BIOLOGÍA CELULAR

Profesor: Alejandro Curino

TEMA II: METODOS DE ESTUDIO DE LAS CELULAS Y DE SUS
COMPONENTES MOLECULARES
 MICROSCOPIOS
El limite de resolución del ojo humano, es decir la mínima distancia que tiene que haber entre dos
puntos para ser detectados como tales, es de 0.2 mm. El tamaño de la mayoría de las células está
por debajo de ese límite y por lo tanto se necesita el uso de MICROSCOPIOS para poder observarlas.
La función de estos instrumentos es ampliar una imagen de manera que la retina pueda resolver
puntos que están a distancia menores que ese límite (Cuando menor es el límite de resolución
mayor es el poder de resolución, es decir la capacidad de distinguir dos estructuras distintas como
tales)
Resolución del ojo en comparación con la de distintos tipos
de microscopios

Distancia entre dos puntos que puede resolverse con:

Ojo humano 0,2 mm

Microscopio óptico (MO) 0,2 μm

Microscopio electrónico de transmisión (MET) 1 nm

Microscopio de fuerza atómica 50 pm

Los microscopios ópticos (MO) utilizan la luz y pueden ser simples, si tienen un único sistema de
lentes (lupas), o compuestos cuando tiene múltiples sistemas de lentes. En general sistemas
ocular y objetivo. El microscopio óptico más común es llamado de campo claro, sin embargo
existen otros tipos de microscopio con sistemas ópticos distintos como por ejemplo el
microscopio de contraste de fase, el microscopio de interferencia diferencial de Nomarsky , el
microscopio de fluorescencia, el microscopio laser confocal y el microscopio de fuerza atómica.

1 mm = 103 μm (micrómetros) = 106 nm (nanómetros) = 107 Å (Angstroms) = 109 pm (picómetros)

Cada diagrama muestra una porción de la imagen anterior multiplicada por 10.

¿Hasta que panel podrías ver con el ojo desnudo? ¿Hasta que panel aproximadamente
podrías ver con el microscopio óptico? ¿Y con el electrónico?
 MICROSCOPIO OPTICO

Revolver y
objetivos Ocular

Macrométrico
Portaobjeto Preparado Cubreobjetos Micrométrico

Platina

Fuente de luz
Condensador
 MICROSCOPIO OPTICO

Marcha de los rayos de luz en el

microscopio óptico

Portaobjetos

Fuente
de luz
 La preparación y coloración de la muestra para su observación al MO de campo claro introduce
artefactos, es decir alteraciones que no estaban presentes en la célula o tejido original. Además, si
se está realizando un experimento con células en cultivo no se las puede colorear porque al hacerlo
las células mueren. Por eso es importante el MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE que permite
observar células vivas (en cultivo) y tejidos no teñidos. Este microscopio, y el DE INTERFERENCIA
DIFERENCIAL DE NOMARSKY en una forma más compleja, utilizan el fenómeno de diferencia de
fase que se produce cuando la luz monocromática (un solo color – una única longitud de onda)
atraviesa partes de la célula de diferente grosor y por lo tanto de diferente índice de refracción
(como se ve en la figura de abajo a la izquierda).

Fibroblasto vivo (en cultivo) observado

con distintos tipos de MO
MO de campo claro MO de contraste de fase

Solo la luz Ondas fuera de

Corte de refractada entra fase generan
tejido al objetivo contraste
coloreado

Ondas en
fase

MO de interferencia MO de campo oscuro

diferencial

En el MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO la muestra es iluminada lateralmente y solo penetran en

el objetivo los rayos de luz refractados por la célula, por eso esta última aparece como un cuerpo
brillante contra un fondo o campo oscuro.
Una molécula fluorescente absorbe la luz a una longitud de onda (color) y la emite a una longitud de
onda mayor. Esta última puede ser detectada por un MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Este
microscopio tiene un filtro que deja pasar la luz monocromática (de un solo color) que excita a cada
colorante fluorescente en particular y un espejo dicroico que refleja dicha luz pero deja pasar la luz
de longitud de onda diferente emitida por la molécula fluorescente (y de un color diferente) como se
puede observar en la figura. Usualmente las moléculas marcadoras fluorescentes se utilizan ligadas
a anticuerpos que reconocen proteínas y estructuras celulares específicas (ver más adelante
métodos inmunohistoquímicos e inmunocitoquímicos).

Lente
ocular
3 filtro elimina cualquier
fluorescencia distinta
del verde

2 Espejo refleja la luz de

longitud de onda
inferior al verde y deja
pasar solo la luz verde
1 Filtro deja pasar
Lente objetivo
solo luz azul

Esquema simplificado de la marcha de los rayos en

un microscopio de fluorescencia. En este caso para Fotomicrografía obtenida con el microscopio de
observar el colorante fluoresceína. fluorescencia. Se han utilizado tres marcadores
fluorescentes distintos: verde para los
microtúbulos; azul para los cromosomas y rojo
para los centrómeros.
El MICROSCOPIO LASER CONFOCAL también usa una óptica fluorescente como el microscopio
de fluorescencia pero además se caracteriza por iluminar fuertemente la muestra en un solo punto
(foco) de la misma, para lo cual utiliza un rayo laser y luego detecta solo la luz emitida por ese
único punto, de allí el nombre de confocal. El punto de iluminación se va moviendo en el mismo
plano focal por lo que la muestra va siendo barrida y se observa solamente ese plano.

La muestra La fluorescencia La fluorescencia

fluorescente es emitida por ese emitida por otros
Fotomicrografía obtenida con un microscopio laser
iluminada en un único mismo punto puntos de la
punto focal focal llega al muestra no confocal. Celulas de glioma (tumor del sistema
detector puede alcanzar nervioso) en cultivo. Se utilizó un marcador
el detector fluorescente rojo para los filamentos de actina y uno
verde para una proteína nuclear. Foto obtenida en el
Laboratorio de Biología del Cáncer (INIBIBB-
CONICET).
El MICROSCOPIO ELECTRÓNICO (ME) utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. Como la
longitud de onda del electrón es mucho menor que la longitud de la luz y como el limite de resolución es
proporcional a la longitud de onda, el límite de resolución es aproximadamente 200 veces menor que el de la
microscopia óptica. En lugar de lentes, como en la microscopia óptica, se utilizan electroimanes que guían al
haz de electrones. Ya que los electrones colisionan con las moléculas de aire la muestra debe ser colocada
en el vacío. La imagen se observa en una pantalla o se captura en una placa fotográfica. Existen dos tipos
de microscopios electrónicos, el de transmisión (MET) en el que los electrones atraviesan la muestra y el de
barrido (MEB). Fuente de
Fuente electrones
de luz

Lente o electroimán
condensador

Muestra

Lente o electroimán
objetivo

Lente
ocular Electroimán
proyector

Imagen Imagen vista

vista en pantalla o
directamente placa
fotográfica
Comparación de la marcha de los rayos de luz en un MO Microscopio electrónico de transmisión (MET)
(se muestra invertido) y el haz de electrones en un MET.
Las muestras son fijadas con glutaraldehído y tetróxido de osmio, luego se deshidratan y se incluyen en una resina plástica
especial. El tejido incluido en esta resina se corta con un micrótomo que usa cuchillas de diamante (cortes de
aproximadamente 50 nm). La tinción se realiza con metales pesados que al frenar el paso de los electrones dan un contraste a
la muestra. Las partes de la muestra que han absorbido o dispersado electrones debido a su mayor densidad, o a la adición de
metales pesados, se observan más oscuras ya que hay menos electrones que impriman la placa fotográfica.
En el microscopio electrónico de barrido (MEB) el haz de electrones es enfocado sobre la superficie de
la muestra y se detectan los electrones que son dispersados por dicha superficie. La superficie del
espécimen es cubierta con una capa de material pesado que dispersa mejor los electrones.

Generador o
cañón de
electrones

Electroimán
condensador

Electroimán
objetivo
Microscopio electrónico de barrido MEB
Electrones
dispersados

Espécimen o
muestra

Marcha del haz de electrones en un MEB

Imagen de glóbulos rojos obtenida con el

microscopio electrónico de barrido (MEB)
Imágenes del núcleo y organelas citoplasmáticas obtenidas con el
microscopio electrónico de transmisión (MET)
Imágenes del núcleo y organelas citoplasmáticas obtenidas con el microscopio
electrónico de transmisión (TEM)
En el MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (AFM) una púa muy pequeña y
extremadamente fina en su punta, sostenida por una palanca móvil, recorre una
superficie sumamente lisa donde se ha colocado la muestra. Un rayo laser se refleja
sobre la superficie de la palanca que sostiene la púa. Cuando la púa encuentra una
molécula se levanta cambiando la reflexión del rayo laser. Esto es detectado por un
fotodiodo y la información es enviada a una computadora que utilizando esa
información reconstruye la imagen.

Imagen obtenida con el AFM de

una molécula de ADN que tiene
unida una proteína reparadora
(mancha blanca en el centro de
la molécula).
Resumen de los pasos necesarios para preparar un tejido para su
observación al microscopio óptico (técnica histológica).
Una de las coloraciones más comunes de la técnica histológica es la
hematoxilina y eosina. Abajo se observan dos preparados teñidos con
esta técnica. Los núcleos se tiñen de azul con la hematoxilina y la
mayoría de las proteínas citoplasmáticas con distintos tonos de rojo con
la eosina.

Corte histológico de riñón Corte histológico de intestino

delgado

Procedencia: Laboratorio de Biología del Cáncer (INIBIBB-UNS-CONICET)

Cultivo de células: Las células pueden ser separadas de los tejidos por
medio de enzimas que degradan las proteínas que las mantienen unidas y
luego pueden ser cultivadas, es decir, pueden crecer y divisarse en cajas de
Petri con el medio de cultivo adecuado que provee todos los nutrientes
necesarios y factores de crecimiento que las estimulan a dividirse. Los
cultivos obtenidos directamente de los tejidos se denominan cultivos
primarios.

(A) Cultivo primario de fibroblastos (células del tejido conectivo); (B) cultivo primario
de células de musculares jóvenes fusionándose para dar células musculares adultas;
(C) cultivo primario de neuronas. La foto de la derecha muestra un cultivo primario
proveniente de un tumor de mama de ratón. Se reconocen las células derivadas del
epitelio mamario abajo a la izquierda. El resto son células derivadas del tejido
conectivo del tumor (estroma) Obtenida en el Laboratorio de Biología del Cáncer
(INIBIB-UNS-CONICET). ¿Con que microscopio se están observando estas células?
Las células de estos cultivos primarios dejan de dividirse luego de un número de
mitosis y entran en un estado denominado senescencia. Otros cultivos acortan sus
telómeros (ADN del extremo de los cromosomas) a medida que se van dividiendo
hasta que finalmente mueren por apoptosis (crisis). Por distintos medios las células
pueden ser inmortalizadas y entonces se dividen indefinidamente. En este caso se
denominan líneas celulares. Estas líneas son más fácilmente obtenidas a partir de
tejidos tumorales. Las cajas de Petri con las células se cultivan en estufas de cultivo o
incubadoras que mantienen constantes la temperatura y la concentración de CO2

A la izquierda se observa una estufa de cultivo. En la foto del medio se pueden

observar varias cajas de Petri y otros recipientes de cultivo en el interior de la estufa. A
la derecha se muestra una caja de Petri con medio de cultivo (rojo). En el fondo de la
caja están las células que no se observan a simple vista.
Los métodos INMUNOHISTOQUÍMICOS o INMUNOCITOQUÍMICOS se basan en el reconocimiento
específico de determinados componentes celulares y tisulares (antígenos) utilizando un anticuerpo
(NOTA: los anticuerpos son proteínas producidas por células del sistema inmune (linfocitos B) en respuesta a una
proteína extraña denominada antígeno a la cual se une específicamente).
Los anticuerpos utilizados pueden ser POLICLONALES o MONOCLONALES. Los primeros se obtienen inyectando el
antígeno a un animal (p. ej. conejo). Distintos clones de linfocitos B producen entonces anticuerpos contra distintas
partes de la molécula del antígeno (epitopes). Los monoclonales son producidos por células híbridas (hibridomas)
producto de la fusión de un clon único de linfocitos B y una célula plasmática tumoral. El clon de linfocitos B produce
un único tipo de anticuerpo dirigido contra un solo epitope. La célula tumoral otorga inmortalización celular y la
capacidad de proliferar activamente. Por esto los anticuerpos monoclonales son mas específicos que los
policlonales.
Para reconocer una molécula determinada (antígeno) se utiliza un primer anticuerpo llamado
primario. Luego se reconoce este anticuerpo primario con un anticuerpo secundario específico para
las moléculas de anticuerpo de la especie animal en la que se obtuve el anticuerpo primario (ver
figura abajo).
Anticuerpo dirigido
Anticuerpo obtenido contra anticuerpos
en conejo dirigido de conejo con un
contra el antígeno A marcador acoplado

Como se puede observar en la figura el anticuerpo secundario esta unido a un marcador que permite su
visualización. Si este marcador está unido al anticuerpo primario el método se denomina directo. Si está unido al
secundario (como en la figura) se dice que es indirecto. ¿Cual es la ventaja del método indirecto?
Si se utiliza como marcador un colorante fluorescente, es decir una sustancia que absorbe luz de
una longitud de onda y emite luz con una longitud de onda mayor, la técnica recibe el nombre de
INMUNOFLUORESCENCIA y la observación debe realizarse con el microscopio de fluorescencia.

Inmunofluorescencia de células de glioma (tumor cerebral) mostrando los microfilamentos de actina en rojo y
los núcleos en verde. En este caso se utilizó faloidina, una molécula que se une directamente a la actina y
que esta unida a un fluorocromo o molécula fluorescente (rojo) y un anticuerpo primario que reconoce una
proteína (hemoxigenasa-1) que se quería demostrar que estaba en el núcleo. Este anticuerpo fue detectado
con un anticuerpo secundario obtenido en una especie animal distinta y unido a un colorante fluorescente
(verde). Foto obtenida en el Laboratorio de Biología del Cáncer (INIBIBB-CONICET).
Si el marcador es la enzima peroxidasa de rábano que convierte un sustrato incoloro en producto
coloreado insoluble que precipita en el sitio de la reacción, la técnica se denomina método de la
inmunoperoxidasa o INMUNOHISTOQUÍMICA.

Inmunohistoquímica de un carcinoma mamario utilizando un anticuerpo policlonal que reconoce la enzima

(hemoxigenasa-1). Las zonas donde se ha precipitado el sustrato insoluble, y que indican la presencia de
la enzima, se observan de color marrón. Izquierda: 10X. Derecha: 100X. Fotos obtenidas en el Laboratorio
de Biología del Cáncer (INIBIBB-CONICET).
Para entender como funciona una proteína primero se requiere obtener grandes cantidades puras de
la misma. La primera etapa de la purificación es obtener un homogenado o extracto celular lisando
las células de un tejido o de un cultivo celular.
Lisado de células o tejidos
La primera etapa de Varios Procedimientos mecánicos rompen la El homogenado o extracto
la purificación es membrana plasmática liberando los contenidos celular resultante contiene
romper tejidos o de la célula (homogenización) Acá se muestran moléculas del citosol tales como
células cuatro.. enzimas, metabolitos, ribosomas
y organelas formadas por
membranas.

La membrana se Detergentes suaves

rompe con hacen agujeros en
ultrasonido la membrana

Células
cultivadas
o tejidos

Si se realiza con cuidado la

homogeneización deja
intacta la mayoría de las
Las células son Las células se rompen organelas formadas por
forzadas a pasar haciendo girar un membranas
por un orifico émbolo giratorio
pequeño usando dentro de un tubo de
alta presión vidrio
 Luego el homogenado es sometido a un fraccionamiento celular por centrifugación
utilizando ultracentrífugas (100.000 revoluciones/minuto, 600.000 veces la fuerza de la
gravedad). Deben ser refrigeradas y trabajar en el vacío para evitar el calentamiento del
homogenado. Los rotores pueden ser de ángulo fijo o de brazo giratorio (swingin-arm
rotor)

La ultracentrífuga

Componentes más
pequeños y menos densos

Componentes más grandes

y más densos
Hay varias formas de fraccionamiento celular por centrifugación. Aquí se muestra la
centrifugación diferencial que consiste en realizar repetidas centrifugaciones a
velocidades cada vez más altas (arriba) y la centrifugación en gradientes de densidad
(abajo)

El homogenado es distribuido a
través de un gradiente de
densidad de sacarosa
En el equilibrio los
componentes han migrado a
una región en el gradiente que
coincide con su propia
densidad.

Componentes con baja

densidad de flotación

Componentes con alta

densidad de flotación
Seguidamente la proteína de interés puede purificarse por cromatografía. Una vez obtenida la
fracción celular esta se pasa por columnas cromatográficas que separan proteínas individuales de
una mezcla en base a sus propiedades (tamaño, forma o carga eléctrica).
La mezcla de proteínas se coloca en la parte superior de la
columna que está rellena con una matriz porosa. Se hace
pasar solvente desde arriba hacia abajo en forma
continua. La fracciones que van saliendo por la parte
inferior de la columna son colectadas separadamente. En
la cromatografía de intercambio iónico las proteínas con
carga son retenidas por las cargas opuestas de las
partículas de la matriz. En la de filtración en gel las
proteínas más pequeñas entran en los poros de las
partículas de la matriz y son retenidas por más tiempo. En
la de afinidad las partículas de la matriz están unidas a
moléculas que interactúan específicamente con la
proteína de interés reteniéndolas (p. ej. anticuerpos o
sustrato de una enzima).

Cromatografía de Cromatografía de Cromatografía de

intercambio iónico filtración en gel afinidad
La ELECTROFORESIS es una técnica para separar moléculas de una mezcla por medio de su
migración en un gel dentro de un campo eléctrico. Es una de las técnicas más usadas para estudiar
proteínas y ácidos nucleicos. La velocidad de migración de las moléculas en el gel dependerá de la
relación entre su carga y su masa.

En la electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) las
proteínas son primero desnaturalizadas
con dodecilsufato de Na (SDS) que se une
a las mismas otorgándoles carga
negativa. Los puentes disulfuro se
rompen con mercaptoetanol. La mezcla
es sembrada en los “wells”. La proteínas
más pequeñas migran más rápido en el
gel. El gel debe ser coloreado para
observar las proteínas. En la “calle” de la
izquierda de la fotografía del gel de la
figura se “corrió” un lisado celular y en la
de la derecha una proteína previamente
purificada. Los números a la izquierda del
gel corresponden a estándares de
proteínas de peso molecular conocido
medidos en kiloDaltons (KDa). Luego de
separadas las proteínas pueden ser
extraídas del gel para realizar estudios
posteriores.

Una vez obtenida en forma pura, la estructura primaria de la proteína puede ser obtenida por
métodos bioquímicos o por espectroscopía de masas.
Todos los videos están disponibles en la plataforma Moodle
Para identificar una proteína en particular y observar como varia su expresión en distintas
condiciones, la SDS-PAGE se puede continuar con la técnica de inmunoblot o Western blot. Las
proteínas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa por medio de un campo eléctrico
y luego expuestas a un anticuerpo primario (Ab1) que las reconoce específicamente. Un anticuerpo
secundario (Ab2), unido a una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente, se une al
primario. Al agregar el sustrato esta enzima produce luz y impresiona una placa radiográfica.

A la derecha se observa un inmunoblot para la

proteína HO-1. Un cultivo de células tumorales fue
tratado con un activador de HO-1 (H) por 12, 24 y
48 hs con sus respectivos controles (C). Un
extracto de estas células fue expuesto a SDS-
PAGE y western blot. ¿Cuántos anticuerpos se
usaron? ¿Qué proteínas fueron reconocidas por
esos anticuerpos? (Extraído de Heme Oxygenase-1 has
an antitumor role in breast cancer, Gandini NA, Alonso
EN, Fermento ME, Mascaró M, Abba MC, Coló GP, Arévalo
J, Ferronato MJ, Guevara JA, Núñez M, Pichel P, Curino
AC, Facchinetti MM. Antioxid Redox Signal, 2019).
 Todos los videos están disponibles en la plataforma Moodle
Algunos métodos para manipular y analizar ácidos nucleicos (tecnología del ADN
recombinante) serán estudiados más adelante.