SEGUNDO PARCIAL

Mecanismos de Traducciónen Eucariontes

1-Componentes principales de la maquinaria que tiene a cargo la traducción del

RNA m
Para la síntesis de una proteína se requiere la acción de más de 100 proteínas y de
RNA. La maquinaria de traducción está formada por el mRNA (es la plan tilla de la
traducción), tRNA, las aminoacil tRNA sintetasas y el ribosoma.

2-Que son los codones y donde se encuentran

La región codificadora de proteína del mRNA, consiste en unidades de 3 nucleótidos
llamadas codones, los cuales especifican el orden de los aminoácidos.

3-Que enzimas acoplan aminoácidos al RNA

Las aminoacil tRNA sintetasas acoplan aminoácidos a tRNA específicos que reconocen
el codón adecuado, lo hacen por la unión del aminoácido al nucleótido de adenosina
terminal 3’, a través de un enlace acilo de alta energía. Cuando este enlace se rompe
contribuye con energía para la formación del enlace peptídico.
El participante central definitivo en la traducción es el ribosoma.

4-Como esta formado el ORF

El ORF (open Reading frame) es el marco de lectura abierto. Cada ORF especifica una
sola proteína, y comienza y termina en sitios internos al mRNA. O sea, que los
extremos de un ORF son distintos a los del mRNA.

5-En que extremo comienza la lectura

La traducción comienza en el extremo 5’ del marco de lectura abierto, y progresa un
codón a la vez hacia el extremo 3´.

6-Como se llaman el primer y ultimo codón de un ORF

El primer ORF se llama codón de inicio. En procariontes son distintos que en
eucariontes, en los primeros son AUG, GUG, UUG y en euc AUG. La función
de los codones de iniciación son 2: especifica el primer aminoácido y define el
marco de lectura para todos los codones ulteriores.
El último codón se llama codón de terminación, que son: UAG, UGA, UAA.

7-Cuantos ORF tienen los eucariontes

En procariotas hay 2 o más ORF en un mRNA, son policistrónicos, en eucariota
el mRNA codifica un ORF, son monocistrónicos.

8-Que es el capuchón 5´
El capuchón 5´consiste en la adicion de una G metilada en el extremo 5’ del
mRNA, cuando éste posee ya de 20 a 40 nt. Se realiza en 3 pasos enzimáticos:
1) eliminación del P del extremo 5´del transcripto.
2) Añade GTP, formándose un enlace 5’-5’ inusual.
3) Se metila.
Los eucariontes reclutan los ribosomas mediante una modificación química
especifica: “capuchón 5’”. Una vez unido al mRNA, el ribosoma se mueve de 5
´3’ hasta que encuentra un codón de inicio, proceso conocido como rastreo.
La cola poli-A también estimula la traducción.
9-Funciones que cumple el RNA t
Los tRNA actúan como adaptadores entre los codones y aminoácidos que
especifican. Hay mucho tipos de moléculas de tRNA, pero cada una está unida a
un aminoácido específico y reconoce un codón/es en particular en el mRNA (la
mayoría de los tRNA reconoce a más de un codón).

10-Mencionar características principales del RNA t pag 446, fig 14-4

 Posee 75-95 ribonucleótidos de longitud.
 Todos los tRNA terminan en su extremo 3´con la secuencia 5’-CCA-3’.
Éste es el sitio en el que se une el aminoácido afín por la acción de la
aminoacil tRNA sintetasa.
 Todos los tRNA presentan varias bases inusuales en su estructura
primaria. Éstas surgen de la etapa postranscripcional por modificación
enzimática de bases normales en las cadenas de polinucleótidos. Ej:
seudouridina ψU, derivada de uridina, la dihidrouridina (D), la
hipoxantina, la timina y la metilguanina. Estas bases inusuales no son
indispensables para la función de los tRNA, pero las células que carecen
de ellas poseen un ritmo de proliferación reducido.
 Su estructura secundaria es de forma de trébol, por su
autocomplementariedad (regiones bicatenarias) y sin complemento
(monocatenarias). La hoja de trébol posee:
Tallo aceptor: sitio de unión entre el aminoácido, formado por el
apareamiento entre los extremos 5’ y 3’ del tRNA. La 5’-CCA-3’hace
protrusión.
Asa ψU
Asa D
Asa anticodón: contiene al anticodón, un elemento decodificador
de tres nucleótidos que reconoce el codón por apareamiento con el
mRNA. El anticodón está delimitado en su ext 5’ por U, y en su ext 3’
por una purina.
Asa variable: se situa entre el anticodón y el asa ψU.
 Su estructura tridimensional es en forma de L. el tallo aceptor y el tallo
del asa ψU forman una hélice extendida, y el asa anticodón y el tallo de
la asa D forman una segunda hélice extendida. Estas dos se alinean en
angulo rectp una con respecto a la otra, con el asa D y el asa ψU
reunidas.
Tres clases de enlaces estabilizan esta estructura: 1) enlaces de H,
enlaces no convencionales, 2) interacciones entre las bases y la columna
de ribosa fosfato. 3) el apilamiento adicional de bases que se obtienen
por la formación de las dos regiones extendidas de apareamiento.
11-Que enzima participa en la unión de los aminoácidos al RNA t
Las aminoacil tARN sintetasas unen un aminoácido a un tARN en dos pasos:
 Adenililación de un aminoácido: el aminoácido reacciona con ATP para
adenililarse, con liberación simultánea de pirofosfato. Adenililación
significa transferencia de AMP. La fuerza impulsora principal para esta
reacción es la hidrólisis de pirofosfato por la pirofosfatasa. Como
consecuencia de la Adenililación el aminoácido se une a ácido adenilico
por medio de un enlace éster de alta energía en el que el grupo carbonilo
del aminoácido se une al fosforilo del AMP.
 Transferencia de un aminoácido adenililado a un tARN: el aminoácido
adenililado unido fuertemente a la sintetasa reacciona con el tARN .Esta
reacción produce la transferencia del aminoácido hacia el extremo 3” del
tARN a través del hidroxilo 2” o 3” y la liberación simultanea del AMP.
Hay dos clases de tARN sintetasas: clase 1 unen el aminoácido al hidroxilo 2” del
tARN
Y son generalmente monomericas. Clase 2 unen el aminoácido al hidroxilo 3” y son
Diméricas o tetrámericas.

12- Como está formado un ribosoma

El ribosoma está compuesto por dos subcongregaciones de ARN y proteínas
conocidas como subunidades mayor y menor. La subunidad mayor contiene el
centro peptidil transferasico, que tiene a su cargo la formación de los enlaces
peptídicos. La subunidad menor contiene el centro decodificador, en el que los
tARN cargados leen o decodifican las unidades codonicas del mARN.

13-Cuantos polipéptidos puede sintetizar un ribosoma por vez

Un ribosoma puede sintetizar solo un polipéptido x vez, cada RNAm puede ser
traducido por muchos ribosomas en forma simultanea

14-A qué se le llama polirribosoma

Un RNAm que porta numerosos ribosomas se conoce como POLIRRIBOSOMA o
polisoma

15-Cual es el orden de la síntesis de una cadena polinucleotídica en crecimiento

Cada aminoácido nuevo tiene que añadirse al extremo c-terminal de la cadena
polipeptidica en crecimiento (síntesis en dirección N-terminal a C-terminal).

16-Cuantos sitios de unión para RNA t tiene el ribosoma

El ribosoma tiene 3 sitios de unión para el RNAt
Para realizar la reacción peptidil transferasica el ribosoma tiene que ser capaz de
unirse por lo menos a 2 tRNA a la vez. En efecto el ribosoma contiene 3 sitios de
unión para tRNA llamados A(donde el tARN cargado entra en el ribosoma), P(sitio
que contiene el peptidil-tARN) Y E(donde los tARN desacilados abandonan el
ribosoma)
17) Cuales son las condiciones necesarias para que se inicie la traducción(pag463)
Para que la traducción se inicie con éxito tienen que producirse tres
acontecimientos (fig.14-22)
Primero: el ribosoma tiene que reclutarse hacia el mRNA.
Segundo: un tRNA cargado tiene q ubicarse en el sitio P del ribosoma.
Tercero: el ribosoma tiene que posicionarse exactamente sobre el codón de inicio
La posición correcta del ribosoma sobre el codón de inicio es fundamental, porque
esto establece el marco de lectura para la traducción de mARN. Incluso el
desplazamiento de una sola base en la ubicación del ribosoma traería como
consecuencia la síntesis de un polipéptido no relacionado para nada.

18) Cuando comienza la prolongación de la traducción(pag469)

Una vez que el ribosoma se arma con el tARN iniciador cargado en el sitio P, puede
comenzar la síntesis del polipeptido. Hay tres acontecimientos fundamentales que
deben ocurrir para la adicion correcta de cada aminoácido. PRIMERO, el aminoacil-
t ARN correcto se carga en el sitio A del ribosoma según dicta el codón en el sitio A.
SEGUNDO, se forma un enlace peptidico entre el aminoacil tARN en el sitio A y la
cadena peptidica unida al peptidil-tARN en el sitio P. Esta reacción peptidil
tranferásica, como vimos, produce la transferencia del polipeptido en crecimiento
desde el tARN en el sitio P hacia la parte de aminoácido del tARN cargado en el
sitio A. TERCERO, el peptidil- tARN resultante en el sitio A Y su codón asociado
tienen que translocarse hacia el sitio P de modo que el ribosoma esté listo para
otro ciclo de reconocimiento codonico y formación de enlace peptidico. Al igual
que con el posicionamiento original del mRNA , este desplazamiento tiene que
producirse con presicion para mantener el marco de lectura correcto del mensaje.
Dos proteínas auxiliares conocidas como factores de prolongación controlan estos
fenómenos. ambos factores utilizan la energía de la unión y la hidrólisis del GTP
para aunmentar el ritmo y la exactitud de la función ribosómica.

19) Cuando finaliza la traducción(PAG 479)

Los Factores de liberación finalizan la traducción en respuesta a los codones de
terminación.
El ciclo ribosómico de unión del aminoacil-t ARN ,formación del enlace peptidico y
translocacion entra en el sitio A. a los codones de terminación los reconocen
proteínas llamadas factores de liberación (RF: Release Factors), que activan la
hidrólisis del polipeptido del peptidil- t ARN.
Hay dos clases de factores de liberación. Los de clase I reconocen los codones de
terminación y desencadenan la hidrólisis de la cadena peptidica del t RNA en el
sitio P.
En los eucariontes hay un solo factor de liberación de clase I . llamado eRF1, que
reconoce los tres codones de terminación. Los factores de liberación de clase II
estimulan la disociación del ribosoma de los factores de la clase I después de la
liberación de la cadena polipeptidica. Hay un solo factor de tipo II denominado
eRF3. Están regulados por el GTP.
 20) Función biológica de las mutaciones
Se denomina mutacion a todo cambio permanente ocurrido en la secuencia de
bases del ADN de un organismo.
Si bien los organismos eucariontes poseen métodos muy eficientes para
preservar la fidelidad de la replicación del ADN, no llegan a anular la producción
de un número limitado de mutaciones en cada generación. En la especie
humana este número difiere entre los varones y las mujeres porque el numero
de mutaciones en la línea germinal depende del número de generaciones
celulares, que es mayor en la espermatogenesis que en la ovogénesis; se estima
que por generación pueden introducirse entre 10 y 100 cambios nucleotidicos
(solo la decima parte de los cuales puede ocasionar mutaciones visibles). La
mayor parte de las mutaciones visibles son perjudiciales y su permanencia es
limitada por la selección natural; sin embargo, algunas mutaciones visibles son
ventajosas para la adaptación a los cambios ambientales y serán resguardadas
por las selección, en tanto q otras, que caen en regiones no esenciales para la
función de una proteína seran “neutrales”, y producirán un polimorfismo en las
proteínas codificadas. Además, casi todos los cambios de nucleótidos, que no
afectan ADN codificante, son “neutrales” respecto de la selección natural . de
esa manera, en cada generación se van introduciendo cambios silenciosos de
bases, que se presentan como polimorfismos en las secuencias no codificantes
de proteínas .
Estos polimorfismos que son mucho mas probables que aquellos que ocurren
en las regiones que codifican proteínas, son mas variables; pero aparte hay
secuencias , como las repeticiones de uno o mas nucleótidos, que son
especialmente proclives a aunmentar la frecuencia de errores de ADN
polimerasa, de modo que hay ciertas secuencias q son ”hipervariables “. La
presencia de polimorfismo de secuencias que en general y de las secuencias
hipervariables en particular es útil para que se las use como “marcadores de
genes”

21) Principales características de células neoplásicas en cultivo

Las células neoplásicas en cultivo presentan algunas de las siguientes características
o todas ellas:
1. menor necesidad de factores de crecimiento
2. perdida de inhibición por contacto, de modo que las células tienen que
acompañarse y formar focos o nódulos.
3. capacidad de dividirse indefinidamente osea que las cel son inmortales
4. proliferación sin anclaje

22-Como se clasifican las mutaciones de acuerdo con su morfología. Principales

características

23) Como se clasifican las mutaciones desde el punto de vista funcional. Caracteristicas

 Silenciosas: no se observa ningún efecto sobre el fenotipo. Corresponden al cambio de

bases no codificantes.
  Cambio de encuadre: por delecion o inserción. Se produce un cambio en el marco de
lectura, por la pérdida o adición de una o dos bases.
 Sin sentido: corresponde al cambio de una base que convierte un triplete codificante
en uno sin sentido, que al ser reconocido por los factores de terminación produce la
cesación de la cadena polipeptidica a ese nivel.
 De cambio de sentido: (delimitado a un triplete) se trata de las sustituciones
 De elementos de control: mutaciones que afectas mutaciones reguladoras (promotor)
 De expansión de repetición de tripletes: importante factor causal e varias
enfermedades hereditarias.

24) que es una sonda.

Una sonda es una molécula con una secuencia conocida. Se emplea para buscar moléculas
con secuencia complementaria dentro de compuestos formados por ácidos nucleicos. Las
sondas de ARN deben estar marcadas para localizarla de inmediato una vez que se
encuentre la secuencia buscada. Existen 3 tipos: fragmentos de ADn, de ARN y
oligonucleótidos sintéticos.

25) que es un primer

Un partidor, cebador, iniciador o primer, es una cadena de ácido nucleico o de una

molécula relacionada que sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Es
una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que
forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de
inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.

26) electroforesis. Fundamento y tipos de geles.

Es la separación de las moléculas de ADN y ARN por medio de un gel. Las moléculas
lineales de ADN se separan de acuerdo con su tamaño cuando se someten a un campo
eléctrico a través de una matriz tipo gel, que es un material poroso inerte similar a la
gelatina. Como las moléculas de ADN tienen carga negativa, cuando se someten a un
campo eléctrico migran a través del gel hacia el polo positivo. Los poros de la matriz
tipo gel tamizan las moléculas de ADN de acuerdo con este volumen; las moléculas
grandes migran a través del gel con mayor lentitud porque tienen un volumen efectivo
superior que el de las moléculas de ADN más pequeñas y, por ende, más dificultades
para atravesar los intersticios del gel. Esto significa que una vez que las moléculas
corrieron por el gel durante un periodo determinado quedaron separadas por que se
movilizaron hasta distancias variables a través del gel relacionado con sus diferentes
tamaños.

Después de finalizada la electroforesis, es posible detectar las moléculas de ADN por

medio de la tinción del gel con colorantes fluorescentes como etidio que se une al
ADN y se intercala entre las bases apiladas. Cada banda revela la presencia de una
población de moléculas de ADN que poseen un tamaño específico.
 La electroforesis separa moléculas de ADN no solo en función de su peso molecular
sino también de acuerdo con su tamaña y sus propiedades topológicas. Una molécula
de ADN circular que esta relajada migra con mayor lentitud que una lineal que posee la
misma masa. Las moléculas de ADN súper enrolladas, que son compactas y tienen un
volumen efectivo pequeño, migran con mayor rapidez durante la electroforesis que las
moléculas de ADN circular súper enrolladas o relajadas compuesta por la misma masa.

La electroforesis también se utiliza para separar moléculas de arn. El arn tiene una
carga negativa uniforme y suelen ser monocatenarias pero con capacidad de formar
estructuras secundarias y terciarias que influyen en su movilidad electroforética. Para
resolver este problema las moléculas de arn se pueden tratar con glioxal, un reactivo
que reacciona con el arn para impedir la formación de estructuras secundarias y
terciarias y por ende migran con una movilidad proporcional a su peso molecular.

Se utilizan dos tipos alternativos de matrices de gel.

 Poliacrilamida: tiene una capacidad elevada de resolución pero solo pueden separar
las moléculas de ADN dentro de un intervalo de tamaño estrecho. Puede diferenciar
moléculas de ADN que solo difieren en un solo para de bases, pero solo cuando las
moléculas tienen hasta algunos cientos de pares de bases.
 Gel agarosa: tiene una potencia resolutiva menor que la poliacrilamida pero permite
diferenciar moléculas de ADN que cuentas con decenas o incluso centenas de kp.

27) Pcr. Fundamento de la técnica. Tres pasos y sus fundamentos. Condiciones de la muestra.

Es un método poderoso para amplificar segmentos específicos de ADN. Este

procedimiento solo implica métodos bioquímicos in vitro. La Pcr utiliza la enzima ADN
polimerasa que dirige la síntesis de ADN a partir de sustratos dexosinucleotidos y actúa
sobre una plantilla de ADN monocatenario.

Se generan dos oligonucleótidos monocatenarios sintéticos, uno complementario con

la secuencia del extremo 5’ de una cadena del ADN que se va a amplificar y el otro
complementario con el extremo 5’ de la otra cadena. El ADN que se va a amplificar se
desnaturaliza y los oligonucleótidos se unen con sus secuencias complementarias. En
este momento se agregan a la reacción los sustratos ADN polimerasa y
dexosinucleotidos y la enzima extiende los dos cebadores. Esta reacción produce ADN
bicatenario sobre la región de ambas cadenas de ADN. En este primer ciclo se obtiene
dos copias bicatenarias del fragmento original.

Luego el ADN se somete a otro ciclo de desnaturalización y síntesis con los mismos
cebadores para obtener 4 copias del fragmento evaluado. De esta manera, la
realización de ciclos nuevos de desnaturalización y síntesis de ADN dirigida por el
cebador amplifica la región entre los dos cebadores en forma geométrica.
 Cada ciclo de Pcr consta de 3 pasos

 Etapa de desnaturalización: ADN diana se incuba a elevada temperatura (94 c) de tal

manera que las hebras se separan quedando accesibles a la hibridación de los primers.
 Etapa de annealing: la mescla de reacción se enfría (55 – 65 c) para permitir que los
primers hibriden con la secuencia complementaria.
 Etapa de extensión: se realiza a (72 c) y en ella los primer se extienden mediante una
ADN polimerasa, utilizando el ADN diana como molde, realizándose entre 30 y 50
ciclos en cada reacción.

28) northern. Fundamento. Condiciones de la muestra.

Es una técnica análoga al southern blot que permite el análisis de la expresión génica.
En este caso se utiliza ARNm que es el resultado de la trascripción de ADN. A diferencia
del southern, no es necesaria la restricción con enzimas de restricción.

En primer lugar, se realiza una electroforesis del arn celular en condiciones

desnaturalizantes (agarosa con urea o formamida) para eliminar las posibles
estructuras secundarias y obtener moléculas completamente lineales. La trasferencia
del arn al filtro se realiza igual que en el southern, suprimiendo el paso
desnaturalización con hidróxido sódico, por ser el arn de cadena simple. El filtro se
hibrida de la misma forma que en el caso ADN.

Esta técnica permite confirmar la trascripción de un determinado gen en un tejido y

conocer el tamaño del trascripto y su nivel de expresión. Permite la determinación del
tamaño del ARNm que corresponde al gen de interés.

29) western. Fundamento

Detección de ciertas proteínas en un gel de poliacrilamida para separación de

proteínas. Las proteínas pueden detectarse en un lisado bacteriano total mediante el
uso de un anticuerpo específico, ya sea policlonal o monoclonal. Al igual que en el
southern, las proteínas son trasferidas a un filtro de nitrocelulosa, pero en este caso
mediante aplicación de un campo eléctrico atravez del gel. Las proteínas ya fijas en el
filtro son sometidas a la reactividad de un anticuerpo específico contra la proteína de
interés. La detección de estas se hace por una reacción coloreada usando un segundo
anticuerpo que está dirigido contra el primero y que lleva unida una enzima que actúa
sobre un sustrato generando un producto coloreado.

La gran ventaja de este método es que permite reconocer el peso molecular de la

proteína en estudio y tiene mayor fiabilidad que otros métodos, aunque no aporte
información sobre su localización en el contexto tisular.

29) southern. Fundamento. Condiciones de la muestra.

Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de

biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una
mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis
en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud
y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la
sonda.1 Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado
Edwin Southern.2

1. Extracción del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en
la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células
del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o
"vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia,
obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es

una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica.
La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el
ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su
tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al
avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz
del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los
poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación
continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los
fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto
de aplicación de la muestra.

4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras

permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras
la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie
de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más
literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de
desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de
quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de una secante a un papel
con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco"
del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los
fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.

5. Hibridación con sonda radioactiva

 Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar
(es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de
restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria
(dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias
de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan
habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para
que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo
de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una
sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración
desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda
no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea
la asociada al ADN del locus diana.

6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de

Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de
nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que
las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración
radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la
hibridación de Southern se conoce como autorradiografía

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios

cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera
sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que
deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un
locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente.
El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como
un "perfil de ADN"

31) hibridación in situ. Fundamento. Condiciones de la muestra.

La técnica permite la localización de secuencias de ácidos nucleicos, ADN, arn virales,

arn celular o ADN cromosómico, en el lugar del tejido en el que se encuentra.

Se utiliza en el diagnostico en medicina, para identificar secuencias virales en tejido y

proporcionar información, sobre los mecanismos patogénicos de las infecciones
virales. La característica que la distingue de otros métodos basados en hibridación es
que el ADN de la muestra no es extraído si no que es detectado directamente en la
célula intacta.

Parte de un corte de tejido extendido sobre un porta. En primer lugar la sección o el

frotis citológico se trata enzimáticamente con proteinasa k o pronasa o se calienta en
microondas, con el fin de romper las envolturas celulares y permitir el acceso de la
sonda al núcleo durante la hibridación, posteriormente se procede a la
desnaturalización del ADN cromosómico por calor ( 95 c) y posteriormente se añade
 una solución que contiene la sonda con el ADN o arn marcado con componentes
radioactivos como p32 y s35 o componentes no radioactivos como peroxidasa, biotina
complementarios a la secuencia genómica que buscamos. El marcador empleado es
marcado y posteriormente es revelado.

Los mejores resultados se obtienen en tejido fijados con formol o en paraformaldheido

y con menor éxito la hibridación in situ puede ser aplicada a tejidos congelados.

La hibridación in situ es menos sensible que las técnicas de hibridación en filtro como
southern y Pcr. También puede realizarse junto con inmunohistoquimica y convinada
por Pcr.

32) lectura de geles de secuenciación

Existen dos métodos mas utilizados para averiguar las secuencias de nucleótidos:

Metodo enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger:

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el

método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes
compuestos:

         El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder
secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad
de ese fragmento. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.

         Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del

bacteriofago T4.

         Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de

20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir
nucleótidos por el extremo 3' OH.

         Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de
marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los
cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.

         Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).

Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo
hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden
incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a
ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado
un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

La técnica se realiza en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada

mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y
 dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido
didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado
(ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la
cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en
el momento y lugar donde se incorpora.Por este sistema, en cada mezcla de reacción
se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud
que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el
extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se

separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy
finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir
fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los productos de cada
una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes
del gel.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película
fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de
la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la
secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base
correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción
correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' ® 3', si

comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y
avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la
secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' ® 3'.

Secuenciación Automática:

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el

método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje.
En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo
habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato
(dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el
proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis
producto de las cuatro mezclas de reacción.

La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN.

La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a
cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN
de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel,
permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden
determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

33) Lectura de cadenas de ADN, RNA y traducción a aminoácidos