UNIVERSIDAD CATOLICA DE

CUENCA

MICROBIOLOGIA
Reacciones inmunológicas

INTEGRANTES: Matthew Zea, Ariel Guerrero, Sofía Bravo,

Camila Sarmiento, Karelys Torres

DOCENTE: Dra. Doris Calderón

CICLO: 2do “B”

AÑO

2020-2021
 Objetivo general

 Analizar los tipos de reacciones inmunológicas Elisa e inmunofluorescencia

Objetivos específicos

 Analizar las teóricas en las que se basa la prueba de Elisa.

 Enumerar y describir los tipos Elisa.

 Determinar la inmunofluorescencia directa e indirecta

 Examinar los pasos que se utilizan en la inmunofluorescencia

 Resumen

Los Anticuerpos poseen una alta especificidad y afinidad para un antígeno

específico. Es esta unión específica lo que permite la detección de analitos por
medio de una variedad de técnicas de inmunonensayo. En este trabajo hablaremos
de una de sus técnicas como es la técnica de Elisa.

La técnica de Elisa es una técnica de inmunoensayo en la cual el antígeno

inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de
generar un producto detectable , como cambio de color o algún otro tipo .Se
fundamenta en la premisa de que luego de acoplar antígenos solubles o anticuerpos
a una matriz sólida insoluble , estos retienen la actividad inmunológica y en estas
biomoléculas también pueden unirse a una enzima , reteniendo el conjugando
resultante , tanto la actividad enzimática como inmunológica. Además de háptenos ,
en el Elisa también es posible determinar moléculas de alto peso molecular , sin
embargo , su principal ventaja está dada en su alto grado de sensibilidad ,
detectabilidad , precisión y exactitud . Existen diferentes tipos de Elisa directo e
indirecto.
Elisa directo es simple y rápido, donde un anticuerpo primario marcado con una
enzima se une directamente al antígeno de interés permitiendo la detección del
mismo, en cambio la técnica Elisa indirecto se utilizan dos anticuerpos, uno primario
y otro secundario .Este método indirecto se utiliza comúnmente para diagnosticar
infecciones por bacterias, virus o parásitos y cuantificar los anticuerpos. Se
considera que la Elisa indirecta es altamente sensible y más flexible que la Elisa
directo.

La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso

de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la
presencia de una determinada molécula. La técnica de inmunofluroscencia directa
usa una unión covalente entre el fluoruro con el anticuerpo primario, requiere de una
etapa de incubación con el antígeno y una sola etapa de lavado y en la indirecta se
divide en dos etapas, el anticuerpo primario no marcado se une con el antígeno
diana y en la segunda etapa, el anticuerpo secundario lleva fluoruro, identifica al
anticuerpo primario y se une a él.
 LA PRUEBA ELISA

La prueba ELISA se basa en varias teorías:

1) El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y
retener su reactividad inmunológica;
2) las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad
relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar
concentraciones muy bajas del ligando;
3) la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva
y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento; y
4) las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar.
Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o
policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de
inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte
sólido, son empleados como conjugados no marcados o enzimáticos y por último
reaccionan con determinante antigénico específico de un antígeno o de un
anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario) según el protocolo de análisis.
Los antígenos se purifican o se producen con tecnología recombinante, y al igual
que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimáticos y son
inmóviles o solubles, dependiendo del protocolo de análisis. Como se puede deducir
los conjugados enzimáticos son antígenos o anticuerpos unidos en forma covalente
a la enzima de elección. Así pues, el reactivo que se forma de la unión covalente
entre enzima y antígeno o anticuerpo es el conjugado. Se conoce que es posible,
también, marcar de forma no covalente anticuerpos o enzimas con biotina y agregar
avidina. La avidina posee cuatro sitios de enlace para la biotina y no todos ellos
participan en la interacción con el anticuerpo marcado con biotina. Los sitios de
enlace libres funcionan como aceptores para la enzima marcada con biotina. Este
procedimiento se acorta utilizando anticuerpo marcado con biotina y avidina
marcada con enzima. Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean en
los diversos métodos ELISA incluyen:
1. Peroxidasa de rábano y su sustrato, peróxido de hidrógeno que en
presencia de cromógeno produce un producto color amarillo-naranja
medible
2. Galactosidasa beta y su sustrato xo-nitrofenil-beta-D'Galactopiranósido que
se transforma en un producto nitrofenolato amarillento medible
3. Fosfatas alcalina y V. su sustrato p-nitrofenilfosfato que también se
transforma en nitrofenolato.
Se utiliza ácido sulfúrico para inhibir la actividad enzimática y estabilizar el producto
final de reacción que tiene color.
Ensayos de enlace competitivo
Los ELISA en fase sólida, no competitivos se utilizan para determinar antígenos,
haptenos o anticuerpos. Aquí el ligando no marcado compite con un ligando
conjugado con enzima por un número limitado de sitios de enlace con el anticuerpo
inmovilizado, y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante, para así
poder relacionar inversamente la cantidad de producto que se forma con la
concentración del ligando no marcado en la muestra problema.
Ensayos de enlace no competitivo
Son denominados también, técnicas del emparedado y son los métodos más
utilizados para determinar antígenos que por lo menos tienen dos determinantes
antigénicos, como fase sólida pueden ser utilizadas perlas de poliestireno en donde
se absorbe un exceso de anticuerpos generalmente monoclonales, y se sigue el
protocolo de trabajo retirando también como en los casos anteriores el exceso de
antígeno presente no unido.

TIPOS DE ELISA
En base al modo en el que se den las interacciones antígeno-anticuerpo, la tecnica
Elisa se clasifica en 4 tipos.

- Elisa directo
- Elisa indirecto
- Elisa tipo sándwich
- Elisa competitivo.
Veamos cada uno de estos tipos de ELISA con más detalle:

1.- ELISA DIRECTO

El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un

anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de
interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.

El procedimiento simplificado sería el siguiente:

1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa

2º Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al

antígeno de interés

3º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal

visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.

2.- ELISA INDIRECTO

Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar
la señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro
secundario, y es este último el que irá conjugado a una enzima.

El procedimiento simplificado sería el siguiente:

1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa

2º Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés

3º Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al

anticuerpo primario
4º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal
visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.

3.- ELISA TIPO SÁNDWICH

En el Elisa tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos,

uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos,
que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno.

El procedimiento simplificado sería el siguiente:

1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa

2º Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al

anticuerpo de captura

3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al

anticuerpo de captura.

4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima,

procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario (que es lo más
habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo
secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.

5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal

visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
4.- ELISA COMPETITIVO

El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también

conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que
competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.

Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy

bajas cantidades.

El procedimiento simplificado sería el siguiente:

1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.

2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la
muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de
complejos antígeno-anticuerpo

3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de

referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo

4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles

5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se

unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.

6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal

visible que será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de interés
presente en la muestra.
El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) es una técnica muy usada
en inmunología para medir anticuerpos, antígenos, proteínas y glicoproteínas en
muestras biológicas. Algunos ejemplos incluyen: diagnóstico de infección por VIH,
test de embarazo, y medición de citocinas o receptores solubles en sobrenadantes
celulares o suero. Generalmente se llevan a cabo en placas de 96 pocillos, lo que
permite medir múltiples muestras en un único experimento. Estas placas deben
tener propiedades especiales para asegurar que el anticuerpo o el antígeno se
pegan a su superficie. Cada prueba mide un antígeno específico, existiendo una
gran variedad de kits disponibles para distintos antígenos.

En la Figura 1 se puede observar un tipo de ELISA, llamado ELISA sandwich, donde

se utilizan dos juegos de anticuerpos para detectar productos, como citocinas. El
método se lleva a cabo en el orden mostrado. El primer paso es recubrir la placa
ELISA con el anticuerpo de captura; cualquier anticuerpo en exceso o que no se
haya unido se elimina después mediante lavado. Este anticuerpo está diseñado
para reconocer el antígeno de interés.
Figura 1. Ensayo ELISA, Es un ELISA tipo sándwich con sus pasos

Después la muestra (ej. orina, suero o sobrenadante celular) es añadida. Cualquier

antígeno que se encuentre en ella se unirá al anticuerpo de captura que recubre la
placa. Las muestras suelen añadirse en duplicado o triplicado y en distintas
concentraciones para garantizar que puedan ser medidos con los niveles de
detección de la prueba. De nuevo, cualquier excedente es eliminado de la placa
usando un paso de lavado.

En el último paso, se añade el anticuerpo de detección, que suele estar marcado

con una enzima, generalmente peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina.
Este anticuerpo se unirá a los antígenos que estarán a su vez unidos al anticuerpo
de captura. Para terminar, se añade una solución substrato. Las pruebas ELISA
suelen ser cromógenas, es decir, se basan en una reacción que convierte el
sustrato en un producto coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas.

Para determinar la concentración de antígeno en la muestra se requiere producir

una curva estándar, utilizando antígenos en concentración conocida (mostrado en la
Figura 2). La concentración del antígeno en la muestra se puede calcular utilizando
la densidad óptica.

Figura 2. Curva estándar típica. Se muestra una curva estándar para un ELISA que
detecta IFNγ. Para determinar la concentración del antígeno en la muestra, la curva
estándar se basa en usar una solución que contiene una concentración conocida del
antígeno.
 INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se emplean

anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o tejidos.

Inmunofluorescencia Directa

El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción. La muestra clínica que

presuntamente contiene antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en
contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho microorganismo
conjugado con fluoresceína. Si el antígeno esperado está presente se formará un
complejo antígeno -anticuerpo. La reacción positiva en forma de fluorescencia verde
manzana puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

Inmunofluorescencia Indirecta

Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar

directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero
anti -inmunoglobulina conjugado con fluorocromo El proceso consta de dos etapas:
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el
substrato conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum,
etc.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos
específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno
-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado Segunda etapa: se
agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionar á con el
anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.

La técnica se realiza en dos etapas:

PRIMERA ETAPA
SEGUNDA ETAPA

Pasos de una inmunofluorescencia

1. Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material

biológico a analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que
existe in vivo. Existen distintos métodos de fijación de material biológico. Esto
dependerá de distintos factores como: el tipo de microscopía a utilizar, la
estructura subcelular que se quiera detectar, entre otras

2. Permeabilización: Existen distintos métodos de permeabilización que son

más “suaves” o más “fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del
compuesto impermeabilizante a utilizar. Produce poros en las membranas
celulares. Lo que permite el ingreso de los anticuerpos a la célula si
queremos detectar estructuras internas de la célula.
3. Bloqueo:
 • Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el
material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.
• En general se utilizan soluciones proteicas concentradas (Generalmente
Albúmina bovina sérica o gelatina de pescado).
• El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse
a su epitope y así detectar la estructura de interés.
• Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por epitopes no específicos.

4. Inmunodetección:
• Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer
específicamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas (antígenos).
• La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina antígeno.
Cada antígeno tiene al menos un epitope o región reconocida por un
anticuerpo.
 Conclusión

Podemos concluir que basándonos anteriormente en la información obtenida nos

damos cuenta que El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie
portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica, las enzimas tienen
actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato
en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del
ligando; la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se
preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento y las enzimas
no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar. Los anticuerpos
utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se
suministran como antisuero no fraccionado estos son conjugados no marcados o
enzimáticos y por último reaccionan con determinante antigénico específico de un
antígeno o de un anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario) según el
protocolo de análisis. Así como también se pudo observar los tipos de Elisa que son:
Elisa directo que más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario
marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de interés permitiendo la
detección y/o cuantificación del mismo; Elisa indirecto que un ensayo parecido al
ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En
este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este
último el que irá conjugado a una enzima; Elisa de sándwich en este el antígeno
queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección
también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epítopos
distintos de un mismo antígeno; Elisa competitivo es una variante más compleja de
la técnica ELISA, también conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un
antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al
anticuerpo primario. Por otra parte hablamos también de la inminofluorescencia
directa e indirecta y se dice que de manera directa se realiza en un paso básico de
reacción. La muestra clínica que presuntamente contiene antígenos del
microorganismo bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal
dirigido contra dicho microorganismo conjugado con fluoresceína y la indirecta Es
una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente
sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti
-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo y por último se examinó los pasos de
la inmunofluorescencia que son: fijación, permeabilidad y bloqueo