UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIAS.

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 2

AMINOACIDOS

Objetivos

 Demostrar la utilidad de la reacción de la ninhidrina para la identificación de los

aminoácidos.
 Separar una mezcla de aminoácidos por medio de una cromatografía de placa delgada
preparativa.
 Identificar por métodos colorimétricos los L – α aminoácidos separados a partir de la
cromatografía preparativa, basados en las reacciones de los grupos R.
 Construir con datos experimentales la curva de titulación de un aminoácido.
 Hallar gráficamente el punto Isoeléctrico de los aminoácidos.

Fundamento teórico

Los aminoácidos son importantes compuestos químicos que cumplen un número variado
de funciones dentro de la célula, tales como: Constituyen las unidades monoméricas de las
proteínas, representan la única fuente de nitrógeno metabolitamente utilizable, aportan entre
un 10 y un 20% de la energía que utiliza diariamente la célula.
Desde el punto de vista químico pueden definirse como aquellos compuestos orgánicos que
poseen al menos un grupo carboxilo y otro amino. Sin embargo se debe tener en cuenta
que en célula eucarionte solo existen los aminoácidos proteínicos, los cuales tienen sus
grupos amino y carboxilo unidos a un átomo de carbono alfa y pertenecen a la serie
estérica L.
Los aminoácidos también presentan una cadena lateral R de estructura variable, que
identifica a cada aminoácido particular. Entre los diversos criterios que se pueden utilizar
para establecer una clasificación de los aminoácidos en la práctica presente se ha
considerado la polaridad de la cadena lateral de los aminoácidos. De acuerdo con éste
criterio pueden subdividirse en aminoácidos no polares y polares sin carga eléctrica a
preciable y con carga eléctrica apreciable (ácidos y básicos).
La cadena lateral R permitirá en el laboratorio realizar las diferencias entre los
aminoácidos por medio de diferentes procedimientos tanto químicos como físicos. La
presencia de los elementos estructurales invariantes en los aminoácidos, permite que
presenten características físicas y químicas comunes, tales como la polaridad, alto punto
de fusión y de ebullición, solubilidad en solventes polares.

En cuanto a sus características químicas presentan las reacciones propias de los grupos
amino y carboxilo, por lo que estas reacciones no pueden ser utilizadas para caracterizar a
los aminoácidos. Sin embargo en la presente práctica se utilizará la reacción de los
aminoácidos con la ninhidrina, la reacción xantoproteica, la prueba de los grupos SH, de
Sakaguchi, de Hopkins – Cole y de Millón (Consultar el fundamento de estas reacciones).
Desde el punto de vista de su solubilidad, esta varía de acuerdo con la polaridad que
presente su cadena lateral de manera que los aminoácidos clasificados como polares
iónicos serían mucho más solubles en agua que aquellos que posean grupos hidrofóbicos
en su cadena lateral R. Esta propiedad permitió aplicarle a los aminoácidos una técnica de
separación basada en las diferentes solubilidades que presentan las sustancias ante una
mezcla de solventes de diferente polaridad, llamada cromatografía. En la presente
práctica se utilizará una cromatografía de placa delgada preparativa, ideal para la
separación de pequeñas muestras de compuestos ligeramente no – volátiles como
aminoácidos.
Los aminoácidos tienen un marcado carácter anfótero debido a la coexistencia en una
misma molécula de grupos ácidos y básicos que se pueden disociar dependiendo del pH.
En soluciones de pH neutro los aminoácidos existen como zwitteriones (iones dipolares)
en los que el grupo carboxilo está disociado y el grupo amino protonado. Los aminoácidos
pueden tener curvas de titulación característica, a partir de los cuales se pueden obtener los
valores de pK de cada uno de los grupos ionizable. El comportamiento anfótero de cada
uno de los aminoácidos y sus valores de punto isoeléctrico son una consecuencia de su
estructura particular, ya que también contribuyen a la carga los grupos ionizables de su
cadena lateral. Esto se reflejará en cu curva de titulación

Materiales y Reactivos

Un par de guantes de cirugía, ajustable para evitar manchas en la piel con el reactivo
ninhidrina y para no tocar la placa preparativa con los dedos.

Curvas de titulación
Soluciones de aminoácidos en agua 0.1 M
NaOH 0.1 N (estandarizado) ( volumen 200ml)
HCl (0.1) N (estandarizado) ( volumen 200ml)
Vasos de precipitados
Buretas
Agitador magnético
pHmetro.
Cromatografía de capa delgada preparativa

Placa preparativa
Mezcla de aminoácidos
Embudo
Vasos de precipitados
Papel filtro
Capilares
Solución de ninhidrina
Cámara de separación
Eluente (Butanol 35%, Acetona 35%, ácido acético 7%, agua 23%)
Soluciones patrones de aminoácidos.
Pulverizador

Identificación de aminoácidos

Solución de ninhidrina
Tubos de ensayo
Acido nítrico concentrado Estufa
Hidróxido de Sodio al 40% Gradilla
Naftol Pipetas
Hipoclorito de sodio al 2% Pinzas de madera
Acido Glioxílico
Acido sulfúrico
Reactivo de Millón

Preparación de algunos reactivos

Soluciones de aminoácidos para las curvas de titulación

Prepare 100 mls de solución de aminoácidos 0.1M, en agua destilada, pesando la cantidad
requerida según los aminoácidos elegidos por el docente o auxiliar (uno polar y otro no
polar).

Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina:

 Reactivo de ninhidrina: disuelva 0.5g en 50ml de acetona antes de usarse.

Existen dos formas para la preparación de este reactivo:

1. Disolución al 1.5% en acetona con ácido acético y agua (95:1: 4) ml

2. Se diluye 3.5g de ninhidrina en BUTANOL : ACETONA ( 25:25) ml
  Soluciones patrones de aminoacidos: 1g de aminoácido en 100ml de isopropanol al
10% v/v.

Eluente: preparar 50 ml de una mezcla de butanol: ácido acético: agua (12:3:1)

Soluciones patrones de aminoácidos para la cromatografía en capa delgada

preparativa:

Se preparan soluciones de aminoácidos asi:

Lisina: 18.2mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Tirosina: 10mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Glicina: 9 mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Triptofano: 20.4mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Arginina: 21.4mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Serina: 10.5mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol
Metionina: 15mg en 10ml de acido fórmico al 50% mas unas gotas de butanol

Mezcla de aminoácidos o muestra problema: Esta mezcla será entregada por el profesor
u auxiliar La cual se siembra junto a los patrones para su corrimiento en la placa.

Procedimiento

Curvas de Titulación.

En un vaso de precipitados de 100 ml deposite 8 ml de la solución de aminoácidos (0.1M).

Calibre el pHmetro y determine el pH inicial de la solución. Usando una bureta agregue
HCl 0.1M, adicionando cada vez 0.5 ml y determinando el pH después de cada adición.
Continué agregando ácido hasta pH 1.5 aproximadamente. Registre los valores de pH y de
ácido adicionado (ml).
Lave el electrodo con agua destilada y titule de la misma manera otros 8 mls de la solución
del mismo aminoácido, agregando hidróxido de sodio 0.1M, hasta pH 12,5.
La titulación se debe hacer con un aminoácido polar o apolar. A partir de las curvas de
titulación determine los valores de pK y calcule los puntos isoelectricos de los
aminoácidos.
Separación de aminoácidos por cromatografía de placa delgada preparativa.

 La placa delgada preparativa será entregada por el auxiliar, junto con la mezcla
desconocida de aminoácidos (No tocar la placa con los dedos).
 La mezcla a separarse (aproximadamente 2 ml) se deposita en una línea delgada sobre
un lado de la placa usando un tubo capilar y se desarrolla en una dirección
perpendicular a esta línea de manera que la mezcla se resuelve en bandas.
 A dos centímetros a aproximados de la mezcla siembre los patrones.
 Coloque la lámina en una cámara que contengan solvente en el fondo y que haya sido
saturada previamente.
 Desarrolle la lámina hasta cuando el frente del solvente haya migrado casi hasta el
extremo.
 Seque la lámina en una corriente de aire seco y examine la placa bajo la lámpara de luz
ultravioleta, luego revele una parte de la placa con ninhidrina.
 El adsorbente que contiene las franjas se remueve del plato y luego se extrae con un
solvente polar para recuperar el compuesto orgánico, (aminoácido), que serán
analizados posteriormente.

Identificación de aminoácidos de la muestra problema entregada por el auxiliar.

Para la identificación de aminoácidos de la muestra problema se debe realizar el

raspado de la placa del lado de la siembra de la muestra. Dicho raspado se debe realizar
como el profesor o auxiliar lo indique, de tal manera que una vez obtenido se diluye en
acido fórmico al 65% o en isopropanol ya que estos fueron los solventes usados para la
preparación de los patrones.

 Para el análisis del filtrado obtenido se utilizan las diferentes pruebas de aminoácidos.
(ver diagrama anexo, marcha analítica).

Preguntas

1. Sobre la base de la estructura química de los aminoácidos utilizados, explique por qué se
produce diferente migración en la cromatografía.

2. Registrar en una tabla los resultados obtenidos.

3. Realice las curvas de titulación pH versus meq de HCl y de NaOH agregados .

4. Determine los valores de pK y calcule el pI.

5. Determinar el punto isoeléctrico de la histidina y Arginina

6. Escriba las reacciones químicas características de los L- α aminoácidos.

7. Diga la composición de la sustancia identificada por medio de la extracción realizada a

partir de la cromatografía preparativa.

8. Qué otras técnicas de separación se utilizan en bioquímica para separación de moléculas.

9. Interprete los resultados.

10. Qué resultado hubiera obtenido si la titulación de los aminoácidos se hubiera hecho en
presencia de formaldehído.

11. Cómo prepararía 1 litro de tampón fosfato 0.02 M a pH 7.5 a partir de KH2P04
cristalino y una solución de NaOH 6 M. (Muestre los cálculos y la utilización de la
ecuación de Henderson - Hasselbach

Pruebas cualitativas para las soluciones patrones de aminoácidos preparadas al 0.5%

en agua.

1. Reacción de la Ninhidrina: Coloque 1 ml de solución de aminoácido en un tubo

de ensayo y ajuste el p.H cerca de la neutralidad; agregue 5 gotas de solución de
ninhidrina, deje hervir por 2 minutos y anote sus resultados.

2. Reacción Xantoproteica: Adicione 1 ml de solución de ácido nítrico a

aproximadamente 1 ml de solución de aminoácido, calentar por 2 min, deje enfriar
y observe el cambio de color. Agregue suficiente NaOH al 20% hasta que la
solución sea fuertemente alcalina. El cambio de coloración de amarillo en solución
ácida a naranja brillante en solución álcali constituye un resultado positivo.

3. Reacción de Millon: A 0.5 ml de la muestra adicione 3 gotas del reactivo de

millon y caliente en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Deje enfriar a
temperatura ambiente agregue 5 gotas de solución de nitrito de sodio, la aparición
de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo.
 4. Reacción del Ácido Glioxílico para el Triptófano: A 1 ml de la muestra agregue
1 ml de ácido glioxìlico,. Observe bien el color inicial en cada caso.
Agregue 1 ml de acido sulfúrico por las paredes del tubo, la formación de un anillo
color púrpura indica que la reacción es positiva.

5. Reacción de Sakaguchi: Mezcle 0.5 ml de álcali fuerte con 1.5 ml de solución de

aminoácido y agregue dos gotas de α naftol. Mezcle fuertemente y agregue cuatro a
cinco gotas de agua de bromo. Note el color formado.

2.8. Bibliografía

Lenhninger, Nelson, Cox. Principles of Biochemistry. Worth Publisher. Cuarta edición,

2005.

Bohinki. Addison - Wesley Iberoamericana. Bioquímica. Quinta edición, 1.991.

Plumer, David T. Editorial McGraw – Hill. Bioquímica práctica. 1981.

Linder, Maria C. Nutritional Biochemistry and Metabolism. Segunda edición. 1991

Anzola, Cecilia y López, E. Guías de laboratorio de Bioquímica. Universidad Nacional

de Colombia, Facultad de Ciencias. Departamento de Química , 2005.

Chechetkin, A.V. et al. Practicas de bioquímica del ganado y aves de corral. Editorial
Mir Moscú. 1984.

Millares, Miguel. Manual de prácticas de Bioquímica para instrumentación quirúrgica.

Fundación universitaria de Boyacá.
Prueba Procedimiento Volumen
En un tubo de ensayo colocar:
Sustancia problema 0.5 ml
P. Ninhidrina:
(Hidrato de Reactivo ninhidrina 0.5 ml
tricetohidrindeno Calentar hasta ebullición por 1 min.
al 0.1 %) Deje enfriar y observe
Sustancia problema 0.5 ml
P. Xantoprotéica
Ácido nítrico concentrado (HNO3) 0.5 ml
Mezclar bien
Calentar a la llama y observar
P. Grupos SH Sustancia problema 0.5 ml
Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH) 0.5 ml
Acetato de Plomo 0.5 ml
Mezclar bien
Calentar a la llama por 4 min. Mezclando
continuamente y observar
P. Sakaguchi Sustancia problema 1 ml
Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH) 3 gotas
Naftol 4 gotas
Hipoclorito de sodio al 2 % 5 gotas
Mezcal bien y observar.
P. Hopkins-Cole Sustancia problema 0.5 ml
Reactivo de Hopkins- Cole 1.5 ml
(Preparación: 10 mg de magnesio en 250 ml de
ácido oxálico, se completa a 1litro con agua
destilada)
Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4), se deja caer 0.5 ml
lentamente por las paredes del tubo, observar.
P. Millón Sustancia problema 1 ml
Reactivo de Millón 2 gotas
(Preparación: Hg y HNO3 En una proporción de 1:3,
diluir con 2 volúmenes de agua la solución resultante.