Universidad de las Fuerzas Armadas

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Extracción de macrófagos, esplenocitos, células de la médula ósea de modelos
murinos
Jonathan Calvopiña, Marbel Torres

Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura, Carrera de Ingeniería en Biotecnología,

Laboratorio Multidisciplinario, Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, Sangolquí,
Ecuador

Keywords: Macrófagos, esplenocitos, PBMC, cámara de neubauer y tioglicolato

Abstract
Los modelos de animales ayudan a la investigación de nuevas terapias en seres humanos, pues comparten
características genéticas, anatómicas, biológicas, etc., además son de fácil control. Los modelos murinos
en particular son ampliamente utilizados en el análisis inmunológico. Los modelos murinos permiten
estudiar a células como macrófagos esplenocitos y PBMCs, con la utilización de tioglicolato. El objetivo
de estudio es la cuantificación de macrófagos, esplenocitos y PMBS como respuestas del sistema inmune
en modelos murinos. Para esto se obtuvieron 9 ratones hembras de raza BALB/c. Se sacrificaron por
dislocación cervical 4 animales en el día 8; se inoculó con tioglicolato 5 ratones y se utilizaron para
extracción y conteo celular en el día 16. Después del sacrificio se realizó la necropsia y remoción de órganos
para recolección de datos. Finalmente se extrajeron macrófagos peritoneales, esplenocitos y PMBCs, y se
tiñeron con azul de tripán. El conteo se realizó en cámara de neubauer; el porcentaje de adherencia de los
macrófagos se pudo observar mediante un microscopio invertido. Se observo una disminución de peso en
las líneas de interacción de los ratones de acuerdo a su jaula y a cada ensayo realizado, la tasa de
supervivencia solo se vio afectada por los sacrificios. Los intestinos de los ratones fueron los que más
variaron en tamaño con relación con su intestino como era lógico. El conteo celular dio un total de 1.3𝑥108
esplenocitos/mL, 1.54𝑥108 PBMCs/mL y un 25,72% de adherencia de macrófagos. La inoculación con
tioglicolato puede causar estragos físicos en ratones como pérdida de peso, o la inflamación de órganos,
porque estimula la respuesta inflamatoria, pero todos estos efectos son temporales y no peonen en riesgo la
vida de los ratones. El uso de tioglicolato como agente inflamatorio permite estudiar la respuesta inmune
en distintos tejidos como bazo, médula ósea y peritoneo, pues estimula su activación.

Video Link
https://drive.google.com/drive/u/1/folders/1FKXw5wKAC6bUvWuysArSLLJ0I1J2Pa2O

Introduction
Los modelos animales comparten muchas características genéticas con los seres humanos y mediante el
estudio de la fisiología, anatomía y metabolismo se logra obtener una visión del funcionamiento del ser
humano para el desarrollo de nuevas terapias (Kitada, Ogura, & Koya, 2016 ). Los animales son
biológicamente similares a los humanos, por eso su uso en la investigación, además de presentar una vida
útil corta, es fácil su control en el ambiente en el que se desarrollen mediante la manipulación de la dieta,
temperatura, humedad, considerándolo un modelo versátil en el estudio de enfermedades (Venugopalan &
Reddy, 2016). Los murinos siguen siendo un modelo muy potente y popular para el análisis inmunológico
frente a patógenos específicos, ya que la creación de pequeñas alteraciones en el genoma, al azar o en
regiones específicas, es un mecanismo eficaz para el estudio de las bases de los procesos inmunológicos
(Rajewsky, 2007 ). Toda investigación que use modelos animales debe estar en función de un marco ético
y legal. “Las tres R, es el principio que regula la experimentación en animales que incluye: reemplazar, es
decir, sustituir siempre que sea posible la experimentación en seres vivos por cualquier otro método,
siempre que los resultados finales sean equivalentes, reducir, disminuir al máximo el número de animales
utilizados y el número de experiencias para conseguir los fines científicos esperados y por último, refinar,
enfocado en la utilización de métodos para disminuir el dolor y el malestar a los que puede estar sometido
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el animal durante las experiencia, sin embargo, en la actualmente se habla de la cuarta R que hace referencia
a Reportar toda la información obtenida en el transcurso de la investigación (Mármol Carrera, 2004). Otro
de los soportes que el investigador debe tener en cuenta en el manejo de animales es el código de Helsinki,
que se enfoca en el principio de beneficio, es decir, mayor beneficio que riesgo, además de la competencia
y experticia del investigador (Gispert, 2005 ).

La investigación en modelos murinos puede realizarse a nivel inmunológico estudiando células como
macrófagos esplenocitos y células monucleares de sangre periférica (PMBCs). Existen diversos
mecanismos que permiten obtener la concentración celular por volumen de líquido, entre estos se encuentra
el conteo directo de células en cámaras de recuento. La cámara de Neubauer permite realizar el conteo en
microscopio y se puede usar tanto en campo claro como en contraste de fases, para esto la cámara cuenta
con cuadrantes que facilitan el conteo celular. El procedimiento es relativamente sencillo donde el líquido
se pone entre la cámara y el cubre objetos y se llena por capilaridad, una vez colocada la muestra se procede
a realizar el conteo (Ruiz-Argüelles, 1994).

El objetivo del estudio es la cuantificación de esplenocitos, PMBCs y determinar el porcentaje de

adherencia de los macrófagos como respuesta del sistema inmune en modelos murinos.

Protocol

1. METODOLOGÍA

Metodología general esquematizada en Figura 1.

Figura 1 Metodología general esquematizada.

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1.1 Animales
Se trabajó con 9 ratones hembras de raza Balb/c, de edad heterogénea nacidos en el año 2019
y peso heterogéneo. Los ratones estuvieron en un período de luz/oscuridad estándar (12 horas
luz/12 horas oscuridad), alimentación y agua proporcionado regularmente en su jaula de
contención lo que duro el ensayo.

1.2 Marcaje, pesado y estimulación

Todos los ratones fueron pesados sobre un frasco ubicado en la balanza analítica, el marcaje
fue realizado en la cola mediante franjas con marcador permanente. Finalmente, se los
estimuló con 0.2 ml de tioglicolato estéril por vía intraperitoneal, sujetándolos bien para no
causar dolor ni perforar ningún órgano. De los 9 murinos, se realizó el ensayo de
inmunización con 5 ratones, los 4 restantes se los sacrifico para medición de sus órganos.

1.3 Dislocación cervical

Se situó en la mesa una rejilla para que el ratón se sujete, con el mango del bisturí sobre el
cuello del animal y la otra mano sujetando la cola se tiró con fuerza mientras se presionaba el
cuello para romper todas las conexiones entre la cabeza y la médula espinal, en caso que el
ratón no se sujete se recomienda dar vueltas para desorbitarlo y que pueda sujetarse a la rejilla.

1.4 Necropsia
Se colocó al ratón de espaldas sobre el papel aluminio esparciendo alcohol al 70% en la zona
abdominal para desinfectar el área, con las tijeras se hizo un pequeño corte en la piel del ratón
a la altura del abdomen (en el cuadrante inferior) para retirar la piel.

1.5 Extracción de órganos

Una vez retirada la piel, se comenzó a extirpar todos los órganos, el primer órgano fue el
intestino evitando dañar los ganglios linfáticos mesentéricos, se midió y se colocó en forma
de rollo suizo, de la región media izquierda del ratón el bazo, de la parte central izquierda y
derecha ubicados en la parte posterior los riñones. Se continuó con la cavidad superior, es
decir, la cavidad torácica, como son los pulmones y el corazón. Finalmente, el cerebro
teniendo cuidado al remover la corteza que le cubre.

1.6 Recolección de macrófagos

A los 8 días de la estimulación, 5 ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se
realizó un lavado peritoneal con 10 ml de RPMI para la recuperación de las células. Se
recolectó la mayor cantidad de líquido posible, evitando la perforación de algún órgano para
no aspirar sangre y evadir la contaminación. La solución recuperada se centrifugó a 1500
rpm por 5 minutos recuperándose el pellet y re suspendiéndolo en 5 ml de RPMI. La solución
fue colocada sobre una caja Petri, e incubada por 2 horas a 37 °C para permitir la adherencia
de los macrófagos, y ser observada en el microscopio invertido a 40X.

1.7 Recolección de esplenocitos

El sacrificio de los ratones se efectuó por dislocación cervical a los 21 días después de la
estimulación con tioglicolato, para la extracción del bazo se realizó la necropsia del ratón. El
órgano fue depositado encima en una caja Petri con 2 ml del medio RPMI, y con el émbolo
de una jeringa se procedió a la maceración, todo el fluido fue recolectado en un tubo falcon
hasta completar un volumen de 15 ml más 2 ml de buffer lisis, solución que fue homogenizada
por 20 minutos para luego ser centrifugado a 1200 rpm por 5 min. Se descartó el sobrenadante,
y el pellet rojizo fue lavado con 2 ml de buffer lisis para eliminar glóbulos rojos, por dos
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minutos y nuevamente se centrifugó a 1200 rpm por 5 min hasta obtener un pellet
completamente blanco, caso contrario realizar otro lavado con buffer lisis. El pellet se diluyó
en 1 ml de medio RPMI.

1.8 Recolección de las células de la medula ósea

El sacrificio de los ratones se efectuó por dislocación cervical a los 21 días después de la
estimulación con tioglicolato, se realizó la necropsia para obtener directamente las
extremidades posteriores del ratón, evitando lastimar la cabeza de los huesos. Una vez limpio
de cualquier rastro de músculo en los huesos, se lavó durante dos minutos en alcohol al 70%,
dos minutos en PBS y un minuto en RPMI. Los huesos se colocaron en un eppendorf de 1ml
con un agujero en la punta, el cual estaba dentro de otro eppendorf de 2 ml. Para extraer la
medula ósea se centrífugo por 40 s, luego se añadió 200 ul de buffer lisis para eliminar
glóbulos rojos y se centrifugó a 2000 rpm por 1 min hasta obtener un pellet completamente
blanco. El sobrenadante fue descartado y el pellet diluido en 200 ul de RPMI.

1.9 Tinción
Las soluciones obtenidas del bazo y la médula del fémur se mezclaron con azul tripán

1.10 Conteo en cámara de Newbauer

La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadrados
grandes de las esquinas están divididos en 16 cuadrados con aristas de 0,25 mm, éstos se
utilizan para el recuento de leucocitos. La línea central es la frontera y decide si las células de
esta zona se deben considerar o no en el conteo (Caprette, 2006).
Se colocó 90 ul tripan blue con 10 ul de muestra, de esta solución se tomó 10 ul que permitió
el conteo del número de células en los cuadrantes de las esquinas.

1.11 Análisis estadísticos

Para la realización del análisis estadístico de los datos se utilizó el software Infostat.

Representative Results
2. RESULTADOS

2.1 Peso y sobrevivencia de los ratones post - inoculación con tioglicolato

Se cuantificó el peso de todos los ratones el día de la inoculación con tioglicolato, después al
día 7 se volvieron a pesar los ratones no sacrificados y por último al día 21 se volvieron a
pesar los ratones que sobrevivieron al ensayo, cabe recalcar que ninguno murió en el
experimento, fueron sacrificados.

Figura 2 Grafica del peso total de los ratones post-Inoculación. Los ratones fueron pesados al día 1 al 21
después de ser suministrado 0,2ml de tioglicolato
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En la Figura 3. se puede observar la sobrevivencia de cada ratón después de ser realizada
cada ensayo: día de la inoculación, día 7 y día 21, indicando en la gráfica, donde 8 animales
fueron sacrificados con un 0% de sobrevivencia, mientras que el resto mantienen una media
aceptable de acuerdo a su peso medido a lo largo de los 21 días.

Figura 3 Supervivencia de los ratones tras cada ensayo. Se observa que al día 1 existe un 100% de
sobrevivencia comparado con el día 21 tras la inoculación del tioglicolato.

2.2 Morfología de los órganos internos de los órganos internos

La morfología que presentan los órganos internos del ratón se puede observar en la figura 4.

Figura 4. Morfología de órganos internos de ratón. (a)Riñones,

(b)Corazón, (c)Ganglios mesentéricos, (d) Bazo, (e) Pulmones, (f)
cerebro, (g) Intestino.

2.3 Dimensiones de los órganos internos.

Se analizó la medida que se muestra en la Tabla1. La variación es mínima entre órganos a
diferencia del intestino que existe una mayor longitud.

Tabla 1 Longitudes de los órganos internos del ratón

Longitudes de los órganos internos del ratón (cm)
Órgano Longitud
Corazón 0,90
Bazo 1,80
Pulmón 1,6
Intestino 40
Riñón derecho 1,05
Riñón izquierdo 1,0
Cerebro 1,50
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2.4 Observación de macrófagos peritoneales

Los macrófagos tras el lavado peritoneal se observaron en el microscopio invertido 40X,
mostrando macrófagos alargados que demuestra la adherencia de los mismos, obteniendo un
resultado positivo como se observa en la Figura 5.

A B

Figura 5. Macrófagos de los ratones vistos en al microscopio invertido 40x. A)

Macrófagos de forma alargados obtenidos del lavado peritoneal. B) Células de
macrófagos adheridas en gran porcentaje.
Se conto 1971 células, de las cuales se adhirieron 507, el porcentaje de adherencia
es el 25,72%

2.5 Conteo de células inmunitarias viables

Luego del conteo de esplenocitos (5 ratones), y PBMCs (5 ratones) se determinó la
concentración de células viables, encontrándose un promedio de 1.3𝑥108 esplenocitos/mL y
1.54𝑥108 PBMCs/mL. Estos datos son observados en la Figura 6 y Figura 7, mostrando una
concentración diferente de PBMCs con respecto a los esplenocitos /mL.

Figura 6 Concentración de células inmunes por ml. Concentración de macrófagos, esplenocitos, PBMC tras la
inoculación con 0,2 mL de tioglicolato.

Figura 7 Numero de células inmunes en esplenocitos y PBMCs. Conteo de esplenocitos y PBMC tras la inoculación
con 0,2 mL de tioglicolato.
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Discussion

Como se puede observar en la figura 2, tras inoculación con tioglicolato los animales presentan pérdida
de peso y solamente después del 7 día unos pocos ratones empieza a subir Figura 3, hasta la siguiente
medición en el día 21, no obstante, la media global es baja al día 21. El tioglicolato es un compuesto
usado en modelos murinos para estudios inmunológicos pues tiende a generar una respuesta aguda,
esto implica un gasto extra en el organismo, de manera que la pérdida inicial de peso puede deberse a
este proceso inflamatorio que después es superado por el organismo y permite una subida de peso más
tarde (Herrera-García, et al., 2005).

La tasa de supervivencia de los ratones solo se vio afectada por el sacrificio de 8 ratones tal como se
muestra en la figura 3, pues la supervivencia fue del 46.67% en el total del ensayo que duro 21 días.
La inoculación con tioglicolato no resulta mortal para ratones y permite su recuperación por lo que es
muy utilizado para estudios inmunológicos, y es por esto que las únicas causas de muerte en el
experimento fueron los sacrificios de los individuos estudiados (Herrera-García, et al., 2005).

El procesamiento realizado y la medida de los órganos muestra como existe muy poca diferencia en
el tamaño de órganos excepto en el intestino como se puede observar en la tabla 1. El tioglicolato se
usa también para modelos de estudios en cáncer ya que produce inflamación sistémica, y es probable
que en el experimento realizado el órgano más afectado haya sido el intestino sin embargo no se tiene
pruebas que el ratón haya sido afectado en su sistema digestivo (Bruzzo, Chiarella, Fernández,
Bustuoabad, & Ruggiero, 2007).

Los macrófagos peritoneales observados al microscopio se reconocieron como estructuras

transparentes principalmente alargados, ovalados o irregulares como se puede ver en la figura 5, la
variedad de formas visibles al microscopio se debe a que estas células fagocitan patógenos por lo que
su forma puede cambiar si se encuentran en presencia de algún agente externo (Kühnel, 2005).

El conteo de esplenocitos y PBMCs que se realizó mediante la técnica de conteo en cámara de

Neubauer, dio como resultado un total de 1.3𝑥108 esplenocitos/mL, 1.54𝑥108 PBMCs/mL cómo se
observa en la figura 7 y un 25,72% de adherencia de macrófagos. Podemos observar que la cantidad de
PBMCs es mayor en comparación con la de los otros, esto no debió pasar ya que la utilización de
tioglicolato pues como ya se había mencionado anteriormente es un agente inflamatorio, que se inocula
normalmente en el área peritoneal, pero que genera una respuesta inflamatoria sistémica que dura
aproximadamente 10 días, debido a que el bazo cumple una función en la inmunidad humoral y celular,
que se encuentra sumamente activo en procesos inflamatorios sistémicos (Arbelàez, 2009 ); (Correa
& Lopez, 2007), se puede concluir en base a los resultados obtenido que tal vez se hizo una mala
dilución respecto a la muestra y al azul de tripan porque un grupo contabilizo solo 68 células vivas vs
33 células muertas en esplenocitos, y esta es una variable que nos causa sesgos en nuestro ensayo..

Es muy conocido que frente a una respuesta inmune ocasionada por un proceso inflamatorio la
concentración de PBMCs aumenta y por otro lado esto si concuerda con nuestro ensayo sin embargo
existe un outlayer que es el conteo de 68 células vivas en esplenocitos en este caso se puede eliminar
el outlayer con su respectivo resultado en PBMCs del raton 3 pero sorprendentemente quedaría el
conteo de esplenocitos y PBMCs muy identicos y realmente no hay un gran cambio en la estadística,
además hay que recalcar que si se hiciera esto el conteo para esplenocitos quedaría de 4 ratones y de
PBMCs de 5 ratones, lo cual se llega a la misma conclusión de que hay más esplenocitos que PBMCs
(Ruiz-Argüelles, 1994).
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Disclosures
Se presenta la base de datos del conteo de esplenocitos y PBMCs para que se pueda comprobar
el outlayer:

Raton Tipo de celulas Celulas vivas celulas muertas Cell viables/ml Cell no viabless/ml
I Esplenocitos 1186 329 2,97E+07 8,23E+06
II Esplenocitos 1166 199 2,92E+07 4,98E+06
III Esplenocitos 68 33 1,70E+06 8,25E+05
IV Esplenocitos 468 260 1,17E+07 6,50E+06
V Esplenocitos 2325 323 5,81E+07 8,08E+06
I PBMCs 1375 28 3,44E+07 7,00E+05
II PBMCs 631 162 1,58E+07 4,05E+06
III PBMCs 1008 162 2,52E+07 4,05E+06
IV PBMCs 1512 756 3,78E+07 1,89E+07
V PBMCs 1630 147 4,08E+07 3,68E+06
Esplenocitos 5213 1144 1,30E+08 2,86E+07
Total
PBMCs 6156 1255 1,54E+08 3,14E+07

Acknowledgements
Insumos, equipos y materiales suministrados por el Laboratorio Multidisciplinario de Docencia
de Biotecnología.

References

Bibliografía
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