Hind III es una enzima de restricción de tipo II, la cual es producida por un

microorganismo llamado Haemophilus influenzae la cual se caracteriza por que

posee una diana de restricción en su ADN de cadena doble dependiendo de una
secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, la cual genera extremos de
cohesivos mediante la actividad catalítica hidrolasa. [5]

La electroforesis es una técnica que consiste en la migración de iones en

mediante un campo eléctrico para la separación analítica y determinación del
peso molecular de distintos tipos de biomoléculas. Existen diferentes tipos como
la electroforesis en papel, electroforesis en gel, los cuales son utilizados para
moléculas de un peso molecular mayor como el ADN, RNA y proteínas. La
técnica de electroforesis en gel es uno de los métodos más convincente y
poderoso en la separación de macro moléculas, los geles más utilizados son la
poliacrilamida y agarosa que gracias a sus poros de dimensiones moleculares
cuyos tamaños pueden especificarse. [2][6]

La aplicación de estas técnicas en la separación del ADN Gel de poliacrilamida,

se consigue a partir de la formación de monómeros acrilamida y estos a sus vez
forman cadenas largas que se unen por N, N’-metilén-bis-acrilamida y así formar
enlaces cruzados entre las diferentes cadenas. Un inconveniente de este gel de
poliacrilamida es su toxicidad en sus componentes del N, N’-metilén-bis-
acrilamida y el persulfato de amonio. [7]

En la figura 2, se muestra la polimerización de la poliacrilamida. [8]

En el gel de la agarosa se presenta como un filtro en el que las porciones de

menor tamaño migran más velozmente hacia el polo positivo que aquellos de
mayor tamaño. Cuando la concentración de la agarosa aumenta dificulta el
movimiento de las porciones a lo largo del gel, para así poder obtener una mayor
resolución en las porciones de menor longitud. Al incrementar el voltaje se da un
aumento también en la velocidad de migración de las porciones.

OBJETIVOS

ü Apreciar mediante la electroforesis en gel como un método de estudio del

tamaño y de la conformación de macromoléculas.

ü Determinar calidad y cantidad de ADN a partir de electroforesis en agarosa y

poliacrilamida.

ü Conocer la utilidad de enzimas de restricción en el ADN.

ü Entender cómo electroforesis separa y clasifica los fragmentos de ADN.

ü Comparar el patrón de bandas en un gel, los diversos fragmentos de tamaño

resultantes de ADN en las bandas de digestión con diversas enzimas y
comprender sobre la migración de una partícula sobre un campo eléctrico.

PARTE I

Electroforesis en gel de Agarosa con restricción enzimática EcoRi y Hind III

MATERIALES Y REACTIVOS

ü Micropipetas de 20-200 μL y 100-1000 μL

ü Puntas para micropipetas

ü 3 vasos de precipitado de 50 mL

ü Tubos de eppendorf

ü Charolas para tinción

ü Fuente de poder

ü Cámara de electroforesis

ü Cinta adhesiva

ü Buffer de actuación

ü Revelador (mesa de luz)

ü Agarosa

ü mancha

ü ADN digerido con EcoRI

ü AND digerido con Hind III

ü ADN sin cortes

ü Tapa de cámara de electroforesis

ü Bandeja de gel

ü Fuente de alimentación

METODOLOGÍA

Forrar con cinta adhesiva los extremos de la bandeja de gel y colocar en el

interior un peine cerca de un extremo de la bandeja (no dejar que toque el fondo),
seguido a esto agregar la solución de agarosa, esperar 20 minutos y retirar las
cintas y el peine. Posteriormente introducir la bandeja con la agarosa en una
cámara de electroforesis y agregar la solución de buffer de actuación, para luego
con una micropipeta tomar alícuotas de 10 μL de las tres