El maltrato infantil se asocia con distintos perfiles

genómicos y epigenéticos en el trastorno de estrés

postraumático
Divya Mehta a, 1 , Torsten Klengel a , Karen N. Conneely b , Alicia K. Smith c , André Altmann a , Thaddeus W. Pace c, d , Monika
Rex-Haffner a , Anne Loeschner a , Mariya Gonik a , Kristina B Mercer e , Bekh Bradley c, f , Bertram Müller-Myhsok a , Kerry J.
Ressler c, e, g , y Elisabeth B. Binder a, c
un b c
Instituto Max Planck de Psiquiatría, 80804 Munich, Alemania; Departamento de Genética Humana, Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Facultad de
d e
Medicina de la Universidad Emory, Atlanta, GA 30322; Winship Cancer Institute, Emory University, Atlanta, GA 30322; Instituto Médico Howard Hughes, Chevy Chase, MD 20815-
f g
6789; Centro Médico de Asuntos de Veteranos, Decatur, GA 30033; y Centro Nacional de Investigación de Primates Yerkes, Atlanta, GA 30322

Editado por Bruce S. McEwen, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, y aprobado el 19 de marzo de 2013 (recibido para revisión el 12 de octubre de 2012)

El maltrato infantil es probable que influya en los procesos biológicos fundamentales y grabe marcas epigenéticas de larga duración, que conducen
a resultados de salud adversos en la edad adulta. Nuestro objetivo fue dilucidar el impacto de diferentes entornos tempranos en la expresión génica
genómica relacionada con la enfermedad y la metilación del ADN en células de sangre periférica en pacientes con trastorno de estrés postraumático
(TEPT). En comparación con los mismos controles expuestos al trauma (n = 108), los perfiles de expresión génica de pacientes con TEPT con
síntomas clínicos similares y exposición de trauma adulto similar pero diferentes eventos adversos infantiles (n = 32 y 29) fueron casi
completamente no permanentes -ping (98%). Estas diferencias en el nivel de transcripciones individuales fueron paralelas por el enriquecimiento de
varias redes biológicas distintas entre los grupos. Además, estos cambios en la expresión génica estuvieron acompañados y probablemente
mediados por cambios en la metilación del ADN en los mismos loci a una proporción mucho mayor en el abuso infantil (69%) frente al grupo que no
usaba solo al abuso infantil (34%). Este estudio es único al proporcionar evidencia de genoma amplio de modificaciones biológicas distintas en el
TEPT en presencia o ausencia de exposición al abuso infantil. Los hallazgos de que las vías biológicas que no se solapan parecen verse afectadas
en los dos grupos de TEPT y que los cambios en la metilación del ADN parecen tener un impacto mucho mayor en el grupo de abuso infantil
podrían reflejar diferencias en la fisiopatología del TEPT, en dependencia de exposición al maltrato infantil. Estos resultados contribuyen a una mejor
comprensión del alcance de la influencia de las diferencias en la exposición al trauma en los procesos fisiopatológicos en los trastornos psiquiátricos
relacionados con el estrés y pueden tener implicaciones para la medicina personalizada.

epigenoma | biomarcadores | psiquiatría | desarrollo

El maltrato infantil es un problema complejo que ejerce enorme impacto sobre los individuos, las familias y la sociedad, y es de gran significación para la

salud pública. Maltrato durante

la infancia probablemente in fl uye en procesos biológicos fundamentales y graba marcas epigenéticas de larga duración, lo que lleva a resultados de
salud adversos en la edad adulta (1). La exposición a eventos adversos de la vida en la infancia no solo se ha relacionado con una mayor
susceptibilidad a una serie de trastornos psiquiátricos, sino también a enfermedades cardiovasculares, diabetes y enfermedad pulmonar crónica,
posiblemente a través de in fl uencias a largo plazo sobre el sistema inmune (2). - 9). Este hallazgo sugiere que las experiencias adversas tempranas no
solo alteran los sistemas neurobiológicos que conducen a un mayor riesgo de trastornos psiquiátricos, sino que también pueden tener un efecto
duradero en varios sistemas de órganos. La experiencia de abuso infantil podría influir en estos sistemas biológicos a través de modificaciones epi-
genética que confieren susceptibilidad de toda la vida a la enfermedad. De hecho, en humanos, se han observado cambios epigenéticos y de expresión
génica en cerebros post mortem de víctimas de suicidio con antecedentes de abuso infantil en comparación con víctimas de suicidio sin antecedentes de
abuso infantil o sujetos control (10).
El traumatismo precoz es un fuerte factor de riesgo para los trastornos psiquiátricos relacionados con el estrés, que se ha demostrado que están
asociados con cambios distintos en la expresión génica y epigenética.
per fi les, tanto en el cerebro como en los tejidos periféricos (11 - 13). El trastorno de estrés postraumático (TEPT) es un ejemplo de un trastorno
común e incapacitante que ocurre después de la exposición a eventos traumáticos potencialmente mortales durante la niñez y la edad adulta. Se ha
demostrado que las personas que experimentan estrés temprano en la vida desarrollan TEPT en la edad adulta con más frecuencia que las personas sin
antecedentes de estrés en la vida temprana (14 - 16) y también tienen más probabilidades de estar expuestos a eventos traumáticos en la edad adulta
(17, 18). El TEPT y otros trastornos relacionados con el estrés pueden ocurrir tanto en presencia como en ausencia de traumas de la vida temprana.
Se ha sugerido que el impacto del trauma puede depender del tipo y el momento de los eventos adversos, y esto a su vez determina las
consecuencias posteriores, como la perturbación de las vías biológicas (19 - 21). Aunque los individuos con trastorno de estrés postraumático, con o
sin una historia de exposición a maltrato infantil cumplen con los criterios de diagnóstico para el mismo trastorno, no está claro si la enfermedad se
asocia con modificaciones biológicas similares.
El objetivo central de este estudio fue buscar evidencias a nivel de todo el genoma de tales enfermedades relacionadas con las modi fi caciones
biológica distintos asociados a la presencia o ausencia de un su-toria de maltrato infantil. Esta meta fue dirigida por In-terrogating la influencia del
trauma primeros años de vida en la expresión de genes y firmas epigenéticos en las células inmunes se producen en pacientes con trastorno de estrés
postraumático como un ejemplo de un trastorno psiquiátrico relacionado con el estrés.
Resultados
En el presente estudio, seleccionamos 169 individuos, todos los cuales habían experimentado al menos dos tipos de trauma además del abuso infantil.
De estos individuos, 108 tenían antecedentes traumáticos pero no tenían antecedentes de TEPT o síntomas actuales de TEPT, y por lo tanto se
consideraron controles expuestos al trauma. Sesenta y un individuos cumplieron los criterios para el TEPT actual, de los cuales 32 informaron un
historial de maltrato infantil y 29 no informaron abuso infantil. Demografía clínicas y epidemiológicas de los participantes a través de los tres grupos
investigados se representan en la Tabla 1. Para el control de las diferencias de grupo significativo fi observados en la edad, sexo, origen étnico, la
gravedad del trauma de adultos, y el abuso de sustancias, estas variables se utilizaron como covariables en la asociación analiza.
Efectos del Maltrato Infantil en Perfiles Transcripcionales Asociados al TEPT. Para evaluar las diferencias de expresión génica entre individuos con trastorno de
estrés postraumático y controles expuestos a trauma, regresión lineal

Contribuciones de los autores: BB, KJR y EBB diseñaron la investigación;DM, TK, AKS, TWP, MR-H., AL y KBM realizaron investigaciones; DM, KNC, AA, MG y BM-M. datos analizados; y DM, TK, KNC,
AKS, AA, TWP, MR-H., AL, MG, KBM, BB, BM-M., KJR y EBB escribieron el documento.
Declaración de conflicto de intereses: KJR tiene un rol no relacionado como cofundador de Extinction Pharmaceuticals para el desarrollo deterapias basadas en N-metil- D -aspartato.
Este artículo es una presentación directa de PNAS.
1
A quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: mehta@mpipsykl.mpg.de.

Este artículo contiene información de respaldo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.

1073 / pnas.1217750110 / - / DCSupplemental .

8302-8307 | PNAS | 14 de mayo de 2013 | vol. 110 | no. 20
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1217750110

Tabla 1. Distribución y comparaciones de variables demográficas y clínicas de las muestras incluidas en el estudio
Comparaciones
Demografía grupales

Valor P Valor P Valor P

PTSD no PTSD + niño
Controles PTSD + niño abuso infantil Controles ~ PTSD + Controles ~ PTSD abuso ~ PTSD no
Muestra (n = 108) abuso (n = 32) (n = 29) abuso infantil sin abuso infantil abuso infantil

Edad - media (DE) 44.23 (1.2) 39.56 (1.8) 43.69 (2.0) 0.059 0.044 0.134
Sexo
Hombres 30 (27.8%) 5 (15.6%) 13 (44.8%) 0.244 0.113 0.023
Mujer 78 (72.25%) 27 (84.4%) dieciséis(55.2%)
Etnicidad
afroamericano 101 (93.5%) 24 (75%) 25 (86.2%) 0.006 0.245 0.343
Otro 7 (6.5%) 8 (25%) 4 (13.8%)
-72 -52
PSS - media (SD) 3.49 (0.32) 35.06 (1.2) 29.83 (1.7) 1.89 × 10 1.14 × 10 0.011
-17 -9
CAPS current - mean (SD) 26.19 (3.3) 112.73 (9.8) 79.71 (10.2) 1.68 × 10 4.46 × 10 0.054
Diagnóstico de TEPT
-32 -26
No 108 (100%) 0 0 2.59 × 10 1.4 × 10 1
Sí 0 32 (100%) 29 (100%)
-24 -18
BDI mean (SD) 8.08 (0.7) 30.13 (2.3) 25.27 (2.1) 2.36 × 10 8.47 × 10 0.128
-32 -9
Abuso infantil (CTQ) - media (DE) 34.35 (1.0) 76.23 (3.5) 37.24 (2.0) 4.69 × 10 0.206 5.15 × 10
No de tipos de abuso infantil
(moderado a severo)
-21 -13
Ninguna 75 (69.4%) 0 29 (100%) 1.19 × 10 0.317 2.54 × 10
Uno 21 (19.4%) 0 0
Dos 12 (11.2%) 32 (100%) 0
-9
Tipos totales trauma de adultos 4.63 (0.23) 7.91 (0.6) 6.49 (0.6) 4.69 × 10 0.005 0.154
(TEI) - media (SD)
Corriente de abuso de sustancias
No 103 (95.4%) 28 (87.5%) 25 (86.2%) 0.111 0.077 0.881
Sí 5 (4.6%) 4 (12.5%) 4 (13.8%)
Tratamiento de PTSD de por vida
-5
No 108 (100%) 24 (72%) 24 (82.8%) 8.9 × 10 0.03 0.352
Sí 0 8 (28%) 4 (17.2%)

modelos fueron construidos para evaluar la influencia del estado de caso en ex-presión per fi les. Un total de 303 transcripciones se expresaron
diferencialmente entre las personas con TEPT con abuso infantil frente a los controles, y 244 transcripciones se expresaron diferencialmente entre las
personas con TEPT sin abuso infantil frente a los controles después de las correcciones para la prueba múltiple ( P ajustado < 0.05) (Fig. 1 y Dataset
S1 ). Se observó una superposición de sólo 14 transcripciones (2%), lo que indica distinta biomarcador pro fi les en trastorno de estrés postraumático
en presencia o ausencia de abuso de niños. Esta superposición no es más de lo esperado por casualidad al azar (valor P exacto de Fisher 's = 0,095).
Post hoc análisis identi- fi ed que sólo el 4% de la diferencialmente expresado transcripciones podría confundirse con el tratamiento de PTSD de por
vida y solo el 1.5% de las transcripciones pueden ser confundidas por diferentes proporciones de tipos de células inmunitarias, lo que sugiere que estos
factores no son factores de confusión importantes en el análisis actual ( Dataset S1 ). Entre las transcripciones dif ferentially expresado, hemos
validado con éxito los cambios de expresión de genes en los grupos correspondientes mediante el uso de PCR cuantitativa (qPCR) en cinco de cinco
transcripciones ensayadas ( Conjunto de datos S2 ).

Correlación de diferencias de expresión génica con metilación de ADN

Cambios Maltrato infantil tiene una influencia sobre biológica procesos a través de modificaciones epigenéticas (22). Para identificar si los anteriores cambios de
expresión de genes se correlacionaron con diferencias de metilación del ADN en loci que codifican estas transcripciones, se investigó la metilación del ADN pro fi
les de los transcritos regulados diferencialmente en cualquiera de los grupos de casos TEPT frente a los controles (n = 547) usando la matriz Illumina 450 k
HumanMethylation. Transcripciones con al menos un CpG dentro de su locus de gen respectivo en la matriz Illumina HumanMethylation 450 k ( n = 304) se
evaluaron las diferencias de metilación en los mismos sujetos probados para las diferencias de expresión génica. Aunque al menos un fi cativamente signi difieren-
entially sitio CpG metilado se identificó en 69,3% de los transcritos únicos a los casos de TEPT con abuso de niños, sólo el 33,6% de los transcritos únicos a los
casos de TEPT sin abuso infantil también mostró diferencias

en el nivel de metilación del ADN para al menos un CpG después de la corrección para pruebas múltiples. Esta diferencia fue aún más acentuada en
las transcripciones para el cual el locus mostró diferencias significativas en la metilación del ADN en cinco o más CpG; aquí, el 11.7% de las
transcripciones mostraron tales diferencias epigenéticas en el grupo de abuso infantil de TEPT, pero este fue solo el caso para el 0.8% de las
transcripciones del grupo de TEPT no dependiente de niños solamente (Fig. 2 A) y B , y Dataset S3 ). Los resultados de la metilación del ADN se
validaron para siete sitios CpG en dos loci distintos usando un método independiente, el Sequenom EpiTYPER ( Dataset S4 ) .
La relación entre la metilación del ADN y la expresión génica es compleja. En línea con otros estudios (23, 24), observamos correlaciones negativas
de CpG con expresión génica cerca de los sitios de inicio de la transcripción y una proporción creciente de correlaciones positivas en sitios reguladores
proximales y distales (Fig. 2 B y Dataset S5 ) .
En comparación con todos los CpG ensayados dentro de los transcritos de ex-presionado diferencialmente, las GPC que también muestran niveles
significativamente dif-rentes metilación signi fi son más a menudo situados cerca de UTR 3 'y en el cuerpo del gen, así como en los estantes de las las
islas CpG y el mar abierto. Además, la gran mayoría de estos CpGs estaban hipermetilados en el grupo de casos (Fig. 2 C ). Además, aunque las
diferencias absolutas en los niveles de metilación entre los grupos son pequeñas (para la mayoría de menos del 5%), la dirección de las diferencias en
la metilación del ADN entre el caso y los grupos de control concuerda en gran medida (73% para individuos CpGs y 94% en el nivel del locus) con las
diferencias grupales observadas en la expresión génica (ver Fig. 3 y Dataset S5 para más detalles).
 Estos resultados indican que los cambios en la expresión génica se asocian más con cambios en la metilación del ADN en el trastorno de estrés
postraumático después del abuso infantil que el trastorno de estrés postraumático en ausencia de abuso infantil, y que estos cambios en la metilación
del ADN pueden mediar el gen observado cambios de expresión

PSICOLÓGICOCIENCIAS
Y COGNITIVAS

Mehta et al. PNAS | 14 de mayo de 2013 | vol. 110 | no. 20 | 8303

Fig. 1. Influencia del abuso infantil en los perfiles de expresión génica en sangre periférica en el TEPT. (A) Diagrama de Venn que representa la superposición de transcripciones
significativamente reguladas diferencialmente entre individuos con trastorno de estrés postraumático y abuso infantil frente a controles expuestos al trauma y personas con trastorno
de estrés postraumático sin abuso infantil frente a controles expuestos al trauma. (B) Mapa de calor de transcripciones expresadas diferencialmente. Se describe el cambio de
expresión de genes en comparación con los controles. La regulación ascendente se representa en magenta y la regulación descendente se representa en verde brillante.

Enriquecimiento de procesos biológicos entre expresiones diferenciales

Transcripciones Como hemos observado diferencias en la expresión de genes per fi les y las marcas epigenéticas en el TEPT se producen en la presencia o En
ausencia de maltrato infantil, intentamos comprender mejor cómo interactúan las transcripciones entre sí. Construimos subredes de las relaciones de transcripción
utilizando un análisis de enriquecimiento fi cada mod-i-gen establecido para identificar las redes sobrerrepresentados en Ariadna Pathway Studio 8.0.

Aunque la anotación funcional reveló vías superpuestas entre los grupos, como la supervivencia celular, el desarrollo celular, la migración celular,
la adhesión celular, la activación de células T y las redes de inmunidad, se observaron varias redes no solapantes entre los grupos. Las diferencias más
notables incluyeron el enriquecimiento del desarrollo del sistema nervioso central y las vías de inducción de tolerancia en el grupo de TEPT con abuso
infantil y las redes de apoptosis y tasa de crecimiento en el grupo de TEPT sin abuso infantil ( Fig. S1). y Dataset S6 ).
 Curiosamente, a pesar de las transcripciones completamente divergentes expresadas diferencialmente entre los dos grupos, varias se superpone a
redes Se identificaron, lo que sugiere un posible efecto aguas abajo común de enfermedad en las células sanguíneas.
Discusión
El objetivo de este estudio fue para interrogar biomarcador per fi les en el nivel de expresión de genes y la metilación del ADN en los individuos con
trastorno de estrés postraumático con o sin abuso infantil. Hemos observado que, aunque robustas diferencias de expresión de genes pueden ser
identificados fi para ambos grupos de TEPT comparación con los controles expuestos al trauma, los cambios significativos apenas se superponen en el
plano fi c transcripción especí (2%) y sólo modestamente (35% ) a nivel de ruta biológica. De hecho, los transcritos expresados diferencialmente en
cada grupo mostraron una regulación altamente variable y, a menudo, el patrón opuesto en el otro grupo respectivo (figura 1). Por otra parte, el grado
de modificaciones epigenéticas (es decir, los cambios de metilación del ADN) con-corriente con estos cambios de expresión génica fueron hasta 12
veces más altos en el grupo de trastorno de estrés postraumático expuestos al trauma de la infancia. Nuestros resultados
implican que las perturbaciones biológicas en individuos con TEPT que tienen un historial de maltrato infantil pueden diferir sistemática y
significativamente de aquellos individuos con TEPT que no tienen un historial de maltrato infantil. Estos hallazgos sugieren que teniendo en cuenta la
exposición al maltrato infantil es de gran importancia en la búsqueda y aplicación de la expresión de genes y la metilación del ADN firmas como
biomarcadores de estrés postraumático y otros trastornos relacionados con el trauma.
A pesar del hecho de que las transcripciones expresadas diferencialmente en cada grupo de PTSD eran distintas, los procesos celulares similares se
enriquecieron en ambos grupos de transcritos, lo que sugiere que estos cambios inicialmente diferentes podrían estar asociados con la perturbación de
las vías biológicas aguas abajo comunes. Por otra parte, varios procesos celulares específico c fueron significativamente sobrerrepresentados sólo
en uno de los grupos de TEPT, lo que indica que las diferentes vías bi-ological tal vez alterados en TEPT con o sin abuso infantil.
Efectos a largo plazo de abuso infantil pueden estar mediados por modificaciones epigenéticas, especialmente los cambios de metilación del ADN
(10, 25, 26). El hecho de que vemos hasta 12 veces más transcripciones expresadas diferencialmente que también muestran diferencias en la
metilación del ADN en el grupo de abuso temprano parece consistente con esta hipótesis e incluso puede sugerir que los mecanismos biológicos que
conducen a las diferencias observadas en la expresión génica son distintos dependiendo del tipo de exposición al trauma. Aunque los cambios medidos
en la metilación del ADN fueron pequeños (98% fueron menos de 5%), el hecho de que observamos la asociación direccional esperada de la
metilación del ADN con la expresión génica en el 94% de los loci (Fig. 3 y Dataset S5 ) sugiere que incluso tales modestas diferencias de metilación
podrían ser de relevancia funcional. Comparación de la metilación del ADN pro fi les entre el cerebro y la sangre se ha demostrado que las diferencias
de metilación del ADN interindividual fueron los más altos en la sangre periférica y, a pesar de que las firmas de metilación varios de ADN eran de
tejido específico, los patrones de variabilidad interindividual fueron consistentes a través de los tejidos, lo que sugiere que la sangre periférica puede
reflejar al menos algunos de los cambios de metilación del ADN en el cerebro (27). Además, un estudio reciente en macacos rhesus demostró que los
cambios de metilación del ADN que se producen en re-SPUE a la adversidad-vida temprana fueron persistentes en la edad adulta y refleja tanto en la
corteza prefrontal y las células T (28). Nuestro hallazgo de que el proceso biológico enriquecido superior en las transcripciones de células sanguíneas
periféricas en el TEPT con traumas infantiles en el desarrollo del sistema nervioso central puede ser una indicación de dicha superposición potencial
de sangre / cerebro.
Los análisis se realizaron utilizando un conjunto común de controles expuestos al trauma, no emparejados por la exposición al maltrato infantil.
Este enfoque permitió la identificación de biomarcadores distinta pro fi les entre los dos grupos de casos. El uso de dos grupos de controles distintos,
pero el trauma emparejado haría más difícil de determinar si las diferencias se originan en el caso o de los grupos de control. Reconocemos que este
enfoque tiene limitaciones y, por lo tanto, realizamos un análisis post hoc utilizando controles pareados con o sin abuso infantil y no vimos ninguna
diferencia en el porcentaje de superposición en genes expresados diferencialmente ( Conjunto de datos S7 ) entre las dos comparaciones de grupos de
casos de TEPT, lo que indica que estos resultados probablemente no sean confundidos por el diseño del estudio. Por otra parte, la comparación de las
transcripciones de fi nir el signa-tura de abuso infantil [por (i) la comparación directa dentro de los casos de TEPT y (ii) la comparación de individuos
con y sin abuso infantil utilizando toda la muestra] con transcripciones significativamente diferentes entre cualquiera de los dos grupos de casos y
controles PTSD mostró una superposición mínima (0.7%), sugiriendo que la firma de expresión génica del PTSD con y sin abuso infantil es distinta de
la firma del abuso infantil dentro de los casos de PTSD ( Dataset S7 ).
Otro factor de confusión potencial de estos resultados es la posibilidad de que la expresión de genes y la metilación del ADN observado pro fi les
sólo son un reflejo de las diferencias en los tipos de células de sangre periférica. La comparación con las transcripciones correlacionadas con la
cantidad relativa de los principales subtipos de células inmunes (CD15 - CD16, CD14, CD4 y CD8) reveló que solo hasta el 1,5% de los transcritos
pueden confundirse con el recuento de células diferenciales. La posibilidad de que

8304 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1217750110 Mehta et al.

UN PTSD + abuso infantil

TEPT sin abuso
segundo Correlacion + ve
infantil 100 Correlacions - ve
2 90

70 veces 80
loci 50 onloca 60
60 70

probado 40
5 veces CpGs / 50
40
30
30
de 20
12 veces de
20
% 10 % 10

0 0
er
1
≥ 1 CpG significativo ≥ 2 CpG significativos ≥ 5 CpG significativos TSS1500 TSS200 5'UTR Exon Cuerpo 3'UTR
Methyla sobre el estado de las CpG
do Probado CpGs CpGs significativos significativas
en el grupo de casos
n = 3958 CpGs n = 458 CpGs de TEPT
Local genómico en 2.5% 0.2% Hiper Hipo
1.5%
er
1 er
Exon 20% 1.7% 2% 1 Exon
15% 13%
Cuerpo 3.7% Cuerpo
41% 6.8% 3.1%
5'UTR 5'UTR
19.2% 10.7% 52% 10.7% 49%
3'UTR 3'UTR
1%
13.8%
TSS200
5.6% 12.8% TSS200
12%
 TSS1500 3% TSS1500

Neighborhood Loca en Hiper Hipo

2%
Isla 13.97% Isla
17.7%
Orillas 29.4% 35.3% 3.71% Orillas

Estantería 44.3% 41.92% Estantería

24.9% 21.18%
Otros/ 8.5% Otros/
Mar abierto Mar abierto
26.8%
13.1% 3.71%
12.7%
0.4%

Fig. 2. Influencia del abuso infantil en la metilación del ADN en sangre periférica en el TEPT. (A) Las diferencias en la metilación del ADN son más frecuentes en el
TEPT con abuso infantil. El gráfico de barras muestra el porcentaje de transcripciones reguladas diferencialmente en las dos comparaciones de grupos respectivos que
tienen una o más, dos o más, o cinco o más CpG metiladas diferencialmente en el locus. Los cambios en la metilación del ADN subyacentes a las diferencias de
expresión génica observadas fueron de 2 a 12 veces mayores en el TEPT con el grupo de abuso infantil en comparación con el TEPT sin grupo de abuso infantil. (B)
Correlaciones de la metilación del ADN con la expresión génica. El gráfico de barras muestra el porcentaje de CpGs con correlaciones positivas vs. negativas con la
expresión génica del transcrito más cercano en la muestra entera estratificada por ubicación con respecto al gen regulado. Correlaciones inversas cercanas a los sitios
de inicio de la transcripción y se observó una proporción creciente de correlaciones positivas en sitios reguladores proximales y distales. (C) Distribución de CpGs
evaluados (paneles izquierdos) y significativos (paneles medios) y dirección de metilación entre todas las CpG metiladas diferencialmente en ambos grupos. Los
paneles de la derecha denotan las distribuciones relativas de todos los sitios CpG probados y significativos con respecto al gen más cercano y las islas CpG y las
direcciones de las diferencias de metilación de los CpG significativos. De los CpG significativos, el 90% estaban hipermetilados y el 10% estaban hipometilados en el
grupo de casos de TEPT con respecto a los controles.

impacto de otros subtipos de células inmune específica, que no están registrados en nuestro análisis puede, sin embargo, no puede excluirse. Por otra
parte, ser causa de los niveles de expresión génica y patrones de metilación solamente se midieron en un punto de tiempo, es difícil concluir si la
expresión y la metilación cambios son de hecho la consecuencia directa de la exposición al abuso infantil per se o una fl re ección de otros factores
modificados por la respuesta al abuso infantil o relacionados con la enfermedad en sí.
A lo mejor de nuestro conocimiento, este estudio de todo el genoma como-sessing la influencia de la exposición al maltrato infantil en la expresión
de genes y la metilación del ADN per fi l en sangre periférica en el TEPT es único. Nuestros hallazgos están de acuerdo con un reciente estudio que
demuestra que las alteraciones epigenéticas en el hipopótamo del campus entre los que cometen suicidio con o sin trauma en la infancia eran distintos
(29), aunque este estudio no exploró los cambios relacionados en la expresión génica. Estos datos proporcionan evidencia adicional de que existen
diferencias sustanciales en las perturbaciones biológicas relacionadas con la enfermedad en presencia o ausencia de exposición a maltrato en la
infancia. El hecho de que varias vías biológicas no solapantes parecen verse afectadas en los dos grupos de TEPT y que los cambios en la metilación
del ADN parecen tener un impacto mucho mayor en el grupo de maltrato infantil puede indicar diferencias en la fisiopatología del TEPT, en
dependencia de

exposición al tipo de trauma Este hallazgo no solo podría tener implicaciones para la investigación de biomarcadores para los trastornos relacionados
con el estrés, sino que podría ayudar a dilucidar las diferencias fisiopatológicas en la dependencia de la exposición al trauma en trastornos inmunitarios
que a menudo acompañan estos trastornos (3, 4, 30, 31). Si estos cambios distintos no se limitan a las células sanguíneas periféricas sino que se
extienden a otros sistemas orgánicos, como lo indican algunos estudios (27, 28, 32), también podrían ayudar en la búsqueda de mecanismos de
enfermedad e intervención terapéutica.
Materiales y métodos
Muestras Los participantes en este estudio pertenecían a un estudio más amplio que investigaba la contribución de factores genéticos y ambientales en el TEPT (33). Todos los
procedimientos del estudio fueron aprobados por las juntas de revisión institucional de la Escuela de Medicina de Emory University y el Grady Memorial Hospital y todos los sujetos
dieron su consentimiento informado por escrito al estudio.
Los 396 participantes se seleccionaron de un estudio más grande, que se ha descrito previamente (34). Los resultados de la expresión del gen de micromatrices se informaron en
un informe previo (34) para un subconjunto de estos pacientes (n = 211). Para este estudio, seleccionamos pacientes de un conjunto ahora ampliado de resultados de expresión
génica de microarrays (agregando 185 nuevas muestras con matrices de expresión génica a las informadas previamente) y ahora también hemos agregado datos de matriz de
metilación de ADN para los 396 individuos.

PSICOLÓGICOCIENCIAS
Y COGNITIVAS

Mehta et al. PNAS | 14 de mayo de 2013 | vol. 110 | no. 20 | 8305

Fig. 3. Dos ejemplos de asociaciones direccionales entre la metilación del ADN y los cambios en la expresión génica. Esta figura muestra la expresión génica y los datos de metilación
del ADN para dos genes, DLC1 (eliminado en el gen del cáncer de hígado 1) y FSCN1 (fascin homolog 1, proteína de unión a la actina). La posición de los CpG significativos en
relación con el gen, las islas CpG y otros CpG en la matriz de metilación de 450 k se encuentran en la parte superior de la serie de diagramas para cada gen (con DLC1 en la parte
superior y FSCN1 en la parte inferior). A continuación, mostramos la diferencia en la expresión génica para la comparación de grupo respectiva (izquierda), la correlación de los niveles
de metilación de un CpG representativo en ese locus con el nivel de expresión del gen en la muestra completa (centro) y las diferencias de grupo en Metilación del ADN de las CpG
significativas en el locus respectivo (derecha). Estos datos ilustran que la dirección de las diferencias en la metilación del ADN y la expresión génica entre los grupos es la esperada
desde la dirección de la correlación entre la expresión génica y la metilación del ADN en la muestra global. * indica un valor P ajustado de menos o igual a 0.05.

Evaluaciones psicológicas Escala sintomática de TEPT y escala de TEPT administrada por el médico. La escala sintomática PTSD modificada (mPSS) se utilizó como una medida de
los síntomas de PTSD (35). Los ítems de frecuencia PSS se sumaron para obtener una medida continua, con valores de más de 20 considerados como síntomas de PTSD
clínicamente significativos. Además, se realizó una clasificación categórica de TEPT utilizando los puntajes de los grupos B, C y D del PSS. Las personas clasificadas como personas
con TEPT tenían que tener síntomas clínicamente significativos en los tres grupos, lo que representa intrusión, evasión / entumecimiento e hiperexcitación (36). La escala de PTSD
administrada por el médico (CAPS) estaba disponible para un subconjunto de 349 de los 396 individuos (37). Hubo una correlación positiva fuerte significativa entre PSS y CAPS
actuales en este conjunto de datos (Pearson r = 0.69, P = 3.15 × 10 -29 ). El CAPS también se usó para evaluar la presencia o ausencia de PTSD de por vida.
Inventario de depresión de beck. El inventario de depresión de Beck (BDI) se administró para medir los síntomas de depresión actuales (38). La depresión actual y los síntomas de
-42
TEPT estaban altamente correlacionados (r = 0.653, P = 1.56 × 10 ). Las pruebas di-agnósticas para el factor de inflación de la varianza y la tolerancia revelaron un factor de
inflación de la varianza de 1,72 y una tolerancia de 0,58, lo que indica que no hay pruebas de multicolinealidad entre los síntomas depresivos y de TEPT.
Abuso de sustancias. Como se describió anteriormente (34), se usaron dos ítems de autoinforme para evaluar los problemas actuales relacionados con el consumo de alcohol y
sustancias.

Mediciones de exposición al trauma Cuestionario de trauma infantil El cuestionario de trauma infantil (CTQ) se usó como una medida de abuso infantil. El CTQ es un inventario
consistente y estable de autoinforme que evalúa cinco tipos de trauma infantil: abuso sexual, físico y emocional y negligencia emocional y física (39). De acuerdo con investigaciones
previas, restringimos nuestros análisis a las tres subescalas de abuso solamente (40). Como se describió anteriormente, los participantes fueron

dicotomizados en dos grupos para cada una de las tres categorías de abuso (presencia o ausencia de abuso físico, sexual o emocional de moderado a severo). Finalmente, creamos
una variable compuesta en los tres tipos de abuso, agrupando a los participantes en (i) aquellos sin exposición a abuso infantil (puntajes menores que el límite para los tres abusos), y
(ii) aquellos con exposición moderada a severa al menos a dos tipos de abuso infantil (puntajes por encima del punto de corte de al menos dos de los abusos).
Inventario de eventos de trauma El inventario de eventos traumáticos (TEI, por sus siglas en inglés) es la medida principal del trauma de abuso infantil en este estudio (41). El número
total de diferentes tipos de trauma entre los participantes se resumió para cada categoría en una variable continua. Aunque el instrumento TEI también incluye la exposición a eventos
traumáticos de abuso infantil en la niñez, la edad media de exposición fue 23.81 (0.70) y; por lo tanto, en el estudio actual esto se refiere principalmente a trauma adulto.

Selección de muestras. De la muestra de 396 descrita anteriormente, 169 personas que habían experimentado al menos dos tipos de abusos infantiles moderados a severos o al
menos otros dos tipos de traumas durante su vida se incluyeron en el análisis para este estudio. De estos, individuos con PSS ≤10 y abuso infantil entre moderado y severo u otros
dos tipos de traumas fueron seleccionados como individuos expuestos al trauma sin antecedentes ni antecedentes de síntomas de PTSD de por vida (controles de trauma) (n = 108) .
De un total de 61 personas con síntomas actuales de TEPT (PSS> 20 y síntomas significativos en todos los grupos PTSD B, C y D), se seleccionaron individuos (i) que habían
experimentado al menos dos tipos de abusos infantiles moderados a severos (n = 32) y (ii) que habían experimentado al menos otros dos tipos de traumas pero no abuso infantil (n =
29).

8306 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1217750110 Mehta et al.

Análisis estadístico. Datos de expresión génica. Los archivos de escaneo de microarrays crudos de las matrices Illu-mina HT-12 v3.0 (Illumina) se exportaron utilizando el programa

Illumina Beadstudio y se cargaron en R para el análisis posterior ( www.R-project.org ). La evaluación de los diferentes pasos de microarrays se realizó utilizando los controles
internos de Illumina. Se excluyeron muestras que eran> 5% SD. Los datos se transformaron y normalizaron utilizando la normalización de estabilización de la varianza (42). Un total

de 15,877 sondas que pasan los criterios de filtro del valor P de detección de sonda de Illumina de <0,01 en 5% de los individuos se usaron para análisis posteriores. Para corregir

los factores de confusión como resultado de los efectos de los lotes, los datos se normalizaron utilizando un método empírico de Bayes para la corrección de lotes (43). La
reproducibilidad de los datos de expresión génica se evaluó utilizando seis pares de réplicas técnicas, obteniéndose correlaciones promedio de Pearson de 0,996. Los modelos
lineales generales se construyeron retrocediendo los perfiles de expresión génica contra el estado del grupo de TEPT y ajustando por sexo, edad, etnia, abuso de sustancias y

tratamiento. La importancia de la asociación se estimó mediante valores P de dos colas utilizando la prueba ANOVA F. Results were corrected for multiple testing by 10,000

permutations using the permutation of regressor residuals test ( http://cran.r-project.org/web/packages/glmperm/index.html ). Briefly, the general linear models for each transcript were
built as described above and the residuals of the regressions were permuted 10,000 times for each transcript using the shuffle-Z method to obtain the empirical P values corrected for
multiple testing as described previously (34).

DNA methylation data. Raw methylation Beta values from the HumanMethylation 450k BeadChip (Illumina) were determined via the Illumina Beadstudio pro-gram and loaded into R.
Internal Illumina controls were used to assess the quality of staining, extension, hybridization, bisulfite conversion, and specificity. Samples with probe detection call rates <90% and
those with an average

1. Szyf M (2011) The early life social environment and DNA methylation: DNA methyl-ation mediating the long-term impact of social environments early in life. Epigenetics 6(8):971–978.
2. Danese A, et al. (2011) Biological embedding of stress through inflammation pro-cesses in childhood. Mol Psychiatry 16(3):244–246.
3. Danese A, et al. (2009) Adverse childhood experiences and adult risk factors for age-related disease: Depression, inflammation, and clustering of metabolic risk markers. Arch Pediatr Adolesc Med
163(12):1135–1143.
4. Danese A, et al. (2008) Elevated inflammation levels in depressed adults with a history of childhood maltreatment. Arch Gen Psychiatry 65(4):409–415.
5. Danese A, Pariante CM, Caspi A, Taylor A, Poulton R (2007) Childhood maltreatment predicts adult inflammation in a life-course study. Proc Natl Acad Sci USA 104(4):1319–1324.
6. Pradhan AD, Manson JE, Rifai N, Buring JE, Ridker PM (2001) C-reactive protein, in-terleukin 6, and risk of developing type 2 diabetes mellitus. JAMA 286(3):327–334.
7. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH (1997) Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med 336(14):973–979.
8. Sin DD, Man SF (2003) Why are patients with chronic obstructive pulmonary disease at increased risk of cardiovascular diseases? The potential role of systemic inflammation in chronic obstructive
pulmonary disease. Circulation 107(11):1514–1519.
9. Widom CS, DuMont K, Czaja SJ (2007) A prospective investigation of major depressive disorder and comorbidity in abused and neglected children grown up. Arch Gen Psychiatry 64(1):49–56.
10. McGowan PO, et al. (2009) Epigenetic regulation of the glucocorticoid receptor in human brain associates with childhood abuse. Nat Neurosci 12(3):342–348.
11. Drury SS, et al. (2012) Telomere length and early severe social deprivation: Linking early adversity and cellular aging. Mol Psychiatry 17(7):719–727.
12. Oberlander TF, et al. (2008) Prenatal exposure to maternal depression, neonatal methylation of human glucocorticoid receptor gene (NR3C1) and infant cortisol stress responses. Epigenetics 3(2):97–
106.
13. Ressler KJ, et al. (2011) Post-traumatic stress disorder is associated with PACAP and the PAC1 receptor. Nature 470(7335):492–497.
14. Bremner JD, Southwick SM, Johnson DR, Yehuda R, Charney DS (1993) Childhood physical abuse and combat-related posttraumatic stress disorder in Vietnam veterans. Am J Psychiatry 150(2):235–
239.
15. Breslau N, Chilcoat HD, Kessler RC, Davis GC (1999) Previous exposure to trauma and PTSD effects of subsequent trauma: Results from the Detroit Area Survey of Trauma. Am J Psychiatry
156(6):902–907.
16. Cougle JR, Timpano KR, Sachs-Ericsson N, Keough ME, Riccardi CJ (2010) Examining the unique relationships between anxiety disorders and childhood physical and sexual abuse in the National Comorbidity Survey-Replication.
Psychiatry Res 177(1-2):150–155.
17. Brewin CR, Andrews B, Valentine JD (2000) Meta-analysis of risk factors for post-traumatic stress disorder in trauma-exposed adults. J Consult Clin Psychol 68(5):748–766.
18. Widom CS (1999) Posttraumatic stress disorder in abused and neglected children grown up. Am J Psychiatry 156(8):1223–1229.
19. Andersen SL, Teicher MH (2008) Stress, sensitive periods and maturational events in adolescent depression. Trends Neurosci 31(4):183–191.
20. Heim C, Newport DJ, Mletzko T, Miller AH, Nemeroff CB (2008) The link between childhood trauma and depression: Insights from HPA axis studies in humans. Psy-choneuroendocrinology 33(6):693–
710.
21. Lupien SJ, McEwen BS, Gunnar MR, Heim C (2009) Effects of stress throughout the lifespan on the brain, behaviour and cognition. Nat Rev Neurosci 10(6):434–445.
intensity value of either <50% of the experiment-wide sample mean or <2,000 arbitrary units (AU) were excluded from further analysis, allowing 163 samples for subsequent analysis.

Unsupervised hierarchical clustering was performed to identify extreme outliers and global trends in methylation. One sample of male DNA was included on each BeadChip as a

technical control throughout the experiment and assessed for reproducibility, with average Pearson correlation coefficient of 0.993 across all replicates. Signals from methylated (M)

and unmethylated (U) bead types were used to calculate a beta value as β = M/(U + M). Hybridization and chip batch effects were accounted for using an empirical Bayes method

(43). The samples were quantile normalized and peak-corrected using the IMA package functions in R (44, 45). Hybridization and chip batch effects were accounted for using an em-

pirical Bayes method (43). Methylation differences were calculated using gen-eralized linear models in R by regressing the β -values against the PTSD group and adjusting for age,

sex, ethnicity, and substance abuse. Results were corrected for multiple testing by 10,000 permutations using the permutation of regressor residuals test ( http://cran.r-

project.org/web/packages/glmperm/index.html ).

ACKNOWLEDGMENTS. The authors thank Maik Koedel and members of the Grady Trauma Project at Emory—particularly Allen Graham, Kimberly Kerley, Jennifer Davis, Angelo
Brown, Alicia Nelson, Jennifer Winkler, Will Holland, Sarah Spann, Kimberly Dement, Dana Goodenough, and Emily Reiser—for excellent technical assistance. This work was
supported by the Max-Planck Society; the Behrens-Weise Foundation (EBB); National Institute of Mental Health Grants MH071537 (to KJR) and MH085806 (to AKS); and the
Burroughs Wellcome Fund.

22. Klengel T, et al. (2013) Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci 16(1):33–41.
23. Brenet F, et al. (2011) DNA methylation of the first exon is tightly linked to tran-scriptional silencing. PLoS ONE 6(1):e14524.
24. Chuang TJ, Chen FC, Chen YZ (2012) Position-dependent correlations between DNA methylation and the evolutionary rates of mammalian coding exons. Proc Natl Acad Sci USA 109(39):15841–15846.
25. Davies MN, et al. (2012) Functional annotation of the human brain methylome identifies tissue-specific epigenetic variation across brain and blood. Genome Biol 13(6):R43.
26. Gunnar M, Quevedo K (2007) The neurobiology of stress and development. Annu Rev Psychol 58:145–173.
27. Sommershof A, et al. (2009) Substantial reduction of naïve and regulatory T cells following traumatic stress. Brain Behav Immun 23(8):1117–1124.
28. Provençal N, et al. (2012) The signature of maternal rearing in the methylome in rhesus macaque prefrontal cortex and T cells. J Neurosci 32(44):15626–15642.
29. Labonté B, et al. (2012) Genome-wide epigenetic regulation by early-life trauma. Arch Gen Psychiatry 69(7):722–731.
30. Smith AK, et al. (2011) Differential immune system DNA methylation and cytokine regulation in post-traumatic stress disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 156B(6):700–708.
31. Uddin M, et al. (2010) Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci USA 107(20):9470–9475.
32. Lee RS, et al. (2011) A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology (Berl) 218(1):303–312.
33. Gillespie CF, et al. (2009) Trauma exposure and stress-related disorders in inner city primary care patients. Gen Hosp Psychiatry 31(6):505–514.
34. Mehta D, et al. (2011) Using polymorphisms in FKBP5 to define biologically distinct subtypes of posttraumatic stress disorder: Evidence from endocrine and gene ex-pression studies. Arch Gen
Psychiatry 68(9):901–910.
35. Foa EB, Tolin DF (2000) Comparison of the PTSD symptom scale-interview version and the clinician-administered PTSD scale. J Trauma Stress 13(2):181–191.
36. Jovanovic T, et al. (2010) Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety 27(3):244–251.
37. Blake DD, et al. (1990) A clinician rating scale for assessing current and lifetime PTSD: The CAPS-1. Behav Therapist 13:187–188.
38. Beck AT, Ward CH, Mendelson M, Mock J, Erbaugh J (1961) An inventory for mea-suring depression. Arch Gen Psychiatry 4:561–571.
39. Bernstein DP, et al. (2003) Development and validation of a brief screening version of the Childhood Trauma Questionnaire. Child Abuse Negl 27(2):169–190.
40. Bradley RG, et al. (2008) Influence of child abuse on adult depression: Moderation by the corticotropin-releasing hormone receptor gene. Arch Gen Psychiatry 65(2):190–200.
41. Hovens JE, Bramsen I, van der Ploeg HM, Reuling IE (2000) Test-retest reliability of the trauma and life events self-report inventory. Psychol Rep 87(3 Pt 1):750–752.
42. Huber W, von Heydebreck A, Sültmann H, Poustka A, Vingron M (2002) Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of dif-ferential expression. Bioinformatics
18(Suppl 1):S96–S104.
43. Johnson WE, Li C, Rabinovic A (2007) Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics 8(1):118–127.
44. Dedeurwaerder S, et al. (2011) Evaluation of the Infinium Methylation 450K tech-nology. Epigenomics 3(6):771–784.
45. Wang D, et al. (2012) IMA: An R package for high-throughput analysis of Illumina's 450K Infinium methylation data. Bioinformatics 28(5):729–730.
 PSYCHOLOGICALCOGNITIVE
AND SCIENCES

Mehta et al. PNAS | May 14, 2013 | vol. 110 | no. 20 | 8307

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