Prueba de la fenilalanina-desaminasa 1. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un organismo de desaminar la fenilalanina en scido fenil- piravico por su actividad enzimatica, con la consiguiente acidez resultante. Il. OBJETIVO (Véase también la Seccién III, Capitulos 33 y 34.) A) Esta actividad enzimatica es caracteristica de todas las especies de Proteus y del grupo Providencia, y se usa para separar estos dos géneros de otros miembros de as Enterobacteriaceae. B) Ayudar a la diferenciacién en especies: Moraxella phenylpyruvica (+) de otras espe- cies de Moraxella (—). 24 II. BASES BIOQUIMICAS El aminodcido aromatico fenilalanina sufre la desaminacién oxidativa catalizada por un aminoacido oxidasa, una flavoproteina?! pa- ra producir el acido ceténico, acido fenilpira- vico. La desaminacién ovidativa da como resultado la extracci6n del grupo amino (NH.) del aminoacido para formar un doble enlace a-cetoicido y libre de amoniaco (NH;). Es éste un proceso en dos etapas; en un principio, es extraido el hidrégeno dando un Iminoacido y el hidrégeno se combina con el oxigeno para format agua, luego el imino- acido es hidrolizado en un cetoacido."” La fenilalanina es’ desaminada a acido fenilpirivico, el que luego es reducido a Acido fenilictico mediante incubacién. Este ultimo RCHNH,COOH + v0 —=28- nenricooH —*#2+ RcOCOOH + Ni ga—¢H coon is -C~COOH y Ni ait O + VO tpreseine a Fenilalanina, Acido Amoniaco FenilpivivicoReconvertido 1 CH,—CH—CooHt Revonvertid (Copiado de Harrow, B., y Mazur, A. (1965), Co., Filadelfia.) puede ser reconvertide en fenilalanina, con lo que el ciclo de la desaminacién vuelve a repetirse, Una pequefia cantidad de ac fenilpinivico es susceptible de ser descarbo xilado a dicido fenilacético, el cual tam puede ser reconvertido en fenilalanina. IV. MEDIO EMPLEADO: MEDIO DE FENILALANINA A) Ingredientes, pH: 7.3. DL-fenilalanina i 2g 2. Extracto de levadura 3g 3. Cloruro de sodio bg 4. Fostato de sodio (NasHPO,) 1 g 5. Aga 12g 6. Agua destilada 1000 mi B) Existen productos comerciales. 1. Difco. 2 BBL. ©) Método de preparacién. 1. Pesar las cantidades exactamente, sic guiendo las indicaciones del pros- pecto. desaminacién Prueba de la fenilalonina-desaminaso 169 (CH,CHOHCOOH 0 Acido fenibietice | a’ Acido fenilpirivieo (PPA) ‘00H | decarbositado 0. CH.COOH @ Frid tenis Texthook of Biochemistry. 9 ed, con autorizacion de W. B, Saunders 2. Rehidratar con agua destilada 0 des- mineralizada. 3. Calentar suavemente hasta disolucién 4. Distribuir en tubos, aproximadamente 4 ml/tubo, en pico de flauta largo. facion, D) Método de este 1. Autoclave. 2 121°C, 15 ibras, 15 min, E) Dejar que el medio se solidifique en posicisn oblicuc. F) Enfriar antes de su empleo y conservar refrigerado (4-10° C). G) Inoculacién. 1. Inéculo denso.* 2. Crecimiento de un cultive puro de 18 a 24h (AIK). 35°C. 4 horas © 18 a 24 1) Agregar directamente el reactive al tubo incubado antes de intentar la interpreta- cion y hacer que el reactivo se deslice suavemente sobre el pico de flauta170. Pruebas bioquimicas para la identificacién de bacterios Si no se obtiene el medio de fenilala- nina comercial, y se utiliza 1-fenilalanina en lugar de la mezcla del isémero DL, sélo es necesario 1 g (1 %).* La forma L. (+), de fenilalanina es degradada mas répidamente por Proteus y Providencia que la mezcla DL." V. REACTIVOS EMPLEADOS A) Dos elecciones. 1, Solucion acuosa de cloruro férrico (FeCls) al 10 %. ° a) Ingredientes, dos tipos. 1. Acidificado, recomendado. a) Cloruro férrico (FeCh) b) Acido clorhidrico concentrado (HC) 2,5 ml ©) Agua destilada, 2 g csp. 100 mi 2. No acidificado. a) Cloruro férrico (FeCl) 10g b) Agua destilada 100 mi 2. Sulfato de hierro y amonio [FeSO, (NH,).S0,,6H,0] semisaturado." B) Métodos de utilizacién. 1. Cloruro férrico, cualquier tipo. a) Agregar 4 a 5 gotas de FeCl, directamente a un tubo incubado de 18 a 24 h. Si el tubo cs inocula densamente, serin suficientes 4h de incubacién.? Hacer rotar suavemente el para que el crecimiento se separe. En el término de 1 a 5 min se produce una reaccién positiva de color verde en el pico de flauta, y en el liquido de sinéresis." by tubo ° 2. Sulfato de amonio férrico.* a) Acidificar con acide sulfirico (H,S04) al 10 & silizando como ficador rojo de fenol 1. Alealino: rojo. 2. Acido: amarillo, ° D) E) b) Agregar de 4 a5 gotas de sulfato ferrico de amonio semisaturado. ©) Agitar suavemente el tubo. d) Una reaccién positiva de color verde se produce dentro del tér- mino de ¥ mi 3. Cualqsier reactive: interpretar la re accién inmediatamente, dado que el color producido es inestable y se desvanece rapidamente. Control de calidad: Los reactivos deben ser controlados con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su empleo general. Son buenos controles la Escheri- chia coli y las especies de Proteus, dado que se obtienen facilmente y su conservacién en cultivos madre no crea problemas. coli: reaccién de la fenilalanina negativa; especies de Proteus: reaccién de la fen alanina positiva. Conservacién: Guardar los reactivos en un refrigerador (4 C) mientras no se usan. Estos reactivos deben ser colocados en. frascos oscuros para evitar la expo- sici6n a la luz. Su estabilidad es variable: por lo tanto, se hard todas las semanas un control de calidad desechando los que muestran una reaccién negativa o debil con un organismo positive conocido. Quimica de la accién reactiva: Como la fEnilalanina esti desaminada, cl color producido como consécuericia del agre- gado de cloruro férrico (FeCl) al 10% se debe a la formacidn de un cetoscido, el Acido fenilpiriivico2” Henecka ® y Houben-Weyl ® demostraron que los a etoicidos dan una reaccién de color positiva tanto con fa solucién alcohélica como con la actiosa de FeCl. El acido pinivigo es un a-cetoacido. Inger y Voleani*” Feuer porta del Cl formacién de una hidrazona. La hidra- cina (RNHNH») es un derivado del amonjaco agregado aun grupo carbonilos tne donk deigeret oe ca igens, silesiras que. ileal ligado a un atomo de carbono.!” Cuando. se condensa un aldehido o una cetona con una hidracina, se produce una hidrazona o un compuesto de tipo hidra- zona, (un nitropene no a ae contiene el derivado), y se elimina ef rman que la e se debe a laA B) A) ) hiidracina © c crews ° erona CH, COOH Oo Ort RNE_Nfty)+ Q Avid fe El miicleo guanidina de la peptona [COVHV(NHgg es un amoniaco un derivado hidracina det acido carbénico.t Los compuestos de tipo cetonico son incoloros, pero si se conjuga un grupo 9) con otro grupo ceto 0 con :—C— u otras ligaduras dobles, puede producirse color.” El cloruro férrico (FeCk) es un agente oxidante y el ion férrico (Fe***) en solucion acida con la hidracina, formara (por medio de una hidrazona) nitrogeno y amoniaco como productos terminales,! reduciendo el ion férrico. NH + Fe** + NHS + ta Ne + HY + Fett Fl cloruro férrico actita como agente quelante; lo hace con el acido fenilpira- vico para formar un color verde." Cuando se expone al oxigeno atmosté- tubo de cultivo con fenilalanina después del agregado de FeCh, aumenta la velocidad de produccidn y la intensidad de la reaccién positiva* VI. RESULTADOS Las fotografias en colores de los raciilineae pueden verse en la Figura 25-1 (Apéndice 1). ‘VII, INTERPRETACION Prueba positiva: Formacién de un color rojo claro a intensu eu el picw de Haut y en el liquido de sinéresis.* Prueba negativa: no se produce cambio de color; se mantiene amarillo por el color del reactivo cloruro férrico. VIII. PRUEBAS RAPIDAS Prueba de la fenilalanina con tira impreg- nada de reactivo (PathoTec), Hidracina Prueba de la fenilalanina-desaminaso 171 X—NHK Hidravonsa * coon Che-¢ NHR + 1.0 Fenilhidravena 1. Fabricante: General Diagnostics Divi- sion, Warner-Lambert Company, 2. Resultados: dentro de los § a 10 min de incubacion. 3. Método: segu fabricante. 4. Correlacién con la prueba standard. las indicaciones del a) 100 %;% % #90 G4 b) Falsos negativos. 1. Dos cepas de Proteus morganii que no fueron influidas por una incubacién prolongada de 30 min. 2. Una cepa de Proteus mirabilis. 3. Una cepa de Prowidencia." Falsos. positives, con dificultades de interpretacién. 1. El pigmento de color oscuro producido por el organismo ede interpretarse como una falsa reaccin positiva 0 se evita" empleando un indculo denso y himedo, Ademis, frotar el inéculo cn parte sobre la zona de reactive yen parte fuera de ella, para ‘comparaci 2. Interferencia del acido sulfhi- drico (SH,). Evitar tomar el inéculo de AHTA/AHK; usar un cultivo de agar nutritivo. B) Tabletas IPA de Key 1. Fabricante: Key Scientific Products Company. Determina dus pruebas bivgutinicas: del indol y de la fenilalanina. 3. Método: seguir las in fabricante,172. Pruebas bioquimicos para la identificacién de bacterias IX. PRECAUCIONES (A) Una prueba de la fenilatanina positiva tac gado del debe serimerp' pues del age porque el color da © negative debe bh primeros 5: min. se deslice sobre el pico de th me” La imerpreucion de positive B) Algunos laboratorios utiliza las inic wedliatamente des sictive FeCl, verde se desvanece nipi- ieerse dentro de los Haciendo que et ChFe permite color mas pronunciado. 10. 1 12, 13. tiene hacer fenilalanina representa tanto éste como el agar con fenilalanina n aspecto idéntico, Cuando se tenga duda en cuanto al medio que se ha querido representar con abre un control. de organismo fenila disponer el a menudo les PA para indicar el medio de Sin embargo, ello puede también agar con peptona y ura PA calidad con un inina positive antes de de dicho medio. BIBLIOGRAFIA Audrioth, L. F., and Ackerson, B. The Chemistry of Hydrazine, New York; John Wiley and Sons, Ine., 1951, pp. 122 ‘and 214-216, BBL Manual of Products and Labora tory Procedures, 5th ed., Cockeysville, Maryland: Division of BioQuest, Di sion of Becton, Dickinson and) Com. pany, 1968, p. 132 Blezevie, D.J., Schreckenberger, P.C., land Matseu, JM. (1973) Evaluation of the PathoTec "Rapid LD” system, Appl Microbiol, 26,886, Borchardt, KA. (1968) Simplified ‘method for identification of enteric and other gram-negative bacteria using re- agent-impregnated strips. Am. J. Clin. Pathol. 49, 748, Cuntarow, A., and Scheparte, #8, Bio chemistry, 3rd ed., Philadelphia: W. B Saunders Company. 1962. pp. 584-585 Cowan. 8. T., and Steel, KJ. Manual for the Identification of Medical Bacte ria, Cambridge: Cambridge University Press, 1966, pp. 120 and 173, Difco’ Supplementary Literature, De \oit: Difeo Laboratories, 1968, p. 280 Edwards, P. R.,.and Ewing, W. H. Iden. tification of Enterobarterincons, Minne apolis: Burgess. Publishing Company, 1955, p. 253, Ewing, W. H., Davis, B.R,, and Reavis, R. W. (1957) Phenylalanine and malo hate media and their use in enteric bac- tertology. Public Health Lab, 15, 153, Fieser, L. F., and Fieser, M. Organic Chemistry. 3rd ed, Now Verk: Reinhold Publishing Corporation, 1956, p. 211 Handbook of Clinical Laboratory Data, 2nd ed., Cleveland: The Chemical Rub. ber Company, 1958, p. 321 Harrow, B., and Mazur, A. Textbook of Biochemistry, Sth ed., Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1966, p. 405. Henecka. H. Chemie’ derBota Decar 16. 11. 18. 20. 21 2, bonyl-Verbindungen, Berlin: Springer, 1960, pp. 110-128. Henriksen, 8. D., and Closs, K. (1938) ‘The production of phenylpyruvie acid by bacteria. Acta Pathol. Microbiol Seand.. 15, 101. Houben-Weyl, Methoden der Organ- ischen Chemie, Vol. II, 4th ed., Stutt- gart: George Thieme, Publisher, 1953, pp. 384-386. Matsen, J. ., and Sherns, J. U. (968) Comparative study of the efficacy of coven paper-roagent stripe and conven tional biochemical tests in identifying gram-negative organisms. Appl. Micro Diol, 28, 452, Nussenbaum, S. Organic Chemistry, Boston: Allyn and Bacon, Ine., 1963. np. 2351, 358, and 597 Prevorsek, M., Kronish, D, P., and Schwarte, B. 8. (1068) Rapid presump- tive identification of enteries with re- agent impregnated paper strips, Am. J Med. Technol., 34, 271 Rosner, R. (1973) Evaluation of the PathoTec “Rapid I-D" system and two additional experimental reagent-im- Pregnated paper strips. Appl. Micro- biol. 26, 890. Singer, J., and Voleani, B. E. (1959) An ‘improved ferric chloride test for differen. tiating Proteus-Providence group from ther Enterobacteriaceae. J. Bacteriol. 258. Smith, D. T., Conant, N, F., and Wil- lett, H. P. Zinsser Microbiology, 14th cd. New “York. Applewn-Century- Crofts, 1968, p. 117 Weaver, D. K., Lee, E. K. H., and Leahy, M. 8. (1968) Comparison of re- agent-impregmated ps ventional methods fo Enterobacteriaceae. Am. J. Clin. Pa- thol., 49, 494.