Agrobiotecnología

Curso 2007

Vacunas Veterinarias
Andrés Wigdorovitz

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario

Tipos de vacunas Nuevas vacunas Referencias

Agrobiotecnología
Vacunas veterinarias

Tipos de vacunas

Agrobiotecnología
Vacunas veterinarias

Conceptos introductorios
• El objetivo de la vacunación es generar una respuesta inmune protectora de larga duración mediante la estimulación de una respuesta inmune adecuada. • La vacunación reduce la cantidad de agente infectante ante una exposición. Usualmente no se logra inmunidad esterilizante. • Las vacunas pueden ser preventivas o terapéuticas.
Agrobiotecnología
Vacunas veterinarias

• El mercado mundial de vacunas veterinarias alcanza los 2000 millones de dólares anuales.

Características de una vacuna ideal: • Segura • Específica • Protectora • Inmunidad duradera • Debe prevenir la dispersión del patógeno • Aplicación en dosis única • Bajo costo y estable Agrobiotecnología • Fácil de administrar Vacunas veterinarias .

Estas vacunas se basan en un desarrollo racional donde se utiliza la información derivada del estudio de la respuesta inmune que el agente patógeno genera así como de cuales son los antígenos principales. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .Incorporan para su desarrollo tecnologías del ADN recombinante y de purificación de proteínas. • Modernas: . . .Vacunas en medicina veterinaria • Convencionales: .Estas vacunas se desarrollan empíricamente y no se necesita un amplio conocimiento del patógeno y de la respuesta inmune que induce.La gran mayoría de las vacunas licenciadas al presente pertenecen a esta categoría.

Microorganismos muertos (inactivados). .Microorganismos vivos atenuados. .Toxoides bacterianos.Vacunas actuales . Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

irradiación.) .Vacunas inactivadas Inactivados Patógenos Agrobiotecnología Vacunas veterinarias Tratamiento (químico. etc. calor.

Son más seguras que las vacunas basadas en microorganismos atenuados.Son estables. . Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . . . .Son fáciles de producir. .El agente vacunal puede no estar completamente inactivado.No generan una respuesta inmune de larga duración. • Desventajas: .Requieren gran cantidad de antígeno.No generan reacciones adversas debidas al uso de adyuvantes.En las vacunas inactivadas el agente biológico no se replica en el hospedador • Ventajas: .

Vacunas a toxoides Tratamiento químico Toxina bacteriana activa .

Vacunas vivas atenuadas Pasajes sucesivos en distintos hospedadores Patógenos Atenuados .

No requieren adyuvantes. .Requieren una única dosis. .En las vacunas basadas en microorganismos atenuados el agente biológico se replica en el hospedador • Ventajas: .Son eficaces. .Generan una respuesta inmune de larga duración. . • Desventajas: .Requieren cadena de frío para su conservación.El microorganismo puede revertir a una forma virulenta. .La atenuación puede ser excesiva o insuficiente. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Desventajas de las vacunas convencionales (patógeno inactivado/ atenuado) • Inactivación completa • Reactivación de la patogenicidad • No se diferencian vacunados de infectados • Manipuleo del agente infectado durante el proceso de producción • Reacciones inespecíficas con otros patógenos • Reacciones de hipersensibilidad por los inactivantes usados Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Nuevas vacunas Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

• Uso de la tecnología de ADN recombinante. • Aparición de patógenos emergentes. • Patógenos que no se pueden cultivar in vitro Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • Vacunas que combinen las ventajas de las inactivadas (seguridad) y las de organismos vivos modificados (eficacia) . • Nuevas regulaciones de las autoridades sanitarias.¿Por qué nuevas vacunas? • Enfermedades infecciosas donde los métodos tradicionales fallaron. • Uso de técnicas genómicas y proteómicas.

El desarrollo de nuevas vacunas es un área que se nutre de múltiples disciplinas .

Evitar reacciones locales y/o sistémicas. . . • Seguridad: .Identificar nuevos métodos para la producción de vacunas o mejorar los existentes. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • Eficacia: . .Proveer immunidad de por vida.Nuevas vacunas: desafíos para la industria • Innovación: .Evitar efectos negativos en el medio ambiente y otras especies. .Identificar nuevos métodos para la administración de vacunas.Proveer protección cruzada.

Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . • Uso de un modo correcto de presentación del/de los antígeno/s al sistema inmune.Etapas a seguir para el desarrollo de nuevas vacunas • Identificación de los mecanismos efectores protectores de la respuesta inmune. • Elección de antígeno(s) que induzca(n) una respuesta inmune en una amplia mayoría de los individuos a ser vacunados.

• Basadas en plantas recombinantes. • Basadas en virus Vaccinia y Avipoxvirus recombinantes vivos. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • Basadas en ADN (génicas). • Basadas en baculovirus como vectores de presentación de antígenos heterólogos.Estrategias para la obtención de nuevas vacunas • Basadas en bacterias y virus atenuados por modificación genética. . • Basadas en subunidades de antígenos recombinantes. • Basadas en bacterias patógenas atenuadas por modificación genética que expresen antígenos heterólogos de otros patógenos.

Vacunas génicas (a ADN) .Nuevas vacunas • Replicativas: .Subunidades Recombinantes Procariotas Eucariotas Agrobiotecnología Vacunas veterinarias Levaduras Plantas No recombinantes Péptidos sintéticos .Portadas por vectores Virales Bacterianos • No replicativas: .Atenuadas por ingeniería genética: No marcadas Marcadas (DIVA) .

Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .Codificantes para factores de virulencia (generalmente proteínas exportadas) . Los genes candidatos a ser mutados usualmente son: . • Para su liberación al medio ambiente.Vacunas replicativas atenuadas • La estrategia común involucra introducir mutaciones en uno o más genes. la cepa vacunal no debe llevar marcadores de resistencia a antibióticos.Codificantes para proteínas de rutas metabólicas biosintéticas • La metodología involucrada es el reemplazo alélico mediante la recombinación homóloga.

Identificación de genes que codifican proteínas exportadas • El 20% de las proteínas sintetizadas por bacterias se alojan fuera del citoplasma. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • Análisis sistemático de la contribución de proteínas exportadas a la virulencia bacteriana. virulencia. etc. . detoxificación. • Las proteínas exportadas cumplen diversas funciones: captación y transporte de nutrientes. generación de energía. • Identificación y caracterización molecular de genes que codifican proteínas exportadas. división celular. comunicación celular. biogénesis e integridad de membranas. motilidad. transducción de señales.

• La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta cuando la enzima se encuentra fuera del ámbito citoplasmático. .Estrategías utilizadas para la identificar proteínas exportadas • Los genes que codifican proteínas exportadas pueden identificarse mediante fusiones traduccionales al gen de la fosfatasa alcalina (phoA) de Escherichia coli. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • La actividad PhoA se detecta fácilmente utilizando BCIP como sustrato. • El gen reportero phoA utilizado no posee su promotor ni la región que codifica el péptido señal amino terminal.

Actividad de PhoA de acuerdo con la localización subcelular NH2 MEDIO EXTERNO Membrana externa NH2 PERIPLASMA NH2 NH2 NH2 Membrana interna CITOPLASMA NH2 NH2 PhoA enzimáticamente inactiva PhoA enzimáticamente activa Segmento hidrofóbico de transmembrana .

Búsqueda de proteínas exportables Agrobiotecnología Vacunas veterinarias Clonado y expresión de fusiones a PhoA en Escherichia coli CC118 .

Vacunas marcadoras (differentiate infected from vaccinated animals. DIVA) Principio: La vacuna perdió un gen específico que codifica un antígeno inmunodominante. Estas vacunas tienen ventajas diagnósticas. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . El presupuesto es que los animales vacunados no presentarán anticuerpos contra la proteína delecionada. Estas vacunas vienen asociadas a un kit diagnóstico donde el antígeno es la proteína inmunodominante. Sin embargo. sigue siendo protectiva.

DIVA) NUEVAS VACUNAS CONTRA HERPESVIRUS BOVINO TIPO 1: DESARROLLO DE UNA CEPA VIRAL CON PATRÓN ANTIGÉNICO DIFERENCIAL CON RESPECTO AL DE LAS CEPAS CIRCULANTES EN EL CAMPO Situación en la República Argentina: • Cepa circulante de HVB-1 tipo Los Angeles • Seroprevalencia general • 20-70% de animales y 8. en base al virus completo .Vacunas marcadoras (Differentiate Infected from Vaccinated Animals.9% de abortos • Vacunación NO OBLIGATORIA Agrobiotecnología Vacunas recombinantes • Vacuna comercializada actualmente inactivada .

países libres de HVB-1 Dinamarca y Suiza HVB-1-erradicado Restricciones para la comercialización de productos derivados Campañas de control y erradicación actualmente en marcha Vacunación con vacunas marcadoras. Agrobiotecnología Vacunas recombinantes Hasta el momento. DIVA) Importancia económica Comunidad Europea: Suecia. . embriones y ganado en pie. no se realizan planes oficiales de control de la enfermedad. Disposición de la Comunidad Europea (64/432.Vacunas marcadoras (Differentiate Infected from Vaccinated Animals. Finlandia. 86/566)restricción para la comercialización de semen. Mercosur: Brasil y Argentina existe un interés creciente en el desarrollo de nuevas vacunas y evaluación de la situación epidemiológica. Noruega y Austria .

Vectores virales HVB-1 salvaje HVB-1 gE (-) Transmisión reducida dentro del rodeo Agrobiotecnología Vacunas recombinantes Sintomatología Excreción viral Sintomatología reducida o nula Discriminación entre vacunados e infectados .

Vacunas portadas por un vector • El gen que codifica el antígeno es portado por un vector (un virus o una bacteria) que lo presenta al sistema inmune. constituyendo así una vacuna multivalente. • El vector puede presentar varios antígenos heterólogos de interés. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

• Este componente puede estar definido (una proteína específica) o ser una fracción subcelular (membranas celulares). • Usualmente los vectores de expresión son eucariotas (levaduras o plantas). • Es necesario tener presente que se necesita conocer previamente cuales son lo antígenos que inducen una respuesta inmune protectora.Vacunas modernas no replicativas. Vacunas a subunidades • Solamente un componente de un microorganismo es parte de la vacuna. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . • Con las modernas tecnologías se puede expresar un antígeno definido y purificarlo por métodos convencionales. • Existen vacunas tradicionales a subunidades que generalmente son componentes de una fracción subcelular.

Vacunas a subunidades Antígenos de agentes patogénicos involucrados en la generación de respuestas inmunes protectoras Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Vacunas recombinantes Principales etapas en la obtención de una vacuna recombiante Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Vacunas a ADN • Las vacunas a genes representan un novedoso medio para expresar antígenos in vivo para la generación de una respuesta inmune tanto humoral como celular. • Consisten de un plásmido bacteriano que contiene un promotor eucariota fuerte (generalmente viral). el gen de interés que codifica el antígeno y una secuencia de terminación transcripcional y de poliadenilación. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Desarrollo de vacunas a ADN Expresión in vivo en tejido de ratones inoculados con plásmidos control y con plásmidos portadores del gen de la β-galactosidasa Agrobiotecnología Vacunas veterinarias Control negativo Control positivo .

Vacunas a ADN Desarrollo de vacunas a ADN Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Vacunas a ADN Respuesta inmune citotóxica a vacunas a ADN .

Vacunas a ADN Desarrollo de construcciones genéticas que permiten acumular el antígeno en diferentes fracciones celulares Citoplasmática Secretada Anclada a membrana PCMV PCMV PCMV Promotor de citomegalovirus Secuencia de anclaje a membrana Secuencia de exportación .

Existe riesgo de generar tolerancia inmunológica.Aplicable solamente a antígenos proteicos.Existe riesgo de integración del ADN vacunal al genoma del receptor.Pueden desarrollarse aunque el microorganismo no pueda cultivarse . .Generan una respuesta inmune de baja intensidad .Pueden inducir la generación de linfocitos T citotóxicos .Riesgo de integración al genoma de células germinales.Desarrollo de vacunas a ADN • Ventajas: .Se pueden generar vacunas multivalentes • Desventajas: .No requieren cadena de frío .No requieren el cultivo de agentes infecciosos para su producción . . Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . .Simplicidad metodológica .

• En esta estrategia. o bien clonados en vectores para vacunas a ADN e inoculados en este formato. y las proteínas evaluadas como vacunas. todos los marcos de lectura abiertos son clonados y expresados.Impacto de las técnicas genómicas y proteómicas en el desarrollo de vacunas • La “vacunología reversa” es una estrategia derivada de la secuencia de los genomas de microorganismos patogénicos. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

• Se pueden identificar antígenos no expresados in vitro. • Desventajas: • Es necesario disponer de la secuencia genómica completa del agente en estudio. • Es aplicable a agentes no cultivables. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • No es aplicable a antígenos no proteicos.Vacunología reversa • Ventajas: • Se pueden identificar antígenos de escasa abundancia. .

Vacunas no convencionales para incrementar la producción animal • Neutralización de la hormona liberadora de gonadotrofina (GNRH) en vacunos • Inmunización de vacunos contra miostatina • Regulación de la fertilidad en animales de compañía Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .

Evaluar la posibilidad de recombinación con cepas de campo que son similares al microrganismo. .Estabilidad genética (in vitro e in vivo). . . . potencia y eficacia • Efectos en el ambiente y en humanos .Evaluar la posible diseminación (shedding) del organismo a partir del hospedador vacunado y su esparcimiento a especies blanco y no blanco Agrobiotecnología Vacunas veterinarias .Caracterización bioquímica del agente recombinante. .Cambios en el tropismo o virulencia del microorganismo en el hospedador.Requisitos para la aprobación de vacunas recombinantes • Resultados de pureza. seguridad.Evaluar la persistencia en el ambiente.

.Conclusiones • En medicina veterinaria. Sin embargo. durante este período también comenzaran a comercializarse vacunas de nueva generación. más del 90% de las vacunas licenciadas son obtenidas mediante métodos convencionales y se asume que esta situación se mantendrá en la próxima década. • Las agencias regulatorias son cautelosas. • Razones: • Muchas de las vacunas actuales son efectivas. • Los costos para registrar los nuevos desarrollos son muy elevados. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • La sociedad es generalmente conservadora.

vacunas en medicina veterinaria • Los documentos necesarios para el registro de OVM buscan fortalecer la bioseguridad y eficacia de las nuevas vacunas • Los futuros desarrollos incluyen: vacunas de ácidos nucleicos.Conclusiones • Las nuevas tecnologías de generación de organismos vivos modificados (OVM) son un método eficaz en el desarrollo de . epidermal) Agrobiotecnología Vacunas veterinarias • La tendencia actual se orienta a la producción de vacunas no replicativas. . nuevos adyuvantes y vías de administración (oral.

2001. 2001. 2002. Grandi. 1997.Referencias 1. 19:2688-2691. Antibacterial vaccine design using genomics and proteomics. T. 2. Agrobiotecnología Vacunas veterinarias . B. Recent advances and novel strategies in vaccine development. 2003. S. International Immunopharmacology. Rappuoli.M. Trends in Biotechnology. a genome-based approach to vaccine development. Reverse vaccinology. 5. R. L. Vaccine. Overview of Vaccines.A. 8:123134. Green. 3:1195-1204. Old and new vaccine approaches. Babiuk. 4. Ada. 5:483-488. and Baker. and Ben-Yedidia. 19:181-188. 6. Veterinary Journal. Vaccination: a management tool in veterinary medicine. A. R. 2002. Current Opinion in Microbiology. 164:188-201. Molecular Biotechnology. G. 3. G. Arnon.