 Microbiología.

1. Muestreo microbiológico.

El muestreo microbiológico se realizó médiate los métodos clásicos de

esterilización de material, aislamiento y enriqucimiento de muestras de suelo y
agua.

c) Microbiología.

La caracterización microbiológica se enfocó en la identificación de bacterias Gram

Negativas (enntereobacterias), utilizando esquemas de identificación, para determina el
tipo de bacteria presente en un medio aislado.
Para poder determinar la identidad de las bacterias obtenidas se siguió el siguiente
procedimiento:

 Esterilización de material.
 Preparación de medios de cultivo.
 Siembra.
 Aislamiento de bacterias, levaduras y hongos.
 Identificación de microorganismos médiate técnicas de Tinción simple y diferencial.
 Pruebas bioquímicas

Esta determinación se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología de la Universidad

Tecnológica del Valle de Toluca.

Técnicas de esterilización de material utilizadas.

1.-Calor Húmedo: Autoclave

1) A una presión de 15 lb durante 15 minutos.

2.-Calor Directo:Se utiliza para asas bacteriológicas y agujas de inoculación.

1) Estas se deben esterilizar antes y después de llevar acabo la siembra de

cualquier tipo de bacteria.
2) Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante algunos
segundos.
3) Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se deja enfriar en alguna
zona séptica.
Preparación de medios de cultivo: Agar Nutritivo.

1) Pesar y disolver los componentes en el volumen requerido, de medio de cultivo,

para las cajas Petri necesarias.
2) Ajustar el pH del medio, si este procede

3) Para la preparación de medios sólidos se adiciona agar-agar como agente

solidificante. Para asegurar la completa disolución del agar, el medio se calienta
hasta ebullición al mismo tiempo que se somete a agitación previamente hasta
su esterilización en el autoclave.

4) Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para
evitar el crecimiento de microorganismos

Siembra: Por estrías.

1) Tomar con el aza bacteriológico una parte de la muestra y estríar en los
medios de cultivo preparados.
2) Colocar en la incubadora durante 72 horas a 37°C.

Aislamiento de bacterias levaduras y hongos: Utilizando la técnica de estría.

1) Elegir la bacteria, hongo o levadura más pronunciada y estriar en “S” hasta dejarla
totalmente aislada.
2) Repetir este proceso en los microorganismos que se dese aislar.

Identificación de microorganismos mediante técnicas de tinción simple y

diferencial: Tincion Gram.
1) Agregar dos a tres gotas de Cristal Violeta que cubra todo el frotis por 2 min.
2) Lavar con agua de la llave la preparación con mucho cuidado, que escurra el
agua
3) Agregar dos a tres gotas de Lugol (yodo) que cubra todo el frotis por 2 min.
4) Lavar con alcohol que escurra sobre el frotis
5) Agregar dos a tres gotas de safranina (rojo) que cubra todo el frotis por 2 min.
6) Lavar con agua de la llave, que escurra sobre el frotis.
7) Colocar una gota de aceite de inmersión y observarlo en 100 X en el
microscopio.

Pruebas bioquímicas: Identificación de entereobacterias aisladas.

 1) Colocar en una gradilla un juego de pruebas bioquímicas por cada colonia que se
desee identificar, iniciando la serie con el tubo conteniendo el medio de citrato.
2) Tomar parte de una colonia aislada con el asa circular del microorganismo que se
desee identificar y estriar en la superficie del medio de cultivo de citrato (no
puncionar).
3) Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de
cultivo hasta una profundidad máxima de ¾ . y posteriormente estriar en las
pruebas de TSI, LIA, KIA (Kligler), y Urea.
4) Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de
cultivo hasta una profundidad máxima de ¾ en las pruebas de SIM Y MIO.
5) Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta o circular e inocular el
caldo de cultivo de la prueba de Voges Proskauer.
6) Incubar a 35 °C durante 24 hr.
7) Tomar una porción de la misma colonia y extenderla sobre un portaobjetos.
Agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno y observar.
8) Con un hisopo estéril tomar una porción de la misma colonia y extenderla sobre un
trozo de papel filtro previamente humedecido con el reactivo para la prueba de la
oxidasa y observar.
9) Después de lo incubación realizar las siguientes pruebas:
a. Adicionar al tubo con medio SIM, 5 gotas del reactivo de Kovac’s para
determinar la producción de indol. Observar y registrar si hubo cambios o
no.
b. Del caldo de cultivo Voges Proskauer, tomar la mitad en un tubo de ensaye
para la determinación correspondiente, y el resto volver a incubar a 35 °C
por 24 hr más.
10) En la porción separada (aprox. 1.5 mL) agregar 3 gotas del reactivo de la solución
de α naftol al 5% y 1 gota de solución de KOH al 40%. Espere de 10 a 15 minutos
para permitir el desarrollo del color. Registre las observaciones.
a. Adicionar al tubo con medio de fenil alanina 4 ó 5 gotas de solución de
cloruro férrico. Observar y registrar observaciones.
b. Pasado el tiempo de la segunda incubación de la porción de caldo VP,
agregar 3 gotas del indicador rojo de metilo. Agitar suavemente para
permitir que se disperse el indicador y se lleve a cabo el desarrollo del color

Resultados microbiológicos.