Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Alcantar 2005 PDF
Alcantar 2005 PDF
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN CIENCIAS
BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS
PRESENTA:
DIRECTOR DE TESIS:
A mi nana Lolita: por recordarme su gran fortaleza de lucha y amor a la vida, por tus
cuidados, atención, amor tierno y sonrisa que me regalabas en cada regreso.
A ti madre: por darme lo mejor de ti, por otorgarme tu apoyo y confianza, por estar
siempre conmigo.
A mis hermanos, David, América Anahí y Daryl Ivan: por sus grandes cualidades y
enseñanzas.
A mis pequeños sobrinos, Sebastián y Carlos: por mantener con gran alegría la
casa de la abuela.
A mis amigas de la infancia: por encontrarnos siempre con gusto y cariño a pesar
de la distancia.
AGRADECIMIENTOS
A Dios: por permitirme alcanzar este anhelo, por ser el único y verdadero camino de
vida.
A mi asesor, Dr. John Paúl Délano Frier: por su aceptación en su laboratorio,
paciencia, constante dedicación y consejos otorgados durante mi estancia; gracias.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT): por el apoyo económico
otorgado a través de la beca con número de registro 174677.
A los doctores Jorge Molina Torres y Neftalí Ochoa Alejo: por formar parte del
comité evaluador, como por su crítica constructiva y sugerencias que aportaron al
presente trabajo de tesis.
A la Q.F.B. Norma Martínez Gallardo: por su experiencia e invaluable apoyo para
concluir este trabajo; mil gracias.
Al Q.F.B. Enrique Ramírez Chávez: por sus consejos y aporte metodológico en la
identificación de metabolitos secundarios.
A la Dra. Ma. Del Carmen Rocha Granados: por su buena disponibilidad en el
trayecto de este trabajo.
A la Q. Yolanda Rodríguez Aza y María Isabel Cristina Elizarraraz Anaya: por su
atención y tiempo recibido.
Al I.A. Javier Luevano Borroel: por su buena disponibilidad y consejos en el manejo
de M. sexta.
A mis amigos y compañeros de laboratorio: Carla, Humberto, Gloria, Hamlet y
Miriam, por su gran solidaridad, apoyo y palabras alentadoras en tiempos difíciles;
por esos momentos de alegría que pasamos.
A todos mis compañeros de generación: Victor, Pedro, Frank, Marco, Alfredo,
Javier, Gloria, Amparo y Cecilia.
A Nancy Barojas Pérez: por la amistad que se formó entre nosotras, por
escucharme y aconsejarme después de un mal momento.
A mi amigo Carlos Montoya: por compartirme su experiencia y apoyo en momentos
difíciles.
El presente trabajo de tesis fue realizado en el
Laboratorio de Fisiología de la Defensa, del
Departamento de Biotecnología y Bioquímica
de Plantas del CINVESTAV- IPN, Unidad de
Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas,
bajo la asesoría del Doctor John Paúl Délano Frier.
ÍNDICE GENERAL
Pág.
ABREVIATURAS i
ÍNDICE DE FIGURAS iii
RESUMEN X
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES 4
2.1. Mecanismos de defensa 4
2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta 5
2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta específica, gen por gen. 6
2.1.1.2. Respuesta local 8
2.1.1.3. Respuesta sistémica 9
2.2. Mecanismos de defensa en tabaco 10
2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas 13
2.3.1. Inhibidores de proteasas 13
2.3.2. Polifenol oxidasas 14
2.3.3. Oligosacáridos 15
2.4. Sistemina 16
2.4.1. Actividad y translocación de sistemina 17
2.4.2. Modelo de la ruta de señalización activada por sistemina 20
2.4.3.Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina (“sisteminas”) de tabaco 22
(TobHypSys)
2.5. Prosistemina 25
2.5.1. Expresión y supresión de la actividad de la prosistemina 26
2.5.2. Homología de la prosistemina de jitomate en plantas solanáceas 28
2.6. Metabolitos secundarios en tabaco 30
2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina) 31
2.6.2. Compuestos fenólicos 33
2.6.3. Terpenos 34
2.7. Modelo de estudio 37
2.7.1. Plantas de tabaco transformadas con prosistemina y sistemina 37
de jitomate Nt -LePS 08, Nt -LeSYS 03 y la cruza WT X Nt -LeSYS 03
Nt-LePS y Nt -LeSYS
3. HIPÓTESIS 46
4. OBJETIVOS 47
5.8.1. Derivatización 53
5.8.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas 54
(GC/MS)
9. PERSPECTIVAS 114
10. BIBLIOGRAFÍA 116
11. APÉNDICE 132
ABREVIATURAS
aa Aminoácidos
ABA Ácido abscísico
ACG Ácido clorogénico
AJ Ácido jasmónico
AMPC Adenosina Monofosfato Cíclica
AOC Ciclasa de óxido de aleno
AS Ácido salicílico
Avr Gen de Avirulencia
C-F Consumidor - Fuente
cm Centímetro
FAL Fenilalanina amonio liasa
EAS 5-epi-aristoloqueno sintasa
Et Etileno
g Gramo
GC/MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas
GRHP Glicoproteínas ricas en hidroxiprolina
GTP Guanidina trifosfato
FPP Farnesil bifosfato
HDJ Hoja distal joven (apical)
HDV Hoja distal vieja (basal)
HL Hoja local (dañada)
h Hora
HS Hoja sistémica
IP Inhibidor de proteasa
JA Jasmonato
L Litro
LOX Lipooxigenasa
i
MB Mosquita blanca
MeJA Éster metílico del ácido jasmónico
mg Miligramo
ml Mililitro
ng Nanogramo
NN Nornicotina
OGA Oligosacáridos
PF Peso fresco
PFO Polifenol oxidasa
PG Poligalacturonasa
Pin II Inhibidor de proteasa II
R Gen de Resistencia
RH Respuesta hipersensible
RP Relacionadas a patogénesis
rpm Revoluciones por minuto
RSA Resistencia sistémica adquirida
RSI Resistencia sistémica inducida
µg Microgramo
µl Microlitro
ii
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 14. II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con 41
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).
iv
Figura 18. Vista general de la magnitud del daño causado por larvas de 45
M. sexta en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas
(Nt-LePS y Nt-LeSYS).
vi
Figura 31. Comparación entre los niveles de nicotina en plantas WT y 73
transgénicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia
tabaci (28 días después de la oviposición). Los asteriscos indican la
diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).
ix
RESUMEN
xi
I. INTRODUCCIÓN
1
almacenar nicotina (Saunders y Bush, 1979; Sinclair et al., 2004). Además, se ha
demostrado que el ataque por insectos herbívoros en N. sylvestris y N. attenuata
incrementa dramáticamente la síntesis y acumulación de nicotina (Baldwin et al.,
1998,1999). Ahora se sabe que la acumulación de nicotina inducida por herida
es regulada por el ácido jasmónico (AJ), este último se produce inicialmente en
la hoja y posteriormente transportado hacia la raíz, que es el órgano dónde se
sintetiza la nicotina y de donde se distribuye al resto de la planta (Baldwin et al.,
1997; Zhang y Baldwin, 1997). En N. attenuata, el tratamiento con jasmonato
indujo la acumulación de nicotina en la planta, la cual se relacionó positivamente
con una resistencia durable hacia el herbívoro (Baldwin et al., 1998). Estos
resultados están de acuerdo con la multiplicidad de funciones que se le han
asignado al AJ, considerado como una hormona vegetal capaz de modular, entre
otras respuestas, el metabolismo secundario en respuesta a estrés biótico y
abiótico (Creelman et al., 1997). Esta capacidad fue ampliamente confirmada en
estudios en los cuales se reportó que la aplicación exógena de AJ indujo la
acumulación de una gran variedad de metabolitos secundarios en cultivos
celulares y en plantas de diversas especies, incluyendo alcaloides (Gundlanch
et al., 1992; Aerts et al., 1994) y compuestos fenólicos. (Lee et al., 1997).
Además de la nicotina y ACG, otros reportes han mostrado una estrecha
relación entre la síntesis y acumulación de los diterpenos glicosilados en tabaco,
como los 16-hidroxigeranil linalool A y B, y la resistencia contra Heliothis
virescens. En concordancia con su función defensiva, este metabolito solo ha
sido detectado en genotipos resistentes a este herbívoro (Snook et al., 1997).
En jitomate (Lycopersicon esculentum) se descubrió que la sistemina,
liberada a partir de la prosistemina, su proteína precursora, es un polipéptido
involucrado en la inducción sistémica de proteínas en respuesta al daño, las
cuales se sugiere que confirieren resistencia contra agresores bióticos. Al igual
que la respuesta al daño mecánico y a otros evocadores activos como
oligogalacturónidos derivados de la fragmentación de la pared celular, la actividad
biológica de la sistemina es dependiente de AJ. En un trabajo previo, del cual se
derivó la presente investigación, se generaron plantas transgénicas de tabaco
capaces de sobreexpresar constitutivamente tanto la prosistemina (LePS) como la
sistemina (LeSYS) de jitomate. Estas plantas mostraron diferentes grados de
resistencia a herbivoría por larvas de Manduca sexta, la cual curiosamente no se
2
correlacionó muy claramente con la acumulación de altos niveles de proteínas
defensivas, como polifenoloxidasas (PFO), inhibidores de tripsina (IT) y
quimotripsina (IQT), solo se detectaron niveles altos en una de las líneas
sobreexpresantes de LeSYS. Éstas últimas presentaron, además, un fenotipo
severamente anómalo, caracterizado por enanismo, morfología alterada de las
hojas y flores, floración precoz y esterilidad (Rocha-Granados, 2004). De manera
que en este trabajo se analizó la posibilidad, previamente demostrada en otras
especies de plantas, de que la resistencia diferencial contra larvas de insectos
herbívoros así como las alteraciones morfológicas y fisiológicas observadas en
una de las líneas de N. tabacum sobreexpresantes de LeSYS, pudieran haberse
debido a una modificación en la síntesis y acumulación de metabolitos
secundarios causada por la expresión de LePS y LeSYS. Para ello, se
compararon los patrones de acumulación de nicotina, ACG, nornicotina (NN),
dihidrocapsenona y compuestos fenólicos totales entre plantas no modificadas
(WT) y plantas transformadas en diferentes estadios de desarrollo y en respuesta
a daño mecánico o infestación por insectos. Los resultados obtenidos indican que
la expresión de LePS y LeSYS en N. tabacum modifica el patrón de acumulación
de metabolitos secundarios, lo que podría estar relacionado con la resistencia
diferencial observada contra larvas de insectos herbívoros, e inclusive, con el
fenotipo severo que caracteriza a una de las líneas sobreexpresantes de
sistemina (Nt-LeSYS 03).
3
2. ANTECEDENTES
4
enzimas involucradas en la síntesis de alcaloides, inhibidores de proteasas,
enzimas de carácter defensivo como la polifenol oxidasa (PFO) y péptidos
antimicrobianos como las defensinas y tioninas, pertenecen al grupo de defensas
inducibles.
Las respuestas defensivas inducibles pueden activarse de manera
localizada, en el área de daño, o bien tener efecto sistémico al activarse en la
planta completa. La eficiencia de los mecanismos defensivos depende
estrictamente de la velocidad de proliferación del agresor y del tiempo necesario
para el reconocimiento del mismo por el huésped y de la subsiguiente activación
de las defensas (Dong, 1998). Como ejemplo de las defensas inducibles se
encuentra la síntesis y acumulación de especies reactivas de oxígeno,
metabolitos secundarios como compuestos fenólicos, alcaloides, terpenos, etc.
(agrupados bajo el término fitoalexinas), enzimas hidrolíticas como quitinasas y
glucanasas, y la acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis,
conocidas como proteínas RP (Osbourn., 1996; Agrawal et al., 1999; Richael y
Gilchrist., 1999).
Estos tipos de mecanismos de defensa se mencionarán más
ampliamente en los siguientes subíndices.
5
2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta específica, gen por gen
6
del flujo de iones H+, K+, Cl- y Ca2+ desde y hacia la célula y la formación de
H2O2 (estallido oxidativo) (Apostol et al., 1989; Nürberger et al., 1994; Roberts y
de Bruxelles, 2001). Después de 5 a 30 minutos, se inicia la fosforilación
dependiente de calcio de algunas proteínas, que inducen una síntesis rápida de
etileno y la activación transcripcional de muchos genes relacionados con la
defensa (Dietrich et al., 1990). De manera temporal, el estallido oxidativo y la
fosforilación/desfosforilación de proteínas, parecen estar controlados por la
activación de canales iónicos, pero su posible relación causal con otros
componentes de la cadena de transducción de señales que conducen a la
activación de respuestas, como por ejemplo proteínas que enlazan GTP, inositol,
AMPc, etc., aún se desconoce. Las células vegetales tienen la capacidad de
reconocer un patógeno potencial y de transmitir esta información dentro de la
célula y células vecinas, para mantener y optimizar las respuestas de defensa
(Basse et al., 1993; Nürberger et al., 1994). La interacción entre evocador-
receptor es el punto de partida para la traducción de señales que activa la
expresión de genes involucrados en la resistencia, ya sea del tipo “no especifico”
que como se indicó anteriormente se induce por diversos evocadores no
específicos reconocidos por numerosas especies, e inclusive géneros, de
plantas resistentes a toda una raza de patógenos, o los de tipo “especifico”,
donde el evocador es el producto de un gen de avirulencia (Avr) del patógeno, y
el receptor, el correspondiente producto del gen de resistencia R, en la planta
(Grant y Loake, 2000).
En la mayoría de los casos, la interacción entre los productos de los
genes R y Avr inicia cascadas de señalización que dan lugar a la reacción
hipersensible (RH) y resistencia sistémica adquirida (RSA). La RH consiste en
una necrosis rápida y localizada en el sitio de daño, actúa directamente contra el
patógeno, mediante la citotoxidad de las especies reactivas de oxígeno, como el
anión superóxido (O2-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), que participan en el
estallido oxidativo (Apostol et al., 1989). Además, se caracteriza por la
acumulación de compuestos fenólicos alrededor de las células atacadas,
fragmentación del ADN, condensación citoplasmática y muerte celular
programada, procesos similares a la apoptosis que se observa en células
animales (Birch et al., 1999).
7
Junto con la RH, en la planta se pueden presentar diferentes cambios
estructurales, moleculares, bioquímicos y/o fisiológicos que ocurren poco tiempo
después del ataque patogénico y tienen lugar tanto en el sitio de daño como en
la periferia (respuestas locales) o, más tardíamente, en zonas distantes a éste
(respuestas sistémicas).
8
son acompañados posteriormente por la síntesis de AS, AJ y/o otros compuestos
que son señales necesarias para la activación génica (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
Los diferentes cambios estructurales, moleculares, bioquímicos y/o
fisiológicos que ocurren poco tiempo después del ataque patogénico, tienen
lugar tanto en el sitio de daño como en su periferia (respuestas locales) o, más
tardíamente, en zonas distantes a éste (respuestas sistémicas).
9
Además de la RSA, existe otro tipo de respuesta denominada Resistencia
Sistémica Inducida (RSI) que también provee protección contra una amplia gama
de patógenos. Esta respuesta, que es inducida por rizobacterias promotoras del
crecimiento, no depende de AS, no está asociada a la RH ni a la síntesis de
proteínas RP, está regulada por el ácido jasmónico, el etileno y la proteína
reguladora NPR-1 (Pieterse et al., 1996, 1998; Van Loon et al., 1998; Knoester et
al., 1998).
Se cree que el etileno funciona como inductor en la síntesis de
compuestos, genes o estructuras defensivas como lignina, proteínas RP y
fenilalanina amonio liasa (FAL). Por otra parte, existe una ruta defensiva
comúnmente conocida como la ruta octadecanoica que involucra AJ o su éster
metílico (MeJA) para inducir, principalmente, la síntesis de inhibidores de
proteasas (IP) en respuesta a herbivoría (Peña-Cortés et al., 1989; Farmer y
Ryan, 1992).
Existen varios ejemplos de la inhibición de una vía por la otra. Por
ejemplo, en plantas heridas tratadas simultáneamente con AS, se inhibe la
acumulación de IP y PFO, que son respuestas típicas producidas por herbivoría,
y reguladas por AJ (Stout et al., 1999). A su vez, también se ha observado la
interferencia del AJ en la resistencia mediada por AS contra ciertos patógenos,
manifestándose como la disminución de la síntesis de algunas proteínas RP
(Sano y Ohashi, 1995; Niki et al., 1998).
10
otras plantas, las defensas inducibles pueden clasificarse como directas e
indirectas. Dentro del primer tipo se incluyen los inhibidores de proteasas, (van
Dam et al., 2001; Glawe et al., 2003) diterpenos glicosilados (Keinänen et al.,
2001) y metabolitos secundarios como la nicotina (Winz y Baldwin, 2001;
Steppuhn et al., 2004) capsidiol (Guedes et al., 1982; Bohlmann et al., 2002) y
ácido clorogénico (Tanguy y Martin, 1972; Lou y Baldwin, 2003).
A su vez, la defensa indirecta se considera como aquella que depende de
un tercer nivel trófico, representado por insectos depredadores o parásitos de los
insectos herbívoros, los cuales son atraídos hacia la planta atacada mediante la
emisión inducida de compuestos volátiles (Halitschke et al., 2000). En N.
attenuata, el daño mecánico y el ataque por M. sexta ocasiona un incremento de
los niveles de AJ, el cual está relacionado con la acumulación de metabolitos
secundarios, inhibidores de proteasas y la síntesis de novo de volátiles. En esta
especie, la inducción de defensas se presenta tanto a nivel local como sistémico,
particularmente en las hojas conectadas filotácticamente, mientras que los
volátiles se inducen en toda la planta. Sin embargo, el ataque a N. attenuata por
M. sexta no origina un aumento de nicotina ya que el incremento simultáneo de
etileno inhibe la expresión de putrescina N-metiltransferasa, que es una de las
enzimas clave en la biosíntesis de nicotina. Este patrón de expresión de
respuestas defensivas ha sido estudiado con particular detalle en especies
silvestres de Nicotiana (e.g., N. sylvestris y N. attenuata) (McCloud y Baldwin,
1997; Lou y Baldwin, 2003; Qu et al., 2004), (Ver Figura 1).
11
DEFENSAS EN TABACO
ATAQUE CON
Defensas
Manduca sexta MeJA Volatiles indirectas
Defensas
daño Diterpenos
AJ directas
glicosilados,etc.
IPs
regurgitante Et
Metabolitos
PMT nicotina
Putrescina secundarios
12
2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas
Los IP son proteínas con gran afinidad por enzimas proteolíticas, capaces
de inhibir fuerte y específicamente su actividad enzimática (Richardson, 1991).
Los inhibidores de proteasas se acumulan de manera constitutiva, pueden ser
inducibles por daño causado mecánicamente, por insectos o por patógenos. Las
evidencias experimentales indican que su efecto protector radica en la inhibición
de enzimas que son esenciales para la digestión de proteínas (Ryan, 1981; de
Bruxelles y Roberts, 2001). Éstos fueron primeramente descritos con detalle en
plantas solanáceas. Sin embargo, hoy en día se ha encontrado que los IP son
expresados en semillas, tubérculos y tejidos vegetativos de más de 100 especies
diferentes de plantas, muchos de los cuales se acumulan después de sufrir algún
tipo de daño (Kessler et al., 2002).
La clasificación de los IP se basa en el tipo de proteasa (o proteasas) que
son capaces de inhibir: serina, cisteína, aspártico y las metalo proteasas. Los
inhibidores de estas enzimas producidas por plantas afectan el crecimiento y
desarrollo de plagas al interferir en la degradación de proteínas de origen foliar.
El argumento más aceptado es que el efecto defensivo se produce como
consecuencia de los efectos antinutricios que se presentaran en los insectos
13
alimentados con plantas que sintetizan altas concentraciones de IP, los cuales
están relacionados con la pérdida de la asimilación de algunos aminoácidos
esenciales, especialmente los sulfurados, debido a una secreción excesiva de
tripsina (Ryan, 1990).
La síntesis de estas enzimas se inicia con la liberación de evocadores,
inducidos por algún tipo de daño; la respuesta se lleva a cabo de manera local y
al mismo tiempo se inicia la activación de mecanismos de transducción de
señales para iniciar la respuesta sistémica (Schaller y Ryan, 1995).
Se considera que la amplia distribución de los IP en tejidos de
almacenamiento y en distintas familias de plantas, su inducibilidad por daño
mecánico y herbivoría, así como su efecto protector en plantas transgénicas, son
criterio suficiente para atribuirles una función como proteínas de defensa contra
herbívoros.
14
Durante el proceso de alimentación del insecto, las PFO tienen acceso a
sus sustratos y generan orto-quinonas a partir de compuestos fenólicos
presentes en la dieta. Estas tienen un efecto nocivo en el huésped ya que
pueden formar enlaces covalentes con grupos sulfhídrilo de aminoácidos
sulfurados y con aminoácidos básicos, como la lisina. La modificación química
de estos aminoácidos provoca eventualmente precipitación de las proteínas, lo
cual altera de manera significativa la digestión y la asimilación de nitrógeno en el
insecto (Felton et al., 1992).
2.3.3. Oligosacáridos
15
2.4. Sistemina
16
coiled”) es debido a estos dos pares de residuos de prolina presentes en su
secuencia. Se sabe, también, que las poliprolinas son motivos estructurales
empleados para la unión con otras proteínas (Ferris et al., 2001); se especula
que esta característica podría ser importante para el reconocimiento de
sistemina por su receptor.
+H3N-AVQSKPPSKRDPPKMQTD-COO-
1 5 10 15 18
17
afectaban su actividad inductora, se utilizó una sistemina sintética análoga que
contenía una sustitución con Ala en cada aminoácido del polipéptido. Se observó
que las sustituciones por Ala en los residuos 2-6, 8, 9 ,10, 14 y 15 producían
pequeños cambios en la actividad, indicando que estos aa eran relativamente
poco importantes en la actividad de la sistemina, mientras que las sustituciones
en los residuos 12 y 13 correspondientes a uno de los dos pares de prolinas
causó una reducción drástica de la actividad biológica, mientras que la
sustitución en la posición 17 (Thr) abolió completamente la actividad inductora de
la sistemina (Figura 3). De este resultado surgió la hipótesis de que la treonina
es fosforilada como parte del proceso de señalización, la cual no ha podido hasta
el momento ser validada o desechada.
18
En experimentos en los que se utilizaron sólo los 14 aa del extremo amino
terminal de una sistemina análoga, se detectó la unión a la membrana celular de
Lycopersicon peruvianum, la cual compitió con la sistemina natural por el sitio de
unión, mientras que la secuencia (Met-Gln-Thr-Asp) del extremo carboxilo no
presentó este comportamiento (Meindl et al., 1998). De este comportamiento
surgió un modelo para explicar el mecanismo de unión ligando-receptor, en el
cual se sugiere que el extremo amino terminal es el que se une inicialmente al
receptor para permitir la generación de los cambios conformacionales que
permitirán la posterior unión del extremo carboxilo terminal y el inicio de las
cascada de señalización (Meindl et al., 1998).
Análisis autorradiográficos y el uso del microscopio de luz, revelaron que
14
al aplicar sistemina marcada con C o 3H en hojas heridas de plantas de
jitomate, ésta se difundía a través de toda la hoja después de 30 min, mientras
que a los 90 min la radioactividad era detectada en las hojas apicales de las
plantas. A su vez, se observó que la aplicación de sistemina marcada con 3H se
concentró en el xilema y el floema de las nervaduras de la hoja herida 15
minutos después de su aplicación. Después de 30 min, la radioactividad se
encontró principalmente en los tejidos vasculares del peciolo, y a los 90 min, la
marca fue encontrada en el floema del tallo principal de las plantas. Los análisis
autorradiográficos, bioquímicos e histológicos, sugerían fuertemente que la
sistemina marcada radioactivamente y aplicada a hojas de jitomate heridas, era
translocada inicialmente al apoplasto o espacio intercelular, posteriormente al
tejido vascular de las nervaduras menores y al simplasto de las células
acompañantes del complejo de tubos cribosos, y finalmente a los tejidos distales
a través del floema. Con estos resultados se obtuvieron fuertes evidencias a
favor del transporte de la sistemina desde el sitio de la herida hacia los tejidos
distales de la planta (Narváez-Vázquez et al., 1995).
19
2.4.2. Modelo de la ruta de señalización activada por sistemina
20
SISTEMINA K+, Cl
Ca2++
H-ATP
R S -1 6 0
MP PLA2
P Ca+
Ca2+ H+
Ác. linolé
linolénico
MAPK
Ca2+
PK Reducció
Reducción
vacuola
β--Oxidació
Oxidación (3)
o
Activació
Activación
génica COOH
Ác. jasmónico
21
2.4.3. Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina (“sisteminas”) de tabaco
(TobHypSys)
22
suspensiones celulares de jitomate y la síntesis de inhibidores de proteasas en
plantas de jitomate, indicando que los receptores de jitomate puedan reconocer a
las llamadas sisteminas de tabaco (Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina),
activando la misma señalización activada por la sistemina de jitomate (LeSYS).
Debido a que el precursor de las sisteminas de tabaco, proTobHypSys, se
encuentra hidroxilado y glicosilado, puede asociarse con la pared celular, como
se demostró para el precursor proTomHypSys en jitomate (Narváez-Vázquez et
al., 2005), y posiblemente puede ser procesado en el sitio de daño para inducir
señales de amplificación en la síntesis de oxilipinas (Ryan y Pearce, 2003).
Recientemente se aislaron de hojas de jitomate tres polipéptidos glicosilados e
hidroxilados de 15, 18 y 20 aa (TomHypSys), similares en la estructura básica a
TobHypSys I y II, los cuales inducen fuertemente la alcalinización cuando se
adicionan a cultivos celulares de jitomate y tabaco. En tabaco, la respuesta a
daño activa sistemicamente la síntesis de inhibidores de tripsina los cuales son
homólogos a los inhibidores II de jitomate (Pearce et al., 1993b).
TomSys +
H2N- A V Q S K P P S K R D P P K M Q T D-COO-
TomHypSys I +
H2N-
R T O Y K T O O O O T S S S O T H H -COO-
TomHypSys II +
H2N- G R H D Y V A S O O O O K P Q D E Q R Q-COO-
H2N- G R H D S V L P O O S O K T D -COO-
+
TomHypSys III
TobHypSys II +
H2N- N R K P L S O O S O K P A D G O R P-COO-
23
La utilización de dos TobHypSys sintéticas, carentes de carbohidratos,
indujo una débil alcalinización en cultivos celulares de tabaco en suspensión y
una débil inducción de inhibidores de tripsina en hojas de tabaco, indicando que
la modificación con cadenas laterales de carbohidratos favorece la actividad
biológica de los glicopéptidos ricos en hidroxiprolina. Al sustituir con alanina la
arginina (R) en la región amino terminal, ácido glutamico (E) en el extremo C-
terminal y en la hidroxiprolina en posición 15 de TobHypSys I, se eliminó por
completo la inducción de actividad de este polipéptido. Además, sustituciones en
las hidroxiprolinas en posición 10 y 14 redujeron drásticamente la actividad del
glicopéptido. A su vez, las sustituciones con alanina en arginina (R) y asparagina
(N) en la región amino terminal redujeron severamente la actividad de
TobHypSys II sintéticas (medida como la capacidad de causar la alcalinización
del medio extracelular al ser aplicados a cultivos celulares de N. tabacum), así
como también la sustitución en el extremo carboxilo terminal de la arginina en la
posición 17, hidroxiprolina en la posición 10 y prolina posición 18,
respectivamente (Pearce et al., 2001) (Figura 6).
24
Figura 6. Actividad de TobHypSys I y TobHypSys II sintéticas, carentes de
modificaciones con cadena de oligosacáridos y con sustituciones de alanina en
cada uno de sus aminoácidos.
2.5. Prosistemina
25
planta, al facilitar el procesamiento de la prosistemina en respuesta a heridas y
promover una rápida carga de la sistemina en el floema, donde puede ser
rápidamente transportada a través de la planta (Jacinto et al, 1997; Li et al.,
2002a; Ryan y Moura, 2002; Narváez-Vázquez y Ryan, 2004; Scilmiller y Howe,
2005).
26
200
180
27
prosistemina radica básicamente en la región carboxilo terminal, donde está
ubicada la sistemina. Sin embargo, no descartaban la posibilidad de que la
región amino terminal podría estar involucrada en otros procesos de señalización
o bioquímicos, así como en el reconocimiento y anclaje de la prosistemina al
receptor SR 160, localizado en la membrana plasmática de las células de
jitomate.
28
daño y tiene, además, un sistema bien definido de señalización entre las hojas y
la raíz mediado por ácido jasmónico, el cual es responsable de la acumulación
de nicotina en raíz (Zhang y Baldwin, 1997).
A 200
180
Inhibidor I (ug/ml extracto)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
25 M
25 M
pM
25 M
2O
pM
2. M
fM
fM
fM
fM
fM
p
p
p
H
0
0
25
25
5
5
25
25
2.
2.
2.
PS 185 PS 113 PS∆SYS PS A195
B 180
160
Inhibidor I (ug/ml extracto)
140
120
100
80
60
40
20
0
25
0. 5
0. 5
25
0
5
5
5
r
2
25
f fe
2.
2.
2.
2.
02
02
02
02
0.
0.
0.
0.
0.
0.
Bu
29
Como se indicó anteriormente, el análisis de varias genotecas de ADNc
de hojas de tabaco reveló la presencia de dos prosisteminas, denominadas pro-
TobSys-A (165 aa) y pro-TobSys-B (164 aa), a partir de las cuales son liberadas
dos sisteminas mayoritarias (TobSys I y TobSys II) y una minoritaria (TobSys Ia)
(Pearce et al., 2001). En tabaco, el precursor ppTobHS-A se indujo en respuesta
a múltiples estímulos, incluyendo daño mecánico, AJ, ácido abscísico, herbivoría
por M. sexta e infestación con B. tabaci. Su expresión generalmente precedió a
la acumulación de transcritos de inhibidores de proteasa del tipo I y II y otros
genes de indole defensiva en tabaco, como una dioxigenasa inducida por
patógenos, por lo que se sugiere que al igual que LeSYS, TobSys juega un papel
importante en la regulación de respuestas defensivas en N. tabacum, tanto a
nivel local como sistémico (Rocha-Granados et al., 2005).
30
de las condiciones ambientales (Saitoh et al., 1985; Snook et al., 1986; Sisson y
Severson, 1990). Como se mencionó líneas arriba, el AJ juega un papel
fundamental en la regulación de la síntesis de novo de numerosos metabolitos
secundarios en cultivos celulares y en plantas de varias especies incluyendo los
alcaloides, terpenos, y compuestos fenólicos (Rickauer et al., 1997; Memelink et
al., 2001).
En N. tabacum y otras especies de Nicotiana, se ha comprobado el papel
fundamental de ciertos metabolitos secundarios en la defensa contra patógenos
e insectos plaga. Un ejemplo muy evidente de esta función se obtuvo de plantas
transgénicas de tabaco capaces de expresar constitutivamente la fitoalexina
resveratol, las cuales exhibieron una marcada resistencia contra el hongo
Botrytis cinerea (Hain et al., 1993).
31
la respuesta al ataque es el incremento sistémico en la producción de dos
defensas directas: inhibidores de proteinasa (Glawe et al., 2003; van Dam et al.,
2001; Zavala et al., 2004a, 2004b) y nicotina (Baldwin, 2001). Los inhibidores de
tripsina interfieren en el aprovechamiento de proteinas esenciales durante la
digestión, afectando de igual modo el crecimiento y desarrollo del herbívoro
(Glawe et al., 2003; Zavala et al. 2004b). La nicotina puede actuar como toxina
defensiva, ya que se une a receptores de acetilcolina, interfiriendo así con el
sistema nervioso central (Wink, 1998). Ambas defensas se producen en distintas
partes de la planta: raíz y tallo, respectivamente (Figura 9). La nicotina es
seguida por la nornicotina en cuanto a abundancia, ya que este alcaloide
constituye el 3% y el 6% del total de alcaloides en hojas y raices de N. tabacum,
respectivamente (Saitoh et al., 1985). Se sintetiza a partir de la desmetilación de
nicotina mediante un proceso oxidativo que involucra intermediarios cargados
positivamente (Botte et al., 1997).
N N
H
CH3
N N
32
2.6.2. Compuestos fenólicos
33
O
O
HO NH2
N CO2H
H
HO
Ácido salicílico
Cafeoilputrescina
O
O
COOH
HO OH
OH OH
OH
OH
Ácido clorogénico
2.6.3 Terpenos
34
Los terpenos poseen un número importante de funciones en las plantas
(Kleining, 1989; Rodríguez-Concepción y Gruissem, 1999). Con respecto a
funciones defensivas en tabaco, varios reportes indican que los diterpenos
glicosilados 16-hidroxigeranilinalool A y B en tabaco implican antibiosis contra
Heliothis virescens F. ya que sólo se encuentran presentes en variedades
resistentes de N. tabacum (Snook et al., 1986).
Un sesquiterpeno de gran importancia en chile (Capsicum annuum),
tabaco y otras plantas solanáceas es el capsidiol. Su acumulación en estas
plantas, la cual es inducida por factores bióticos y abióticos, limita la dispersión
de patógenos en los tejidos infectados. Sin embargo, es un metabolito inestable
ya que sus niveles en plantas decaen rápidamente después de su síntesis
(Lozoya-Gloria, 2004). Numerosos reportes indican que la acumulación de
capsidiol en las hojas de plantas de N. tabacum se debe casi exclusivamente en
respuesta a patógenos (sin embargo consultar Bohlmann et al., 2002).
A su vez, algunos diterpenos (duvanos y labdanos) son componentes de
la capa de cutícula en hojas de tabaco cuya presencia se ha asociado con
resistencia a insectos masticadores (H. virescens) y chupadores (el áfido M.
persicae) (Johnson y Severson, 1982). Recientemente, se descubrió también
que un diterpeno tipo labdano llamado WAF-1, actúa como una señal endógena
durante la activación de respuestas defensivas contra daño mecánico y la
infección por el virus del mosaico del tabaco (Ohashi et al., 2003).
35
O OH
HO HO
O O
Capsidiol Dihidrocapsenona
CH3
O O
O CH2OH
OH OH O O
CH2
OH O OH
OH O
OH
OH CH3
OH O
OH OH
OH
16-hidroxigeranilinalool
OH
WAF-1
36
2.7. Modelo de estudio
37
2100
ACTIVIDAD ESPECIFICA.
1800
IT
1500
1200
HL
900
HS
600
300
0
0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24
16
14
PFO
D.O./min/mg proteína
12
10
8
HL
6
HS
4
2
0
0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24
200
180
PG
160
nmol/min/mg proteína
140
120
100
HL
80
HS
60
40
20
0
0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24
38
2.7.2. Alteraciones morfológicas y fisiológicas en la línea Nt -LeSYS
03.
La línea Nt-LeSYS 03 mostró una acumulación altamente significativa de
actividad inhibitoria contra tripsina (IT), quimotripsina (IQT) y PFO. Además, esta
línea se caracterizó por desarrollar un fenotipo con numerosas alteraciones
morfológicas y fisiológicas, las cuales de describen a continuación: hojas más
pequeñas y lanceoladas (Figura 13, B y D), con numerosas regiones necróticas
sobre la superficie de sus hojas, semejantes a las generadas durante la reacción
hipersensible en una interacción planta-patógeno incompatible; senescencia más
acelerada de sus hojas; desarrollo y crecimiento más rápido de los brotes
laterales, aunque de mucho menor tamaño que la planta sin transformar (Figura
13 A y 14 B); ausencia de un pecíolo bien definido, el cual más bien semeja una
prolongación de la hoja (Figura 15 B) y alteraciones morfológicas en flores, que
fueron más pequeñas y con estambres de talla menor al pistilo, lo cual contrastó
con las flores de plantas de tabaco WT, que normalmente desarrollan estambres
largos que sobresalen del pistilo para permitir la caída del polen maduro sobre
éste y así asegurar la autofecundación (Figura 14 A, Figura 15 D y G a la
derecha, a la izquierda en 15 F y 15 G). Además, los sacos polínicos de las
plantas Nt-LeSYS 03 produjeron muy poco polen. Es muy probable que estas
dos anomalías se combinaron para impedir su autofecundación natural. La
fecundación fue altamente ineficiente, ya que la mayoría de las cápsulas
producidas estaban vacías y solamente en algunas se encontró semilla.
Además, las pocas semillas producidas por las plantas Nt-LeSYS 03 germinaron
mucho más lentamente que las semillas de las plantas no transformadas. De
modo que no se observó emergencia después de un mes de haber sembrado las
semillas de las plantas transformadas, mientras que la germinación de las
semillas de plantas control no tardó más de 3 semanas (Figura 15 A) (Rocha-
Granados, 2004). Por estas características se optó por cultivar esta línea in vitro
para agilizar la generación de las plantas necesarias para los experimentos.
39
CRECIMIENTO
A B
WT Nt-LeSYS 03 WT Nt-LeSYS 03
WT Nt-LeSYS 03
Nt-LeSYS 03
40
Figura 14. II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). Observese en el panel (A) hacia la izquierda
que el pístilo sobresale de los estambres. En el panel B se muestra la
generación espontánea en la superficie de las hojas de regiones necróticas
localizadas semejantes a las que se forman durante la reacción hipersensible.
41
GERMINACIÓN FLORACIÓN ANORMAL
A D F
E
DESARROLLO DEL PECIOLO
B B C
Figura 15. III. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con
sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). En el panel (A), la semilla de las plantas Nt-
LeSYS 03 presentó un claro retardo en la tasa de germinación, y el desarrollo
subsiguiente de las plántulas fue muy lento con respecto al control, mientras que
en los paneles (B) y (C) las flechas señalan las diferencias en el desarrollo de los
pecíolos de las hojas entre plantas control (B) y las plantas Nt-LeSYS 03 (C). En
los paneles D, E y F, se muestran diferencias morfológicas observadas en las
flores de plantas Nt-LeSYS 03 con respecto al testigo. La fotografía del panel (G)
muestra que las flores de las plantas Nt-LeSYS 03 (derecha) son más pequeñas
que las flores de la planta WT (izquierda). Además, los estambres de las plantas
Nt-LeSYS 03 fueron mas cortos (E, a la Izquierda, F, a la derecha), que los
desarrollados en las plantas control (D, a la derecha, F, a la izquierda) y no
produjeron suficiente polen (tomado de Rocha-Granados, 2004).
42
2.7.3. Resistencia a herbivoría por larvas de Manduca sexta en
plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS
43
Control Transform adas
A B
Figura 16. Larvas de Manduca sexta antes (A) y 6 días después (B) de haber
sido alimentadas con plantas de tabaco sin transformar (B, a la izquierda) o con
plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS (B, a la derecha) (Tomado de Rocha-Granados,
2004).
a
10
Lo ng itu d
Peso (g) y longitud (cm)
b P eso
8
c
6
d
4
44
LePS
LePS
Control
Figura 18. Vista general de la magnitud del daño causado por larvas de M. sexta
en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas (Nt-LePS y Nt-
LeSYS) (Tomado de Rocha-Granados, 2004).
45
3. HIPÓTESIS
46
4. OBJETIVOS
47
5. MATERIALES Y MÉTODOS
48
Composición del medio de cultivo
Sacarosa o azúcar comercial 30 g
Sales de Murashige y Skoog 4.32 g
Mioinositol 1g
Vitaminas de Murashige y Skoog 1 ml
Bencil amino purina 0.5 mg/l
Agar 8g
Nota: ajustar el pH=5.7 ± 1, antes de agregar el agar,
cristalizar el medio por 10 minutos en el horno de microondas
y esterilizar a 121 ºC por 20 min.
49
Solución “stock” Concentración final Mezcla
(ml)
NaH2PO4 al 1 M 100 Mm 10.0
EDTA 0.5 M pH 8 10 Mm 20.0
Ferrocianuro de 0.5 Mm 10.0
potasio 0.005 M, pH 7
X-Gluc 0.02 M* 1 mM 1.0
Triton X-100 10% 0.1 % 0.1
Agua destilada _ 58.9
Una vez preparada la solución “stock”, se esterilizó por filtración (0.22 µm) y se
almacenó en la oscuridad a 4 °C.
50
fueron colectadas 5 días después de haber aplicado el daño (respuestas
sistémicas).
5.5. Bioensayos
51
5.5.2. Infestación con mosquita blanca (Bemisia tabaci)
52
rpm y a la misma temperatura. Los sobrenadantes obtenidos se filtraron y fueron
utilizados inmediatamente para el análisis de los metabolitos de interés.
5.8.1 Derivatización
53
sililtrifluoracetamina (MSTFA). La nueva mezcla reactiva se incubó a 37 °C por
30 minutos. Las mezclas derivatizadas se dejaron reposar por dos horas a 25 ºC
antes de inyectar la muestra al sistema GC/MS. La metoximación y la
trimetilsilanización están diseñadas para permitir la derivatización y análisis de
hidroxi y amino ácidos, alcoholes, azúcares, poliaminas y ácidos aromáticos,
entre otros (Fiehn et al., 2000).
54
de chile ancho (Capsicum annuum) tratado con hemicelulasa de Aspergillus
niger (Brooks et al., 1985). Los estándares se derivarizaron igual que las
muestras, a excepción de la nicotina, la cual se diluyó con metanol e inyectó
directamente. Para la derivatización, se tomaron 10 µl de cada una de las
muestras empleadas para generar las curvas tipo, las cuales se evaporaron a
sequedad, para ser posteriormente derivatizadas en las mismas condiciones que
se emplearon para las muestras problema. Cada punto de la curva de calibración
se preparó por duplicado y se evaluó por GC/MS.
Los resultados obtenidos fueron analizados para obtener las curvas de
calibración de cada uno de los metabolitos, incluyendo sus respectivas
pendientes y coeficientes de correlación r (que fueron superiores a 0.95 en todos
los casos). Con estas curvas se obtuvieron las ecuaciones para cuantificar cada
uno de los metabolitos de interés (ver apéndice).
55
6. RESULTADOS
56
Abundance
TIC: NT193b.D
1.2e+07
1.1e+07
1e+07
9000000
8000000
7000000
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000 *
15.83
T
* *
48.83
32.78
1000000 *20.05
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
Time-->
57
Abundance
A *
15.80
TIC: nic102a.D
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
Time-->
Abundance
400000
350000
300000
250000
200000 133
150000
161
100000
42
50000 119
51 65 92
77
30 58 99105 145
0
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
m/z-->
58
Abundance
A TIC: NT193b.D
4000000
3500000
3000000
14.84
2500000
2000000 ٭
15.83 16.74
1500000
1000000 15.39
15.35 16.82
18.57
14.20
500000
15.70 19.02
14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 19.00
Time-->
Abundance
400000
350000
300000
250000
200000 133
150000
161
100000
42
50000 119
65
105 145 207 299
0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z-->
59
Abundance
1.25e+07
TIC: clorogenico30a.D
*
48.90
1.2e+07
1.15e+07
1.1e+07
A
1.05e+07
1e+07
9500000
9000000
8500000
8000000
7500000
7000000
6500000
6000000
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
47.22
Abundance
450000
400000
73
350000
300000
200000
150000
147
100000
219
191
50000 397
372
103 167 283 419
45 127 462 491
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
m/z-->
60
Abundance
750000
700000
650000
600000
550000
500000
450000
400000
*
48.83
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
46.50 47.00 47.50 48.00 48.50 49.00 49.50 50.00 50.50 51.00 51.50 52.00
Time-->
Abundance
50000
45000
73
40000
35000
20000
15000 147
10000
191 219
397
5000 372
45 103123 167 283 419
326 462
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
m/z-->
61
Abundance
1100000
A TIC: estCAP1.D
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
*
300000 * 32.35
32.18
200000
100000
0
31.8031.90
32.0032.10
32.2032.3032.40
32.5032.60
32.7032.80
32.9033.00
33.10
Time-->
Abundance
32000
B 73
Scan 5393 (32.187 min): estCAP1.D
30000
28000
26000
24000
22000
20000
18000
16000 319
14000
147
12000
10000
8000 220
6000
189
4000 103 243
2000 45 169
271291 361 451
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
m/z-->
62
Abundance
TIC: estCAP1.D
1100000
A
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000 *
300000 *
32.18
32.35
200000
100000
0
31.8031.90
32.0032.10
32.2032.3032.40
32.5032.60
32.7032.80
32.9033.00
33.10
Time-->
Abundance
B
24000
23000
22000
21000
20000
19000 275
18000
290
17000
16000
15000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000 219
249
5000
4000 117
91 157
3000 133 193
2000 45
380
234
1000 173 319
337
0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
m/z-->
63
Abundance
TIC: NT193b.D
340000
320000
A
300000
280000
260000
240000
*
32.78
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
32.3032.4032.5032.6032.7032.8032.9033.0033.1033.2033.3033.4033.5033.60
Time-->
Abundance
48000
46000
B Scan 5503 (32.775 min): NT193b.D
204
44000
42000
40000
38000
36000
34000 73
32000
30000
28000
26000
24000
22000
20000
18000
16000
14000 319
12000
10000 147
8000
6000
4000
103
2000 45 233
172 259 291 361 466
128
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
m/z-->
64
Abundance
A *
20.54
TIC: nornicotinastd3a.D
600000
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
Time-->
Abundance
18000
17000
B 142
16000
15000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000 73
5000
4000
205
3000 220
191
2000
45 59
1000 32 118 177
88 106 132
0
30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220
m/z-->
65
Abundance
TIC: NT19b.D
200000
A
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000 *
40000
20.57
20000
20.44 20.46 20.48 20.50 20.52 20.54 20.56 20.58 20.60 20.62 20.64 20.66
Time-->
Abundance
5500
5000
4500
4000
3500
3000 73
2500
2000
205
1500
220
1000
45 191
500 59 84
32 100 117 161 177
0
30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220
m/z-->
66
6.2. Cuantificación de nicotina en plantas jóvenes y/o adultas
67
Nt-SYS 03, y ii) la inducción local y sistémica (en hojas distales apicales) de
nicotina por daño mecánico fue más intensa en las líneas Nt-LePS 08 y Nt-
LeSYS 03.
Los niveles basales de nicotina en hoja y raíz de plantas WT jóvenes
resultaron similares a los detectados en plantas adultas (2.2 y 0.9 µg/mg PF,
respectivamente) (Fig. 29 A). Sin embargo, el daño mecánico en plantas jóvenes
no indujo una acumulación local de nicotina, mientras que en hojas distales se
detectó una reducción significativa en los niveles de nicotina (de 3 a 2.1 µg/mg
PF).
En general, el efecto causado por daño mecánico en plantas transgénicas
jóvenes fue similar (neutro o negativo) al observado en plantas WT. Sólo se
detectaron niveles superiores a los de las plantas intactas en la respuesta local
en la línea Nt-LeSYS 03 y en la respuesta sistémica en plantas WT × Nt-LeSYS
03. En contraste, los niveles de nicotina, locales y sistémicos (en hoja y raíz),
detectados en las plantas Nt-LePS 08 fueron significativamente inferiores a los
detectados en plantas intactas (1.12 vs 1.21, 1.0 vs 1.6 y 0.73 vs 0.54 µg/mg PF
en hoja dañada, hoja distal y raíz de plantas dañadas e intactas,
respectivamente).
68
PLANTA JÓVEN PLANTA ADULTA
A WT 0h B WT 0h
4 8
5 día 5 día
**
ug Nicotina/mg PF
ug Nicotina/mg PF
3 6 **
*
2 4
**
1 2 *
0 0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
C WT X Nt-LeSYS 03 0h D WT X Nt-LeSYS 03 0h
2 8
** 5 día 5 día
ug Nicotina/mg PF
**
ug Nicotina/mg PF
6
1 4 **
2 **
0 0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
E Nt-LePS 08 0h F Nt-LePS 08 0h
2 10
5 día 5 día
ug Nicotina/mg PF
ug Nicotina/mg PF
8 ** **
* ** 6
1 **
4
** 2 *
*
0 ** 0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
G Nt-LeSYS 03 0h H Nt-LeSYS 03 0h
4 10
5 día ** 5 día
ug Nicotina/mg PF
ug Nicotina/mg PF
3 * 8 **
6
2
4
1 2 **
0 0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
69
Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 A) que en la línea Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 C). Esto se reflejó
en la detección de contenidos de nicotina en las plantas transgénicas dañadas
por M. sexta que fueron marginal o significativamente inferiores a los observados
en plantas WT igualmente tratadas.
Los resultados indicaron que la sobreexpresión de LePS y LeSYS en N.
tabacum, causó una represión generalizada de la acumulación de nicotina en
respuesta a herbivoría por M. sexta. Este efecto se observó en todos los tejidos
analizados, particularmente en raíz, y en menor proporción en las hojas dañada
y distal superior. Mientras tanto, la acumulación de nicotina inducida por
herbivoría en plantas WT se detectó únicamente en las hojas dañadas y la raíz.
En raíz, la inducción fue sumamente fuerte: 6.5 × los niveles detectados en raíz
de plantas intactas, y 5.1 × los niveles detectados en raíz de plantas dañadas
mecánicamente.
70
A WT
8 WT X Nt-LeSYS 03
ug Nicotina/mg PF
6
4
**
2 **
*
**
0
HL HDV HDJ RAÍZ
B WT
8
Nt-LePS 08
ug Nicotina/ mg PF
2 **
** **
0
HL HDV HDJ RAÍZ
C WT
8 Nt-LeSYS 03
ug Nicotina/mg PF
4
**
2
**
0
HL HDV HDJ RAÍZ
71
Al comparar los niveles de nicotina presentes en plantas infestadas WT y
transgénicas, se observó un incremento significativo en la respuesta local y
sistémica en follaje de plantas Nt-LePS 08 (Fig. 31 B). En las plantas Nt-LeSYS
03 (Fig. 31 C), la acumulación sistémica de nicotina fue significativamente
superior a la observada en plantas WT, particularmente en raíz, mientras que el
efecto represor de la infestación por MB fue muy fuerte en plantas WT × Nt-
LeSYS 03 (Fig. 31 A), cuyos niveles de nicotina en hoja infestada y hoja distal
superior fueron significativamente inferiores a los detectados en plantas WT
infestadas.
Los resultados obtenidos indica que la infestación por B. tabaci no tuvo un
efecto evidente sobre la inducción de la acumulación de nicotina en hojas de
plantas WT (±1.5× los niveles basales detectados en plantas intactas de la
misma edad), pero redujo drásticamente la acumulación de nicotina en raíz (a
niveles no detectables). Curiosamente, la ausencia de nicotina en la raíz de
plantas infestadas no se observó en la línea Nt-LeSYS 03 (Fig. 31 A), mientras
que los niveles de nicotina en las hojas de las plantas transgénicas infestadas
Nt-LePS 08 (respuesta local y sistémica; Fig. 30 B) y Nt-LeSYS 03 (sólo
respuesta sistémica; Fig. 31 C), fueron significativamente superiores a los
detectados en plantas WT, pero menores a los niveles basales detectados en las
plantas transgénicas intactas de la misma edad. Finalmente, en las plantas WT ×
Nt-LeSYS 03 infestadas se observó una represión de la acumulación de nicotina
en hojas, la cual fue significativamente menor a la observada en plantas WT.
72
A
WT
3
WT X Nt-LeSYS 03
ug Nicotina/mg PF
2
**
**
1
0
HL HS RAÍZ
B
WT
6
Nt-LePS 08
**
ug Nicotina/mg PF
**
2
0
HL HS RAÍZ
C WT
3
Nt-LeSYS 03
**
ug Nicotina/mg PF
**
1
**
0
HL HS RAÍZ
73
redireccionamiento de la ruta biosintética de los fenilpropanoides debido a la
sobreexpresión de FAL (Howles et al., 1996), de una enoil-CoA hidratasa
bacteriana (Mayer et al., 2001) o del gen C58-6b de Agrobacterium tumefaciens
(Gális et al., 2002). En estos casos, los niveles máximos reportados fueron de
0.3 a 5 µg/mg PF. Esta discrepancia posiblemente refleje diferencias entre
variedades de N. tabacum, en forma similar a lo que se ha reportado entre
especies de Nicotiana. Por ejemplo, en la especie silvestre N. attenuata los
niveles de ACG son extremadamente bajos, de aproximadamente 27 µg/g PF
(Keinänen et al., 2001). Las diferencias observadas también podrían haberse
debido al empleo de GC/MS, en lugar de otras técnicas como HPLC/MS, para su
aislamiento y cuantificación.
En plantas WT adultas (Fig. 32 B), los niveles basales promedio de ácido
clorogénico (ACG) detectados fueron los siguientes: 9.01 µg/mg PF (hoja de
transición entre tejido consumidor-tejido fuente [C-F], u hoja local), y 4.3 y 4.1
µg/mg PF en las hojas distales vieja y joven, respectivamente. En raíz, los
niveles de ACG fueron más bajos (1.7 µg/mg PF). El daño mecánico indujo un
incremento significativo en los niveles de ACG tanto local como sistémico y en
todos los tejidos analizados: es decir, se detectó una acumulación de ACG que
fue 1.5, 1.2, 1.3 y 1.18 veces más alta que en plantas intactas en la hoja dañada,
en hojas distales inferior y superior y en raíz, respectivamente.
En la línea WT × Nt-LeSYS 03 los niveles basales de ACG en todos los
tejidos analizados, excepto la hoja de transición tejido consumidor-tejido fuente
(C-F), fueron superiores a los detectados en las plantas WT (entre 1.95 [raíz] y
3.8 [hoja distal inferior] veces más altos). Sin embargo, el daño mecánico causó
una disminución significativa en los niveles de ACG en todos los tejidos
analizados de estas plantas (entre 2.4 [respuesta sistémica en raíz] y 5.3
[respuesta sistémica en hoja distal superior] veces más bajos).
Al comparar los niveles basales de ACG en plantas WT y Nt-LePS 8, se
observó una drástica reducción (27× menores), a valores casi indetectables, en
la hoja de transición C-F (hoja local) de ésta última, mientras que en las hojas
distales inferior y superior, y en raíz, los niveles basales de ACG fueron
superiores a los de las plantas WT (1.5× [hoja distal inferior], 4.1× [hoja distal
superior] y 1.3× [raíz] veces más altos). Curiosamente el daño mecánico causó
74
un incremento significativo en ACG solamente en los tejidos aéreos más viejos
de plantas de esta línea (hoja C-F o local [25×] y hoja distal inferior [1.6×]); en
raíz y en la hoja distal superior se observó una disminución significativa, la cual
fue mucho más marcada en éste último tejido (13×). En plantas WT × Nt-LeSYS
03 se detectó una disminución altamente significativa de ACG en todos los
tejidos de las plantas dañadas.
En la línea Nt-LeSYS 03 se observó una disminución generalizada en los
niveles basales de ACG, los cuales fueron entre 2.5 (raíz) y 6.2 (hoja C-F) más
bajos que los detectados en plantas WT intactas. Al igual que la línea WT × Nt-
LeSYS 03, el daño mecánico provocó una disminución altamente significativa en
los niveles de ACG en tejido aéreo, particularmente la hoja distal inferior
(respuesta sistémica basal) donde el ACG disminuyó a valores no detectables.
En cambio, esta línea fue la única en la cual se detectó una acumulación
significativa de ACG en raíces de plantas dañadas.
Los niveles basales de ACG en plantas WT jóvenes fueron menores a los
detectados en las plantas adultas, particularmente en la hoja inferior, u hoja
“local” (0.56 µg/mg PF) (Fig. 32 A). Los niveles de este metabolito fueron 16
(hoja inferior), 3.3 (hoja superior) y 4.5 veces más bajos que los detectados en la
hojas C-F y distal inferior, y raíces de plantas adultas, respectivamente. Un
comportamiento similar se observó en las tres líneas de plantas transgénicas. A
su vez, el daño mecánico en plantas WT sólo produjo una acumulación sistémica
significativa de ACG en las hojas inferiores adyacentes intactas y en la raíz.
Los niveles basales de ACG en hojas de las tres líneas de plantas
transgénicas analizadas fueron menores a los detectados en las plantas WT,
particularmente en las hojas de la línea Nt-LeSYS 03, donde no se detectó este
metabolito en las hojas inferiores. En hojas jóvenes adyacentes superiores los
niveles se redujeron, entre 3.0 y 3.6 veces, con respecto a hojas similares en
plantas WT. La respuesta sistémica al daño mecánico en la línea WT × Nt-
LeSYS 03 fue similar a la observada en plantas WT, mientras que en las raíces
de plantas dañadas se observó una desaparición de ACG. La ausencia de ACG
en raíces de plantas dañadas también se observó en la línea Nt-LePS 08.
Asimismo, el daño mecánico causó una reducción significativa de ACG a nivel
local (Nt-LePS 08) y sistémico (Nt-LeSYS 03). Resultó interesante observar la
75
completa falta de respuesta local al daño mecánico en esta última línea, lo cual
contrastó con la acumulación de ACG en raíz, cuyos niveles fueron los más
elevados de todas las plantas en estudio.
En síntesis, los niveles de ACG en tabaco están al parecer regulados por
el estado de desarrollo de la planta, ya que se incrementaron notablemente en
plantas WT adultas. El estado de desarrollo de la planta también ejerció una
influencia sobre la acumulación de ACG en follaje en respuesta al daño
mecánico en plantas WT, ya que ésta fue detectada tanto en forma local como
sistémica en plantas adultas, mientras que en plantas jóvenes solo se observó
en forma sistémica, incluyendo la raíz. Excepto en casos aislados, se observó
una disminución generalizada en los niveles de ACG basales e inducidos por
daño en las plantas transformadas, la cual también se vio fuertemente influida
por el estado de desarrollo de la planta. El ejemplo más claro de esta tendencia
se observó en la línea WT × Nt-LeSYS 03, que en hojas de plantas jóvenes se
comportó en forma similar a las plantas WT, detectándose un incremento
significativo de ACG en respuesta al daño en tejido sistémico, mientras que en
plantas adultas el daño causó una disminución significativa en los niveles de
ACG en todos los tejidos analizados. Asimismo, los niveles de ACG, tanto
basales como inducidos por daño, se redujeron drásticamente tanto en plantas
jóvenes (líneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03) como adultas (línea Nt-LeSYS 03).
Esta última línea se distinguió por la alta acumulación constitutiva de ACG en
raíz, cuyos niveles se incrementaron aún más en plantas adultas dañadas
mecánicamente. Esta característica contrastó con lo observado en las raíces de
plantas jóvenes y adultas de las dos líneas restantes, en las cuales el daño
mecánico redujo el contenido de ACG en forma altamente significativa,
especialmente en plantas jóvenes, donde no pudo ser detectado.
76
PLANTA JÓVEN PLANTA ADULTA
A WT 0h B WT 0h
3 20
ug Clorogénico/mg PF
5 día
ug Clorogénico/mg PF
5 día
15 *
2 *
10
1
5
* *
**
0 0 *
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
C D WT X Nt-LeSYS 03 0h
WT X Nt-LeSYS 03 0h
0.6 20 5 día
ug Clorogénico/mg PF
ug Clorogénico/mg PF
5 día
15
0.4
10
0.2 5
**
**
** **
0.0 0 *
HL HDV
*
HDJ RAÍZ
HL HS RAÍZ
E Nt-LePS 08 0h F Nt-LePS 08 0h
0.6 20
ug Clorogénico/mg PF
ug Clorogénico/mg PF
5 día 5 día
0.4 15
* *
10 **
0.2 *
5
0.0 ** **
0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
G Nt-LeSYS 03 0h H Nt-LeSYS 03 0h
0.6 3
ug Clorogénico/mg PF
5 día 5 día
ug Clorogénico/mg PF
0.4 2
0.2 1 **
**
0.0 0 **
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
77
6.3.2. Tratamiento: herbivoría por larvas de M. sexta (plantas adultas)
78
A WT
1.0 WT X Nt-LeSYS 03
ug clorogénico/mg PF
0.5
**
0.0
HL HDV HDJ RAÍZ
B 1.0 WT
Nt-LePS 08
ug clorogénico/mg PF
0.5
**
0.0
HL HDV HDJ RAÍZ
C WT
1.0 Nt-LeSYS 03
ug clorogénico/mg PF
0.5
0.0
**
HL HDV HDJ RAÍZ
79
La misma tendencia se observó en la línea WT × Nt-LeSYS 03. Sin embargo, la
disminución con respecto a plantas WT infestadas, aunque significativa, no fue
tan drástica, al menos en follaje. La infestación con B. tabaci causó también una
disminución considerable en ACG en todos los tejidos analizados de plantas WT
× Nt-LeSYS 03 con respecto a los niveles basales de ACG en tejidos
equivalentes de plantas de esta línea no infestadas de la misma edad.
Los resultados obtenidos indican que la infestación con B. tabaci en
plantas WT indujo un incremento sistémico (en hoja) y una disminución local y
sistémica (en raíz) en los niveles de ACG en relación a los niveles detectados en
tejidos de plantas WT no infestadas. En forma similar a los resultados obtenidos
de plantas dañadas por M. sexta (Fig. 33), la infestación con B. tabaci causó una
disminución generalizada en los niveles de ACG en plantas WT y transgénicas.
Sin embargo, el efecto fue mucho más marcado en plantas transformadas con
LeSYS (líneas Nt-LeSYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03).
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 35. Los datos que aquí
se presentan representan una cuantificación indirecta de los niveles de capsidiol,
ya que debido a la conocida inestabilidad de este metabolito in planta, aunada a
los largos períodos de muestreo (≥28 d) solo pudo detectarse un producto de
degradación de este metabolito (ver Figs. 11 y 24-26), cuya identidad no pudo
ser determinada, pero cuyo espectro de masas resultó semejante al del cis-9,10-
dihidrocapsenona, un posible catabolito estable de capsidiol detectado en
cultivos celulares en suspensión de C. annuum (Ward et al., 1977; Whitehead et
al., 1987). Se considero, por lo tanto, que la dihidrocapsenona indica los niveles
de su precursor el capsidiol). Los niveles detectados en las plantas en estudio
resultaron de 3 a 4 órdenes de magnitud más altos a los reportados en la
literatura en tejido de N. tabacum inducido por patógenos o PMAP.
80
WT
A 15
WT X Nt-LeSYS 03
ug clorogénico/mg PF
10
5
* **
0
*
HL HS RAÍZ
B WT
15
Nt-LePS 08
ug clorogénico/mg PF
10
0
HL HS RAÍZ
WT
C 15 Nt-LeSYS 03
ug clorogénico/mg PF
10
0 ** ** *
HL HS RAÍZ
81
En plantas WT, los niveles basales de dihidrocapsenona en plantas
jóvenes fueron entre 6.5 (en raíz) y 7.5 (en la hoja distal superior) veces mayores
a los detectados en tejidos equivalentes de plantas adultas, en las cuales no se
detectó dihidrocapsenona l en las hojas C-F. Además, el daño mecánico abatió
los niveles de dihidrocapsenona en todos los tejidos analizados de plantas
jóvenes (la disminución fue altamente significativa a nivel local y sistémico en la
hoja dañada y en raíz, respectivamente, y marginal a nivel sistémico en la hoja
adyacente superior), mientras que lo contrario se observó en plantas adultas, en
las cuales el daño indujo una acumulación altamente significativa de
dihidrocapsenona en todos los tejidos (aunque sin alcanzar los niveles
detectados en las plantas jóvenes). Esto sugiere que la síntesis constitutiva e
inducida de capsidiol esta regulada por el estado de desarrollo de la planta.
El efecto del daño mecánico también se modificó en las tres líneas de
plantas transgénicas analizadas el cual fue, asimismo, influido por el estado de
desarrollo. De manera que en plantas jóvenes, el daño mecánico en plantas Nt-
LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03 indujo una acumulación de dihidrocapsenona en
todos los tejidos analizados (excepto en la respuesta local en la línea Nt-LePS
08), aunque los niveles basales en estas dos líneas de plantas fueron, en
promedio, aproximadamente 6 veces menores a los detectados en las plantas
WT. Sin embargo, los niveles de detectado dihidrocapsenona en plantas WT y
transgénicas (de estas dos líneas) dañadas mecánicamente fueron muy
similares. En plantas Nt-LeSYS 03, el efecto del daño fue mucho más notable,
particularmente en follaje, ya que al parecer indujo la síntesis de novo de este
metabolito, el cual no se detectó en plantas intactas, mientras que en raíz no se
detectaron cambios significativos. A pesar de ello, los niveles de
dihidrocapsenona en plantas Nt-LeSYS 03 dañadas fueron, en general, menores
a los detectados en el resto de las plantas dañadas analizadas.
Al igual que en plantas WT, el daño mecánico en plantas adultas de las
líneas plantas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03 indujo una acumulación
generalizada y altamente significativa de dihidrocapsenona. La diferencia radicó
en el hecho de que los niveles de este metabolito acumulados en las plantas
transgénicas dañadas fueron muy elevados, entre 9 (respuesta sistémica en hoja
distal superior en las línea WT × Nt-LeSYS 03) y 80 (hoja dañada de ambas
82
líneas) veces más altos a los detectados en plantas WT dañadas. En plantas Nt-
LeSYS 03 adultas, que a diferencia de las plantas jóvenes tenían niveles basales
detectables de dihidrocapsenona en follaje, pero que en raíz fueron 1.8 veces
menores a los detectados en plantas jóvenes, sólo se observó un incremento
significativo en los niveles de dihidrocapsenona a nivel sistémico en la hoja distal
superior. En la hoja distal inferior el efecto del daño fue inhibitorio, mientras que
no se observaron cambios significativos en la hoja dañada ni en la raíz. En
plantas adultas de esta línea, la acumulación sistémica de dihidrocapsenona
inducida por daño no fue de la magnitud observada en las dos líneas restantes,
sino similar a la observada en plantas WT.
83
PLANTA JÓVEN PLANTA ADULTA
A WT 0 día B WT 0 día
1.5 0.5
5 día 5 día
0.4
** **
1.0 0.3 **
P=0.06 5
0.5 ** **
0.2 **
0.1
0.0 0.0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
0.0 0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
0.5 0.1
**
**
0.0 **
0.0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
84
En la línea WT × Nt-LeSYS 03 se observó un patrón similar aunque
menos marcado, particularmente en la respuesta local a la herbivoría, que no fue
diferente a la detectada en plantas intactas de la misma edad. En raíces de esta
planta, los niveles de dihidrocapsenona en plantas dañadas por M. sexta fueron
3.7× más altos a los basales.
Los niveles de dihidrocapsenona detectados en plantas Nt-LePS 08 y WT
× Nt-LeSYS 03 dañadas por M. sexta fueron considerablemente inferiores a los
detectados en plantas WT dañadas. Asimismo, en ambas líneas se observó un
contraste muy marcado entre los niveles de dihidrocapsenona acumulados en
plantas dañadas mecánicamente (acumulación hasta niveles excepcionalmente
altos) o por larvas de M. sexta (disminución en los niveles o represión de su
síntesis).
Una vez más, la línea Nt-LeSYS 03 se comportó en forma diferente a las
otras dos. En todos los tejidos analizados, los niveles de dihidrocapsenona se
incrementaron en respuesta a herbivoría, con respecto a los niveles basales
detectados en plantas Nt-LeSYS 03 intactas de la misma edad. El efecto más
marcado fue en la hoja dañada y en la hoja distal inferior (niveles 5.3× más altos
en ambos casos). Los niveles detectados en plantas sometidas a folivoría por M.
sexta también fueron más altos a los detectados en plantas dañadas
mecánicamente. La acumulación de dihidrocapsenona en follaje en respuesta a
herbivoría en estas plantas fue marginal o significativamente (respuesta
sistémica en hoja distal inferior) más alta a la detectada en plantas WT. Sin
embargo, al igual que en las líneas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03, los niveles
de dihidrocapsenona en la raíces de plantas dañadas por M. sexta fueron
significativamente inferiores a los detectados en plantas WT similarmente
tratadas.
85
A WT
2.0
WT X Nt-LeSYS 03
1.0
**
0.5
*
0.0 **
HL HDV HDJ RAÍZ
B 2.0 WT
Nt-LePS 08
ug capsidiol/ mg peso fresco.
1.5
1.0
0.5
*
0.0
** ** **
HL HDV HDJ RAÍZ
C WT
2.0
Nt-LeSYS 03
ug capsidiol/ mg peso fresco.
1.5
P= 0.07
1.0 **
0.5 P = 0.22
**
0.0
HL HDV HDJ RAÍZ
86
6.4.3. Tratamiento: infestación por mosquita blanca (plantas adultas)
87
que los niveles constitutivos o inducidos de este metabolito en planta están
ontogénicamente determinados. La acumulación de dihidrocapsenona en
respuesta a daño mecánico en plantas adultas y a infestación por MB se
potenció marcadamente en la línea Nt-LePS 08 y en menor grado en la línea WT
× Nt-LeSYS 03, particularmente en la hoja dañada o infestada. El daño por
insectos chupadores y masticadores indujo una acumulación local y sistémica de
dihidrocapsenona en plantas WT, la cual fue más intensa en respuesta a B.
tabaci. En general, la inducción de dihidrocapsenona en respuesta al daño por
insectos se redujo significativamente en las plantas transgénicas.
88
A WT
15
WT X Nt-LeSYS 03
ug Capsidiol/mg PF
10
**
5
** **
0
HL HS RAÍZ
B WT
15
Nt-LePS 08
ug Capsidiol/mg PF
**
10
0
HL HS RAÍZ
C WT
15
ug Capsidiol/mg PF
Nt-LeSYS 03
10
5 **
**
0 **
HL HS RAÍZ
89
inferior. También se observó una disminución significativa en el contenido de NN
en raíces de plantas adultas dañadas mecánicamente (de 0.17 a 0.04 µg/mg PF)
(28 días después de la oviposición). Los asteriscos indican la diferencia
estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).
La línea Nt-LeSYS 03 se caracterizó por ser la única línea en la cual se
detectó NN en forma constitutiva en follaje de plantas jóvenes. El daño mecánico
en estas plantas causó una reducción a niveles no detectables (ND) en la hoja
dañada (respuesta local inhibitoria), mientras que en la raíz indujo su síntesis de
novo (de ND a 0.05 µg/mg PF). En la hoja distal adyacente se detectó un
aumento marginal de NN (0.03 a 0.12 µg/mg PF). Un comportamiento muy
similar se observó en follaje de plantas adultas de la línea Nt-LeSYS 03 dañadas
mecánicamente, ya que se volvió a presentar una reducción significativa de NN
en hojas dañadas, mientras que el incremento detectado en hojas distales
superiores (7.6× mayor; de 0.09 a 0.69 µg/mg PF) fue ahora altamente
significativo. Los niveles de NN sintetizados en raíces de plantas jóvenes Nt-
LeSYS 03 dañadas mecánicamente resultaron muy similares a los niveles
constitutivos detectados en las raíces de plantas adultas, los cuales no variaron
significativamente en respuesta al daño mecánico.
El daño mecánico tuvo un efecto sistémico negativo sobre los niveles de
NN en las dos restantes líneas de plantas adultas transformadas (Nt-LePS 08 y
WT × Nt-LeSYS 03), observado en la hoja distal superior y raíz. Aunque en
ambas líneas el daño mecánico causó una disminución de NN a niveles no
detectables, el efecto observado fue particularmente severo en la raíz.
No se detectó NN en plantas de cualquiera de los genotipos analizados
sometidas a herbivoría por M. sexta o infestación por MB (resultados no
mostrados).
90
PLANTA JOVEN PLANTA ADULTA
A WT 0h
0.3 5 día
ug Nornicotina/mg PF
0.2
*
0.1
** **
0.0
HL HDV HDJ RAÍZ
B WT X Nt-LeSYS 03 0h
5 día
ug Nornicotina/mg PF
0.3
0.2
0.1
0.0 ** **
HL HDV HDJ RAÍZ
C Nt-LePS 08 0h
0.3
ug Nornicotina/mg PF
5 día
0.2
0.1
0.0 ** **
HL HDV HDJ RAÍZ
P=0.072 **
0.1 0.5
**
** 0.0
*
0.0
HL HS RAÍZ HL HDV HDJ RAÍZ
91
6.6. Cuantificación de fenoles totales en plantas jóvenes y/o adultas
92
que los niveles de fenoles totales detectados en la hoja dañada (respuesta local),
hojas distales inferiores y superiores y raíz (respuesta sistémica) resultaron
marginal o significativamente menores a los observados en plantas intactas
(excepto por el incremento significativo detectado en la hoja distal superior en la
línea WT × Nt-LeSYS 03) (Fig. 39 D).
93
PLANTA JÓVEN PLANTA ADULTA
A WT B WT 0 día
0 día
5 8 5 día
4 ** 6
3
**
4
2
1 2
*
0 0
HL HS Raíz HL HDV HDJ Raíz
0.5 5 día
4 5 día
0.4 3
0.3 2 *
** *
0.2 ** 1
0.1 *
0 0
HL HS Raíz HL HDV HDJ Raíz
ug/mg pesofresco
0.6 2 ** **
0.4
**
** **
1
0.2 **
**
0 0
HL HS Raíz HL HDV HDJ Raíz
1.5 2
1 * ** **
1 **
0.5 **
0 0
HL HS Raíz HL HDV HDJ Raíz
94
A WT
1.6 WT X Nt-LeSYS 03
B WT
1.6 Nt-LePS 08
ug/mg peso fresco
1.2
0.8 **
**
0.4
0
HL HDV HDJ Raíz
C WT
1.6 Nt-LeSYS 03
ug/mg peso fresco
1.2
0.8 **
0.4
*
0
HL HDV HDJ Raíz
Figura 40. Comparación entre los niveles de fenoles totales solubles en plantas
WT y transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a herbivoría
por larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV),
hoja distal jóven (HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia
estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).
95
6.6.3. Tratamiento: infestación por mosquita blanca (plantas adultas)
96
A WT
3
W T Х Nt-L e SYS 03
**
0
HL HDJ Ra íz
B WT
3
N t -L eP S 08
ug/mg peso fresco
0
HL HDJ Ra íz
C WT
3 N t- L eSYS 03
ug/mg peso fresco
** **
1
**
0
HL HDJ Ra íz
Figura 41. Comparación entre los niveles de fenoles solubles totales en plantas
WT y transgénicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia
tabaci (28 días después de la oviposición). En hoja local (HL), hoja distal jóven
(HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia estadísticamente significativa (P
≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).
97
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
98
Genuinae); el resto está constituido por los alcaloides nornicotina (3.0%),
anabasina (0.3%) y anabatina (1.9%) (Saitoh et al., 1985). Se estima que la
nicotina contribuye a la resistencia contra insectos herbívoros gracias a su
capacidad de interactuar con receptores de acetilcolina del sistema nervioso de
animales (Steppuhn et al., 2004; Liu et al., 2005). Asimismo, se ha encontrado
que el daño al follaje, mecánico o por herbívoros, tanto en N. tabacum como en
las especies silvestres N. attenuata, N. sylvestris y otras, induce la síntesis de
novo de nicotina en raíces, la cual es posteriormente reubicada en el follaje (vía
el xilema) para contribuir a la defensa de la planta y reducir la pérdida de área
foliar por herbivoría. El ácido jasmónico, que es producido en las hojas dañadas
y rápidamente transportado a las raíces vía el floema, es un componente
esencial de la señalización entre hoja y raíz que facilita esta respuesta (Zhang y
Baldwin, 1997). De acuerdo a Ohnmeiss y Baldwin (2000), la distribución de la
nicotina proveniente de la raíz en el follaje estará determinada por los postulados
de la teoría de defensa óptima, que predice que los tejidos más valiosos para la
planta, o aquellos con una mayor probabilidad de ser atacados, serán los mejor
defendidos. Éstos son en general los tejidos jóvenes, con altas tasas
fotosintéticas y/o las estructuras reproductivas; sin embargo, se ha encontrado
que el valor del tejido varía de acuerdo a la ontogenia de la planta y puede estar
influido por su nivel nutricional. El ataque por herbívoros o patógenos también
puede alterar la cantidad y la distribución de metabolitos defensivos.
Como se observa en las Figuras 29 A y B, los niveles basales de nicotina
fueron similares en plantas WT jóvenes y adultas. Sin embargo, la acumulación
significativa de nicotina en respuesta a daño mecánico sólo se observó en los
tejidos analizados (predominantemente en la hoja dañada y en la hoja distal
joven) de las plantas adultas; en plantas jóvenes dañadas, se observó, en
contraste, una disminución generalizada en los niveles de nicotina, la cual fue
significativa a nivel sistémico. De acuerdo a la teoría de la defensa óptima,
descrita anteriormente, la diferencia entre plantas jóvenes y adultas podría
explicarse en parte, si se considera que el valor que tienen las hojas expandidas
en una planta joven es similar debido a que la diferencias en el estado de
desarrollo son mínimas, tal como se ha observado en plantas de N. sylvestris en
el estadio de roseta (Baldwin et al., 1997). Otros factores que podrían haber
contribuido a la débil respuesta en plantas jóvenes, en cuanto a la inducción de
99
la acumulación de nicotina en respuesta al daño mecánico, son los siguientes: i)
la alta disponibilidad de recursos en plantas jóvenes, los cuales al no estar
siéndo desviados hacia la generación de estructuras reproductivas o producción
de semillas, permiten la utilización de estrategias menos costosas desde el punto
de vista metabólico que la síntesis de nicotina, como el rebrote de tejidos
después del daño; ii) las plantas jóvenes son incapaces de fijar altas
concentraciones de nicotina; iii) la nicotina no es necesariamente el metabolito
de defensa más importante en esta etapa de desarrollo; iv) el similar valor que el
tejido foliar tiene en plantas jóvenes garantiza una distribución uniforme de
metabolitos de defensa, y/o v) la incapacidad de exportar suficiente JA a la raíz
para inducir la síntesis de nicotina, aún a pesar de que los tejidos jóvenes y
reproductivos son los que producen los mayores niveles de AJ, tanto
constitutivos como inducibles (Creelman y Mullet, 1997;Ohnmeiss y Baldwin,
2000). Esta última posibilidad podría haberse debido al hecho de que las hojas
inmaduras constituyen tejidos consumidores que importan fotosintatos desde las
hojas maduras y viejas, de manera que la exportación de AJ hacia el floema y
eventualmente hacia la raíz, podría estar comprometida en plantas jóvenes en
crecimiento activo y sin un aparato fotosintético eficiente.
En cuanto a las plantas WT adultas dañadas, la máxima acumulación de
nicotina se observó a nivel local y sistémico apical, lo que sugiere que estas
hojas tienen un mayor valor para la planta que la hoja distal basal. De manera
que la acumulación local de nicotina podría ser parte de una estrategia de
defensa para la defensa de tejidos valiosos (e. g., aquellos con las tasas
fotosintéticas más altas por área foliar, tal como se ha reportado para hojas
maduras en N. sylvestris) contra insectos, especialmente de aquellos que tienen
poca movilidad. También se ha especulado que la acumulación de defensas en
tejido dañado puede disuadir a los herbivoros a consumir tejido de menor valor e
inclusive, a migrar hacia plantas vecinas competidoras. En todo caso, los
resultados para nicotina obtenidos en este trabajo contrastaron con los
reportados para N. sylvestris, en las cuales se observó que la sensibilidad al
daño mecánico disminuía gradualmente a medida que las plantas avanzaban en
su estado de desarrollo (Ohnmeiss et al., 1997; van Dam et al. 2001).
En plantas transgénicas jóvenes, exceptuando la línea Nt-LeSYS 03, los
niveles basales de nicotina fueron menores a los detectados en las plantas WT.
100
El efecto negativo que el daño mecánico tuvo sobre el contenido de
nicotina en plantas WT jóvenes se hizo más marcado en la línea Nt-LePS 08
(disminución significativa generalizada), lo cual contrastó con la inducción local
(en Nt-LeSYS 03) y sistémica (en WT × Nt-LeSYS 03) de niveles
significativamente más altos de nicotina. En plantas adultas, el patrón de
acumulación de nicotina como respuesta al daño resultó muy similar entre
plantas WT y transgénicas, aunque estas últimas mostraron una respuesta más
intensa al daño, particularmente la respuesta sistémica en la hoja distal joven en
las líneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03. Estos resultados sugieren que la
expresión de LePS y LeSYS en tabaco alteró el patrón de síntesis y distribución
de nicotina en la planta. Tomando en cuenta que la acumulación de metabolitos
defensivos en tabaco se produce de acuerdo al valor relativo que los tejidos
tienen para la planta atacada, es válido sugerir que el comportamiento
observado fue un indicio de que el valor de estas hojas en las plantas
transgénicas se incrementó. Las razones de este cambio se desconocen, pero
podrían estar relacionados con cambios fisiológicos causados por la
sobreexpresión de estos genes en tabaco, los cuales podrían haber alterado las
relaciones entre tejidos consumidores y tejidos fuente (debido a la síntesis
constitutiva de proteínas y metabolitos de defensa) o bien, podrían haber
alterado el desarrollo normal de N. tabacum. Este último argumento podría
aplicarse a la línea Nt-LeSYS 03, la cual presenta un fenotipo caracterizado por
alteraciones marcadas en su desarrollo, como enanismo, hojas modificadas,
floración precoz y senescencia acelerada (Rocha-Granados, 2004 y resultados
no publicados; ver Fig. 13). En plantas adultas de todos los genotipos analizados
se observó también un incremento significativo de nicotina en raíz en respuesta
al daño, lo que fue un indicio de que la síntesis de novo de AJ en las hojas y su
posterior transporte, vía floema, a la raíz, no se alteró en las plantas
transgénicas. Sin embargo, los niveles de nicotina en raíces de plantas Nt-
LeSYS 03 intactas y dañadas, fueron inferiores a los detectados en plantas WT y
demás plantas transgénicas. Es posible que la floración precoz y la senescencia
acelerada observada en esta línea hayan causado una reducción en la síntesis
de nicotina y/o un aumento en el catabolismo de nicotina como parte de una
estrategia para canalizar el nitrógeno hacia la producción de estructuras/tejidos
101
reproductivos. Esta propuesta se sustenta en cierta medida con lo observado en
plantas de N. attenuata y N. sylvestris, en las cuales se detectó una reducción en
el contenido de nicotina durante las etapas de elongación (generación de
estructuras reproductivas) y floración (Ohnmeiss y Baldwin, 2000; Baldwin,
2001).
La reducción en los niveles de nicotina, con respecto a plantas intactas,
observados en hojas de plantas WT y transgénicas sometidas a herbivoría por
larvas de M. sexta (Figuras 30 A y 30 B) estuvo de acuerdo a varios reportes en
la literatura en los que se ha observado que el daño causado por este insecto
tolerante a la nicotina en especies silvestres de Nicotiana, reprime su síntesis, a
pesar de un marcado aumento en los niveles de AJ, tanto en hoja como en raíz
(McCloud y Baldwin, 1997). Este efecto se ha atribuido a una síntesis de novo
sostenida de etileno, que al igual que en otras especies (e.g., Arabidopsis
thaliana, Griffonia simplicifolia), es antagónico al efecto inductivo local y/o
sistémico de AJ (Zhu-Salzman et al., 1998; Rojo et al., 1999; Kahl et al., 2000).
Además, se ha demostrado que está inhibición se debe a la supresión por etileno
de dos genes (putrescina-N-metil transferasas 1 y 2) que son esenciales para la
síntesis de nicotina en raíz (Winz y Baldwin, 2001). El contraste observado entre
daño mecánico (inducción) y herbivoría (represión), coincidió con estudios
previos que han demostrado que la síntesis de etileno, responsable a su vez de
la represión de la síntesis de nicotina, se produce exclusivamente en respuesta a
un grupo de amidas, sintetizadas a partir de la conjugación de ácidos grasos con
aminoácidos, presentes en las secreciones orales de M. sexta (Halitschke et al.,
2001; Schittko et al., 2001). Además de su efecto sobre la síntesis de nicotina, la
herbivoría por M. sexta también causa una reorganización transcripcional en
plantas de tabaco diferente a la observada en respuesta a daño mecánico, la
cual se caracteriza por la expresión diferencial de más de 500 genes
involucrados en fotosíntesis, transporte de electrones, síntesis y funcionamiento
del citoesqueleto, metabolismo de carbono y nitrógeno, y respuesta al daño o
invasión por patógenos (Hermsmeier et al., 2001).
La represión de la acumulación de nicotina en hojas atacadas por M.
sexta fue, sin embargo, mucho más marcada en las plantas transgénicas que en
las plantas WT. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de LePS y
LeSYS en tabaco potenció el efecto inhibitorio que la herbivoría por M. sexta
102
tiene sobre la síntesis de nicotina. Considerando que los ensayos de daño
mecánico no afectaron la inducción de la acumulación local y sistémica de
nicotina en las plantas transformadas, y que estudios previos han confirmado
que la síntesis de AJ no es afectada negativamente por herbivoría (McCloud y
Baldwin, 1997), es posible que la potenciación del efecto inhibitorio observado en
las plantas transgénicas se haya debido a una sobre-producción de etileno
endógeno en respuesta a las secreciones orales de M. sexta. Esta es una
posibilidad que deberá analizarse con mayor detalle, ya que no hay evidencia de
que la sobreexpresión de prosistemina, por lo menos en L. esculentum,
favorezca la síntesis de etileno en respuesta a herbivoría. El efecto sistémico en
raíz fue aún más marcado, ya que en las plantas transgénicas los niveles
disminuyeron marcadamente (1.67 veces en la línea Nt-LeSYS 03 y hasta
niveles no detectable en las otras dos líneas). Esto contrastó con las plantas WT,
en las cuales se detectó una acumulación de nicotina en raíz de plantas dañadas
por herbivoría que fue 6.8 veces mayor a la observada en plantas WT dañadas
mecánicamente. Este efecto se podría explicar en base a los argumentos de
Baldwin (2001), quién sugirió que la acumulación de nicotina en raíces de
plantas dañadas por herbívoros que consumen follaje constituye una estrategia
benéfica para la planta, ya que al localizar la síntesis y localización de este
metabolito en la raíz, se favorece el empleo de la nicotina para la defensa de
tejidos aéreos durante el subsiguiente período de recuperación, en la cual la
capacidad fotosintética de la planta (y por lo tanto la síntesis de novo de nicotina)
estará seriamente comprometida.
La infestación B. tabaci también tuvo un efecto negativo sobre la
acumulación de nicotina en plantas WT y transgénicas, particularmente a nivel
local. Es posible que el efecto observado haya sido debido, al igual a lo
observado por daño con M. sexta, a la síntesis facilitada de etileno, aunque esto
no ha sido demostrado aún. La única evidencia experimental a favor de esta
posibilidad, es la inducción de proteínas RP en jitomate en respuesta a la
infestación por este insecto (Mayer et al., 1996), las cuales dependen de etileno
para su expresión en patógenos (Kombrink y Somssich, 1997; Ohtsubo et al.,
1999). Sin embargo, parece más probable que la infestación por B. tabaci, que
es un insecto succionador que se alimenta directamente del floema, haya
cambiado la relación tejido fuente-tejido consumidor en los tejidos infestados, de
103
manera que la demanda de fotosintatos en la hoja infestada de las plantas WT
podría haber reducido la fuerza de la raíz como tejido consumidor, similarmente
a lo que ocurre cuando las plantas de tabaco entran en la fase de floración
(Shiroya et al., 1961), causando una disminución en el transporte de JA a la raíz,
con la consecuente supresión de la inducción de la síntesis de nicotina. Esta
posibilidad se apoya en los resultados obtenidos al analizar las raíces de las
plantas infestadas, excepto la línea Nt-LeSYS 03, en las cuales la nicotina se
redujo hasta niveles no detectables. Otra posibilidad es que los niveles de
nicotina regresaron a sus niveles basales, al menos en follaje, debido al largo
tiempo de muestreo, que se hizo 28 días después de haber infestado con
insectos adultos las hojas de plantas que, al inicio del experimento, tenían solo 4
hojas expandidas. De acuerdo a lo anterior, es probable que los bajos niveles de
nicotina detectados en hojas y raíces de plantas WT y transgénicas infestadas
por B. tabaci se hayan debido a una combinación de efectos ontogénicos y
fisiológicos, caracterizados estos últimos por cambios en el estatus fotosintético
del tejido fuente o consumidor de los tejidos analizados. Esta suposición
concuerda en cierto modo con evidencias experimentales previas obtenidas en
Nicotiana que indican que cualquier tratamiento capaz de incrementar la fuerza
de la raíz como tejido consumidor (e. g., fertilización con nitrógeno) facilita el
transporte de AJ y consecuente síntesis de nicotina, desde las hojas dañadas a
la raíz (Ohnmeiss y Baldwin, 2000) y con la noción de que las relaciones tejido
fuente-tejido consumidor ejercen una influencia muy marcada sobre la
resistencia de las plantas a agobios bióticos y abióticos (Coleman 1986;
Coleman y Leonard, 1995).
Después de la nicotina, la nornicotina es el alcaloide más abundante en N.
tabacum (3% y 6% del total de alcaloides en hojas y raíces, respectivamente)
(Saitoh et al., 1985). En ciertas especies como N. glauca, la nornicotina es
acilada mediante la formación de enlaces amida con ácidos grasos de 12 a 16
átomos de carbono en respuesta a daño mecánico y AJ exógeno; esta
transformación la hace más tóxica hacia herbívoros adaptados a la nicotina
como M. sexta (Laue et al., 2000). Los resultados obtenidos en plantas WT, en
las cuales solo se detectó nornicotina en las hojas distales superior e inferior y
en la raíz de plantas adultas intactas, coincidieron en cierto modo con los
reportados en plantas de N. sylvestris (cuyo contenido de nornicotina es superior
104
al reportado en N. tabacum) en las cuales la nornicotina y otros alcaloides
menores fueron cuantitativamente importantes sólo en plantas senescentes
(Baldwin, 1989). En forma similar a la acumulación de derivados acilados de
nornicotina en plantas de N. glauca dañadas y tratadas con AJ, la nornicotina se
acumuló en hojas dañadas y distales superiores de plantas WT. Por su parte, la
acumulación en respuesta al daño en plantas adultas se reprimió completamente
en las líneas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03, mientras que en la línea Nt-
LeSYS 03 se observó una inducción sistémica apical relativamente intensa (ver
Figura 30). Además, esta línea fue la única en la que se detectó este alcaloide,
tanto en forma constitutiva como inducible, en hojas y raíces de plantas jóvenes.
Tampoco se detectó nornicotina en todos los genotipos sometidos a herbivoría
por M. sexta o a infestación por B. tabaci, lo que posiblemente fue un reflejo de
los niveles abatidos de nicotina detectados en respuesta a estos tratamientos.
Los resultados sugieren que la expresión de LeSYS en tabaco altera el flujo
biosintético de nitrógeno entre nicotina en raíz y nornicotina en follaje,
especialmente en plantas jóvenes. La presencia de nornicotina en plantas
jóvenes de esta línea podría haber sido consecuencia de la senescencia
acelerada que la caracteriza.
El ácido clorogénico (ACG) es un metabolito presente constitutivamente
en varias especies de plantas, particularmente en solanáceas, que funciona
como agente protector contra desafíos de tipo biótico. Por ejemplo, en plantas de
jitomate y tabaco con altos niveles de este metabolito (en tabaco se acumula en
los tricomas glandulares de la superficie de las hojas), se observó una
progresión más lenta y una reducción en los niveles de infección por
Pseudomonas syringae y patógenos fungosos, respectivamente (Maher et al.,
1994; Shedle et al., 2003). Asimismo, incrementos en el contenido de ácido
clorogénico fueron detectados en hojas de plantas infectadas con virus del
mosaico de tabaco, aunque éstos se asociaron más con la formación de
quinonas y productos poliméricos que con la generación de lesiones necróticas y
acumulación de compuestos fenólicos propias de la reacción hipersensible
(Tanguy y Martin, 1972). Su efecto se atribuye, al menos en parte, a la actividad
antioxidante de este metabolito. Esta cualidad favorece su oxidación, después
del daño causado por la infección microbiana o por insectos, por la enzima
105
polifenol oxidasa para generar quinonas reactivas, que tienen la propiedad de
limitar el crecimiento de microorganismos invasores y/o el daño tisular gracias a
su capacidad de formar entrecruzamientos con componentes de la pared celular
(Rober, 1989; Keinänen et al., 2001).
Los niveles basales de ACG resultaron mucho menor en hojas de plantas
jóvenes que en las de plantas adultas. Este resultado posiblemente fue un reflejo
del control estricto que sobre la biosíntesis de fenilpropanoides se presenta
durante el desarrollo de la planta (Bate et al., 1994; Whetten y Sederoff, 1995).
Al parecer, el nivel de estos metabolitos en hoja depende de un balance entre la
actividad de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato-sintasa, DAHPS (ruta
del ácido shiquímico) y fenilalanina amonio liasa, FAL (ruta de los
fenilpropanoides de donde se produce finalmente el ACG). La actividad de FAL
también depende de señales (a)bióticas derivadas del medio ambiente, como
aquellas que se producen en respuesta al daño, lo que coincidió con la
acumulación sistémica y local de ACG (en plantas WT adultas). A su vez, la
expresión de LePS y de LeSYS en plantas transgénicas jóvenes causó una
disminución generalizada, en relación a las plantas WT, del contenido de ACG
en plantas intactas y dañadas. En plantas transgénicas adultas de la línea WT ×
Nt-LeSYS 03 y Nt-LeSYS 03 también se observó una marcada disminución en
los niveles de ACG locales y sistémicos de plantas dañadas, particularmente en
ésta última. La línea Nt-LePS 08 mostró un efecto altamente contrastante
caracterizado por niveles muy bajos de ACG en la hoja de transición tejido
fuente-consumidor, pero muy elevados en la hoja distal superior de plantas
intactas, situación que se invirtió en los mismos tejidos de plantas dañadas. A su
vez, los niveles de ACG disminuyeron drásticamente en plantas WT (reducción a
niveles no detectables en la respuesta sistémica en hoja y raíz) y transgénicas
(reducción generalizada a niveles no detectables en todos los tejidos analizados)
sometidas a herbivoría por M. sexta (Figs. 33 A, B y C). La infestación por B.
tabaci también provocó una disminución en los niveles de ACG, pero ésta fue de
mucho menor intensidad, excepto en hojas de la línea Nt-SYS 03, donde el ACG
se mantuvo por debajo de los límites de detección (ver Figura 34 B). Estos
resultados indican que al igual que en el caso de la nicotina, la herbivoría por
insectos, particularmente M. sexta, redujo los niveles de ACG en plantas WT y
106
que este efecto negativo se potenció en las plantas transgénicas, observándose
inclusive en plantas dañadas mecánicamente. Esto sugiere que el metabolismo
de fenilpropanoides se alteró, de un modo aún no determinado, por la expresión
de LePS y LeSYS en N. tabacum.
Sin embargo, los resultados obtenidos en plantas de la línea Nt-LeSYS
03, en las cuales se detectaron en general niveles significativamente reducidos
de ACG podrían ofrecer una posible pista sobre el mecanismo mediante la
expresión de LePS y LeSYS pues podrían estar afectando la ruta de los
fenilpropanoides, ya que el crecimiento y desarrollo anormal que se presenta en
estas plantas caracterizado por enanismo de las plantas, floración precoz,
morfología alterada de las hojas (lanceoladas, con bordes irregulares y lesiones
necróticas constitutivas) y flores (más pequeñas, con un desarrollo incompleto de
los estambres), lo que se reflejó en una producción de semillas reducida con
muy baja eficiencia de germinación (Rocha-Granados, 2004) se asemeja al
observado en plantas de tabaco en las cuales se encuentra alterado el
metabolismo de fenilpropanoides. Con estos antecedentes se podrían sugerir los
siguientes escenarios para explicar la reducción de ACG (y de fenoles totales) en
plantas de tabaco sobreexpresantes de LeSYS y LePS: i) alteración del balance
de aminoácidos aromáticos, tal como se observó en plantas transgénicas de
tabaco en las cuales la sobreexpresión de triptófano y tirosina descarboxilasas
resultó, curiosamente, en una reducción en los niveles de triptófano y tirosina.
Esto causó alteraciones fisiológicas y bioquímicas en las plantas transgénicas
debido a un giro compensatorio en el flujo de la ruta del ácido shiquímico para
favorecer la síntesis de estos dos aminoácidos y disminuir la de compuestos
fenilpropanoides; tales cambios se asociaron a la detección de niveles
anormales de metabolitos secundarios como nicotina y ácido clorogénico (Guillet
et al., 2000); ii) modificación del equilibrio entre citocininas y auxinas, similar a la
observada en plántulas de tabaco transformadas con variantes del gen 6b de
Agrobacterium tumefaciens, que se considera como un gen accesorio que
modula la acción de estas hormonas. Este cambio se atribuyó a una reducción
en el catabolismo de auxinas debido al efecto protector asociado con la
acumulación temprana de los fenilpropanoides escopolina y ACG (Gális et al.,
2002, 2004), y/o iii) alteración en la actividad de la enzima fenilalanina amonio
liasa (FAL), que es la enzima clave responsable de catalizar la reacción limitante
107
en la síntesis de ACG, que junto con la rutina, son los compuestos fenólicos
extraíbles más abundantes en hoja de tabaco. Esta última posibilidad se apoya
en el hecho de que plantas de tabaco en las cuales la expresión de FAL
endógeno se suprimió por la sobreexpresión de dos genes FAL exógenos,
provenientes de fríjol, presentaron niveles muy bajos de fenilpropanoides así
como un fenotipo caracterizado por alteraciones morfológicas severas como
enanismo, curvatura y cambio en la textura de las hojas, morfología y
pigmentación alterada de las flores, reducción de la viabilidad del polen, lesiones
necróticas y fluorescentes en hojas y lignificación reducida, particularmente en el
xilema (Elkind et al., 1990).
Una forma relativamente sencilla de comprobar que existe una relación
entre la reducción de ACG, un mayor catabolismo de auxinas y una consecuente
inhibición del crecimiento por citocininas en plantas Nt-LeSYS 03, podría hacerse
mediante la adición de niveles bajos (0.3 µM) de auxinas sintéticas exógenas
(ej., ácido naftalenacético) al medio de cultivo usado para la regeneración in vitro
de estas plantas, tal como fue demostrado por Gális et al., (2002).
Por lo menos siete sesquiterpenos bicíclicos (capsidiol, risitina, lubimina,
solavetivona, fituberina, fituberol y debneiol) se acumulan en respuesta a estrés
en N. tabacum (Guedes et al., 1982; Threlfall y Whitehead, 1988). De éstos, el
capsidiol es el más abundante, no sólo en N. tabacum sino en otras plantas
solanáceas como Capsicum annuum, Solanum tuberosum y Datura spp.
(Guedes et al., 1982). Usualmente, el capsidiol se encuentra ausente en tejidos
sanos y se sintetiza rápidamente en N. tabacum; la acumulación de esta
fitoalexina se detecta entre 12 y 24 h después de la infección de plantas intactas
por hongos, oomicetos, bacterias y virus o de la inducción de suspensiones
celulares con evocadores bíoticos (esporas fungosas, fragmentos de paredes
celulares de hongos, glicoproteínas derivadas de oomicetos como criptogeína,
celulasa, etc.) o abióticos (e. g., iones metálicos) (Threlfall y Whitehead, 1988;
Vögeli y Chappel, 1988, 1990; Yin et al., 1997; Keller et al., 1998). Sin embargo,
la acumulación de capsidiol en cultivos celulares inducidos de tabaco, papa y
chile es relativamente fugaz, ya que éste tiende a desaparecer con la misma
velocidad con la cual se acumuló, mediante un proceso catabólico que no ha
sido plenamente identificado (Threlfall y Whitehead, 1988). En contraste, la
108
síntesis de capsidiol está bien definida. Este metabolito, al igual que todas las
fitoalexinas sesquiterpénicas, se sintetiza a través de la ruta biosintética de los
isoprenoides. Su síntesis de novo es precedida por la activación de la enzima
clave 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGR), de cuya reacción se
derivará eventualmente el farnesil pirofosfato (FPP). El FPP es el último
compuesto en común por el que compiten las rutas biosintéticas de los esteroles
y sesquiterpenos, respectivamente. En esta última, los esqueletos carbonados
son dirigidos hacia la síntesis de capsidiol y otras fitoalexinas similares mediante
una ruta cuya reacción determinante, catalizada por la enzima 5-epi-
aristoloqueno sintasa (EAS), es la conversión de FPP a 5-epi-aristoloqueno
(Dudley et al., 1986; Croteau et al., 1987; Threlfall y Whitehead, 1988; Bohlmann
et al., 2002).
En este estudio no se pudo detectar capsidiol sino un producto de
degradación (Ramírez E, comunicación personal) que bien podría ser similar a
aquellos reportados por otros investigadores, como la capsenona o la cis-9,10-
dihidrocapsenona (Zacharius et al., 1985; Whitehead et al., 1987). Es probable
que la ausencia de capsidiol en las muestras analizadas tomadas de las plantas
dañadas mecánicamente o por insectos se haya debido a los tiempos de
muestreo, los cuales rebasaron ampliamente la vida media del capsidiol (12-24
h). Resulta, sin embargo, difícil de explicar la detección de catabolitos del
capsidiol en tejidos de plantas intactas donde, debido a la naturaleza
estrictamente inducible de este metabolito, no debería estar presente (pero ver
los argumentos presentados más adelante).
Posiblemente, y tal como se ha observado con otros metabolitos
secundarios de N. tabacum analizados en este trabajo, la acumulación
constitutiva del capsidiol, la cual se asume por la presencia de su catabolito,
pudiera estar regulada también por la ontogenia de la planta, ya que los niveles
constitutivos de esta fitoalexina detectados tanto en hoja como en raíz, fueron de
9 a 30 veces más altos en plantas jóvenes. El efecto sobre los niveles de
capsidiol causado por daño mecánico, que se sabe induce levemente la
expresión de EAS (Yin et al., 1997), también varió con la edad de las plantas,
siendo inductivo en plantas adultas, e inhibitorio en plantas jóvenes (Fig. 35 A y
B). La detección de bajos niveles de dihicrocapsenona en plantas intactas,
aunque inesperada, tiene relación con resultados previos en los cuales se
109
detectó una expresión basal del gen GUS en hojas, tallos y raíces de un número
de plantas transgénicas de N. tabacum transformadas con el promotor de EAS4,
uno de las 12 a 15 copias del gen de esta sesquiterpeno ciclasa que se han
detectado en el genoma de N. tabacum (Fachini y Chappel, 1992). De manera
que la presencia de múltiples formas del gen EAS en tabaco sugiere que, en
esta especie, cada uno de los genes podría ser regulado independientemente, y
en forma diferencial, durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos
ambientales (Yin et al., 1997), lo que podría explicar los resultados contrastantes
entre plantas jóvenes y adultas obtenidos tanto con plantas intactas como
dañadas. En las raíces de plantas de N. tabacum intactas también se detectó
capsidiol cuantificado en forma directa como dihicrocapsenona cuyos niveles, al
igual que en follaje, fueron superiores en plantas jóvenes. Este resultado
coincidió con lo encontrado en raíces de plantas de tabaco silvestres (N.
attenuata y N. sylvestris), donde se detectó la expresión constitutiva del gen
EAS, a la cual se le atribuyó una leve acumulación de capsidiol (10 ng/g PF) en
raíces de plantas intactas (Bohlmann et al., 2002). De acuerdo a estos
investigadores, este hallazgo sugiere que el capsidiol no es solamente un
metabolito defensivo cuya acumulación se induce en respuesta a patógenos,
sino que constituye una defensa de tipo constitutivo que se expresa en forma
tejido específica en algunas especies de Nicotiana para impedir la invasión de
patógenos en la rizósfera, cuyas células epidérmicas, las cuales carecen de una
capa de cutícula protectora, son particularmente vulnerables debido a la abrasión
a la que continuamente están expuestas.
La sobreexpresión en tabaco de LePS y LeSYS redujo, en general, los
niveles constitutivos de capsidiol (dihidrocapsenona), en las plantas
transformadas, que en algunos casos (e. g., hojas de plantas jóvenes de la línea
Nt-LeSYS 03) estuvieron por debajo del límite de detección. El daño mecánico
tuvo un ligero efecto inductivo en plantas transgénicas jóvenes, que contrastó
con lo observado en plantas WT, mientras que en plantas transgénicas adultas
(excepto en la línea Nt-LeSYS 03) el daño mecánico causó una acumulación
extraordinaria de dihidrocapsenona, particularmente en plantas Nt-LePS 08 (Fig.
35 F). Estos resultados sugieren fuertemente que los mecanismos de regulación
que controlan la síntesis de este metabolito en N. tabacum se alteraron de tal
forma que permitieron la sobre acumulación de dihidrocapsenona en respuesta a
110
daño mecánico. Un posible blanco podría ser el gen EAS, cuya expresión está
estrechamente relacionada con la acumulación de capsidiol y otras fitoalexinas
sesquiterpénicas en N. tabacum. De modo que, al igual a lo que se ha observado
en la inducción del gen FAL (Kuhn et al., 1984; Bolwell et al., 1985; Lawton y
Lamb, 1987; Lois et al., 1989), que como se ha mencionado anteriormente es
una de las enzimas claves que regulan la ruta biosintética de los
fenilpropanoides, la síntesis elevada y estable de capsidiol en la plantas Nt-LePS
08 y WT × Nt-LeSYS 03 podría haberse debido a un incremento en: i) la tasa de
traducción de los ARNm que codifican para las diferentes formas del gen EAS y
la subsiguiente síntesis de novo de la enzima EAS; ii) la estabilidad de los
transcritos de EAS; y/o, iii) la velocidad de transcripción del gen EAS. Esta
hipótesis se apoya en los hallazgos de un estudio realizado por Vögeli y
Chappell (1990), quienes demostraron que la regulación de la actividad de la
enzima sesquiterpeno ciclasa en N. tabacum está mediada por un control, a nivel
transcripcional, de la expresión del gen EAS. Sin embargo, no puede descartarse
una posible contribución de otros genes reguladores de la síntesis de
isoprenoides, como el HMGR. Estas son posibilidades que quedan sujetas a
posterior investigación para ser verificadas o desmentidas.
La acumulación de capsidiol (dihidrocapsenona) en plantas WT sometidas a
herbivoría por larvas de M. sexta fue ligeramente superior a la detectada en
plantas dañadas mecánicamente (Figs. 35 y 36). Un efecto similar se observó en
plantas Nt-LeSYS 03 (Fig. 36 C), mientras que en las líneas Nt-LePS 08 y WT ×
Nt-LeSYS 03, la herbivoría fue claramente incapaz de inducir la acumulación de
los mismos niveles de capsidiol observados en plantas dañadas mecánicamente,
lo que sugiere que cualquiera que haya sido el factor generado por daño
mecánico que disparó la síntesis de capsidiol en estas plantas transgénicas, fue
neutralizado o suprimido por componentes presentes en las secreciones orales
de M. sexta, tal como se discutió anteriormente en el caso de la nicotina. A pesar
de ello, la leve inducción de capsidiol coincidió con los resultados reportados por
Bohlmann et al., (2002), quienes detectaron la acumulación de transcritos de
EAS y de capsidiol, aunque en niveles inferiores a los reportados en
suspensiones celulares de N. tabacum (Vögeli y Chappell, 1988), en tejido aéreo
de plantas de N. attenuata y N. sylvestris dañadas por larvas de M. sexta. Por el
111
contrario, se detectó una fuerte acumulación de capsidiol (dihidrocapsenona),
particularmente a nivel local (excepto en la línea Nt-LeSYS 03), en plantas
infestadas por mosquita blanca (Fig. 37 A a 37 C). Los altos niveles de capsidiol
detectados en estas plantas coinciden con la propuesta de que los insectos
chupadores que se alimentan directamente del floema son percibidos por la
planta como patógenos, debido a las similitudes que existen entre la manera en
que las hifas fungosas y el estilete de los insectos chupadores penetran la planta
y en menor medida, entre el tipo de enzimas hidrolíticas que se liberan durante la
invasión por hongos patógenos o alimentación de los insectos (Fidantsef et al.,
1999; Walling, 2000). La expresión de respuestas defensivas similares a las
inducidas por patógenos en plantas infestadas por insectos chupadores también
se ha atribuido a los virus y/o microorganismos, endo simbiontes que ellos
frecuentemente se encuentran (McKenzie et al. 2002). Es probable que la
inducción de capsidiol (dihidrocapsenona), por mosquita blanca detectada en las
plantas estudiadas, al igual a lo observado en plantas transgénicas de N.
tabacum transformadas con el promotor EAS4 fusionado al gen GUS (Yin et al.,
1997), haya sido independiente de ácido salicílico, ácido jasmónico y H2O2. Esta
propuesta se apoya, en cierta medida, en los resultados reportados por van de
Ven et al., (2000), quienes encontraron que la expresión del gen SLW3, inducida
en plantas de calabaza infestadas por B. argentifolii, fue independiente de estas
moléculas de señalización.
112
8. CONCLUSIONES
113
9. PERSPECTIVAS
114
existe una relación entre la reducción de ACG observado con un mayor
catabolismo de auxinas y una consecuente inhibición del crecimiento por
citocininas, debido a la expresión de LeSYS.
Considerando que el espectro de masas de la mayoría de los picos
obtenidos por GC/MS produjo señales que indicaban la presencia de
modificaciones por oligosacáridos y otros compuestos orgánicos, sería
conveniente realizar un análisis de los extractos después de su hidrólisis ácida
para tener una idea del grado de modificación que pudieran tener los metabolitos
secundarios de interés en tabaco. Resultaría interesante determinar si el grado
de modificación cambia en respuesta al daño mecánico y herbivoría, y si estos
cambios tienen relación con su actividad biológica.
115
10. BIBLIOGRAFÍA
Baldwin IT, Zhang Z, Diab N, Ohnmeiss TE, McCloud ES, Lynds GY,
Schemelz EA (1997) Quantification, correlations and manipulation of wound-
induced changes in jasmonic acid and nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta
201: 387-404
Bate Nj, Weiting JO, Meromi A, Meromi N-H, Doerner PW, Dixon RA, Lamb
CJ, Elkind J (1994) Quantitative relationship between phenylalanine ammonia-
lyase levels and phenylpropanoid accumulation in transgenic tobacco identifies a
rate-determining step in natural product synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 91:
7608-7612
116
Bergey DR, Howe GA, Ryan CA (1996) Polipeptide signaling for plant defensive
genes exhibits analogies to defense signaling in animals. Proc Natl Acad Sci
USA 93: 12053-12058
Birch PRJ, Avrova AO, Duncan JM, Lyon GD, Toth RL (1999) Isolation of
potato genes that are induced during an early stage of the hypersensitive
response to Phytophthora infestans. Mol Plant-Microbe Interactions 12: 356-361
Bolwell GP, Bell JN, Cramer CL, Schuch W, Lamb CJ, Dixon RA (1985) L-
Phenylalanine ammonia-lyase from Phaseolus vulgaris: characterization and
differential induction of multiple forms from elicitor-treated cell suspension
cultures. Eur J Biochem 149: 411-419
117
Croft KPC, Voisey CR, Slusarenko AJ (1993) Volatile products of the
lipooxigenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris (L.) leaves inoculated
with Pseudomonas syringae pv phaseolicola. Plant Physiol 101: 13-24
Dietrich A, Mayer JE, Hahlbrock K (1990) Fungal elicitor trigger rapid, transient
and specific protein phosphorylation in parsley cell suspension cultures. J Biol
Chem 265: 6360-6368
Dong X (1998) SA, JA, ethylene and disease resistance in plants. Curr Opin
Plant Biol 1: 316-323
Ebel J, Cosio EG (1994) Elicitors of plant defense responses. Int Rev Cytol 148:
1-36
Elkind, Y., Edwards, R., Mavanad, M., Hedrick, S.A., Ribak, O., Dixon, R.A.,
Lamb, C.J. (1990) Abnormal plant development and down-regulation of
phenylpropanoid biosynthesis in transgenic tobacco containing an heterologous
phenylalanine ammonia-lyase gene. Proc Natl Acad Sci USA 87: 9057-9061
118
Fachini PJ, Chappel J (1992) Gene family for an elicitor-induced sesquiterpene
cyclase in tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11088-11092
Farmer EE, Ryan CA (1990) Interplant communication: airborne methyl
jasmonate induces synthesis of proteinase inhibitors in plant leaves. Proc Natl
Acad Sci USA 87: 7713-7716
Fidantsef, A.L., Stout, M.J., Thaler, J.S., Duffey, S.S., Bostock, R.M. (1999)
Signal interactions in pathogen and insect attack: expression of lipoxygenase,
proteinase inhibitor II, and pathogenesis-related protein P4 in the tomato
Lycopersicon esculentum. Physiol Mol Plant Pathol 54: 97-114
119
Geoffroy P, Legrand M, Fritig B (1990) Isolation and characterization of a
proteinaceous inhibitor of microbial proteinases induced during the hypersensitive
reaction of tobacco to tobacco mosaic virus. Mol Plant-Microbe Interactions 3:
327-333
Glawe GA, Zavala JA, Kessler A, van Dam N, Baldwin IT (2003) Ecological
costs and benefits correlated with trypsin protease inhibitor production in
Nicotiana attenuata. Ecology 84: 79-90
120
Hain R, Reif H, Krause E, Langebartels R, Kindl H, Vornam B, Wiese W,
Schreier PH, Stocker RH, Stenzel K (1993) Disease resistance results from
foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361: 153-156
Halitschke R., Schittko U., Pohnert G., Boland W., Baldwin I.T. (2001)
Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta
(Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. III. Fatty acid-
amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient
for herbivore-specific plant responses. Plant Physiol 125: 711-717
Heo WD, Lee SH, Kim MC, Kim JC, Chung WS, Chun HJ, Lee KJ, Park HC,
Choi JY, Cho MJ (1999) Involvement of specific calmodulin isoforms in salicylic
acid-independent activation of plant disease resistance responses. Proc Natl
Acad Sci USA 96: 766-771
Howles PA, Sewalt VJH, Paiva NL, Elkind Y, Bate NJ, Lamb C, Dixon RA
(1996) Overexpression of L-phenylalanine ammonia-lyase in transgenic tobacco
plants reveals control points for flux into phenylpropanoid synthesis. Plant Physiol
112: 1617-1624
121
proteinase activity insensitive to inhibition. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8041-
8045
Kleinig H (1989) The role of plastids in isoprenoid biosynthesis. Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol 40:39-59
Knoesterm M, Van Loon LC, van den Hevel J, Henning J, Bol JF, Linthorst
HJM (1998) Ethylene-insensitive tobacco lacks nonhost resistance against soil-
borne fungi. Proc Natl Acad Sci USA 95: 1933-1937
Kombrink E., Somssich I.E. (1997) Pathogenesis related proteins and plant
defense En Carroll CG, Tudzynski P (eds). Plant relationships. Berlin: Springer-
Verlag, p 107-128
Laue G, Preston CA, Baldwin IT (2000) Fast track to the trichome: induction of
N-acyl nornicotines precedes nicotine induction in Nicotiana repanda. Planta 210:
510-514
122
Lawton KA, Friedrich L, Hunt MH, Weymann K, Delaney T, Kessmann H,
Staub T, Ryals J (1996) Benzothiadiazole induces disease resistance in
Arabidopsis by activation of the systemic acquired resistance signal transduction
pathway. Plant J 10:71-82
Li L, Li C, Lee GI, Howe GA (2002a) Distinct roles for jasmonate synthesis and
action in the systemic wound response of tomato. Proc Natl Acad Sci USA 99:
6416-6421
Li C, Williams MM, Loh Y-T, Lee GI, Howe GA (2002b) Resistance of cultivated
tomato to cell content-feeding herbivores is regulated by the octadecanoid-
signaling pathway. Plant Physiol 130: 494-503
Maher EA, Bate NJ, Ni W, Elkind Y, Dixon RA, Lamb CJ (1994) Increased
disease susceptibility of transgenic tobacco plants with suppressed levels of
preformed phenylpropanoid products. Proc Natl Acad Sci USA 91: 7802-7806
123
Mayer MJ, Narbad A, Parr AJ, Parker ML, Walton NJ, Mellon FA, Michael AJ
(2001) Rerouting the plant phenylpropanoid pathway by expression of a novel
bacterial enoyl-CoA hydratase/lyase enzyme function. Plant Cell 13: 1669-1682
Mayer RT, McCollum TG, McDonald RE, Polston JE, Doostdar H (1996)
Bemisia feeding induces pathogenesis-related proteins in tomato. En D Gerling,
RT Mayer (eds.) Bemisia 1995: taxonomy, biology, damage control and
management. Andover, Hants, UK: Intercept Ltd. P 179-188
McKenzie C.L, Shatters R.G., Doostdar H., Lee S.D., Inbar M., Mayer R.T.
(2002) Effect of geminivirus infection and Bemisia infestation on accumulation of
pathogenesis-related proteins in tomato. Arch Insect Biochem Physiol 49: 203-
214
Meindl T, Boller T, Felix G (1998) The plant wound hormone sistemin binds with
the N-terminal to its receptor but needs the C-terminal part to activate it. Plant
Cell 10: 1561-1570
124
Narváez-Vásquez J, Pearce G, Ryan CA (2005) The plant cell matrix harbors a
precursor of defense signaling peptides. Proc Natl Acad Sci USA 102: 12974-
12977
Nelson CE, Walker-Simmons KM, Makus D, Zuroske G, Graham J, Ryan CA
(1983) Regulation of syntesis and accumulation of proteinase inhibitors in leaves
of wounded tomato plants En PA Hedin (ed) Plant Resistance in leaves.
American Chemical Society, Washington, D.C. pp 103-122
Ohnmeiss TE, Baldwin IT (2000) Optimal defense theory predicts the ontogeny
of an induced nicotine defense. Ecology 81: 1765-1783
Paré PW, Tumlinson JH (1997) Induced synthesis of plant volatiles. Nature 385:
30-31
Pallas JA, Paiva NL, Lamb C, Dixon RA (1996) Tobacco plants epigenetically
suppressed in phenylalanine ammonia-lyase expression do not develop systemic
acquired resistance in response to infection by tobacco mosaic virus. Plant J 10:
281-293
Parker JE (2003) Plant recognition of microbial patterns. Trends Plant Sci 8: 245-
247
125
Pearce G, Strydom D, Johnson, S, Ryan CA (1991) A polypeptide from tomato
leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science 253: 895-
898
Pieterse CMJ, van Loon LC (1999) Salicylic acid independent plant defence
pathways. Trends Plant Sci 4: 52-58
Pieterse CMJ, van Wees SCM, van Pelt JA, Knoester M, Laan R, Gerrits N,
Pelt JA, van Loon LC (1996) Systemic resistance in Arabidopsis induced by
biocontrol bacteria is independent of salicylic acid accumulation and
pathogenesis-related gene expression. Plant Cell 8: 1225-1237
126
Rocha-Granados MC (2004) Sobre-expresión de la prosistemina y sistemina de
jitomate (Lycopersicon esculentum) en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) y
su influencia sobre la resistencia a insectos. Tesis de Doctorado. Cinvestav IPN-
Unidad Irapuato
Ryals JA, Neuenschwander UH, Willits MG, Molina A, Steiner HY, Hunt MD
(1996) Systemic acquired resistance. Plant Cell 8: 1809-1819
Ryan CA, Jagendorf A (1995) Self defense by plants. Proc Natl Acad Sci USA
92: 4075
Ryan CA, Moura DS (2002) Systemic signaling in plants: A new perception. Proc
Natl Acad Sci USA 99: 6519-6520
127
Schaller A (1999) Oligopeptide signalling and the action of systemin. Plant Mol
Biol 40: 763-769
Scheer JM, Ryan CA (2000) The systemin receptor SR160 from Lycopersicon
peruvianum is a member of the LRR receptor kinase family. Plant Biol 99: 9585-
9590
Shedle GL, Wesley SV, Korth KL, Chen F, Lamb C, Dixon R (2003)
Phenylpropanoid compounds and disease resistance in transgenic tobacco with
altered expression of L-phenylalanine ammonia-lyase. Phytochemistry 64: 153-
161
128
Sisson VA, Severson RF (1990) Alkaloid composition of the Nicotiana. Beitr
Tabakforsch Int 14: 327-340
Snook ME, Mason PF, Sisson VA (1986) Polyphenols in the Nicotiana species.
Tob Sci 30: 43-49
Snook ME, Johnson AW, Severson RF, Teng Q, White RA Jr, Jackson DM
(1997) Hydroxygeranyllinalool glycosides from tobacco exhibit antibiosis in the
tobacco budworm [Heliothis virescens (F.)]. J Agric Food Chem 45: 2299-2308
Stout MJ, Findantsef AL, Duffey SS, Bostock RM (1999) Signal interactions in
pathogens and herbivores of the tomato, Lycopersicum esculentm. Physiol Mol
Plant Pathology 54: 115-130
Thain JF, Doherty HM, Bowles DJ, Wildon DC (1990) Oligosaccharides that
induce proteinase inhibitor activity in tomato plants cause depolarization of
tomato leaf cells. Plant Cell Env 13: 569-574
129
Tian M, Benedetti B, Kamoun S (2005) A second Kazal-like protease inhibitor
from Phytophthora infestans inhibits and interacts with the apoplastic
pathogenesis-related protease P69B of tomato. Plant Physiol 138: 1785-1783
van de Ven WTG, LeVesque CS, Perring TM, Walling LL (2000) Local and
systemic changes in squash gene expression in response to silverleaf whitefly
feeding. Plant Cell 12: 1409-1423
130
Whitehead IM, Threlfall DR, Ewing DF (1987) Cis-9,10-dihydrocapsenone: a
possible catabolite of capsidiol from cell suspension cultures of Capsicum
annuum. Phytochemistry 26: 1367-1369
Yamamoto RT (1964) Mass rearing of the tobacco hornworm II. Larval rearing
and pupation. J Econ Entomol 62: 1427-1431
Zhang Z-P, Baldwin IT (1997) Transport of [2-14C] jasmonic acid from leaves to
roots mimics wound-induced changes in endogenous jasmonic acid pools in
Nicotiana sylvestris. Planta 203: 436-441
Zhu-Salzman K., Salzman R.A, Koiwa H., Murdock L.L, Bressan R.A.,
HAsegawa P.M. (1998) Ethylene negatively regulates local expression of plant
defense lectin genes. Plant Physiol 104: 365-372
131