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Tesiss B Caroteno Por HPLC PDF
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TESIS
HUANCAYO - PERÚ
2017
JURADO EXAMINADOR
i
Dedicado a mi madre Sra. Feliciana Requena de Chamorro y hermanos quienes me impulsaron
a superarme cada día, también por su incondicional e invaluable apoyo brindado hasta el día
de hoy.
ii
Agradecimientos
A la empresa IMBAREX S.A. por permitirnos usar su equipo de extracción con CO2-
supercrítico.
Y a todos aquellos que han estado junto a mí durante el desarrollo de este trabajo de
investigación
iii
INDICE GENERAL
iv
2.4.1 Descripción 28
2.4.2 Clasificación Taxonómica 28
2.4.3 Propiedades 29
2.4.4 Aporte Vitamínico 29
2.4.5 Los carotenos y el color de las zanahorias 30
III. MATERIALES Y METODOS 31
3.1 LUGAR DE EJECUCION ,31
3.2 MATERIA PRIMA 31
3.3 MATERIALES Y EQUIPOS 31
3.3.1 Equipos 31
3.3.2 Materiales 32
3.3.3 Reactivos 32
3.4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL 33
3.4.1 Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por fluidos
supercríticos- CO2 33
3.4.1.1 Acondicionamiento de la zanahoria 33
3.4.1.2 Descripción del flujo de procesamiento 34
3.4.1.3 Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria
por el método convencional (tetrahidrofurano – metanol) 35
3.4.1.4 Descripción de la extracción convencional
(tetrahidrofurano – metanol) de carotenoides de zanahoria 36
3.4.1.5 Diagrama de flujo del proceso de extracción de carotenoides con
CO2 – supercrítico . 37
3.4.1.6 Descripción del protocolo para la cuantificación de
carotenoides por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) 38
3.4.2 Diseño experimental estadístico 40
3.4.2.1 Diseño estadístico 40
3.4.2.2 Modelo estadístico 41
IV RESULTADOS Y DISCUSIONES 42
4.1 PROCESO DE EXTRACCIÓN CON SC-CO2 DE ZANAHORIA 42
4.1.1 Acondicionamiento de la Materia Prima 42
4.1.2 Determinación por Cromatografia Liquida de Alta eficiencia (HPLC) de
carotenoides extraídos por el método convencional. 45
4.1.3 Determinación por HPLC de Carotenoides de zanahoria 46
4.1.4 Espectros de los Estándares de Luteína, α-caroteno y β-caroteno 51
v
4.1.5 Espectros de carotenoides de zanahoria α-caroteno, β-caroteno
y Luteína extraídos por CO2-superritico 52
V. CONCLUSIONES 63
VI. RECOMENDACIONES 64
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA 65
VIII. ANEXOS 73
vi
LISTA DE FIGURA
vii
Figura 16. Perfil cromatográfico de los carotenoides de zanahoria extraídos
con CO2-supercrítico a 200 bar y 60 °C. 48
viii
LISTA DE TABLAS
ix
Tabla 16. Medias de los carotenoides totales 60
Tabla 18. Comparación de rangos múltiples por Duncan para las temperaturas 62
x
RESUMEN
1
I. INTRODUCCION
Es importante destacar que las zanahorias, al igual que otras hortalizas, desempeñan
un papel muy importante en el equilibrio de la dieta humana, especialmente por su
composición en vitaminas, minerales y otros compuestos bioactivos, caracterizándose
además por ser pobre en grasa y rica en fibra dietética. Los estudios de calidad
nutricional de las zanahorias, muestran que tienen alto contenidos de β-caroteno
(Fraser y Bramley, 2004), que estos pueden variar con factores físicos y ambientales,
y además tienen alta capacidad antioxidante (Nicolle, Simon, Rock, Amouroux y
Remesy, 2004). Los pigmentos responsables del color de las zanahorias, son de
importancia para los científicos de alimentos y nutrición debido a su provitamina A y a
la actividad antioxidante. β-caroteno constituye una porción grande (60 – 80 %) de los
carotenoides en la zanahoria seguido de α-caroteno (10 – 40 %), luteína (1 – 5 %) y
otros carotenoides menores (0,1 – 1 %) (Sun y Temelli, 2006).
Por otra parte, los fluidos supercríticos han sido usados ampliamente en la extracción
de diversos compuestos naturales a partir de plantas debido a las propiedades que
presentan y principalmente porque no dejan residuos en el producto final y además
por ser amigable con el medio ambiente. El dióxido de carbono (CO2) en estado
2
supercrítico es uno de los disolventes más utilizados en este tipo de tecnología debido
a que su temperatura critica es baja (31,1 °C) esto permite que sea un disolvente
apropiado para la extracción de compuestos termolábiles como es el caso de los
carotenoides que sufren descomposición térmica por arriba de 65 °C, además es
barato, fácil de transportar y no es toxico.
Objetivo General:
Objetivos Específicos:
3
II. REVISION BIBLIOGRÁFICA
2.1 CAROTENOIDES
Los carotenoides son pigmentos naturales más comunes, son los responsables de la
gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos incluidos en los alimentos
vegetales y en algunos alimentos de origen animal, también presentes en pájaros,
insectos, peces y crustáceos. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta
familia que se dividen en dos grandes grupos según su estructura química, los
hidrocarbonados llamados carotenos y los oxigenados denominados xantofilas
(Rodríguez- Amaya 1999). Desempeñan una gran diversidad de funciones biológicas
en las plantas sino que también son importantes para los animales y los seres
humanos. (Esteban, Moran, Berrecil y Garcia, 2015). Pero el papel más importante en
la dieta humana es su capacidad como provitamina A, sin embargo para obtener
beneficios de los carotenoides, estos deben absorberse, transportarse y ser
depositados en ciertos tejidos (Dutta, Chadhuri y Chakraborty, 2005).
4
Son varios los factores que afectan el contenido de carotenoides en las plantas,
entre los cuales se pueden mencionar, los factores genéticos, el estadío de
madurez del vegetal, su procesamiento y almacenamiento; factores ambientales
como, la exposición a la luz (a mayor exposición mayor concentración de
carotenoides), condiciones del cultivo y enfermedades de los vegetales
(Fennema, 2000).
5
Tabla 1. Estructura y características de los carotenos comunes en los
alimentos
6
Tabla 2. Estructuras y características de las xantofilas comunes en los
alimentos
7
2.1.3. Propiedades generales
8
dobles enlaces conjugados, el cual consiste en alternar enlaces
carbono-carbono simple y doble. Por lo general se denomina cadena
poliénica. Esta parte de la molécula conocida como el cromóforo, es
responsable de la capacidad de los carotenoides de absorber luz en
la región visible (480-780 nm) y en consecuencia su gran capacidad
de coloración. (Mínguez, Perez y Hornero, 2005) y (Rodríguez-
Amaya, 1999). El color se acentúa a medida que se extiende el
sistema conjugado de dobles enlaces y la presencia de diferentes
grupos funcionales determinaran en última instancia las
características espectroscópicas propias de cada pigmento. La
ciclación causa algún impedimento, por tanto el β-caroteno y el -
caroteno son de color naranja y rojo - naranja respectivamente,
aunque tienen el mismo número de enlaces dobles conjugados que el
licopeno (once). La intensidad y matiz de los colores en los alimentos
dependen de que carotenoides están presentes, sus concentraciones
y estado físico. (Rodríguez- Amaya, 1999).
9
Figura 2. Espectro de absorción ultravioleta/visible para los
carotenoides.
*I, II y III representan los picos de absorción de la región visible.
Fuente: Burgos y Calderón (2009)
Los carotenoides, son insolubles en agua y por lo tanto las pérdidas por
lixiviación durante el lavado y procesamiento de frutos son mínimas. Otros
tratamientos empleados en las industrias alimentarias, como por ejemplo el
tratamiento a alta presión, parecen no afectar significativamente a los niveles de
carotenoides en diversos productos vegetales (Meléndez et al., 2004).
10
depende si el pigmento se encuentra en el laboratorio y de las
condiciones ambientales (Díaz, 2008). En presencia de oxigeno se
produce una degradación oxidativa, a menudo paralela a la oxidación de
lípidos. La tasa de oxidación depende de la presión parcial de oxígeno,
actividad del agua y temperatura. Los carotenoides, en general son más
estables en sistemas con elevado grado de instauración, ya que el propio
sistema acepta más fácilmente oxígeno y radicales libres, antes que el
carotenoide. Inversamente, en sistemas con lípidos saturados los
carotenoides presentan mayor inestabilidad. (Begoña, Granado y
Navarro, 2001). En consecuencia estos compuestos pueden actuar como
pro- o antioxidantes dependiendo del potencial redox de la molécula y del
entorno, entre otros factores. Los carotenoides que contienen 9 o más
dobles enlaces conjugados pueden inactivar ciertas formas reactivas de
oxígeno, como el oxígeno singlete. En este sentido, el β-caroteno posee
como característica importante, que lo diferencia del resto de
antioxidantes solubles en grasas (como la vitamina E), la de ser más
efectivo a bajas presiones de oxígeno (Meléndez et al., 2004).
11
vapor, cocidas a presión, trituradas, etc), la cocción de las zanahorias en
agua y sin presión resultó ser la que producía una mayor retención de los
carotenoides estudiados (Meléndez et al., 2004).
12
2.1.5. Biodisponibilidad de los carotenoides
13
et al., 2005; Begoña et al., 2001; Rodríguez- Amaya, 1999; Burgos y calderón,
2009 y Macías et al., 2002).
14
Tabla 3. Métodos empleados para la extracción de compuestos naturales
(pigmentos).
Técnicas de
extracción Descripción
La muestra se coloca en el recipiente de extracción y se
mantiene en contacto con el disolvente extractante en el
tiempo necesario a una temperatura determinada. Se hace
Maceración necesaria una filtración de la muestra
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y se
lixivia con el disolvente caliente en un extractor soxhlet
Soxhlet durante un tiempo determinado. La evaporación del se
convencional hace por separado.
La muestra se coloca en un recipiente de extracción y es
introducida en el disolvente hirviendo durante 30 - 60 min.
El recipiente es entonces sometido a la extracción soxhlet
Soxhlet con el reflujo del disolvente. Es posible hacer una
Automatizada evaporación del disolvente.
La muestra es tratada con enzimas para degradar los
tejidos y paredes celulares para facilitar de esta forma el
Enzimático proceso de extracción
La muestra a extraer se coloca en un recipiente de
extracción y se le aplica ultrasonido, pudiendo controlar la
Asistida por temperatura se hace necesario la filtración y en ocasiones
ultrasonido la centrifugación del material
La muestra se coloca en una cámara de alta presión y es
extraída con el fluido supercrítico que puede circular a
través de la muestra en circuito cerrado o abierto (CO2), a
presiones mayores a 72 atm y a temperaturas mayores de
31,1 °C. Después de la despresurización los analitos son
Fluidos recogidos en un pequeño volumen de disolvente orgánico
supercríticos o en una trampa sólida
La muestra se coloca en un recipiente abierto o cerrado y
Asistida por se le adiciona el disolvente de extracción. Seguidamente
microondas se le suministra energía en forma de microondas.
15
2.2.2 Extracción mediante fluidos supercríticos
16
Figura 3. Propiedades del fluidos supercríticos
Fuente: Luque de Castro et al. (1993).
17
denominan presión crítica (Pc) y temperatura crítica (Tc), respectivamente
(Luque de Castro et al., 1993).
18
Tabla 5. Propiedades criticas de las sustancias más comúnmente
empleadas en condiciones supercríticas
Peso Densidad
molecular Presión Temperatura critica
Compuesto (g/mol) critica(bar) critica (°C) (g/mL)
Dióxido de carbono 44,01 72 31,1 0,47
Agua 18,02 214,8 374,2 0,32
Amoniaco 17,03 109,8 132,5 0,23
Argón 39,95 48,6 -122,4 0,73
Acetona 58,08 47,0 235,0 0,28
Etanol 46,07 72,0 243,4 0,28
Metanol 32,04 78,9 239,0 0,27
Metano 16,04 46,0 -82,6 0,17
Etano 30,07 47,6 32,3 0,20
Al igual que ocurre con el punto crítico, la región supercrítica también tiene unas
propiedades que la hacen peculiar (Shi, 2004 y Mukhopadhyay 2000)
19
La bajísima tensión superficial permite una alta penetrabilidad a través de
sólidos porosos y lechos empaquetados.
20
2.2.4.4 Humedad
21
principal causa del efecto invernadero, cualquier aumento del efluente de CO2
derivados de la extracción con fluido supercrítico industrial seria insignificante,
plantas comerciales recirculan CO2 por lo que su uso como un disolvente de
extracción no aumenta la cantidad ya presente en la atmosfera (Barbosa,
Tapia y Cano, 2005). Tiene un bajo costo, lo que hace que su uso no sea muy
costoso una vez que se tiene el equipamiento de extracción, presenta además
una alta capacidad de solvatación, selectividad y una gran efectividad de
extracción, en muchas ocasiones superiores a los métodos tradicionales que
utilizan disolventes orgánicos (Mustapa, Manan, Mohd, Setianto y Mohd,
2011)
22
los componentes solubilizados se transfiere al separador donde el poder de
solvatación del fluido se reduce mediante el aumento de la temperatura y / o
disminuyendo la presión del sistema, el extracto se precipita en el separador,
mientras que el fluido CO2-supercrítico se libera ya sea a la atmósfera o se
recicla de nuevo al extractor (Mendiola, 2008 y Shi, 2004).
23
Figura 5. Esquema de un extractor de fluidos supercríticos
Fuente: Reglero, Señoráns y Ibañez (2005).
24
Sun y Temelli (2002) estudiaron la extracción de carotenoides de zanahorias secas
Daucus carota L. con CO2 - supercrítico, empleando temperaturas de 40, 55, 70 °C y
presiones de 276, 413 y 551 bar, los principales carotenoides en el extracto de aceite
de zanahoria cruda fueron α-caroteno, β-caroteno y luteína. Comprobaron que el
rendimiento de la extracción de carotenoides totales aumentaron trabajando a
condiciones de a 55 °C y a 276 bar, obteniendo (738,9 µg/g). No hubo tendencia clara
para el cambio en el rendimiento de la luteína con la temperatura y presión.
La extracción supercrítica con CO2 tiene también inconvenientes. Por ejemplo (Daood
et al., 2002) han descrito dificultades de extracción de los diésteres de las xantofilas
en determinadas condiciones, así como el riesgo de isomerización de trans a cis de
los carotenoides.
La extracción supercrítica con CO2 también puede ser utilizada para extraer pigmentos
clorofílicos (Del Valle y Aguilera, 1999; Uquiche, Del Valle y Orriz, 2004). También
puede disminuirse la solubilidad de estos pigmentos a 45 °C y 36 MPa con un aumento
de humedad de los pelets. Además, esta solubilidad depende más de la presión (con
un aumento de rendimiento del 82 % desde 22 a 50 MPa) que de la temperatura (con
un aumento máximo de rendimiento del 29 % de 35 a 45 – 65 °C)
25
Tabla 6. Solubilidad del β- caroteno con CO2 supercrítico
Temperatura Presión Solubilidad
Autor (K) (Mpa) (Y2 x 10-7 (mol/mol)
(313-343) (6,2-34,3) (0,01-23,03)
Hansen et al., (2001) ± 0,2 ± 0,2 ± 30%-50%a
(308-323) (9,9-29,8) (0,22-5,0)
Sakaki, (1992) ± 0,1 ± NR ± 10%a
(310-340) (9,7-26,0) (0,15-17,0)
Subra et al., (1997) ± NR ± 0,1-1,5 ± 0,02-0,7
(313-333) (12,0-29,9) (0,02-6,27)
Mendes et al., (1999) ± NR ± NR ±5%-10%a
(313-343) (25,7-43,9) (0,09-25,4)
Cygnarowicz et al., (1990) ± NR ± NR ± NR
a: Incertidumbre portada como reproducibilidad
NR: Incertidumbre no reportada
Fuente: Elizalde (2008).
26
Tabla 7. Extracción de carotenos con CO2 supercrítico
con 414 bar T: 38 °C y 48 °C Entre las muestras deshidratadas presentan mayor rendimiento las
Caudal de CO2 14-18 min deshidratadas por congelación (228 ug/g muestra) que por horno de
aire forzado (77 ug/g muestra) Un 50 % de los carotenoides se
Volumen de CO2: 200 L pierde durante el secado en el horno a causa de reacciones
oxidativas.
27
2.4 LA ZANAHORIA
2.4.1 Descripción
Reino: Vegetal
Clase: Angiospermae
Subclase: Dicotyledoneae
Orden: Umbelliflorae
Familia: Umbelliferae
Género: Daucus
Especie: Carota L.
28
2.4.3 Propiedades
29
de 1,1 a 64,0 mg/100g fresco de β-caroteno 0,53 a 36,0 mg/100g fresco de α-
caroteno y 0,27 mg /100g fresco de luteína
30
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.1. Equipos
31
3.3.2. Materiales
Fiolas volumétricas
Balón de destilación de 250 a 500 mL
Matraces erlenmeyer
Cápsulas de porcelana
Matraces Kitazato 250 a 500 mL
Micro pipetas de 50-100 µL y de 100 - 1000 µL
Paletas y utensilios de plástico
Papel filtro Watman # 4
Pipetas graduadas 1, 2, 5, y 10 mL
Pinzas metálicas
Pizeta
Probetas graduadas de 10, 50, 100, 250 mL
Placas petri
Termómetro (-10 °C – 100 °C)
Vasos de precipitación 10, 50, 100, 250, 600, 1000 mL
Viales para HPLC
Jeringas de plástico de 3 mL
Acrodisco de 0,45 µm
Tips para 50 - 100 µL y de 100 - 1000 µL.
3.3.3. Reactivos
Etanol p.a
Hexano p.a
Patrón de carotenoides (α caroteno, β-caroteno, luteína)
Dióxido de carbono al 99,995% de pureza
Diclorometano grado HPLC
Metanol grado HPLC
Acetonitrilo grado HPLC
Acetato de etilo grado HPLC
Agua de grado HPLC
BHT (Hidroxitolueno Butilado).
Agua destilada
32
Tetrahidrofurano
Metanol p.a.
Carbonato de magnesio.
Zanahoria
Lavado
En rodajas de 5 mm de espesor
Cortado
33
3.4.1.2. Descripción del flujo de procesamiento
34
3.4.1.3. Proceso de extracción de carotenoides de zanahoria por el
método convencional (tetrahidrofurano - metanol)
Extracción
Metanol /Tetrahidrofurano (50:50)
convencional
Cuantificación de
Los carotenoides fueron monitoreados
carotenoides con usando un detector UV-VIS a 450 nm
HPLC
35
3.4.1.4 Descripción de la extracción convencional (tetrahidrofurano y
Metanol) de carotenoides de zanahoria.
36
3.4.1.5 Diagrama de flujo, del proceso de extracción de carotenoides con
CO2-Supercrítico.
Despresurización a 12 bar y 40 ºC
Separación
Temperatura = 40 °C
Evaporación Presión = 0,67 bar
Almacenamiento Temperatura: - 40 °C
37
3.4.1.6 Descripción del protocolo para la cuantificación de carotenoides
por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
38
son la polaridad, la viscosidad, volatilidad y toxicidad.
(Rodriguez- Amaya y Kimura, 2004).
39
3.4.2 Diseño experimental
PARTICULAS SECAS DE
ZANAHORIA
P1 P2
T1 T2 T3 T1 T2 T3
Donde:
P1 = Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 200 bar.
P2 =Presión de extracción por CO2 - supercrítico a 280 bar.
T1 = Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 40 °C.
T2 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 50 °C
T3 =Temperatura de extracción por CO2 - supercrítico a 60 °C
40
FACTOR A: presión de extracción por CO2 supercrítico
P1=.200 bar.
P2=.280 bar.
T1=40 °C.
T2=50 °C.
T2=60 °C.
Yijk = u + Pi + Tj + (PT) ij + ε
Donde:
41
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Características Zanahoria
Humedad de equilibrio (%) 8±0,04
Humedad de trabajo (%) 10±0,09
Diámetro de la partícula (mm) 0,250 <Ø<1
42
teoría de la difusión de solutos en partículas, cuanto mayor sea la distancia de
que un soluto tenga que viajar desde el interior de la partícula a la superficie la
extracción es más lenta, a su vez la mayor superficie de contacto disponible se
da cuando la partícula es más pequeña y la cantidad de carotenoides extraídos
será mayor (Sun y Temelli, 2006). Se retira fácilmente de muestras molidas con
tamaño de partícula característico entre 0,1 y 0,7 mm (Nagi y Simandi, 2008).
Las muestras molidas a partir de laminados, luego peletizados y
acondicionados a baja humedad tienen un rendimiento mayor que aquellas no
molidas previamente, ello se debe a que la extracción de fracciones de interés
aumenta con una mejor distribución y conectividad de los poros
(Fernández, 2008).
43
Tabla 11. Cantidad de extracto de zanahoria obtenida a diferentes
condiciones temperatura y presión CO2-Supercritico.
44
4.1.2 Determinación por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) de
carotenoides extraídos por el método convencional.
En la figura 10. se puede observar dos picos cromatográficos bien definidos que al
ser comparados con el cromatograma del patrón de carotenoides, espectros y
tiempos de retención, se puede asegurar la presencia de dos carotenoides siendo
el pico cromatográfico (1) α-caroteno y (2) β-caroteno. La luteína no fue identificada
eso nos señala que no fue extraída por el método convencional (tetrahidrofurano/
metanol) a diferencia que con la extracción con CO2- supercrítica si se logra
solubilizar y extraer la luteína. Velasco, Villada y Carrera (2007) señalan que la
selectividad durante la extracción puede ser manipulada dada la variación de las
diferentes condiciones de operación temperatura y presión afectando la solubilidad
de varios componentes en el fluido supercrítico. Los carotenoides son pigmentos
estables en el ambiente natural, pero cuando los alimentos se calientan o cuando
son extraídos en disoluciones, aceites o en disolventes orgánicos se vuelven mucho
más lábiles (Rodríguez- Amaya, 1999 y Hernández, Candelas, Meza y
Minjares, 2010).
45
4.1.3 Determinación por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) de
carotenoides de zanahoria.
100
0
T1
46
T2
T3
47
T4
T5
48
T6
En las figuras 12, 13, 14, 15, 16 y 17, se muestra los cromatogramas de los seis
tratamientos aplicados para la extracción de carotenoides de zanahoria. Al
comparar los perfiles cromatográficos de los carotenoides de zanahoria, con el
estándar (Figura 11), se observa la presencia de tres picos plenamente identificados
de la siguiente manera; Luteína (1), α- caroteno (2) y β-caroteno (3) y comparando
los tiempos de retención y espectros se puede asegurar la presencia de estos tres
carotenoides mayoritarios en la zanahoria del valle del Mantaro. Los picos
cromatograficos 2 y 3 indican que son los carotenoides de mayor concentración
presentes en la zanahoria, donde β-caroteno 50,88 %, α- caroteno 36,86 % y la
luteína se encuentra en menor proporción de 1,16 %. También aparecen trazas de
49
otros carotenoides como el ζ-caroteno en porcentaje de 0,1 al 1 %. Los tres picos
cromatográficos de mayor área son similares a los encontrados por (Alzate, 2013 y
Rodríguez-Amaya, 2001) quienes muestran cromatogramas con fracciones de
carotenoides de zanahoria con similares tiempo de retención y porcentaje de area.
La presencia de otros picos o crestas en el perfil cromatografico de la muestra se
debería a la solubilidad de carotenoides en las condiciones de extracción y
cuantificación.
50
4.1.4 Espectros de los estándares de luteína, α-caroteno y β-caroteno
(a)
(b)
(c)
51
4.1.5 Espectros de carotenoides de zanahoria α-caroteno, β-caroteno y luteína
extraídos por CO2-superritico
52
carotenoides absorben máximo a tres longitudes de onda, lo que resulta en los
espectros de tres picos (Burgos y Calderón, 2009 y Rodriguez-Amaya, 2001).
Estándar Zanahoria
Carotenoides Picos de absorción Picos de absorción
α-caroteno 423 446 474 424 447 475
β-caroteno 426 451 479 427 452 479
luteína 423 446 474 423 446 474
En la tabla 12, se muestra las longitudes de onda máximas que corresponden a los
tres picos o bandas características, obtenidas del estándar y del extracto de
zanahoria. Los valores de longitud de onda máxima en los tres espectros de
absorción del estándar y zanahoria se encuentran dentro de un rango de 423 nm-
479 nm. El α-caroteno absorbe una longitud de onda máxima de 447 nm, el β-
caroteno es el carotenoide más característico encontrado en la zanahoria absorbe
una longitud de onda máxima de 452 nm, y la luteína absorbe una longitud de onda
de 446 nm, las longitudes de onda obtenidas resultan ser muy similares a las
reportadas por (Rodriguez-Amaya, 2001). El espectro en la región visible de los
carotenoides es bastante característico en la longitud de onda comprendida entre
400 y 500 nm por lo cual suelen ser sustancias coloreadas (Burgos y Calderón,
2009). El bicíclico β-caroteno, aunque poseen el mismo número de dobles enlaces
conjugados como el licopeno, es de color naranja amarillo y λmax a 450 y 477 nm
y una inflexión (hombro) a 425 nm, el doble enlace en el anillo ε de α-caroteno es
de conjugación, dejando 10 dobles enlaces conjugados (9 en la cadena de polieno
y 1 en el β anillo); por lo tanto, este carotenoide es amarillo claro y su espectro de
absorción es más definido con λmax a longitudes de onda ligeramente más cortas
(422, 445 y 473 nm) que los de β-caroteno (Rodriguez-Amaya, 2001).
53
Tabla 13. Tiempos de retención, área y % de área de carotenoides estándar y obtenidos por extracción con CO2 –supercrítico y
convencional en la zanahoria
Zanahoria
CO2- Zanahoria
Estándar (50 ppm ) supercritica Convencional
Tiempo
Tiempo de Tiempo de de
Retención Área %de Retención Área %de Retención Área %de
Carotenoides (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área (min) (mAU2) Área
alfa-caroteno 17,08-17,19 2382157 34,58 17,62 5723881 36,86 21,53 205067 28,62
beta-caroteno 19,07-19,50 3830787 55,61 19,15 7776121 50,88 23,47 439769 61,38
luteina 1,79-1,85 231560 3,36 1,81 180250 1,16 - - -
En la Tabla 13, se observa, el tiempo de retención, el área y el % de área de los picos de los cromatogramas, se observa claramente la
presencia mayoritaria de β-caroteno y α- caroteno y en menor cantidad la luteína en la zanahoria extraído por CO2-supercrítica, también se
observa que el área obtenida por la extracción convencional (tetrahidrofurano/metanol) es menor tanto para el β-caroteno y α- caroteno y no
hay presencia de la luteína.
54
Tabla 14. Fracciones de carotenoides por extracción con CO2-supercrítico presentes en el extracto de zanahoria
Carotenoides
Presión Temperatura Tiempo α-caroteno β-caroteno Luteína (mg/100g Totales
Tratamiento (Bar) (°C) (h) (mg/100g ms) (mg/100g ms) ms) (mg/100g ms)
55
Las fracciones de α-caroteno, β- caroteno, luteína y carotenoides totales obtenidos en
la extracción con CO2 -Supercrítico bajo diferentes combinaciones de temperatura y
presión se muestran en la Tabla 14, para α-caroteno fue de 4,20 a 12,27 mg/100g ms,
β-caroteno de 14,60 a 71,34 mg/100g ms, luteína 0,51 a 0,89 mg/100g ms y
carotenoides totales fue 21,10 a 84,50 mg/100g ms.
100.00
90.00
80.00
carotenoides totales (mg/100g)
70.00
P=200 bar, T=40 °C
60.00
P=280 bar, T=40 °C
20.00
10.00
0.00
Tratamientos
56
La mayor cantidad de carotenoides totales se obtuvo en el T4 (280 bar y 50 °C) seguido
del T3 (200 bar y 50 °C) siendo los tratamientos donde al aumentar la presión de 200
a 280 bar y manteniendo la temperatura de 50 °C se observa un incremento en el
rendimiento de α-caroteno, β-caroteno y carotenoides totales como se puede apreciar
en la tabla 16 y Figura 20, a temperatura constante con el aumento de la presión la
densidad del fluido supercrítico se incrementa y por consiguiente la solubilidad del
analíto en el fluido supercrítico aumenta (Velasco, Villada y Carrera, 2007 y Durante,
Salvatore y Mita, 2014). Sun y Temelli (2002) en su trabajo de investigación reportaron
que a 55 °C y 276 bar de presión obtuvieron 73,89 mg de carotenoides totales /100 g
ms. Nacimiento et al., (2009) en la extracción de carotenoides de zanahorias
liofilizadas con CO2-supercritico a 40 °C y 400 bar obtuvo 24,57 mg de β-caroteno/100
g ms. Durante et al., (2014) en su trabajo de investigación utilizaron diferentes
temperaturas de 40 a 70 ° C y presiones de 25 a 35 MPa en la extracción con CO2-
supercritica de carotenoides de calabaza, ellos encontraron que el rendimiento de
carotenoides aumentó con el aumento de presión y temperatura.
57
80.0
70.0
Carotenoides (mg/100g)
60.0
alfa-caroteno
50.0
beta-caroteno
40.0
Luteina
30.0
20.0
10.0
0.0
T1 T2 T3 T4 T5 T6
58
90
70
60
50
40 convencional
SC-CO2
30
20
10
0
α-caroteno β-caroteno luteina carotenoides
totales
(mg/100g ms)
59
Tabla 15. Análisis de varianza ANOVA de los carotenoides totales de los seis
tratamientos obtenidos con CO2 - SC en la zanahoria.
nivel de nivel de
P T N Media
200 40 2 21,10
200 50 2 75,15
200 60 2 48,88
280 40 2 40,57
280 50 2 84,50
280 60 2 27,47
60
En la extracción de α-caroteno se reporta a través del análisis estadístico un R2 =
0,92 y un coeficiente de variabilidad de 15,45 % se identifica que existe diferencia
significativa para el efecto de la temperatura (p<0,05) durante la extracción
resumido en el (ANEXO VII). Realizado el test de Duncan con un nivel de
significancia de 0,05 se encontró que la diferencia es significativa para el efecto
de la temperatura, resultando mejor el trabajo a la temperatura de 50 °C.
61
Tabla 17. Comparación de rangos múltiples por Duncan para carotenoides
totales con CO2-supercrítico en la zanahoria.
Temperatura
Agrupamiento Media N (°C)
A 30,83 4 40
A 31,18 4 60
B 79,81 4 50
62
V. CONCLUSIONES
63
VI. RECOMENDACIONES
64
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS
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- Widman, R. (2004). Handbook of food Analytical chemistry. CRC Press Boca Raton
London New York Washington, D.C.
72
VIII. ANEXOS
73
ANEXO I
1. ORIGEN E HISTORIA
La zanahoria (Daucus carota L.) ha sido cultivada hace más de 3000 años en Asia,
en la región que hoy ocupa Afganistán, si bien algunos autores consideran como
lugar de origen la zona templada del Mediterráneo en ambas regiones se encuentra
en estado silvestre, las primeras zanahorias eran blancas, violetas y amarillas
(Tirador, 2011).
El año 600 a.c se cultivaban zanahorias de color morado en Afganistán. Durante los
siglos IX y X se desarrolló zanahoria de raíz amarilla en Siria y que el cultivo fue
introducido en china a fines del siglo XIII. Las variedades amarillas llegaron a
Europa en el siglo XIV, reportándose el cultivo de la zanahoria en casi todo el
continente europeo. Las variedades de raíz anaranjada se reportaron por primera
vez en Holanda en el siglo XVII, de donde se distribuyeron y popularizaron por toda
Europa y pasaron al continente americano donde los indios de Norteamérica
adoptaron la zanahoria como alimento y la consideraban de gran valor (Morales,
1995).
La zanahoria antes de utilizarse como alimento fue usada como planta medicinal
para curar problemas digestivos y heridas. (Morales, 1995). Durante la edad media
la zanahoria se utilizaba como tinte para la mantequilla y en Francia la hoja se
utilizaba para decorar peinados y sombreros (Tirador, 2011).
2. TIPOS DE ZANAHORIA
74
c) Largas. Acaban en punta y superan los 20 cm de longitud. Habitualmente
se utilizan para la comercialización.
En los últimos años se ha dado una mayor importancia al cultivo de productos con
alto valor nutritivo es por eso que en el Perú se ha visto un crecimiento en la
producción de zanahoria, debido a la existencia de diferentes zonas agroecológicas
que ofrecen condiciones favorables para el cultivo de esta hortaliza. En la (Tabla 2)
se aprecia los principales departamentos productores de zanahoria en el 2010,
liderando en la producción los departamentos de Junín y Lima. En Junín se produce
anualmente un promedio del 60% del total de la producción de zanahoria, la cual
abastece principalmente a Lima y otras regiones como la selva central (Sierra
Exportadora, 2010).
75
Tabla 1. Producción Nacional de Zanahorias en superficie cosechada
76
Tabla 2. Composición química de 100 g de parte comestible de
zanahoria sin cascara.
Componente Contenido
Agua 89,0 g
Carbohidratos totales 9,2 g
Carbohidratos disponibles 6,4 g
Fibra cruda 1,2 g
Fibra dietética 2,8 g
Proteínas 0,6 g
Grasa total 0,5 g
Calcio 33 mg
Fosforo 16 mg
Zinc 0,24 mg
Hierro 0,5 mg
Retinol 1696,0 ug
Vitaminas equivalentes totales 841,0 ug
Vitamina c 17,4 ug
Tiamina 0,04 ug
Riboflavina 0,04 mg
Valor energético 41 kcal
77
ANEXO II
6000000
4000000
2000000
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración ppm
78
b) Cromatograma de beta-caroteno (62,5 ppm)
1500000
1000000
500000
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración ppm
79
c) Cromatograma de Luteína (33 ppm)
200000
Area mAU
150000
100000
50000
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración ppm
80
d) Rendimiento del extracto de zanahoria obtenida por CO2- supercrítico
2.50
Rendimiento(g de extracto /100 g ms)
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
T1 T2 T3 T4 T5 T6
Tratamientos
CO2-
Carotenoides Convencional Supercritico
α-caroteno (mg/100 g ms) 7,22 ±0,08 12,27 ±1,80
β-caroteno (mg/100 g ms) 40,86 ±0,51 71,34 ±1,67
Luteína (mg/100 g ms) - 0,89 ±0,051
carotenoides totales (mg/100g ms) 48,08 ±0,81 84,50±12,3
81
ANEXO III
Estadístico P- valor
Shapiro-Wilk W 0,984256 Pr>w 0,9954
Kolmogorov-Smirnov D 0,10335 Pr>D >0,1500
Cramer-von Mises W-Sq 0,027212 Pr> W-Sq >0,2500
Anderson- Darling A-Sq 0,174807 Pr> A-Sq >0,2500
82
ANEXO IV.
83
ANEXO V.
84
ANEXO VI.
85
ANEXO VII
86
87
88
89
ANEXO VIII.
90
91
92
93
ANEXO XI
94
95
96
97
ANEXO X.
98
99
100
101
102
ANEXO XI
103