Antecedentes

Brasil tiene la mayor población de ganado comercial del mundo, con más de 190
millones de animales criados tanto para productos lácteos como para carne [1].
Las razas bovinas que actualmente se crían en Brasil pueden clasificarse en dos
grupos, según su origen, como exóticas o criollas. El grupo de razas exóticas
incluye las importadas en los últimos 50 a 100 años, tanto cebuina como taurina,
que actualmente constituyen el grueso de las poblaciones intensivamente
manejadas. La fuerte selección direccional ha venido dando forma a estas
poblaciones bovinas en Brasil en los últimos 40 años principalmente a través del
uso intensivo de un pequeño número de padres de élite en inseminación artificial,
así como procedimientos de transferencia de embriones. A pesar del gran número
de censos de algunas de las razas más eminentes, como la cebuina Nellore, Gyr y
sus híbridos taurinos, el tamaño efectivo de la población se ha reducido
considerablemente, aunque todavía no se dispone de estimaciones firmes. Hace
unos años, Georges y Andersson [2] estimaron una población efectiva de casi
1.000 habitantes para una población animal de 10 millones de Holstein en los
Estados Unidos. Es razonable pensar que, con el aumento de la accesibilidad a
las prácticas de reproducción asistida, en la actualidad se observa una situación
similar en todas las razas de bovinos sometidas a una gestión intensiva en el
Brasil.
Asimismo la mayoría de los países europeos y los EE.UU., el rápido crecimiento
de estas razas comercialmente orgullosamente ha sucedido a expensas del
segundo grupo de razas localmente adaptadas, genéticamente heterogéneas.
Este grupo de razas criollas, también denominadas razas autóctonas, locales o
naturalizadas, incluye las procedentes de las primeras poblaciones ganaderas
introducidas por los conquistadores europeos hacia 1500. Mientras que todos los
demás países sudamericanos recibieron sólo razas españolas, debido a su
peculiar origen colonial Brasil fue el único que recibió razas portuguesas [3].
Selección natural actuando en ambientes notablemente variables en todo el país,
junto con los eventos recurrentes de la mezcla de razas de raza llevó al desarrollo
de razas criollas adaptadas a una amplia gama de entornos con niveles
excepcionales de variabilidad fenotípica y una mejor adecuación a las condiciones
locales. En las regiones del noreste la raza Curraleiro arised y luego se trasladó a
los estados centrales de Minas Gerais y Goías. En las regiones del sureste las
razas Junqueira y Franqueiro se desarrollaron junto con el Caracu y Mocho
Nacional. En el Sur apareció la raza Criolo Lageano y en la región Pantanal la raza
Pantaneiro.
Mientras que el conocimiento histórico se ha acumulado en las razas criollas
brasileñas [4-8], muy poco se sabe en su composición genética. Algunos estudios
han analizado la variación de secuencia en las regiones hipervariables del mtDNA
y mostraron, como era de esperar, que ambos haplotipos de taurina africanos y
europeos están presentes en las razas criollas americanas, lo que es consistente
con los registros históricos. Algunos informes describen estudios preliminares del
polimorfismo genómico de algunas razas de ganado criollo brasileño, basados en
marcadores RAPD de bajo contenido informativo que no permiten realizar análisis
comparativos a través de estudios independientes [11,12]. Se necesita un estudio
más sistemático y de mayor alcance basado en el "lenguaje común" de los
marcadores de microsatélites para entender la diversidad genética de las razas
bovinas brasileñas con su peculiar origen histórico y su actual estado de peligro.
En el contexto de las Directrices para el Desarrollo de Planes Nacionales de
Manejo de Recursos Genéticos Animales de Granja [13], la FAO propuso un
programa integrado para el manejo global de los recursos genéticos bovinos
utilizando un conjunto común de marcadores de microsatélites de referencia. Los
estudios de las relaciones genéticas entre razas de bovinos utilizando una
herramienta de medición común no sólo proporcionan información útil y
comparable sobre la evolución de las razas hasta la fase actual, sino que también
proporcionan datos para un desarrollo científico de planes de conservación
asistidos por marcadores [14,15]. En los últimos años una serie de estudios han
reportado la caracterización de razas de ganado vacuno en todo el mundo [16-23].
En esos estudios se han utilizado progresivamente conjuntos comunes de
marcadores de microsatélites, lo que ha facilitado la realización de estudios
comparativos de la diversidad y las relaciones y la consolidación y el análisis de
grandes conjuntos de datos para múltiples aplicaciones de cría, evolución y
conservación.

A raíz del proyecto propuesto para los recursos genéticos animales por la FAO
(Modad - Measurement of Domestic Animal Diversity)[13], el objetivo de este
estudio era evaluar los niveles de diversidad genética, relaciones filogenéticas y
patrones de introgresión taurina/cebuina y mezcla entre diez razas de ganado
criado en Brasil. Se midió la diversidad en un conjunto de 22 microsatélites
recomendados internacionalmente, tanto por la FAO como por ISAG (Sociedad
Internacional de Genética Animal) para dilucidar la relación genética de un total de
915 animales pertenecientes a cinco razas de ganado criollo (Pantaneiro - PAN,
Curraleiro - CUR, Criolo Lageano - CRL, Mocho Nacional - MON, y Caracu - CAR)
tanto entre ellos y en comparación con las razas taurinas europeas especializadas
(Holstein - HOL y Jersey - JER) así como tres razas cebuinas principales criados
en Brasil (Nellore - NEL, Gyr - GYR y Guzerat - GUZ).

Resultados
Marcadores microsatelitales
Se analizó un total de 915 animales que representaban diez razas brasileñas
(Tabla 1). Todos los marcadores de microsatélites mostraron alto contenido de
polimorfismo en todas las razas. Se detectaron 278 alelos en todos los loci de los
915 animales analizados. El archivo adicional 1 lista todas las estimaciones de
frecuencia de alelo para cada microsatélite en cada raza. Los datos se enviarán a
la base de datos sobre la diversidad del ganado[25]. El número medio de alelos
por locus fue de 13,2 (entre 8 en INRA63 y 23 en TGLA122). En el cuadro 2 se
resumen las estadísticas descriptivas específicas del locus para los 22
marcadores de microsatélites, consolidando los datos entre razas para cada
subespecie de Bos (taurina y cebuina) y para ambas subespecies juntas. Las
heterocigosidades de locus esperadas en ambas subespecies y todas las razas
combinadas fueron nominalmente mayores que la heterocigosidad observada para
todos los loci. La única excepción se observó en el locus ETH3 en el grupo de
razas zebuinas, aunque no resultó en un exceso estadísticamente significativo de
heterocigotos. En el grupo de razas taurinas sólo loci INRA63 y HEL1 y en el
grupo zebuino sólo loci INRA35, INRA37, CSSM66, SPS115, TGLA227, INRA23,
ETH3 y BM1824 se encontraron para estar en HWE. Todos los demás loci
mostraron desviaciones de HWE. Cuando todas las razas combinadas fueron
analizadas todos los loci desviados de HWE (Tabla 2). Las estimaciones globales
de loci de endogamia mostraron que en ambos grupos de subespecies y el
conjunto consolidado existe una reducción significativa de la heterocigosidad
debido tanto a la endogamia poblacional (FIS) como a la diferenciación de razas
estimada bajo el modelo infinitesimal (FST) y el modelo de mutación gradual
(RST). Una estimación más alta de la endogamia dentro de la subespecie se
observó para la zebuina (0.113) en comparación con la taurina (0.074), aunque el
tamaño de la muestra más grande de taurina podría ser en parte responsable de
esta diferencia. Sin embargo, cuando se llevó a cabo un análisis de muestras
ecualizadas de 292 animales por subespecie, los resultados fueron los mismos.
La contribución de los marcadores microsatelitales para la diferenciación de razas
se estimó por la importancia de las estadísticas FST. El número de loci que
contribuyó a la diferenciación de razas varió entre las dos subespecies con un
mayor número de taurina en comparación con zebuina. Entre las razas taurinas
sólo loci ILSTS5 y HEL5 no contribuyó a la diferenciación de raza. Los otros veinte
loci tenían un FST significativo con INRA63, INRA5, CSSM33, ETH10 y TGLA227
como los cinco loci con los valores nominales más altos con INRA5 con el valor
más alto en 0.102 (Tabla 2).
En el grupo zebuino, por otro lado, sólo ocho marcadores contribuyeron a la
diferenciación de razas con una significativa estadística de FST. Estos fueron
INRA35, INRA37, ILSTS5, INRA5, CSSM66, CSSM33, CSSM9 y ETH152 con el
mayor valor significativo de FST en 0,054 para INRA5. Curiosamente, el FST
nominalmente más alto se estimó para el locus ETH10 sin embargo, no se
consideró significativo por la rejilla de la navaja. Los valores estimados de
diferenciación debido a la deriva genética bajo el modelo de mutación gradual
(RST) fueron en general más pronunciados que por las estadísticas de FST en
valores absolutos. Las estimaciones de loci globales de FST y RST fueron
similares en ambos grupos de subespecies sin embargo RST fue mucho mayor
que FST cuando todas las razas juntas fueron analizadas. El déficit global de
heterocigosidad cuando todas las razas de ambas subespecies fueron
combinadas ascendió a 0.176 y la diferenciación global entre todas las razas fue
estimada por FST en 0.098 y en 0.1861 por RST. La mayor parte de esta
diferenciación es probable debido a la bien conocida y marcada diferencia
genética subespecies aunque la variación genética entre razas de la misma
subespecie también es significativa (ver abajo).
Diversidad genética dentro de las razas
Las medidas de diversidad para cada raza mostraron un número medio
notablemente similar de alelos por locus fluctuando alrededor de 8,5. (Tabla 3).
Las razas criollas CRL y PAN fueron las poblaciones más diversas con la mayor
riqueza alélica media superior a 9.0. CAR tenía un poco menos de 8 alelos por
locus y era la raza con la menor riqueza alélica. Entre las razas zebuinas (NEL,
GYR, GUZ) el número promedio de alelos fue muy similar, alrededor de 8.7
mientras que las dos razas taurinas domesticadas fueron menos diversas con un
número promedio más pequeño de alelos ligeramente por encima de 8.0. Aunque
JER tiene un tamaño de muestra más pequeño que las otras razas esta diferencia
no generó una reducción notable del número de alelo medio cuando se analizó
una rejilla igualada de 50 animales por raza.
La heterozigocidad promedio observada y esperada osciló entre 0,6316 y 0,7409 y
0,7151 y 0,7839 respectivamente. En todas las razas observados los valores de
heterocigosidad eran nominalmente más pequeños que los esperados. De los 220
marcadores por raza HWE pruebas, 43 fueron significativos, muy por encima de la
esperada 5%. En todas las razas, al menos un marcador microsatelital se desvió
de las expectativas de HWE. La MON fue la raza donde se observaron y se
esperaba heterozigocidades fueron las más cercanas y donde la desviación
observada es menor que el número esperado por casualidad (5% de 22 = 1,1).
En todas las demás razas, el número de loci marcadores desviados no puede ser
contabilizado sólo por casualidad. Las tres razas zebuinas mostraron varios loci
desviados de HWE. En el lado taurino tanto las razas comerciales HOL y JER,
sino también el PAN criollo y CUR mostraron números similares de loci desviados
significativamente. Los valores más altos de FIS se observaron para JER seguido
de cerca por las tres razas de cebuina GYR, GUZ y NEL y la taurina CUR. La
proporción media de alelos compartidos entre los animales dentro de las razas
eran similares para todas las razas aunque PAN, MON y CRL tenían valores más
bajos consistentes con sus heterozigosities más altos observados.
Variación genética y relación entre razas
El fraccionamiento de la variación genética a diferentes niveles resultó en pequeño
pero significativo (p < 0,001) entre las proporciones de raza de la variación en
todas las estructuras probadas (Tabla 4). Entre las cinco razas criollas locales la
variación fue la más baja, estimada en 4.43% más cercana al valor encontrado
entre las tres razas zebuinas, en 4.96%. Como era de esperar, la mayor
proporción de variación entre grupos, casi el 17%, se estimó cuando sólo se
compararon las dos razas taurinas especializadas (HOL y JER) con las tres razas
zebuinas. Cuando todas las razas fueron analizadas juntas, casi 12% de la
variación se encontró entre razas.
Las estimaciones de la diferenciación genética de pares basadas en el modelo
infinitesimal (FST) fueron todas significativas después de las correcciones de
Bonferroni (p < 0,01), indicando que todas las razas pueden ser consideradas
como entidades genéticamente independientes. Se estimaron diferentes medidas
de distancia genética, pero todas mostraron una correlación muy alta, por lo que
sólo se informó de la distancia Nei, DA (Tabla 5). Como era de esperar, se
observaron las mayores distancias genéticas entre las razas taurina y zebuina,
como entre JER y NEL (0,3820). Se observaron pequeñas distancias en pares
entre las tres razas zebuinas. Entre las razas criollas locales se observaron las
distancias más bajas entre PAN y CUR (0,0841). CAR está genéticamente más
cerca de MON (0.099) que a su vez está más cerca de CRL (0.0861). Entre las
razas criollas CRL y PAN fueron las más cercanas a la raza zebuina NEL lo que
sugiere una mayor frecuencia de introgresión de genes indicine en estas dos razas
(0.2101 y 0.2320 respectivamente).
La reconstrucción filogenética a partir de un agrupamiento UPGMA basado en la
matriz de distancia DA dio lugar a un árbol con valores de bootstrap más altos que
por el método Neighbor Joining y consistente con la información histórica y
morfológica conocida (Figura 1a). La topología del árbol fue confirmada por los
valores relativamente altos del bootstrap. Cuatro razas criollas locales CRL, CUR,
PAN e MON se agruparon más cerca, con las otras tres razas taurinas uniéndose
en ramas separadas, JER y HOL más cerca. GYR, GUZ y NEL formaron un
cúmulo bien separado con GYR y GUZ más cerca. Un análisis de Neighbor-Net
corrobora aún más esta imagen, dando una mejor visión de la posición intermedia
de las razas criollas entre las razas puramente taurinas y zebuinas, y mostrando
una mayor proximidad de las razas PAN y CRL con el grupo zebuino en
comparación con las otras razas criollas (Figura 1b). Un dendrogram individual-
animal-basado vecino-unión construido a partir de las estimaciones de las
distancias compartidas alelo entre todos los 915 individuos muestra que la
mayoría de los animales dentro de cada raza ensamblado de cerca en ramas
discretas, pero algunas excepciones fueron observadas (Figura 2). Las razas
taurina y zebuina fueron claramente segregadas en dos ramas discretas. Sin
embargo, mientras que la taurina razas HOL, CAR y JER formado subramas casi
compacto con pocos individuos de estas razas fuera de lugar en otros grupos de
raza, Una alta frecuencia de animales fuera de lugar se observó entre las razas
criollas y especialmente cuando se mira a las tres razas zebuinas particularmente
así entre el GYR y GUZ.
El análisis de la estructura utilizando un enfoque bayesiano se realizó con un
número creciente de poblaciones inferidas. El agrupamiento basado en modelos a
k = 2 resultó en la agrupación de las dos principales subespecies con indicaciones
de introgresión génica en ambas direcciones. Con k = 3, las razas criollas locales
agrupadas formando un racimo. Es posible notar apareamientos direccionales de
las razas exóticas en los genomas locales. Basado en los valores de Q, la k más
probable encontrada fue k = 10. El diagrama muestra claramente que la mezcla se
ha producido entre las razas criollas locales confirmando indicaciones previas del
dendrograma animal-individual basado en distancias compartidas alelo (Figura 3).
Discusión
Hasta donde sabemos, este es el informe más completo sobre la estructura
genética y diversidad de las razas bovinas en Brasil, el país con la mayor
población mundial de ganado comercial y una peculiar composición mixta de
ambas taurinas, Cebuinas y razas híbridas. Los datos de genotipo recogidos
muestran que se mantienen cantidades significativas de variación genética en las
poblaciones locales de ganado vacuno. Las razas criollas CRL, CUR, MON y PAN
mostraron una riqueza alélica claramente mayor que ambas razas especializadas
y todavía nominalmente mayor que las razas cebuinas (Tabla 3) muy
probablemente resultado de la presión de selección suave y un patrón más liberal
de manejo del rebaño.
Excepción a esta tendencia es el comportamiento de la raza criolla CAR, la que
tiene la menor riqueza alélica y baja heterocigosidad observada consistente con su
historia única de cría selectiva. Nuestros resultados son consistentes con las
observaciones de Liron et al. [23] al analizar un grupo de diez razas en Argentina y
Bolivia que incluyeron razas criollas, taurinas y zebuinas.
Diversidad de microsatélites
El número medio total de alelos observados en cada locus, que consolida los
datos de las diez razas, está por encima de las estimaciones encontradas en otros
estudios [21,22,26-29]. Este número mayor puede explicarse por los tamaños de
muestra relativamente mayores analizados para las varias razas. Alelos raros, con
frecuencias inferiores al 5% se observaron en todas las razas en casi todos los
locus (archivo adicional 1). Las estimaciones de tales frecuencias por debajo del
umbral sugerido por la regla general de 5/2n (donde n = número de individuos)[30]
que corresponde a ~5/200 = 2.5% para la mayoría de las razas se deben ver con
precaución. Varios marcadores mostraron un déficit significativo de heterocigotos
debido a la endogamia intrapoblacional en ambas subespecies y en el análisis
combinado. Este resultado se ha observado comúnmente en encuestas de razas
bovinas en otros países [21,23,27]. La aparición de alelos nulos y errores de
genotipado también podría llevar a la deficiencia de heterocigotos. Sin embargo,
considerando que las estimaciones del déficit de heterocigotos para el mismo
locus marcador variaban por subespecies y que el conjunto de microsatélites
utilizados se ha recomendado cuidadosamente y se ha utilizado ampliamente para
estudios de diversidad en todo el mundo [31] esta explicación es improbable.
Variación genética dentro y entre razas
El déficit global de heterocigotos (FIT) en la muestra de 915 animales estudiados
fue relativamente alto, superior a las estimaciones de otros estudios en los que
participaron razas locales de origen taurino y zebuino [23,29,32]. Sin embargo es
importante tener en cuenta que en este estudio se analizaron razas taurinas
criollas en conjunto con razas taurinas especializadas y cebuinas así inflar
deliberadamente el valor de FST. La reducción global observada de la
heterocigosidad se debe, por tanto, en proporciones casi equivalentes a la
endogamia intrapoblacional (FIS = 0,086) y a la deriva genética entre las diez
razas (FST = 0,098). Todas las razas mostraron una reducción significativa en la
heterocigosidad debido a apareamientos no aleatorios dentro de las poblaciones
(Tabla 3). Las tres razas de cebuina, JER y CUR tuvieron los coeficientes de
endogamia más altos y significativos dentro de la población (FIS). Este resultado
refleja muy probablemente el manejo reproductivo más intenso que las razas
cebuinas y JER han sido sometidos, con el uso de un número relativamente
pequeño de toros de alto valor como donantes de semen en prácticas de
reproducción asistida. Dos razas criollas, CAR y MON mostraron los coeficientes
más bajos de endogamia entre las diez razas. Estas dos razas han sido objeto de
esfuerzos concertados para conservarlas. La raza MON se recuperó de un número
muy pequeño de animales mediante apareamientos dirigidos acoplados a
procedimientos de transferencia de embriones [7]. Además CAR es
fenotípicamente muy similar a MON, la única diferencia es la presencia de cuernos
en CAR. La extracción de cuernos de los animales de CAR y apareamientos con
MON ha llevado a absorber el cruce de la raza MON por CAR. Como el tamaño
efectivo de la población de MON es todavía muy pequeño, el entendimiento es
que esta absorción de raza irreversible, aunque resulta en una uniformización de
las dos razas, debería ser finalmente positivo desde el punto de vista práctico, ya
que los alelos potencialmente útiles se conservarán en las poblaciones más
grandes de la RCA. Tal posición también ha sido defendida como no
necesariamente indeseable cuando constituye una parte integral de la evolución
de una raza. Entre las cinco razas criollas se detectó la mayor endogamia en
CUR. Esto se esperaba ya que el número de toros disponibles para esta raza es
muy limitado. Las actuales acciones de conservación de esta raza han incluido el
intercambio de toros entre las pocas propiedades que crían estos animales, así
como la expansión del muestreo de germoplasma y la crioconservación [3].
La diferenciación genética significativa fue observada entre las diez razas
estimadas tanto por FST = 0.098 y RST = 0.1861 (Tabla 2). Se han estimado
valores similares de FST entre razas africanas taurinas y zebuinas (FST = 0,06)
[29]; 0,112 entre siete razas europeas taurinas [17]; 0,035 entre razas belgas
taurinas [33]; 0,107 en un grupo de razas europeas septentrionales [28]; alrededor
de 0,07 en razas ibéricas y francesas [28] [19,32] y 0,089 entre portugueses
taurinos locales [22]. En un estudio similar al nuestro, cuando se analizó un grupo
de razas taurinas y zebuinas criollas de Argentina y Bolivia, la diferenciación se
estimó en FST = 0,088 y RST = 0,144 [23]. Las estimaciones mucho más altas de
la diferenciación por el RST en comparación con FST sugieren que las diferencias
entre razas implican no sólo las frecuencias de alelo sino también las diferencias
de tamaño de alelo debido al comportamiento mutacional de los microsatélites.
La importancia y los valores de las estimaciones globales de FST entre las diez
razas para los 22 microsatélites son indicadores útiles de marcadores que podrían
ser herramientas poderosas para la diferenciación de razas. Diferenciación de
razas que pertenecen a diferentes subespecies, taurina o indicina, es una tarea
relativamente trivial como varios marcadores con un significativo FST podría
diagnosticar fácilmente la raza más probable, así como las proporciones de
zebuina y taurina genomas. Dentro de cada subespecie sin embargo sería más
difícil. En taurina, por ejemplo, de los veinte marcadores que contribuyen
significativamente a las diferencias entre razas, los marcadores INRA63, INRA5,
CSSM33, ETH10 y TGLA227, los cinco primeros clasificados por los valores FST,
podrían ser probados para este propósito. En zebuina, sólo ocho marcadores
mostraron una significativa FST, y todos de muy bajo valor, por lo que la
diferenciación de razas en esta subespecie podría exigir otros tipos de marcadores
como polimorfismos de nucleótidos individuales cuidadosamente seleccionados y
validados ancestralmente informativo. Tanto las estimaciones de FST como las de
RST en los grupos de taurina y cebuina tomados por separado mostraron una
menor diferenciación entre las tres razas cebuinas en comparación con el grupo
taurino. La posible explicación reside en la forma en que estos dos grupos fueron
introducidos y se gestionan actualmente en Brasil. En ese momento no se practicó
ninguna segregación específica de razas y todos los animales procedentes de las
Indias se clasificaron genéricamente como Zebu [6]. Además, las decenas de
millones de animales cebuinos existentes en la actualidad han resultado en su
mayor parte de la absorción de cruzamientos entre toros indicinos y presas
locales. Muy raramente, si es que existen, rebaños genéticamente puros
disponibles, que descienden directamente de animales importados de ambos
sexos y son totalmente inmunes al flujo del gen taurino [34]. Por último, sólo en
1938 se describieron y aplicaron las normas raciales para las razas cebuinas.
Hasta entonces, todas las razas estaban registradas en un único libro genealógico
de la raza Zebu [35].
Cuatro de las cinco razas criollas CRL, CUR, MON y PAN mostraron una mayor
riqueza alélica que todas las otras razas. Liron et al. observaron el mismo patrón
comparativo de variación genética. La introducción de animales taurinos en el
continente americano fue uno de los últimos movimientos de dispersión de bovinos
en el mundo. La población fundadora de las actuales razas criollas locales era un
pequeño grupo de animales ibéricos que se enfrentaban a una presión selectiva
significativa debido al clima tropical y a tensiones bióticas y a una casi extinción
debido a la introducción de razas más productivas [7]. Sin embargo, una fuerza
evolutiva opuesta fue la mezcla con razas de orígenes geográficos muy diversos
[3]. La dispersión de estas poblaciones a distintas regiones después de las
migraciones humanas, junto con las condiciones ambientales muy diversas que se
encuentran en un país continental, presión selectiva direccional muy suave e
hibridaciones de razas recurrentes, muy probablemente han dado forma al estado
actual de la diversidad genética de estas razas. Además, en los últimos años,
también se ha producido la introgresión de las razas zebuinas. Sólo la raza CAR
contrastó a esta imagen mostrando una reducción observada heterocigosidad y
riqueza alélica (Tabla 3). Esta es la única raza criolla que tiene una historia de
selección artificial y el declive de esta raza en los años 60 y 70 también podría
haber contribuido a esta reducción de la variación genética.
Relación genética entre razas y conservación
La partición de la variación genética de una AMOVA también reveló que la mayor
cantidad de variación siempre se encontró entre los individuos dentro de las razas,
independientemente de las diferentes estructuras probadas (Tabla 4). La máxima
diferenciación se encontró al comparar la cebuina con razas taurinas
especializadas. Se ha visto un patrón muy similar de división de la varianza en
varios otros estudios de razas bovinas [19,22,23] donde el 90% o más de la
variación está contenida dentro de las razas. Sin embargo, Liron et al. [23]
encontraron que sólo el 1% de la variación se debió a diferencias entre razas
criollas argentinas y bolivianas, menores que el 4% que encontramos entre las
razas criollas brasileñas. Aunque no se puede hacer una prueba comparativa
formal para determinar la importancia de estas estimaciones, el valor
nominalmente más alto podría resultar de dos características distintivas de las
razas criollas brasileñas. En primer lugar, Brasil fue el único país de América del
Sur que recibió razas taurinas portuguesas [3] que han demostrado tener tanto un
linaje evolutivo europeo como africano representados por los grupos cóncavo
marrón y convexo rojo [22]. En segundo lugar, como se mostrará más adelante,
algunas de estas razas locales brasileñas han experimentado una mayor
introgresión de genes zebuinos. Sería interesante realizar un extenso análisis
conjunto de las razas locales de varios países de América del Sur junto con todas
las razas ibéricas para reconstruir una imagen de toda la región de los patrones de
variación genética.
Una comparación de microsatélite autosómico, haplogrupos mtDNA y haplotipos
de microsatélite Y-cromosoma ha demostrado que para las razas criollas
bolivianas y argentinas ha tenido lugar la introgresión masculina mediada por
cebuinas [23,36]. El patrón esperado para Brasil sería una proporción aún mayor
del genoma ancestral zebuino en las razas taurinas criollas a medida que uno se
mueve hacia el norte, consistente con la introducción y uso de animales zebuinos
para una mejor adaptación a los climas tropicales. Tal tendencia fue detectada en
nuestro estudio para todas las razas criollas analizadas, y particularmente para
CRL y PAN que mostraron las distancias genéticas interraciales más pequeñas en
relación a las tres razas zebuinas (Tabla 5), y del análisis de ESTRUCTURA,
mejor visto con k = 3 (Figura 3). Varios animales de CRL y PAN mostraron una
cantidad discernible de genoma de cebuina y la proximidad de estas dos razas
con el grupo de cebuina se observó claramente en el gráfico de Neighbor-Net. Los
datos históricos recogidos en los lugares donde se tomaron muestras de estos
animales indican la presencia de machos de Nellore o de sus híbridos en los
rebaños. En CUR y MON la introgresión zebuina fue menos pronunciada y casi
ninguna para los animales CAR consistente con la historia de una gestión de cría
más sistemática y segregada de CAR como una raza taurina. Dentro de la rama
zebuina, las razas GYR y GUZ están más cerca y en el dendrograma de un solo
animal los animales de estas dos razas se entremezclan, en consonancia con la
proximidad geográfica de su centro de origen en la India. El análisis STRUCTURE
fue capaz de diferenciar estas dos razas, sin embargo un número de animales
mostraron ascendencia mixta. Ibeagha-Awemu et al. [29] al analizar un conjunto
más grande de razas de cebuinas africanas señaló, de hecho, que el modelo-El
enfoque de agrupamiento basado implementado por el programa STRUCTURE no
puede efectivamente discriminar a individuos con genotipos muy estrechamente
relacionados o niveles muy bajos de diferenciación a su raza legítima sin
información previa de la población.
Ha habido mucha controversia y se han propuesto varios enfoques para evaluar
las prioridades de conservación sobre la base de marcadores moleculares [19,37].
En este estudio no se intentó definir la prioridad de conservación. Todas las razas
criollas brasileñas son objetivos importantes y viables para la conservación [3].
Son genéticamente únicos y muestran rasgos peculiares que merecen esfuerzos
de conservación. Por ejemplo, los animales CUR son pequeños, de bajo peso,
muy adaptados a las regiones semiáridas de Brasil y capaces de sobrevivir en
condiciones muy duras con poca comida y agua, mostrando una marcada
resistencia a varios parásitos y alta fecundidad.
Conclusión
Este estudio reporta un estudio integral de la estructura genética y diversidad de
razas bovinas en Brasil. El análisis genético mostró que una cantidad significativa
de variación genética se mantiene en las poblaciones locales de ganado vacuno y
todas las razas estudiadas podrían ser consideradas como entidades genéticas
distintas. Cuatro de las cinco razas criollas brasileñas mostraron una riqueza
alelica notablemente mayor que todas las otras razas más probable como
resultado de una combinación de selección natural en diversas condiciones
ambientales, presión selectiva artificial leve e hibridaciones de razas recurrentes,
incluida la introgresión de razas cebuinas. Los datos genéticos corroboran los
registros históricos en que indican que los patrones variables de mezcla de razas
han ocurrido desde tiempos coloniales que conforman el estado genético actual de
las razas locales. Las razas criollas brasileñas constituyen un importante y diverso
reservorio de diversidad genética para la cría de bovinos y objetivos viables para
la conservación, ya que presentan rasgos peculiares de naturaleza fenotípica y
cultural. Como han señalado varios autores, hay que tener en cuenta muchos
otros aspectos, además de la cantidad y la distribución de la diversidad genética,
al abordar las estrategias de conservación de las especies ganaderas. Los
aspectos históricos, culturales y tradicionales relativos al uso de determinadas
razas son cuestiones pertinentes. Además no hay que olvidar el hecho de que la
selección direccional practicada por el hombre ha moldeado los genomas
animales de maneras inesperadas favoreciendo alelos o complejos de genes para
los cuales los marcadores neutros sustitutivos utilizados en las encuestas de
diversidad no son necesariamente plenamente representativos.
Métodos
Animales
Se analizaron diez razas bovinas brasileñas, con un total de 915 animales. Las
razas estudiadas pueden clasificarse en tres grupos: a) razas taurinas criollas
(Caracu - CAR; Criolo Lageano - CRL; Curraleiro - CUR; Mocho Nacional - MON y
Pantaneiro - PAN); b) razas taurinas europeas (Holstein - HOL y Jer - ZEBUINE) y
brasileñas (Nellore - NEL; Gyr - GYR y Guzerat - GUZ) (Cuadro 1). Para las razas
donde la información pedigrí estaba disponible, individuos no relacionados por lo
menos tres generaciones fueron seleccionados. El ADN genómico total se extrajo
mediante un procedimiento de salazón de rutina [42]. Este estudio siguió los
aspectos jurídicos y las normas con las que Embrapa está comprometida y ha sido
aprobado por el Comité de Ética de Embrapa Recursos Genéticos y Biotecnología.
Además, cumplía los requisitos legales establecidos por el Consejo de Gestión del
Patrimonio Genético - CGEN del Ministerio de Medio Ambiente de Brasil.
Tipificación de marcadores de microsatélites
Veintidós microsatélites fueron amplificados por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en cinco sistemas multiplex diferentes donde el cebador
delantero de cada microsatélite fue etiquetado con fluorocromos de 6-FAM, HEX o
NED según el rango de tamaño del alelo esperado. Varios de estos microsatélites
han sido utilizados habitualmente por otros grupos de todo el mundo, lo que ha
hecho posible el análisis comparativo o la consolidación de conjuntos de datos en
el futuro. Los sistemas multiplex utilizados fueron: un 7-plex compuesto por
marcadores INRA35, INRA37, HEL9, HEL5, INRA63, ILSTS5, ETH152
(temperatura de recocido Ta = 56 C); un 2-plex de marcadores CSM9, CSSM33;
un 5-plex de marcadores BM2113, ETH10, SPS115, TGLA122, ETH225 (Ta = 61
C) y un 5-plex de marcadores TGLA227, TGLA53, INRA23, ETH3, BM1824 (Ta =
61 C). El microsatélite CSSM66 se amplificó solo (Ta = 61 ºC) y el producto PCR
se inyectó junto con los marcadores HEL1 e INRA5 antes de la electroforesis. Solo
los marcadores CSSM9 [43] y CSSM33 [44] no se incluyeron en los
recomendados para estudios de diversidad de la población bovina por el programa
Modad de la FAO para el Manejo de los Recursos Genéticos Animales de Granja.
Las referencias y secuencias iniciales de los microsatélites utilizados están
disponibles en la base de datos sobre la diversidad bovina [25]. Los productos
amplificados por PCR fueron electroinyectados en un analizador genético ABI
PRISM 3100 (Applied Biosystems) y los datos recogidos bajo filtro virtual D
usando Genescan 2.0 y Genotyper 2.1 (Applied Biosystems) para declarar alelos.
Para calibrar alelos se utilizó un patrón de tamaño interno etiquetado con ROX
[45]. Los genotipos de ocho loci recomendados por ISAG (BM2113, ETH10,
SPS115, TGLA122, ETH225 TGLA227, INRA23, BM1824) se calibraron utilizando
muestras de referencia genotipadas en la prueba de comparación ISAG 2005-
2006 (D. Tapagratglia pers. comm.). El software Allelobin se utilizó para clasificar
los tamaños observados de los alelos del microsatélite en alelos discretos
representativos utilizando el algoritmo de minimización de mínimos cuadrados de
Idury y Cardon [46].
Análisis de datos
Las frecuencias de alelos se calcularon por conteo directo. Se estimaron
parámetros de diversidad de locus para todos los marcadores microsatelitales de
todas las razas utilizando el software Cervus [47], incluyendo: heterocigosidad
observada (Ho), heterocigosidad esperada (He) y contenido de información
polimórfica (PIC) Las estadísticas F de Wright para cada locus se calcularon
utilizando el método de Weir y Cockerman [48] utilizando FSTAT [49]. Se obtuvo
una prueba de significancia en las estimaciones de las estadísticas F de Wright
(FIT, FIS y FST) para cada locus microsatelital mediante la construcción de
intervalos de confianza del 95% y 99% basados en las desviaciones estándar
estimadas por jackknifing en poblaciones usando FSTAT. Se utilizó una prueba
exacta para determinar desviaciones de las proporciones de Hardy-Weinberg y
deficiencia de heterocigosidad utilizando el paquete de software GENEPOP [50].
El método de la cadena Markov [51] se utilizó para estimar valores P exactos no
sesgados. Las estimaciones de la variabilidad genética para cada raza (He, Ho
con su error estándar asociado) se calcularon utilizando el Excel Microsatellite
Toolkit [52]. Se utilizó el software FSTAT para calcular la riqueza alélica (AR)
estandarizada para la variación en el tamaño de la muestra. La diferenciación de
razas fue estimada por las estadísticas F de Wright (FIT, FIS y FST) y el valor
indicativo P fue ajustado por un procedimiento Bonferroni utilizando el mismo
paquete de software [49]. Utilizando información de raza se formaron diferentes
grupos basados en su origen (taurina zebuine) e información previa (raza criolla
especializada). Con estas definiciones, se realizó un análisis jerárquico de la
varianza utilizando un enfoque de análisis de varianza molecular (AMOVA)
implementado en el paquete ARLEQUIN [53]. Las distancias genéticas entre razas
fueron estimadas por DA [54] usando DISPAN [55]. La distancia tradicional de
Reynold (FST) fue calculada usando FSTAT. Las estadísticas logarítmicas de
probabilidad G [56] se utilizaron para estimar los valores P y la significación de
pares se estableció tras una corrección estándar de Bonferroni [49]. También se
estimó RST [57] utilizando el programa Microsat. La correlación del momento del
producto (r) y la estadística de la prueba de Mantel se calcularon para
comparaciones de pares de matrices de distancia. Un árbol UPGMA (Método de
Grupo de Par No Ponderado con Media Aritmética) y un árbol de unión del vecino
fueron construidos basados en distancias DA usando el paquete Dispan. Los
valores de bootstrap se calcularon sobre 1.000 replicas. Adicionalmente se
construyó un gráfico Neighbor-Net [58] basado en distancias DA con el programa
Splitstree4 [59].
Las distancias genéticas en pares entre todos los animales individuales se
calcularon mediante el logaritmo de las proporciones de alelos compartidos (Dps)
[60], utilizando Microsat [61]. El método de agrupamiento [62] se utilizó para
construir un árbol basado en la matriz de distancia genética utilizando el paquete
Phylip [63] y el archivo resultante se introdujo en Treeexplorer [64] para encontrar
una representación gráfica adecuada.
Sobre la base de los genotipos en los 22 loci marcadores, los animales
individuales se agruparon en un número determinado de poblaciones y se
asignaron probabilísticamente a los grupos inferidos con un enfoque bayesiano
implementado por el software STRUCTURE [65]. Las pruebas se realizaron sobre
la base de un modelo de mezcla en el que las frecuencias alélicas se
correlacionaron aplicando un período de combustión de 50.000 y 500.000
iteraciones para la recopilación de datos. De dos a quince grupos inferidos se
realizaron con tres carreras independientes cada uno. Los resultados se
introdujeron en el programa DISTRUCT [66] para proporcionar una visualización
gráfica.