3.2.

1 Montaje de cariotipos a partir de tejidos del pez: Se emplearán las

técnicas modificadas de Bertollo et al (1978) y Kligerman and Bloom
(1977).

Los pasos son:

a. Inyectar intramuscularmente en la parte dorsal del pez,
una solución de levadura (0.1/8 gr peso del animal), 48
horas antes del sacrificio.
b. Inyectar intraperitonealmente 0.01 ml de solución de
colchicina (0.04 a 0.5 %) por cada gramo del animal, 2
horas antes del sacrificio.
c. Sacrificar al animal y extraer el riñón y el intestino y
colocarlos en solución de tripsina (0.5%) para facilitar
la obtención de células.
d. Los órganos se colocan en solución hipotónica de KCl
(0.075 M) durante 30 minutos y se agita con alguna frecuencia.
e. Centrifugar durante 10 - 15 minutos a 1600 rpm.
f. Resuspender y fijar con Carnoy ( 3 metanol : 1 ac. acéti-
co ). por tres veces.
g. Gotear dos o más portaobjetos y secar.
h. Colorear con Giemsa al 2% durante 15 minutos.
i. Lavar con agua destilada, secar y analizar al microscopio
de luz en el objetivo 100x.
j. Las placas se montarán permanentemente con entellan.

3.2.2 Análisis cariológico: Comprende:

a. Fotografiar metafases bien conformadas en un microscopio
con cámara incorporada, recortar los cromosomas y montar los cariotipos
teniendo en cuenta el número, el tamaño y la forma según la posición del
centrómero ( Levan 1964 ).
b. Los cromosomas se medirán empleando un calibrador de alta
precisión ( tipo VAL con 1/20 mm de aproximación) y cada medida será el
promedio de un mínimo de tres medidas.
En la clasificación de los cromosomas, además de tener en cuenta la forma
típica determinada por la posición del centrómero, se tendrá en cuenta la
clasificación propuesta por Chen ( 1971 ), en la siguiente forma:

Cromosomas L y F:
Los cromosomas se clasificarán, bien como de tamaño "funda-mental" ( F ) o
como "largos" ( L ), dependiendo de su longitud relativa. La clase F, que se
espera sea la mas frecuente, incluirá cromosomas metacéntricos,
submetacéntricos y acrocéntricos de longitud decreciente. La clase L, que se
espera sea muy infrecuente, se caracterizará por tener una longitud doble
respecto de los cromosomas F y por ser generalmente metacéntricos o
aproximadamente metacéntricos.
Los cromosomas L, posiblemente se originan mediante la fusión céntrica de dos
cromosomas F. Al respecto, se ha pro- puesto la fórmula cariotípica ( FC ): FC
= (2n - 2x)F + xL en la cual, por cada dos cromosomas F faltantes en el
número diploide, se sumará 1 cromosoma L.

Cromosomas SSA y LSA:

Los cromosomas SSA son acrocéntricos, con el brazo corto (short) muy
corto, y los cromosomas LSA son acrocéntricos con el brazo corto mas largo.
Esta clasificación se hace estableciendo la relación: Longitud del brazo largo /
longitud total. Si esta relación es mayor a 0.8, el cromosoma se clasifica como
SSA y si es menor de 0.8, se clasifica como LSA (Chen and Ruddle, 1970).
Al hacer esta clasificación, se puede determinar el número relativo (%) de
cromosomas SSA entre los acrocéntricos. En las especies nativas este
porcentaje tiende a 100 y en las mas evolucionadas tiende a 0. Esto porque
probablemente, los cromosomas LSA se derivan de los SSA mediante
inversiones pericéntricas y sin pérdida de cromatina.
La no pérdida de cromatina en la evolución cariológica de dos especies ícticas
emparentadas, se puede comprobar comparando estadísticamente ( prueba de
t ) la longitud promedio de los cromosomas acrocéntricos ( SSA + LSA ) de los
dos genomas (Chen and Ruddle, 1970 ).
Cromosomas con dos brazos:
Esta clasificación incluye: Cromosomas metacéntricos F (FM), cromosomas
metacéntricos L (LM) y cromosomas submetacéntricos (SM).
Los cromosomas SM, posiblemente se originaron a partir de los cromosomas
acrocéntricos, mediante inversiones pericéntricas. Es de esperar que entre mas
evolucionada sea una especie, tenga mas cromosomas SM que acrocéntricos.
En los análisis cariológicos, cada pez será una unidad de muestreo y de cada
ejemplar se analizarán un mínimo de 25 metafases. En cada acuario se
colocarán tantos peces como repeticiones se quieran, en ningún caso serán
menor a tres.
Los resultados del análisis cariológico se reportará mediante:

- Gráficos de barras con: Y = Número o frecuencia

X = Clase de cromosomas o especie.
- Tablas con el siguiente contenido:
____________________________________________________________
Especie 2N Acrocéntrico* Dos brazos* FC**
_________________ __________________
LSA SSA SSA (%) FM F(SM) LM
____________________________________________________________
------ -- -- -- --- -- -- -- -----
____________________________________________________________
* Las siglas están descritas en el texto.
** La fórmula cariológica es mas general que la propuesta anteriormente. En
este caso es:

FC = CF + CL
En donde: CF (cromosoma F) = LSA + SSA +FM + FSM
CL = Cromosomas L (largos).