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Appl Microbiol Biotechnol (2010) 86:545-554

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DOI 10.1007/s00253-009-2241-z

ENZIMAS Y PROTEÍNAS BIOTECNOLÓGICAMENTE RELEVANTES

Síntesis de dextranos con cantidades controladas de enlaces α-

1,2 utilizando la transglucosidasa GBD-CD2
Yoann Brison & Emeline Fabre & Claire Moulis &
Jean-Charles Portais & Pierre Monsan &
Magali Remaud-Siméon

Recibido: 21 de junio de 2009 / Revisado: 31 de julio de 2009 / Aceptado: 2 de septiembre de 2009 / Publicado en línea: 16 de octubre de 2009
# Springer-Verlag 2009

El resumen GBD-CD2 es una enzima α-1,2 Universidad de Lille1,

transglucosidasa, obtenida del DSR-E, una glucansucrasa Ciencias y Tecnologías,
59655 Villeneuve d'Ascq cedex, Francia
producida naturalmente por Leuconostoc mesenteroides
NRRL B-1299. Esta enzima cataliza desde la sacarosa, la
α-1,2 transglucosilasa de las variedades de glucosilo en α-
1,6 cadenas de dextrano. Los estudios cinéticos en estado
estable demostraron que las reacciones de hidrólisis y
transglucosilación se producían en la fase inicial de la
reacción en presencia de 70 kDa de dextrano como
aceptador y sacarosa. La reacción de transglucosilación
catalizada por el GBD-CD2 sigue un mecanismo Ping
Pong Bi Bi con un alto valor kcat de 970 s-1. La cantidad
de las cadenas laterales sintetizadas α-1,2 se encontró que
dependía directamente de

Yoann Brison y Emeline Fabre contribuyeron por igual a este trabajo.

Y. Brison : C. Moulis : J.-C. Portais : P. Monsan :
M. Remaud-Siméon (*)
Universidad de Toulouse; INSA, UPS, INP; LISBP,
F-31077 Toulouse, Francia
e-mail: remaud@insa-toulouse.fr

Y. Brison : C. Moulis : J.-C. Portais : P. Monsan :

M. Remaud-Siméon
CNRS, UMR5504,
F-31400 Toulouse, Francia

Y. Brison : C. Moulis : J.-C. Portais : P. Monsan :

M. Remaud-Siméon
INRA, UMR792 Sistemas Biológicos e Ingeniería de
Procesos,
F-31400 Toulouse, Francia

Dirección actual:
E. Fabre
Unidad de Glicobiología Estructural y Funcional,
CNRS UMR 8576, IFR 147,
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la proporción molar inicial [sacarosa]/[dextrano]. Se
sintetizó Dextrans con contenidos de enlace controlados
α-1,2 que van del 13% al 40%. El procedimiento dio
como resultado la producción de dextrans con el mayor
contenido de enlaces α-1,2 jamás reportado.

Palabras clave Mecanismo cinético . Alfa-1,2

transglucosilación . Ping Pong Bi Bi . Glucansucasa de
ingeniería . Dextran

Introducción

La demanda de polisacáridos y oligosacáridos

biodegradables producidos mediante procesos
ambientalmente inocuos a partir de recursos naturales
renovables está aumentando actualmente. La diversidad
natural y la alta complejidad de estas moléculas debido a la
composición de los monómeros, el tipo de enlaces osídicos
y el grado de polimerización hacen que sea difícil su
síntesis por química (Seeberger 2008). La síntesis
microbiana o enzimática in vitro es una alternativa muy
prometedora. Sin embargo, la adaptación de las estructuras
de los polímeros para que cumplan las especificaciones
requeridas para una aplicación específica en los campos de
la alimentación, los piensos, la cosmética, la química o la
medicina sigue siendo una tarea difícil. Los avances en la
sobreexpresión e ingeniería de las enzimas recombinantes
ofrecen nuevas posibilidades para mejorar el rendimiento
de las enzimas. Por ejemplo, se está desarrollando la
ingeniería racional y combinatoria en un intento de
transformar las hidrolasas de glucósidos en enzimas
sintetizadoras (Shaikh y Withers 2008). Entre las hidrolasas
de glucósidos, las glucansucrasas pertenecientes a la familia
de las GH
70 son bastante notables ya que poseen naturalmente una
alta actividad de transferencia (Monchois et al. 1999).
Sintetizan homopolímeros de glucosa a partir de la sacarosa
y sin ningún tipo de azúcares activados por nucleótidos.
Además, estas transglucosinasas también producen
oligosacáridos y glicoconjugados en
la presencia de los aceptantes (Böker et al. 1994; Côté 2009; polimerasa y sólo era capaz de catalizar la reacción de
Robyt y Walseth 1978; Demuth et al. 2002; Hellmuth et al. hidrólisis en presencia de sacarosa sola. Con la sacarosa
2007; Koepsell et al. 1953; Remaud-Simeon et al. 2000). En como donante y los isomalto-oligosacáridos como
función de la especificidad de la glucansucrasa, pueden aceptantes, la hidrolización de la sacarosa -
sintetizarse glucanos y glucoligosacáridos de diferentes
tamaños y tipos de vínculos, lo que permite acceder a una
gran variedad de productos (Remaud-Simeon et al. 2000).
Al utilizar la glucansucasa exocelular de Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-742, se demostró que el porcentaje
de α-1,3 puntos de ramificación en el dextrano puede
modularse variando las condiciones de la reacción (Côté y
Robyt 1983). Además, la ingeniería de la glucansucrasa ha
demostrado recientemente su eficacia para adaptar el
tamaño de los glucanos y modificar la regiospecificidad de
las enzimas (Funane y otros 2005; Hellmuth y otros 2008;
Kralj y otros 2005; Moulis y otros 2006a, b).
Como miembro de las enzimas de la familia GH 70, la
caja de dextranos de L. mesenteroides NRRL B-1299 es
original ya que cataliza, a partir de la sacarosa, la síntesis
de un dextrano muy ramificado, que está compuesto por
una espina dorsal de glucosilo enlazada α-1,6 con un 35%
de unidades de glucosilo enlazadas lateralmente α-1,2
(Seymour y otros 1977; Coutinho y Henrissat 1999;
Remaud-Simeon y otros 1994). En presencia de maltosa
como aceptante, la enzima produce una mezcla de
glucooligosacáridos (Dols y otros 1999). Sin embargo, sólo
el 50% (peso/peso) de los glucooligosacáridos sintetizados
(SGA) poseen una unidad de glucosilo vinculada a α-1,2,
los demás sólo contienen vínculos α-1,6. Debido a la
presencia del enlace α-1,2, poco frecuente en la naturaleza
y muy resistente a las enzimas digestivas, se demostró que
esos SGA poseen propiedades prebióticas, que son de
interés para las aplicaciones en alimentos y piensos
(Boucher et al. 2003; Djouzi et al. 1995; Flickinger et al.
2000; Sanz et al. 2006). Para controlar mejor el contenido
de α-1,2 en glucanos y oligosacáridos, se investigó el
modo de síntesis de los enlaces α-1,2 y α-1,6. Se clonó y
secuenció el gen que codifica la enzima responsable de la
síntesis del dextrano ramificado α-1,2 (Bozonnet et al.
2002). Se caracterizó el producto proteínico denominado
DSR-E. Se descubrió que su capacidad para catalizar tanto
α-1,2 como α-1,6 enlaces glucosídicos estaba relacionada
con una estructura, caracterizada por la presencia de dos
dominios catalíticos (CD1 y CD2) unidos por un dominio
de enlace glucano (GBD). El análisis de secuencias reveló
que ambos dominios pertenecen a la familia GH 70 (Fabre
y otros, 2005). La construcción racional de varias formas
truncadas de DSR-E (es decir, DSR- E-Δ(CD2)) mostró
además que el dominio catalítico CD1 era responsable de la
síntesis de un polímero de dextrano que contenía un 86%
de enlaces α-1,6, un 11% de enlaces α-1,3 y un 3% de
enlaces α-1,4, pero ningún enlace α-1,2. Por otra parte, la
forma truncada del primer dominio catalítico, denominada
GBD- CD2 (Δ(VZ-CD1)-DSR-E), no actuaba como
La actividad de lisis se redujo drásticamente, y el GBD- células TOP10 de Escherichia coli. Las células se
CD2 esencialmente catalizó la reacción de cultivaron a 30°C en el medio de Luria Bertani con
transglucosilación de las moieties de glucosilo mediante ampicilina a una concentración final de 100µg mL-1 a una
la formación de vínculos α-1,2. En consecuencia, la absorbancia a 600 nm (A600 nm) de 0,5. Entonces, el
actividad de transglucosilación α-1,2 del DSR-E se inductor L-arabinosa fue
atribuyó al dominio catalítico adicional CD2 (Fabre y
otros, 2005). Como todos los dominios catalíticos de las
enzimas de la familia GH 70, se predijo que CD2: a)
adoptaría un (β/α)8 plegado de barril, b) poseería una
tríada catalítica compuesta de dos ácidos aspárticos y un
ácido glutámico c) procedería mediante un mecanismo de
retención de α que implicaría la formación de un
intermedio de la enzima β-glucosil.
La capacidad de la GBD-CD2 de sintetizar
específicamente el enlace glucosídico α-1,2 hace que esta
enzima de ingeniería sea particularmente atractiva para la
síntesis de dextranos ramificados α-1,2 y el desarrollo de
nuevos productos prebióticos. El objetivo de este estudio
fue optimizar la reacción de transglucosilación de α-1,2
para controlar la ramificación de α-1,2 de moléculas de
dextrano u oligodextrano ya existentes. Se realizó
primero la cinética de estado estable de la reacción de
transglucosilación α-1,2 en dextrano de 70 kDa, y se
propuso un modelo cinético para esta reacción. Los datos
se explotaron para proporcionar un nuevo método
enzimático para el control de la ramificación α-1,2 del
dextrano.

Materiales y métodos

Clonación y producción de la transglucosidasa GBD-CD2

El gen gbd-cd2 utilizado para el presente estudio

corresponde a una forma truncada (gen eliminado de 1 a
3.994 pb) de dsr-E (número de adhesión AJ430204) de L.
mesenteroides NRRL B- 1299 (Centro Nacional de
Reinserción en la Utilización Agrícola, Peoria, Ill.). El
gen gbd-cd2 se clonó en el vector pBAD/ Thio TOPO®,
TA Cloning® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en
fusión con la secuencia que codifica una etiqueta de
epitopo V5-6xHistidina en el extremo terminal 3′ y una
etiqueta de tioredoxina HP- en el extremo terminal 5′.
Como se informó anteriormente (Fabre y otros, 2005), se
obtuvo una ganancia en la expresión y la actividad tras la
eliminación del tag HP- Tioredoxina. Así pues, la
codificación de la secuencia para la etiqueta HP-
Tioredoxina se eliminó utilizando la enzima de restricción
NcoI. El vector lineal se purificó por electroforesis en un
gel de agarosa al 0,8%, se extrajo del gel utilizando el
QIAquick® GelExtraction Kit (Qiagen, Valencia, CA,
EE.UU.) y luego se autoligó utilizando ADN ligasa T4
(New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.). El gen
es un promotor de PBAD inducible por la L-arabinosa. El gen
clonado en el plásmido pBAD-gbd-cd2 se expresó en las
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...añadida a una concentración final de 0,002%

(peso/volumen). Las células fueron cultivadas durante Ensayo de actividad enzimática
nueve horas adicionales y cosechadas por centrifugación.
Los gránulos se resuspendieron hasta un final A600 nm de Una unidad enzimática se define como la cantidad de
20, en un tampón de acetato de sodio de 20 mM de pH 5,4, enzima que cataliza la ruptura de 1 µmol de sacarosa por
complementado con guanidina-HCl 6 M. El agente tensor minuto
de dina se utilizó para solubilizar los cuerpos de inclusión
después de la disrupción celular por sonicación. El extracto
celular completo se dializó durante la noche para asegurar
la renaturalización de las enzimas, utilizando un tubo de
diálisis de celulosa con corte de 6 kDa (Sigma-Aldrich, St
Louis, MO, EE.UU.) a 4°C en un tampón de acetato de
sodio de 20 mM con pH 5,4. Este extracto dializado se
centrifugó después a 20.000 g, 4°C, durante 20 min para
eliminar los restos celulares. El sobrenadante se utilizó
como fuente de enzimas para la purificación.

Purificación de GBD-CD2

La proteína de fusión GBD-CD2-6xH fue purificada por

cromatografía de afinidad en resina Ni-NTA Superflow
(Qiagen) a 4°C. La solución salina amortiguadora de
fosfatos (PBS) (Na2HPO4,12H2O 20 mM, KH2PO4
20 mM, NaCl
500 mM, pH 7,3) se utilizó con varias concentraciones de
imidazol. Para 1 vol de resina, se realizó la unión para
2 h con 4 vol de extracto de enzimas complementado con
imidazol a 20 mM (pH ajustado a 7,5). La resina se lavó
con 3 vol de tampón PBS que contenía 20 mM de
imidazol. Las proteínas GBD-CD2-6xHis se eluyeron
aumentando la concentración de imidazol en la solución
reguladora de elución de 50, 100, 150 y 200 a 250 mM. Se
utilizó un volumen para cada paso de la elución. La enzima
GBD-CD2 se eluyó con tampones de imidazol de 100 y
150 mM, se recogió y se dializó utilizando un tubo de
diálisis de celulosa de corte de 6 kDa (Sigma-Aldrich)
durante la noche a 4°C en un tampón de acetato de sodio
de 20 mM de pH 5,4. La purificación hasta la
homogeneidad fue controlada por SDS-PAGE (NuPAGE®
3-8% gel de trisacetato 1,5 mm; Invitrogen) y Western-
blotted usando anticuerpos anti 6xHis (C-terminal)
(Invitrogen). La temperatura y el pH óptimos de la
actividad de la GBD-CD2 fueron de 40°C y 5,4,
respectivamente (no se muestran los datos). Los tiempos
de semivida se midieron a 22°C, 30°C y 40°C y
alcanzaron 50 h, 10 h y 15 min, respectivamente (datos no
mostrados). Debido a la débil estabilidad a 40°C, las
velocidades iniciales fueron todas ensayadas a 30°C y pH
5.4. La actividad específica de la preparación enzimática
purificada fue de 61 U/mg de proteínas en las condiciones
estándar de ensayo de la actividad enzimática (véase el
párrafo siguiente). Los ensayos de proteínas se llevaron a
cabo utilizando el protocolo de micro-Bradford con suero
bovino albu- min como estándar.
54
a 30°C en un tampón de acetato de sodio de 20 mM, pH
5,4, con sacarosa y cloruro de calcio en las
concentraciones finales de 292 y 3,4 mM
respectivamente. En presencia de sacarosa como único
sustrato, el GBD-CD2 muestra sólo la actividad
hidrolítica de la sacarosa, produciendo glucosa y fructosa
(Fabre et al. 2005). Así pues, la tasa de consumo de
sacarosa se disuadió mediante la vigilancia de la
liberación de azúcares reductores de la sacarosa utilizando
el método del ácido dinitrosalicílico (Sumner y Howells
1935).
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Se incubaron diversas cantidades de α-1,6 dextranos, de L.
mesenteroides NRRL B-512F, a concentraciones de 62,
309, 463, 1.235 y 2.470 mM (MW 70 kDa; rangos de peso
molecular de 65 a 85 kDa; Sigma-Aldrich), durante 12 h
con sacarosa (292 mM) y GBD-CD2 (1 U/mL) para la
ramificación del dextrano, a 30°C en tampón de acetato
de sodio

Adquisición de datos para la cinética de estado estacionario

El mecanismo GBD-CD2 fue investigado por la cinética

de estado estable. Todas las velocidades iniciales se
midieron a 30°C, en 20 mM de tampón de acetato de
sodio de pH 5,4 suplementado con cloruro de calcio 3,4
mM. Se determinaron a partir de experimentos en los que
las concentraciones iniciales de sacarosa ([Suc]) en el
medio de reacción oscilaban entre 10 y 600 mM y las
concentraciones iniciales de dextrano ([Dex]) de L.
mesenteroides NRRL B-512F (MW 70 kDa; rangos de peso
molecular de 65 a 85 kDa; Sigma- Aldrich) oscilaban
entre 31 y 617 mM. En aras de la claridad, las
concentraciones de dextrano se expresarán como
concentraciones molares de unidades de anhidroglucosilo
dentro del dextrano, dividiendo las concentraciones de
masa de dextrano por 162 g mol-1. Las reacciones se
iniciaron por adición de enzimas a una concentración final
de 0,25 U/mL. A intervalos regulares, se retiraron
muestras y se calentaron inmediatamente a 95°C durante 5
minutos para detener la reacción. Las concentraciones de
glucosa y fructosa liberadas se determinaron mediante
cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), en un
sistema Dionex equipado con una columna de
carbohidratos Aminex HPX-87C (300× 7,7 mm; Bio-rad,
Hercules, CA, EE.UU.), utilizando agua ultrapura como
eluyente a 0,6 mL min-1. La temperatura del horno de la
columna se fijó en 80°C. Las velocidades iniciales de la
hidrólisis de la sacarosa se calcularon directamente a
partir de las tasas de producción de glucosa. Las
velocidades iniciales de transferencia de glucosilo a
dextrano se calcularon a partir de la diferencia entre las
tasas de producción de fructosa y glucosa. Las tasas de
producción de glucosa reflejan la actividad de la
hidrólisis, mientras que las tasas de producción de
fructosa reflejan la actividad de la transglucosidasa α-1,2
más la actividad de la hidrólisis. La determinación de los
parámetros cinéticos y el ajuste de los datos se realizaron
con el programa informático estadístico R (R Devel-
opment Core Team 2005).

α-1,2 ramificación del dextrano, y purificación

20 mM (pH 5.4) complementado con cloruro de calcio
3.4 mM.
Los dextranos 10, 40 y 2.000 kDa (Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) se utilizaron a una
concentración de 300 mM, como se ha descrito
anteriormente para el dextrano 70 kDa. Sacarosa
se midió el agotamiento y la producción de
glucosa/fructosa
se calculó un dextrano diferente, equivalente al porcentaje
de residuos de D-Glcp vinculados α-1,2, a partir de las
intensidades relativas de las correspondientes señales
anoméricas de carbono o protones mediante la integración
de las áreas de los picos, como se indica a continuación:
100 × ðIB þ ICÞ=2
% ofa - 1; 2 ramificación ¼
IA þ IB þ þ IC

por HPLC como se ha descrito anteriormente (véase la

sección anterior).
Luego, excepto en las reacciones en las que se utilizaba
dextrano 10 kDa como aceptador, se añadía etanol al medio
de reacción hasta una concentración final del 50%
(vol/vol). En cuanto a las reacciones que contenían
dextrano 10 kDa como aceptador inicial, la precipitación
de dextrano se llevó a cabo utilizando una concentración
final de etanol del 70% (vol/vol). Tras la precipitación, el
dextrano se recuperó por centrifugación. Los gránulos se
lavaron con 1 vol de agua ultrapura, equivalente al
volumen inicial del medio de reacción, y se precipitaron de
nuevo con un volumen adicional de etanol. Este
procedimiento se repitió cinco veces antes de la
liofilización.
A resonancia anomérica del carbono libre 2, α-1,6
residuos D- Glcp vinculados de la cadena lineal principal
B resonancia anomérica de α-1,6 unió los residuos de D-Glcp
de la cadena lineal principal, con el carbono 2
involucrado en un enlace α-1,2 con una unidad de
glucosilo ramificado
C resonancia anomérica de α-1,2 D-Glcp enlazada (es decir,
puntos de ramificación; Fig. 4b, c y d).
13C
A, B y C podrían ser alternativamente las resonancias
1H
o . El porcentaje de α-1,2 ramificación de la

Análisis de RMN de polímeros

Los dextranos liofilizados se solubilizaron en una

concentración de 0,5 g/l en D2O. Todos los espectros de
RMN se registraron en un espectrómetro Avance 500 MHz
(Bruker) utilizando una sonda TBI de 5 mm de gradiente z.
Los datos fueron adquiridos y procesados usando el
software XWINNMR 3.5. La temperatura fue
343 K. Se registraron los espectros cuantitativos de 13C-NMR
como se ha descrito anteriormente (Dols et al. 1998; Fabre
et al. 2005) utilizando una secuencia de compuerta inversa
tomada de la biblioteca de secuencias de pulsos de Bruker,
y utilizando un pulso de 90°, una anchura de barrido de
25.000 Hz, un retardo de relajación de 2,5 s y un tiempo de
adquisición de 0,63 s. Se registraron un total de 30.000
escaneos. Los espectros de protones se adquirieron
utilizando un pulso de 30°, un ancho de barrido de 12.500
Hz, un retardo de relajación de 2,5 s y un tiempo de
adquisición de 2,0 s. Se registraron un total de cuatro o 16
escaneos.
Las asignaciones de señales se hicieron a partir de
Seymour y Maina (Maina et al. 2008; Seymour et al. 1979;
Seymour y Knapp 1980) y de la comparación de los
espectros de los productos y el aceptador de la reacción de
ramificación. La región anomérica del espectro de
productos de la reacción contenía tres resonancias
principales denominadas A, B y C y que correspondían,
respectivamente, a
donde IB, IC y IA son las intensidades de las resonancias
anómicas. En los cálculos realizados a partir de los
espectros de 1H, las resonancias B y C podrían
intercambiarse sin afectar a la discusión.

Resultados

Estudios cinéticos

A fin de investigar el mecanismo cinético de la

transglucosilación α-1,2 por cinética de estado
estacionario, se incubó la transglucosidasa GBD-CD2 con
sacarosa en concentraciones iniciales que variaban de 10 a
600 mM y 70 kDa de dextrano como aceptador en
concentraciones iniciales de 31 a 617 mM. Durante las
primeras etapas de la reacción (cuando se consumía
menos del 5% de la sacarosa), sólo se identificaron dos
productos de reacción mediante la HPLC: a) la fructosa,
que se liberaba a la misma velocidad que se consumía la
sacarosa, y b) la glucosa, que se producía cada vez menos
a medida que aumentaba la concentración de dextrano.
Las velocidades de hidrólisis inicial (viH) se
obtuvieron directamente midiendo las tasas de producción
de glucosa, y las velocidades de trans-glucosilación (viT)
iniciales α-1,2 se calcularon restando las tasas de
hidrólisis de la sacarosa a las tasas de consumo de la
misma.
Se trazaron los viT y viH observados a concentraciones
fijas de dextrano frente a las concentraciones de sacarosa
(Fig. 1a, b, respectivamente). El viH disminuye
fuertemente a medida que aumentan las concentraciones
iniciales de dextrano. Las variaciones del viT son
contrarias a las del viH, y el viT alcanza un valor máximo
de 235µmol min-1 mg-1 de enzima purificada, a 617 mM
de dextrano y 300 mM de sacarosa. En estas condiciones,
el viT excede 28 veces el valor de viH (8,3 µmol min-
1mg-1 de enzima purificada). Además, el viT disminuye
para concentraciones iniciales de sacarosa superiores a
300 mM, lo que indica una inhibición por la sacarosa. El
viH no se ve afectado por altas concentraciones de
sacarosa. Además, en ausencia de dextrano, las
velocidades iniciales de hidrólisis de la sacarosa se ajustan
a un modelo de Michaelis-Menten con un KmH de 9,7
mM y un VmaxH de 34,1µmol min-1mg-1 de
enzima purificada.

Modelización cinética de la transglucosilación α-1,2

Las gráficas doble recíprocas 1/viT contra 1/[Suc] en fijo

[Dex] y 1/viT contra 1/[Dex] en fijo [Suc] fueron las
primeras
 reacciones inversas 2 y 4. La ecuación de la tasa se
muestra en la Ec. 1.

¼ VmaxT½Suc]½Dex]
vi ð1Þ
T
KmSucT½Dex]þKmDexT½Suc]þ½Suc
]½Dex]

Fig. 1 a Velocidades iniciales para α-1,2 transglucosilación en

presencia de sacarosa (de 10 a 600 mM) y para varias
concentraciones de dextrano de 70 kDa: (círculos llenos) 31 mM,
(círculos vacíos) 62 mM, (triángulos invertidos) 309 mM y
(triángulos) 617 mM (concentraciones de dextrano expresadas en
equivalentes de unidades de anhidroglucosilo). Condiciones de
reacción: pH5,4, 30°C, actividad enzimática 0,25 U/mL. b
Velocidades iniciales para la hidrólisis de la sacarosa en presencia de
ésta (de 10 a 600 mM) y para varias concentraciones de dextrano:
(cuadrados) 0, (círculos llenos) 31, (círculos vacíos) 62, (triángulos
invertidos) 309 y (triángulos) 617 mM (concentraciones de dextrano
expresadas en equivalentes de unidades de anhidroglucosilo).
Condiciones de reacción: pH5,4, 30°C, actividad enzimática
0,25 U/mL

trazados (Fig. 2a, b, respectivamente). Para típica de la representación King-Altman utilizada para el
concentraciones de sacarosa que van de 10 a 300 mM, modelo Ping Pong Bi Bi, la fructosa y las concentraciones
estos gráficos describen dos conjuntos de líneas rectas de α-1,2 dextrano (Dexn+1) se consideraron
paralelas, características de un modelo de Ping Pong Bi Bi suficientemente bajas al principio de la reacción de
(Segel 1993). Sin embargo, el viT disminuye con el abandono
aumento de las concentraciones de sacarosa por encima de
300 mM, indicando así una inhibición por la sacarosa (Fig.
1a). Utilizando el procedimiento King-Altman, derivamos
ecuaciones cinéticas a partir de una variedad de modelos
cinéticos teniendo en cuenta tanto el mecanismo de Ping
Pong Bi Bi (Segel 1993) como la inhibición por la sacarosa
para concentraciones superiores a 300 mM. Sin embargo,
ninguno de ellos encajó correctamente los datos a tan altas
concentraciones de sacarosa. Por lo tanto, el modelado se
restringió a la concentración de sacarosa comprendida
entre 10 y 300 mM. Como se muestra en la Fig. 2c, que es
Fig. 2 a Parcelas doblemente recíprocas obtenidas para la α-1,2
trans-glucosilación considerada para concentraciones de sacarosa
que van de 10 a 300 mM y concentraciones de dextrano de 70 kDa
de (círculos rellenos) 31, (círculos vacíos) 62, (triángulos
invertidos) 309 y (triángulos) 617 mM. Las líneas rectas
corresponden al modelo Ping Pong Bi Bi. Condiciones de reacción:
pH5,4, 30°C, actividad enzimática 0,25 U/mL. b Parcelas recíprocas
dobles obtenidas para la transglucosilación α-1,2 consideradas para
concentraciones de 70 kDa de dextrano iguales a 31, 62, 309 y 617
mM y concentraciones de sacarosa (círculos) 10, (triángulos
invertidos) 20, (triángulos) 30, (cuadrados rellenos) 50, (cuadrados
vacíos) 100 mM y (diamantes) 300 mM. Las líneas rectas
corresponden al modelo Ping Pong Bi Bi. Condiciones de reacción:
pH 5.4, 30°C, actividad enzimática
0,25 U/mL. c Diagrama King-Altman para la transglucosilación α-
1,2 catalizada por GBD-CD2
Donde
VmaxT es la velocidad máxima.
KmSucT y KmDexT son las constantes de Michaelis para
sucrosa y dextrano,
respectivamente. [Suc] y[Dex] son las
concentraciones molares de
sucrosa y dextrano, respectivamente.
Todas las constantes cinéticas se definen según la
nomenclatura de Cleland. Los valores de VmaxT, KmSucT
y KmDexT se evaluaron primero de forma aproximada a
partir de gráficos de doble repetición. Los refinamientos de
los valores y los cálculos del error estándar se realizaron
con el algoritmo nl2sol del software R (Tabla 1). Como se
observa en la Fig. 2a, b, el modelo encajaba bien con los
datos experimentales. Los valores calculados de
VmaxT, KmSucT y KmDexT son 303±5µmol min-1mg-1
de la enzima
ga 970 s-1), 42±2 mM, y 75±3 mM
purificada (k to
(de unidades de anhidroglucosilo dentro del dextrano),
respectivamente.
Cuando se expresa en mM de 70 kDa de dextrano, el valor
de KmDexT es de 0,174±0,008 mM (Tabla 1).
Control del grado de ramificación α-1,2
A medida que la transglucosilación α-1,2 avanza a través
de un mecanismo de Ping Pong Bi Bi, razonamos que
variando la proporción molar inicial [Suc]/[Dex] debería
permitir controlar el porcentaje de ramificación α- 1,2 en
dextrano. Así pues, llevamos a cabo reacciones de
aceptador utilizando una concentración fija de sacarosa
(292 mM) y varias concentraciones de 70 kDa de dextrano
como aceptador. Tras el agotamiento de la sacarosa, se
determinaron los porcentajes de residuos de glucosilo
incorporados en α-1,2 dextranos y subproductos. Como se
muestra en la Fig. 3, todos los residuos de glucosilo se
transfieren al dextrans en bajas proporciones molares
iniciales (es decir, 0,12 y 0,24). En proporciones molares
iniciales más altas [Suc]/[Dex], la formación de la unión α-
1,2 disminuyó, transfiriéndose una mayor parte de los
residuos de glucosilo a la fructosa para producir leucosa
[O-α-D-glucopiranosil- (1→5)-D-fructopiranoside] o
liberándose en el medio que produce glucosa (hidrólisis).
La producción de leucosa aumenta al final de la reacción
debido a la alta concentración de fructosa en el medio.
Tabla 1 Parámetros cinéticos calculados para la transglucosilación α-
1,2 de dextrano catalizada por el GBD-CD2
La constante de laparameter tasa cinética
Fig. 3 Destino principal de las unidades de glucosilo de la sacarosa, al
final de la reacción de ramificación α-1,2, utilizando dextrano de 70
kDa, obtenido para diferentes relaciones molares iniciales
[Suc]/[Dex] (0,12, 0,24, 0,63, 0,95 y 4,74; equivalentes de unidades
de glucosilo; análisis HPLC). De abajo a arriba, unidades de glucosilo
negro en la sacarosa residual, glucosa gris (de la hidrólisis de la
sacarosa), unidades de glucosilo gris oscuro transferidas a la fructosa
(leucosa), unidades de glucosilo blanco transferidas por α-1,2
transglucosyla- tion a α-1,6 70 kDa dextran. Condiciones de reacción:
pH5,4, 30°C,
actividad enzimática 1 U/mL, duración de la reacción 12 h
La cantidad de α-1,2-dos enlaces D-Glcp en el producto de
la reacción del aceptador se determinó por medio de 13C- y
1H-
RMN. Como se ve en la Fig. 4b, el espectro de los
productos de la reacción aceptadora en presencia de
dextrano muestra dos picos adicionales denominados B y
C, situados a 96,2 y 97,0 ppm, respectivamente. Como se
informó anteriormente (Dols y otros 1998; Fabre y otros
2005; Maina y otros 2008; Seymour y Knapp 1980), el
pico B está asignado al C1 de las unidades 1→2,6-α-D-
Glcp-1→6 en cadena lineal (Fig. 4b-d) y el pico C al C1 de
las unidades α-D-Glcp1→2 (llamado C en la Fig. 4b-d).
La intensidad de los picos B y C son equivalentes, lo que
indica que las cadenas laterales están compuestas por una
sola unidad de glucosilo. También se detectaron los picos
de los protones correspondientes a 5,49 y 5,55 ppm,
respectivamente, en los espectros de 1H-NMR (Fig. 4c). El
grado de enlace α-1,2 se determinó entonces a partir de las
intensidades de los carbones anómicos en la 13C- RMN y
también a partir de la de los protones anómicos de los
espectros 1H (Tabla 2). Los dos métodos dieron resultados
muy similares, aunque las mediciones de 1H-NMR dieron
como resultado valores ligeramente inferiores de los
enlaces α-1,2 (Tabla 2). El valor más alto de α-1,2
enlaces (40%) se observó para dextranos ramificados
producidos en una relación molar inicial [Suc]/[Dex] de
4,74. Este valor es sólo un 3% más alto que el calculado
para dextranos sintetizados con una relación molar inicial
[Suc]/[Dex] de 0,95. Indica que el 40% de los enlaces de
ramificación es probable que sea el valor máximo que se
puede alcanzar con GBD-
VmaxT (µmol min-1mg-1 CD2. Este es el porcentaje más alto de conexiones de α-1,2
de enzima purificada) k2k4=ðk2 þ k4Þ303± 5
en dextrans que se ha notificado hasta ahora. El mejor
compromiso
KmSucT (mM)k4ðk-1 þ k2Þ=k1ðk2 þ k4Þ42± 2 entre un alto porcentaje de vínculos α-1,2 y un bajo co
KmDexT (mM de k2ðk-3 þ k4Þ=k3ðk2 þ k4Þ75± 3 El rendimiento del producto se obtiene para una relación
equivalentes de
unidades de
molar inicial [Suc]/[Dex] de 0,63. Usando esta proporción,
k el 69% de las fracciones de glucosilo de
anhidroglucosilo)
la sacarosa se transfiere al dextrano, lo que conduce a un α-
1,2
KmDexT (mM)2ðk-3 þ k4Þ=k3ðk2 þ k4Þ 0.174±0.008
grado de vinculación del 35% (Tabla 2).
Fig. 4 a Utilizando 70 kDa de dextrano como aceptador inicial,
porcentaje de α-1,2 enlaces en dextrano ramificado en función de la
relación molar inicial [Suc]/[Dex] (0,12, 0,24, 0,63, 0,95 y 4.74; en
equivalentes de unidades de anhidroglucosilo); círculos llenos 1H-NMR,
círculos vacíos 13C-NMR. b 13C- Espectros de RMN de las regiones anómeras del
dextrano ramificado α-1,2 en función de la relación molar inicial
[Suc]/[Dex]= 4,74 y del
correspondiente aceptador de dextrano de 70 kDa. c Espectros de 1H-
NMR de
las regiones anoméricas del dextrano ramificado α-1,2 para la
relación de concentración molar inicial [Suc]/[Dex]= 4,74 y del
correspondiente aceptador de dextrano de 70 kDa. d Estructura
esquemática de una zona ramificada del dextrano α-1,2

Para determinar si el peso molecular del dextrano α-1,6 de la sacarosa como la transglucosilación α-1,2 en dextrano
como aceptador podría afectar al contenido del enlace α- a principios de los años 90.
1,2, la reacción del aceptador en presencia de 10, 40 ó
2.000 kDa dextranos se realizó en una proporción molar
inicial [Suc]/[Dex] de 0,95. Todos los productos mostraron
un contenido de enlace similar α-1,2 comprendido entre el
37% y el 39% (13C-NMR; véase el cuadro 2), lo que se
correlaciona con las tasas de transglucosilación calculadas
a partir del análisis con HPLC (no se muestran los datos).

Discusión

Demostramos que el GBD-CD2 catalizó tanto la hidrólisis

etapa de la reacción cuando se incuba con sacarosa y de un enlace α-1,2 o se libera en el medio de reacción
dextrano como aceptador. Teniendo en cuenta que la (hidrólisis). La actividad de la transglucosidasa α-1,2 fue
GBD-CD2 sigue un mecanismo de retención α como las bien modelada por un mecanismo Ping Pong Bi Bi para
otras glucansucrasas de las familias GH 70 y 13, y que la concentraciones de sacarosa que van de 10 a 300 mM. A
reacción procede a través de la formación de un complejo mayores concentraciones de sacarosa, las velocidades
covalente de glucosil-enzima (Jensen et al. 2004; Mooser iniciales disminuyeron. Cuando se introdujeron términos
et al. 1991), este resultado indica que la fracción de para permitir una posible inhibición por la sacarosa, el
glucosil se transfiere al dextrano a través de la formación modelo no encajaba bien con los datos experimentales. Este
Tabla 2 Porcentajes de los
enlaces α-1,2 determinados por Peso molecular del Grado de polimerización Relación inicial % de la % de α-1,2
1H- RMN
y 13C-RMN para α-1,2 dextrano (kDa) (número de unidades de molar vinculación α-1,2 enlace (13C-NMR)
dextranos ramificados glucosilo) [Suc]/[Dex]/mol (1H-NMR)
sintetizados en presencia de 292 ar
mM de sacarosa y dextrano de 10 62 0.95 38 38
diferentes pesos moleculares en 40 250 0.95 37 39
concentraciones que van de 62 a 70 437 4.74 38 40
2.470 mM (concentrados de 70 437 0.95 35 37
dextrano expresados en
equivalentes de unidades de 70 437 0.63 33 35
glucosilo) 70 437 0.24 19 20
70 437 0.12 12 10
2,000 12,500 0.95 36 37

conformación de α- 1,2 dextrans en comparación con el del

puede indicar que por encima de 300 mM, pueden aparecer dextrano inicial puede inducir probablemente cambios de
limitaciones en la transferencia de masa y también puede ser afinidad hacia el sitio activo de la enzima, lo que puede
responsable de la disminución de la velocidad. repercutir en la tasa y la velocidad durante la reacción de
Notablemente, la velocidad de reacción de transglucosilación manera diferente, dependiendo de la relación molar inicial
es mucho mayor que la velocidad de hidrólisis. El kcat de la [Suc]/[Dex]. Este valor corresponde al grado más alto de
transglucosilación es una de las mayores constantes vinculación α-1,2 registrado hasta ahora para el dextrano,
catalíticas (970 s-1) reportadas para las glucansucrasas. A siendo más de un tercio de las unidades α-D-Glcp 1→2,6-α-
modo de comparación, Kitaoka y otros informaron de una D-Glcp-1→6 unidades. Para alcanzar este valor, la
kcat de 641 s-1 para la reacción de polimerización catalizada concentración de dextrano tuvo que reducirse. En estas
por la actividad enzimática de L. mesenteroides B-512FMC condiciones, las moléculas de dextrano no competían
y una kcat de 1.070 s-1 para la transferencia de D- glucosa de la eficientemente con el agua y las moléculas aceptadoras como
sacarosa a la maltosa (Kitaoka y Robyt 1999). Para el ASR la fructosa. Una solución que puede preverse para mejorar
C-del, una variante truncada de la alternansucasa de L. aún más la transglucosilación en el dextrano consistiría en
mesenteroides NRRL 1355, y para el DSR-S vardel Δ4N,
una variante truncada de L. mesenteroides NRRL B- 512F,
los respectivos valores de kcat son 404 (Joucla et al. 2006)
y 584 s-1 (Moulis et al. 2006a). Además, la comparación
para GBD-CD2 entre los valores de KmT para la
sacarosa (42 ± 2 mM) y 70 kDa de dextrano (0,174
±
0,008 mM) indica una afinidad mucho mayor por el
dextrano,
que podría acelerar la deglucosilación del intermediario de
la enzima glucosil-.
Nuestros resultados también demuestran que el grado de
vinculación α-1,2 puede controlarse eligiendo la
proporción molar inicial [Suc]/[Dex] utilizada para la
reacción del aceptador. Esto está totalmente de acuerdo
con un mecanismo de Ping Pong Bi Bi. Variando esta
proporción de 0,92 a 4,74, se obtuvieron dextranos con
grado de α-1,2 ramificaciones que oscilan entre el 10% y
el 40%. Sin embargo, no fue posible alcanzar un porcentaje
de α-1,2 ramificaciones superior al 40%. El cambio de
reduciendo las reacciones competitivas (hidrólisis y trans-
glucosilación en fructosa) por ingeniería enzimática. La
estructura tridimensional del GBD-CD2 ayudaría a
comprender el modo de formación de enlaces α-1,2 a
nivel molecular y el diseño de la enzima guía.
Clásicamente, el grado de ramificación se determina a
partir de análisis de 13C-NMR, para los cuales la alta
resolución espectral proporciona una ventaja para separar
las señales de todos los carbones anómicos (Dols y otros
1998; Fabre y otros 2005; Seymour y Knapp 1980). Aquí
hemos demostrado que las señales de 1H-NMR de los
protones anoméricos de los dextranos ramificados puros
α-1,2 estaban bien separadas con relaciones señal/ruido
mucho más altas que las obtenidas con las señales de 13C.
1H-
RMN demostró ser precisa dentro de un margen de
error del 2-3% (Fig. 4a). Esto es importante con vistas a la
exploración de nuevas actividades de síntesis α-1,2 ya que
sólo se necesitan un par de minutos para registrar los
espectros de 1H-NMR, mientras que se necesitan 26 h para
obtener espectros de 13C-NMR con relaciones señal/ruido
compatibles con la cuantificación.
Por último, el peso molecular del dextrano utilizado
como aceptador no tiene ningún efecto en la cantidad de
enlaces α-1,2 que se forman. La actividad de la α-1,2
transglucosidasa de la GBD-CD2 es por lo tanto
independiente del grado de polimerización del dextrano
(DP), al menos para los dextranos con DP que oscilan
entre 62 y 12.346 unidades de glucosilo.
En conjunto, estos resultados demuestran que tanto el
contenido del enlace α-1,2 como la masa molecular de
dextranos ramificados producidos por el GBD-CD2
pueden ser controlados variando la proporción molar
inicial [Suc]/[Dex]. Esto representa un importante avance
para la producción de dextrano ramificado a medida α-
1,2. Ahora se puede sintetizar un panel mucho más
grande de productos con esta enzima, abriendo así el
camino a nuevas aplicaciones.

Agradecimientos Parte de este trabajo se llevó a cabo en MetaSys -

el Centro de Metabolómica y Fluxómica del Laboratorio de
Ingeniería de Sistemas Biológicos y Procedimientos (LISBP, Toulouse,
Francia) - que cuenta con el apoyo de la Región de Mediodía-
Pirineos (Francia) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional
(FEDER). También reconocemos con gratitud al Pr. Philippe Besse,
Sandrine Laguerre, Dr. Gabrielle
Potocki-Véronèse y Pierre Escalier por su asistencia. Yoann Brison es Jensen MH, Mirza O, Albenne C, Remaud-Simeon M, Monsan P,
apoyado por una subvención de la Région Midi-Pyrénées, Francia. Gajhede M, Skov LK (2004) Estructura cristalina del covalente

Referencias

Böker M, Jördening HJ, Buchholz K (1994) Cinética de la formación

de leucosa a partir de la sacarosa por dextransucosa. Biotechnol
Bioeng 43:856-864
Boucher J, Daviaud D, Simeon-Remaud M, Carpene C, Saulnier-
Blache JS, Monsan P, Valet P (2003) Effect of non-digestible
gluco-oligosaccharides on glucose sensitivity in high fat diet fed
mice. J Physiol Biochem 59:169-173
Bozonnet S, Dols-Laffargue M, Fabre E, Pizzut S, Remaud-Simeon
M, Monsan P, Willemot RM (2002) Caracterización molecular
de la DSR-E, una dextranscriptasa sintetizadora de enlace alfa-1,
2 con dos dominios catalíticos. J Bacteriol 184:5753-5761
Côté GL (2009) Productos aceptados de alternansucrase con gencio-
biosa. Producción de nuevos oligosacáridos para alimentos y
piensos y eliminación del amargor. Carbohidratos Res 344:187-
190
Côté GL, Robyt JF (1983) La formación de enlaces de rama α-D-
(1→3) por una glucansucasa exocelular de Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-742. Carbohidrato Res 119:141-156
Coutinho PM, Henrissat B (1999) Servidor de enzimas activas de
carbohidratos. http://afmb.cnrs-mrs.fr/_cazy/CAZY/index.html
Demuth K, Jordening HJ, Buchholz K (2002) Síntesis de
oligosacáridos por dextranscriptasa: nuevos aceptantes no
convencionales. Carbohydr Res 337:1811-1820
Djouzi Z, Andrieux C, Pelenc V, Somarriba S, Popot F, Paul F,
Monsan P, Szylit O (1995) Degradación y fermentación de alfa-
gluco-oligosacáridos por cepas bacterianas del colon humano:
estudios in vitro e in vivo en ratas gnotobióticas. J Appl
Microbiol 79:117-127
Dols M, Remaud-Simeon M, Willemot RM, Vignon M, Monsan P
(1998) Caracterización de las diferentes actividades de la
dextransucrasa excretadas en el medio de la glucosa, la fructosa
o la sacarosa por Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.
Appl Environ Microbiol 64:1298- 1302
Dols M, Remaud-Simeon M, Willemot RM, Demuth B, Jördening
HJ, Buchholz K, Monsan P (1999) Kinetic modeling of
oligosaccha- ride synthesis catalyzed by Leuconostoc
mesenteroides NRRL B- 1299 dextransucrase. Biotechnol
Bioeng 63:308-315
Fabre E, Bozonnet S, Arcache A, Willemot RM, Vignon M, Monsan
P, Remaud-Simeon M (2005) Role of the two catalytic domains
of DSR-E dextransucrase and their involvement in the formation
of highly alpha-1, 2 branched dextran. J Bacteriol 187:296-303
Flickinger EA, Wolf BW, Garleb KA, Chow JM, Leyer GJ, Johns
PW, Fahey GC Jr (2000) Los oligosacáridos basados en la
glucosa muestran diferentes patrones de fermentación in vitro y
afectan a la digestibilidad aparente de los nutrientes in vivo y a
las poblaciones microbianas de los perros. J Nutr 130:1267-1273
Funane K, Ishii T, Ono H, Kobayashi M (2005) Cambios en la pauta
de vinculación de los productos de glucosa inducidos por la
sustitución de los residuos de Lys en la dextransucrasa. FEBS
Lett 579:4739-4745
Hellmuth H, Hillringhaus L, Hobbel S, Kralj S, Dijkhuizen L, Seibel
J (2007) Síntesis quimioenzimática altamente eficiente de
nuevos tiooligosacáridos ramificados por dirección del sustrato
con glu-canasas. Chembiochem 8:273-276
Hellmuth H, Wittrock S, Kralj S, Dijkhuizen L, Hofer B, Seibel J
(2008) Ingeniería de la reacción enzimática de la glucansucrasa
GTFR y especificidad del enlace glucosídico: hacia productos de
polímeros y oligosacáridos hechos a medida. Bioquímica
47:6678-6684
 intermedio de la amilosacarasa de la Neisseria polysaccharea.
Bioquímica 43:3104-3110
Joucla G, Pizzut S, Monsan P, Remaud-Simeon M (2006)
Construcción de una alternansucasa truncada totalmente activa,
parcialmente eliminada de su dominio carboxital. FEBS Lett
580:763-768
Kitaoka M, Robyt JF (1999) Mechanism of the action of
Leuconostoc mesenteroides B-512FMC dextransucrase: kinet-
ics of the transfer of D-glucose to maltose and the effects of
enzyme and substrate concentrations. Res de carbohidratos
320:183- 191
Koepsell HJ, Tsuchiya HM, Hellman NN, Kazenko A, Hoffman CA,
Sharpe ES, Jackson RW (1953) Síntesis enzimática del
dextrano; especificidad del aceptador e iniciación de la cadena.
J Biol Chem 200:793- 801
Kralj S, van Geel-Schutten IG, Faber EJ, van der Maarel MJ,
Dijkhuizen L (2005) Rational transformation of Lactobacillus
reuteri 121 reuteransucrase into a dextransucrase. Bioquímica
44:9206-9216
Maina NH, Tenkanen M, Maaheimo H, Juvonen R, Virkki L (2008)
Análisis espectroscópico por RMN de exopolisacáridos
producidos por Leuconostoc citreum y Weissella confusa.
Carbohydr Res 343:1446-1455
Monchois V, Willemot RM, Monsan P (1999) Glucansucrases:
mechanism of action and structure-function relationships.
FEMS Microbiol Rev 23:131-151
Mooser G, Hefta SA, Paxton RJ, Shively JE, Lee TD (1991)
Aislamiento y secuencia de un péptido de sitio activo que
contiene un ácido aspártico catalítico de dos alfa-
glucosiltransferasas de Streptococcus sobrinus. J Biol Chem
266:8916-8922
Moulis C, Arcache A, Escalier PC, Rinaudo M, Monsan P, Remaud-
Simeon M, Potocki-Veronese G (2006a) Producción y
purificación de alto nivel de una dextranscriptasa recombinante
totalmente activa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-
512F. FEMS Micro- biol Lett 261:203-210
Moulis C, Joucla G, Harrison D, Fabre E, Potocki-Veronese G,
Monsan P, Remaud-Simeon M (2006b) Understanding the
polymerization mechanism of glycoside-hydrolase family 70
glucansucrases. J Biol Chem 281:31254-31267
R Development Core Team (2005) R: A language and environment
for statistical computing, reference index version 2.4.0. R
Fundación para la Computación Estadística, Viena, Austria.
ISBN 3-900051- 07-0. http://www.R-project.org.
Remaud-Simeon M, López-Munguia A, Pelenc V, Paul V, Monsan
P (1994) Producción y utilización de glucosiltransferasas de
Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 para la síntesis de
oligosacáridos que contienen enlaces α-(1→2). Appl Biochem
Biotechnol 44:101-117
Remaud-Simeon M, Willemot RM, Sarçabal P, Potocki de Montalk
G, Monsan P (2000) Glucansucrasas: ingeniería molecular y
síntesis de oligosacáridos. J Mol Catal B: Enzym 10:117-128
Robyt JF, Walseth TF (1978) The mechanism of acceptor reactions
of Leuconostoc mesenteroides B-512F dextransucrase.
Carbohidrato Res 61:433-435
Sanz ML, Côté GL, Gibson GR, Rastall RA (2006) Influencia de los
enlaces glucosídicos y el peso molecular en la fermentación de
los oligosacáridos basados en la maltosa por las bacterias del
intestino humano. J Agric Food Chem 54:9779-9784
Seeberger PH (2008) Síntesis automatizada de carbohidratos como
plataforma para abordar aspectos fundamentales de la
glicobiología: situación actual y retos futuros. Carbohydr Res
343:1889-1896
Segel IH (1993) Cinética enzimática-comportamiento y análisis de
los sistemas enzimáticos de equilibrio rápido y de estado
estacionario. Wiley, Hoboken
Seymour FR, Knapp RD (1980) Structural analysis of α-D-glucans
by 13C-NMR, spin-lattice relaxation studies. Carbohydr Res
81:67- 103
Seymour FR, Slodki ME, Plattner RD, Jeanes A (1977) Six unusual
Shaikh FA, Withers SG (2008) Teaching old enzymes new tricks:
dextrans: methylation structural analysis by combined G.L.C.-
engineering and evolution of glycosidases and glycosyl trans-
M.S. of per-O-acetyl-aldonitriles. Carbohydr Res 53:153-166
ferases for improved glycoside synthesis. Bioquímica Celular
Seymour FR, Knapp RD, Bishop SH (1979) Correlación de la
Biol 86:169-177
estructura del dextrano con sus espectros 1H-NMR. Carbohydr Res
Sumner J, Howells S (1935) Un método para la determinación de la
74:77-92
actividad de la invertasa. J Biol Chem 108:51-54