiedades del suelo (Alister et
pesticidas en el agua potable de Europa (0.1 µg l- 1) y EE. UU. al. 2005). Se detectó atrazina en el río Chi l lán a
(3,0 µg l- 1) concentraciones que son tóxicas para Dafnia
(Mandelbaum et al. 1995; Rousseaux et al.
2001).
En Chile, las áreas de cultivo aumentaron 70%
entre 1997 y 2007 spp. (Cooman et al. 2005). s- Triazina
RCSuelo Nutr. Verduras 8 (2) 2008 (19-30) J. Soil Sc. Plant Nutr. 8 (2) 2008 (19-30) 21
los niveles máximos de contaminantes para el agua et al. 2008a; Hernández et al. 2008b).
potable aún no se han establecido en Chile (Norma Pseudomonas sp. ADP se ha convertido en la cepa
Chilena para Agua Potable, NCh 409/1. De. 2005; modelo para s- Estudios de biodegradación de triazinas.
Instituto Nacional de Normalización, Chile, www3.inn.cl). Esta cepa bacteriana es capaz de utilizar la atrazina
La degradación de la simazina en el suelo ocurre como única fuente de nitrógeno y su vía catabólica
predominantemente por procesos biológicos atrazina se ha caracterizado ampliamente (Martínez et al.
(Gebendinger y Radosevich, 1998; Newcombe y
Crowley, 1999). Para el diseño de procesos de 2001). Las enzimas de la vía superior, que son
biorremediación de herbicidas en suelos contaminados, responsables de la conversión de atrazina en ácido
el aislamiento de bacterias nativas y la caracterizacióncianúrico, están codificadas por el atz UNA, atz B y atz C
de sus genes. La vía inferior mineraliza el ácido cianúrico y
está codificada por el atz Operón DEF (Martínez et al. 2001).
s- Se requiere potencial de degradación de triazina. Se El herbicida simazina también se degrada por estas
han aislado diversos microorganismos capaces de enzimas catabólicas (Fig. 1).
degradar estos herbicidas (Mandelbaum et al. 1995;
Struthers et al.
1998; Topp et al. 2000a, 2000b; Hernández
Figura 1: Las rutas catabólicas de la simazina. los atz genes que codifican las enzimas metabólicas
se indican.
Figura 1: Vías catabólicas de simazina. Se indican los genes atz que codifican las enzimas
metabólicas
22 Biorremediación de herbicidas en suelos, Hernández et al.
suelos agrícolas del valle del Aconcagua, centro de Análisis microbiológico y molecular de suelos.
Chile (Flores et al. 2008). La materia orgánica del suelo
y los minerales arcillosos son los principales sorbentes
para s- triazinas (Garc I a- Virginia lcár Cel y Tadeo, 1999; Establecer procesos de biorremediación que eliminen s-
Flores et al. 2008). En conclusión, las características triazinas, se requiere la detección de comunidades
físicas del herbicida, la superficie activa de los microbianas indígenas activas capaces de degradar
minerales y el contenido orgánico de los suelos, así estos herbicidas. Recientemente, un método
como la cantidad de herbicida aplicada, son parámetros interesante para la detección y enumeración de MPN
importantes para comprender la dinámica de s- herbicidas de s-
de triazina en el medio ambiente. Para proteger las Se han descrito microorganismos que degradan la triazina
aguas superficiales y subterráneas de la contaminación en el suelo (Dinamarca et al. 2007). Este método se basa
por plaguicidas, y para mejorar su impacto, se requiere en la capacidad de las bacterias para usar un s- triazina
un amplio conocimiento sobre sus procesos de como única fuente de nitrógeno. La actividad metabólica
sorción-desorción en el medio ambiente. de los microorganismos se detecta mediante la reducción
del cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio en un producto
de formazán coloreado.
Figura 2: Detección de s- Actividades degradantes de triazinas en suelos mediante el método MPN-TTC. Se prepararon diluciones en serie de
diez veces de la muestra de suelo y se inocularon 5 pocillos de una placa de microtitulación. Al final de la incubación, se añadió TTC
(concentración final al 0,01%) y la placa de microtitulación se incubó a 3ºC. 0ºC durante 4 h. Una reacción positiva se determina mediante la
visualización del cambio de color mediante la producción de formazán (color rojo).
Figura 2: Detección de actividad degradadora de s- triazina en suelos mediante el método NMP-TTC. Se prepararon
diluciones serias (1/10) de muestras de suelo y se inocularon en cinco pocillos de una microplaca. Al final de la
incubación, se adicionó TTC (concentración final de 0,01%) y se incubó la microplaca a 30ºC durante 4 horas. El cambio
de color por la producción de formazán (color rojo) indica una reacción positiva.
24 Biorremediación de herbicidas en suelos, Hernández et al.
En la Figura se muestran las actividades degradantes de microorganismos los s- Las actividades catabólicas de
simazina de microorganismos en un suelo de plantación de triazina cuantificadas por el método MPN-TTC y los
aguacate del centro de Chile. genes catabólicos determinados por la técnica MPN-PCR
2. Las actividades catabólicas microbianas en los suelos se correlacionan con la eliminación de simazina de estos
pueden atribuirse a la historia previa del tratamiento con suelos.
simazina (Rousseaux et al. 2001; Ralebitso et al. 2002, Mor una norte
et al. 2006). Las abundancias relativas de s- Los genes ESTUDIOS DE BIOREMEDIACIÓN
catabólicos de triazina en el suelo pueden analizarse
mediante una técnica MPN-PCR. La detección de La biorremediación es una tecnología efectiva para la
limpieza de ambientes contaminados. Esta
atzA El gen en el ADN extraído directamente de este biotecnología tiene varias ventajas en comparación con
suelo se ilustra en la Figura 3. los tratamientos fisicoquímicos: menores costos
operativos, aplicación in situ, eliminación permanente
del residuo y mínima alteración del sitio tratado
(Ralebisto et al. 2002; Philp y Atlas, 2005; Navia y
Seeger, 2006). Los métodos más eficientes para
transformar un contaminante en un producto final
menos dañino son la bioestimulación y la
bioacumulación. La bioestimulación implica tratar los
suelos contaminados para aumentar la
biodisponibilidad de los contaminantes, o agregar un
suplemento nutricional o co-sustrato para aumentar la
población de bacterias indígenas que degradan los
contaminantes (McTavish, 2001). La bioaugmentación
implica la inoculación de suelos o agua contaminados
Figura 3. Amplificacion de catabolico atzA con cepas o consorcios microbianos específicos para
gen de suelos tratados con simazina. mejorar la capacidad de biodegradación del sistema
Marcadores de masa molecular (línea 1), para un contaminante orgánico específico (Philp y
suelo herbicida recién aplicado (línea 2), Atlas, 2005).
suelo cuatro semanas después de la
aplicación del herbicida (línea 3).
cepas (Rousseaux et al. 2002). En segundo lugar, para salud del suelo (Torsvik y Overas, 2002). La mayoría de
aumentar la tasa de biodegradación, la cepa nativa debe los microbios en muestras ambientales no se pueden
inocularse en el sitio contaminado a altas densidades. Para la cultivar en medios de laboratorio, que están
biorremediación del suelo se requiere un mayor tamaño de predispuestos para el crecimiento de microorganismos
inóculo que para la bioaugmentación de los ecosistemas específicos (Torsvik et al. 2002). Las técnicas de biología
acuáticos. Un alto tamaño de inóculo permite superar la molecular y los enfoques microbianos independientes del
competencia con las bacterias nativas, la depredación por cultivo se emplean cada vez más para el estudio de la
protozoos y bacteriófagos y una menor biodisponibilidad de ecología microbiana en entornos complejos (Alfreider et
contaminantes debido a los mecanismos de sorción en el al. 1996; Muyzer y Smalla, 1998; Osborn et al. 2000;
suelo (Philp y Atlas, 2005). Para la biorremediación de Nogales et al.
atrazina en suelos, se han probado diferentes tamaños de
inóculo (Topp, 2001; Rousseaux et al. 2002). Finalmente, el 2001). La secuencia del gen 16S rRNA es importante
sistema de inoculación es un factor esencial en la para el análisis de la diversidad microbiana y es un
bioacumulación. La inoculación de células inmovilizadas en marcador relevante para estudiar la filogenia de las
matrices de alginato u otros materiales poliméricos es una bacterias (Fig. 4).
estrategia de creciente importancia. Por ejemplo, el alginato
permite el paso de nutrientes y productos de excreción, Hasta la fecha, la mayoría de los estudios cuantifican el
protege a las bacterias de los depredadores y el estrés agotamiento del contaminante o controlan los microorganismos
nutricional y preserva la viabilidad de los organismos cultivables o sus actividades catabólicas en suelos contaminados.
(Newcombe y Crowley, Solo unos pocos informes describen la dinámica de las
comunidades microbianas a lo largo del proceso de
biodegradación (Piutti
et al. 2003; Moreno et al. 2007). El conocimiento de las
1999). La bioacumulación con inoculaciones repetidas comunidades microbianas que habitan. s- Los suelos
podría ser útil para aumentar la eficiencia de la contaminados con triazina y su respuesta a las estrategias
biorremediación. Las aplicaciones repetidas de la cepa de bioaugmentación son útiles para la identificación de los
superan los problemas de supervivencia a largo plazo microorganismos que están adaptados a estos compuestos
(Newcombe y Crowley, 1999). Recientemente, una y que están involucrados en su degradación. Se han
exitosa estrategia de bioacumulación para suelos observado cambios en la estructura de la comunidad
agrícolas usando la bacteria nativa que degrada la bacteriana en el suelo por la aplicación de pesticidas
simazina Pseudomonas sp. Se informó la cepa MHP41 (Engelen
(Morgante et al. 2008). Después de la bioacumulación con
la cepa MHP41, aumentaron las actividades catabólicas et al. 1998; El fantroussi et al. 1999). La estructura de la
de simazina y se mejoró la eliminación de herbicidas. comunidad microbiana en un suelo contaminado con
atrazina cambió en respuesta a las enmiendas
orgánicas del suelo (Martin-Laurent et al. 2004) y
disponibilidad de fuentes de carbono y nitrógeno (Rin
Figura 4. Métodos moleculares independientes del cultivo para el análisis de comunidades microbianas. PCR: reacción en cadena de
la polimerasa; DGGE: electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante; TGGE: electroforesis en gel con gradiente de temperatura;
SSCP polimorfismo de conformación de cadena sencilla; T-RFLP: polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal;
RISA: análisis espaciador intergénico ribosómico.
Figura 4. Métodos moleculares de cultivo independiente para el análisis de comunidades microbianas. PCR:
reacción en cadena de la polimerasa; DGGE: electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante; TGGE:
electroforesis en gel con gradiente de temperatura; SSCP: polimorfismo de la conformación de cadena simple de
ADN; T-RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminales; RISA: análisis del espaciador
intergénico ribosomal.
capaz de degradar la simazina. Sin embargo, la adición compañerismo. PV y VM agradecen las becas
de una cepa nativa mejoró las actividades de degradación MECESUP-UCV-0206.
de simazina y fue esencial para aumentar la atenuación
de la simazina en el suelo. La secuenciación de clones
representativos de bacterias del suelo mostró que la Referencias
estructura de la comunidad microbiana estaba constituida
ALFREIDER, A., PERNTHALER, J.,
principalmente por Proteobacterias, Actuar inomicetos, Acidobacterias
y AMANN, R., SATTLER, B., GLÖCKNER,
F.-O., WILLE, A., Y PSENNER R. 1996.
Planctomicetos. El análisis de la comunidad microbiana por Análisis comunitario de los ensamblajes
T-RFLP reveló que la aplicación de simazina y la bacterianos en la cubierta invernal y las
bioacumulación promueven cambios en la estructura de las capas pelágicas de un lago de alta montaña
comunidades microbianas del suelo, mientras que FISH por en el lugar hibridación. Appl. Reinar.
indica variaciones en algunos grupos bacterianos Microbiol 62: 2138-2144. ALISTER C., L ÓP EZ
específicos. R., Y KOGAN,
DE SOUZA, ML, SEFFERNICK, J., GARZA UNA NDEZ, M., VILLALOBOS, P.,
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atzABC están muy extendidos y altamente bacteria que degrada la simazina del suelo
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