ANOTACIONES COMPLEMENTARIAS A LAS UNIDADES DE DIAPOSITIVAS DE

CLASE NO VISTAS PRESENCIALMENTE.

ASIGNATURA: INGENIERIA GENETICA
SECCION II: Sección B
TEMATICAS: DE CLONACION EN LEVADURAS, PLANTAS Y
ANIMALES/HUMANOS, HASTA TERMINAR.

LEVADURAS (Diapo. 14 a la 32)

La importancia de las levaduras, radica en que a pesar de ser un
microorganismo unicelular como las bacterias, es un organismo eucariota. Así,
sus vectores de clonación, presentan en sus plásmidos, la capacidad de
expresión funcional de genes la genes propios o de otros organismos
eucarioticos como los presentes en animales y plantas. Esta expresión está
garantizada por la presencia de fuertes promotores.
La reproducción celular de las levaduras está caracterizada por las diferentes
fases universales el ciclo celular, pero con una característica muy particular,
como es su división celular asimétrica. Desde el punto de vista de la genética,
otra característica importante de su ciclo celular o de vida , es la presencia de
células diploides 2n (α/a) , y haploides n (α) o (a). Las líneas haploides expresan
en su fenotipo toda su genética en los doble haploides (líneas homocigotas),
de gran interés para evaluar la expresión de genes sin enmascaramiento por
la dominancia de otros genes o alelos.
Otras características, no menos importantes de las levaduras, como la facilidad
de cultivo y manipulación en el laboratorio, y por su bien conocidas genética,
fisiología; es su capacidad de modificar post-transduccionalmente las
proteínas expresadas por genes propios o foráneos insertos en sus sistemas
vectores utilizados por las diferentes técnicas de transformación genética.
Los sistemas vectores en levaduras son múltiples, pero podemos destacar
cuatro de ellos: 1) Plásmidos Integrativos-Yip; 2) Plásmidos Episomales-YEp; 3)
Plasmidos Centromericos-YCp o YRp; y 4) Los miniCromosomas Artificiales de
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levadura-YAc. Estos vectores se nominan o representan de esa forma por
varias razones: Primero. Por sus sistemas de replicación celular, asi los
llamados integrativos, se integra al cromosoma bacteriano para su replicación,
pero los episomales solo requieren la presencia de secuencias 2µ (dos miu),
para su replicación autónoma sin integración, y funcionan bien en diferentes
especies de levaduras. Los centromericos poseen secuencias de centromeros
que facilitan su replicación celular, y los minicromosomas que se replican como
un cromosoma más, y con una estructura más compleja que los anteriores,
incluyendo la presencia de telomeros. Segundo. Porque presentan diferente
número de copias por célula, y diferente capacidad de transformación por
microgramo de ADN (Tra/µg ADN). Caracteristicas importantes al momento de
seleccionar un vector para la expresión de un gen para un uso en particular.
Por ejemplo, para genes de uso industrial, o sea que se necesitan productos
en grandes cantidades, un vector tipo Yip, porque presentan más de 100 copias
por genoma, y una alta capacidad de transformación por microgramo de ADN
(20.000 tra/µg ADN). Otro ejemplo seria seleccionar un vector de clonación
para armar una genoteca. Cual escogería? El minicromosoma sería ideal, con
diferentes sitios para corte por enzimas de restricción (RE), para múltiples
sitios de clonación de genes (MCS),

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PLANTAS (Diap. 33 a la 50)
Para el mejoramiento de plantas o la producción de nuevas variedades con
características agronómicas, alimenticias o ambientales deseables, la
naturaleza y el hombre han venido trabajando desde sus existencias.
Probablemente, la naturaleza a través del agua, del viento, de los insectos y
las aves; han venido movilizando información genética, vía semillas o polen,
entre organismos similares o distantes, en diferentes ambientes. Pero el
hombre, desde nuestros ancestros y en la actualidad han venido acelerando
esta movilización genética, o mejoramiento genético, con herramientas
manuales, biológicas, físicas y químicas; hasta el punto de romper las barreras
naturales existentes para el cruzamiento entre especies no relacionadas de
plantas.
En mejoramiento de plantas, además de la polinización artificial o
macroscópica, con gránulos de polen, y /o procesos manuales vía injertos; se
han aplicado técnicas celulares o microscópicas, como la manipulación de
protoplastos; y otras aún más complejas a nivel molecular o
ultramicroscópicas como la tecnología del ADN recombinante o ingeniería
genética.
Las técnicas celulares pueden implicar el aislamiento y fusión de protoplastos
de especies afines para producir híbridos celulares como: heterocariontes,
sincariocitos o cibridos; estos implican la presencia de núcleos, fusión de
núcleos o fusión de citoplasmas respectivamente. Estos híbridos pueden
implicar intercambios de grupos de genes o de cromosomas, y la posible
regeneración de nuevas plantas o variedades con características promisorias.
Las técnicas moleculares implican la tecnología del ADN recombinante que se
desarrolla como la ingeniería genética. Aquí, el intercambio de información
genética implica aislamiento de genes individuales, que codifican para
características agronómicas deseables. Para acceder a estos genes se aplica la
tecnología de forma “inversa”, o sea que a partir de características fenotípicas,
como el color de la cascara de una fruta, se procede a buscar el gen
responsable. Por ejemplo, para identificar y aislar el gen responsable del color
rojo de la cascara del tomate. Este color resulta de la expresión del gen en
ARNm cuya translación en el ribosoma produce la proteína responsable del
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color. Así, la tecnología inversa permite aislar los ARMm presentes en la fruta
y utilizarlos para producir copias de ADN (ADNc), utilizando la transcriptasa
reversa; luego se usa este ADNc como sonda para hibridar con ADN genómico,
y así identificar la secuencia completa del gen para el color rojo. Luego de la
identificación del gen se incorpora a un sistema vector, como el de
Agrobacterium, muy eficiente en la transformación de plantas. Por ejemplo si
queremos producir frutos de guayaba con cascara roja, podemos transformar
células o tejidos con este vector y regenerar plantas transgénicas para
producción de guayabas rojas, con un mayor potencial de mercado por lo
atractivo del color. Para confirmar la estabilidad del gen clonados se hacen
observaciones por unas 5 generaciones que siguen una herencia mendeliana
normal.
En general, las diferentes técnicas de transformación como las biológicas vía
virus o bacterias; o las químicas vía dimetilsulfosido (DMSO) o polietilenglicol
(PEG); o como las físicas vía electroporacion, micro inyección o pistola de
microparticulas; tienen un gran potencial para la transgénesis en diferentes
cultivos de importancia alimenticia, farmacéutica o industrial. Muchos de
estos cultivos pertenecen a los grupos de las gramíneas, de las palmas,
productores de raíces, musáceas y otros frutales.
Los genes para transformar plantas no solo tienen origen en otras plantas, sino
que pueden provenir de otros grupos de organismos como virus, bacterias o
animales. Estos genes pueden conferir características de resistencia a plagas y
enfermedades, a factores ambientales adversos o aportar características
agronómicas y alimenticias superiores.
Para ilustración tenemos algunos ejemplos remarcables de transgénesis. La
transformación y producción de plantas de maíz con genes para alfa-
endotoxinas (Cry), aislados de Bacillus thuringiensis (Bt), para conferir
resistencia a plagas como el gusano cogollero, u otras plagas como
lepidópteros, dípteros y nematodos.
Los genes Cry codifican para proteínas toxicas, estas forman cristales inertes
en las células vegetales de las plantas trangenicas, que al ser ingeridos por el
gusano, son disueltos y activados en forma de toxinas monomericas, que se
asocian en grupos de a tres y forman oligomeros activos o toxina, que se

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insertan en las células de la membranas de los tejidos digestivos, formando
microporos por los que ocurren perdidas de electrolitos, causando lisis celular
o muerte celular del gusano.
Las multinacionales ofrecen cultivos transgénicos, con diferentes genes, tipo
Cry (I. II, III, IV…..), y a la ves proponen diferentes tipos de arreglos de siembra
en campo. Por ejemplo proponen siembras de solo maíces transgénicos con
dos genes Cry diferentes; un segundo arreglo propone uso de transgénicos,
que activan el gen Cry, solo cuando la planta llega a floración; y un tercer
arreglo propone la siembra tanto de plantas transgénicas como no
transgénicas. Cual arreglo le parece mejor? Porque?
Un segundo ejemplo muy interesante y relacionado con el de la clonación de
genes que confieren resistencia a herbicidas. Aquí tenemos el gen de la N-
acetiltransferasa, que confiere resistencia al herbicida glifosato en las plantas
transformadas con este gen, y amplificado 10.000 veces. Esta enzima
neutraliza la actividad del glifosato al insertar grupos acetilo en su estructura.
El mecanismo de muerte de las plantas, de coca (Erythroxylum coca), por la
aplicación del glifosato en plantas no transgénicas, es que puede actuar como
un análogo del Fosfoenolpiruvato. Esto implica que el shikimato reacciona con
glifosato, bloqueando la producción del enolpiruvilshikimato-3-fosfato, que es
el precursor en la síntesis de tres aminoácidos esenciales: triptófano, tirosina
y fenilalanina; bloqueándose así la síntesis de proteínas, lo que induce la
muerte de la planta.
Un tercer ejemplo, está relacionado con la manipulación de genes para el
control de virus en plantas. Esta tecnología consiste en utilizar la clonación
“Anti Sentido”, o sea que se clona un gen que exprese un ARNm que es
complementario a un ARNm del virus, como por ejemplo, que codifique para
la proteína de la capside viral; así, al unirsen por homología estos dos ARN
mensajeros, forman una doble cadena, impidiendo que el ARNm viral sea
reconocido por el ribosoma, evitándose asi la producción de la proteína de la
capside viral y al mismo tiempo se bloquea la formación de partículas virales.
También, esta doble cadena de ARN mensajeros puede ser reconocida como
una molécula anormal y ser destruida por las nucleasas.

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Como cuarto ejemplo, tenemos manipulación de genes para mejorar la calidad
de los frutos del tomate, confiriéndole resistencia al deterioro de la piel o
cascara del tomate. Aquí se aplica la tecnología de “Sustraccion de Genes”, que
consiste en reducir, de forma parcial, la actividad o expresión del gen
responsable de la característica a controlar, con la aplicación parcial de la
técnica antisentido. Aquí se clona una parte del gen en forma antisentido,
bloqueando de forma parcial la expresión completa del gen, lo que reduce la
cantidad de proteína responsable de la característica o problema. En este caso
la expresión del gen a controlar es el de la enzima poligalacturonasa, que
acelera el deterioro del tomate en el almacenamiento, pero al reducirse la
cantidad de esta enzima en la fruta, permite que el tomate dure mucho mas
sin descomponerse.
Esta técnica tiene aplicaciones prácticas, en plantas, para control del color de
flores o frutos, de la cantidad de almidón, de ácidos grasos y/o de fosforo no
digerible, entre otros
Como quinto ejemplo, tenemos la tecnología para la manipulación de genes
en semillas, para controlar su germinación, que puede ser vista como una
amenaza a la biodiversidad de los países tropicales subdesarrollados. Estas
semillas transgénicas, en general producidas por multinacionales extranjeras,
pueden pretender monopolios en su producción, distribución y siembra.
Esta tecnología, para la producción de semillas que no germinan, se les ha
apodado entoces como “Tecnologia Schwarzeneger” o “”Exterminadora”.
Esta tecnología, en general, involucra la manipulación de dos genes, y de dos
promotores. Uno de los dos genes codifica para proteína que bloquea la
función del ribosoma, denominada RIP; el otro gen codifica para una enzima
llamada recombinasa Cre, capaz de remover secuencias Cre. Estas secuencias,
al estar insertas en la secuencias del gen RIP bloquean su expresión.
Para la expresión del gen RIP, tiene asociado uno de los promotores que se
activa en la semilla antes de iniciar la formación del embrión. El segundo
promotor está asociado a la expresión de la recombinasa, y es activado por la
presencia del antibiótico tetraciclina. Así, el distribuidor de esta clase de
semilla la puede almacenar sin activar RIP, pero al momento de la venta la trata
con tetraciclina, para inducir la expresión del gen de la recombinasa, que libera

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las secuencias Cre inactivadoras de la expresión del gen RIP, permitiendo que
se genere la proteina que bloquea la formación del embrión, generando así
semillas que no germinan.

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ANIMALES/HUMANOS (Diap. 51 a la 88)
La ingeniería genética en animales y/o humanos en general se aplica a células
o tejidos, y a organismos intactos. Inicialmente la introducción de genes se
realizaron para análisis tipo prueba y error, para ver qué efectos producían en
el organismo y su desarrollo.
En particular para su aplicación, se han manipulado células reproductivas,
como los oocitos u óvulos. Esto ha implicado el desarrollo de procesos o
protocolos para su producción y desarrollo en el laboratorio. Para el control
de estos procesos se maneja la producción y uso de hormonas necesarias para
generación de células viables. Para la producción de ovulos, se aplican
hormonas como la Estimulante del Folículo (FSH); y/o las hormonas para la
maduración y liberación de los óvulos, como la Leutinisante (LH).
La manipulación de células u óvulos de ranas, ratones, ovejas, y humanos entre
otros, se han venido utilizando, pero el corto tiempo entre las generaciones
en ratón, ha estimulado su uso, para una evaluación más rápida de los
transgénicos.
Para la transformación de estos organismos, la tecnología de la micro
inyección, ha jugado un rol dominante, para la introducción de genes al núcleo
celular. La introducción controlada de concentraciones de ADN, ha producido
transgénesis, con eficiencias entre el 1 y el 25 %, siendo las más altas en
ratones.
Para la identificación de estos transgénicos, los sistemas vectores cuentan con
diferentes genes marcadores específicos. Algunos marcadores son de tipo
hormonal, como la Hormona del Crecimiento (GH); otros son del tipo
oncogénico. Estos marcadores pueden estar unidos a promotores poderosos
como los aislados del virus inductor de tumores en células mamarias de
ratones (MMTV).
Además del uso de la tecnología de la micro inyección, se han usado de forma
exitosa, vectores retrovirales, para la introducción de genes en células
Carcinomicas Embrionales (EC). Estas células pueden ser de tipo ectodérmico,
mesodérmico o endodérmico; esto permite asociar los genes introducidos con

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el tipo particular de células que afectan, y su posible implicación en el
desarrollo del organismo.
Otra de las importantes aplicaciones de la ingeniería genética, es el desarrollo
de la “terapia génica” para corregir defectos o enfermedades genéticos (as).
Potencialmente, se puede decir, tantos genes, tantas posibles enfermedades,
o sea que para el caso de los humanos, con unos 20-30 mil genes, esos mismos
números de terapias han de desarrollarse. Así, cuando se conocen las causas
moleculares de la enfermedad, y los genes implicados, se puede tratar de
corregir los defectos genéticos.
Las posibilidades de terapia génica son inversamente proporcionales al
número de genes implicados en un desorden genético o enfermedad. En
consecuencia, las enfermedades mono génicas, en la que está implicado un
solo gen, tienen una mayor posibilidad de control por terapia génica. Por lo
tanto enfermedades poligénicas, o que impliquen perdidas cromosómicas
parciales o totales, serán más complejas para el desarrollo de terapias génicas.
Previos a la implementación de una terapia génica se deben tener unos
controles como: 1) Análisis de proteínas y confirmación del gen alterado; 2)
Verificar técnicas de clonación existentes, y la eficiencia de las mismas; 3)
Consejería genética para verificar con el paciente sus características y
potencial de solución a su problema; 4) Tener en cuenta aspectos éticos como
resoluciones o acuerdos al respecto, aspectos morales del paciente como sus
pensamientos o creencias, y aspectos legales, para que se tengan en cuenta
las legislaciones vigentes al respecto y no se viole la ley.
En humanos las células objeto de transgénesis son las somáticas y las
germinales. La terapia génica somática no involucra la transferencia génica a
la siguiente generación. Implica eliminar o bloquear la expresión del gen
anormal, e introducir un gen normal que exprese una proteína funcional. Se
aplica en caso de genotipos recesivos, e involucra el uso de embriones. Tener
en cuenta para su aplicación diferentes criterios (ver diap.60). Un ejemplo de
la aplicación de esta terapia, es el tratamiento exitoso de pacientes con el
síndrome Lesh-Nyhan o hiperuricaemia, tratados con el gen normal de la
Hiposantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT), aplicado con un vector
retroviral a las células linfo blastoideas.

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Transgénesis en células germinales implica la transmisión de los genes
clonados a la siguiente generación de forma mendeliana y estable. Aquí se
puede utilizar la micro inyección en óvulos fertilizados, y se aplica
exitosamente, en casos como el de la hormona del crecimiento, y/o el gen que
codifica para un receptor o lipoproteína de baja densidad para reducir riesgos
cardiovasculares. Para células humanas, este tipo de manipulación tiene un
bajo porcentaje de éxito, siendo menor al 5%. También, la micro inyección de
óvulos humanos, crea problemas por inconformidad social y religiosa, y de tipo
ético, por el bajo porcentaje de recuperación de individuos transgénicos, y alto
número de embriones que mueren.
En otras aplicaciones de esta tecnología, el núcleo del ovulo puede ser
removido y reemplazado por el núcleo de una célula somática, al que
previamente se le ha microinyectado un gen de interés. Luego, el ovulo con el
nuevo núcleo somático transgénico se inserta en una madre sustituta, para
que dé a luz al nuevo organismo transgénico.
Otros ejemplos exitosos de este proceso se han realizado en ovejas, donde el
producto del gen clonado, se puede aislar de la leche del animal; esto se
produce al unir a la secuencia del gen un promotor específico para la expresión
del gen en glándulas mamarias, como es el promotor de la beta-lactoglobulina.
Otro ejemplo, es la producción de insulina humana en E. coli, transformada
con este gen. Aquí, se utiliza un sistema binario, para la producción en el
laboratorio, y de manera independiente las dos cadenas (A yB) que conforman
esta proteína. Similar sistema se utiliza para la producción de hormonas de
crecimiento como la somatostatina y la somatotropina.
La clonación de genes, en cierto tipo de vectores o huéspedes, no siempre
resulta en la expresión de una proteína funcional, por lo que se debe encontrar
un organismo y/o sistema de expresión de genes que sea eficiente y preciso.
Para ilustrar estos casos, se tiene el ejemplo de la clonación y expresión, en
diferentes organismos, del gen que codifica para el factor de coagulación VIII,
para el tratamiento en humanos, de pacientes hemofílicos. Su producción
inicial en hámsteres transgénicos generaba proteínas que no siempre eran
funcionales, lo que era un problema para los pacientes tratados con ellas.
Posteriormente, se pudo generar una proteína funcional estable, en glándulas
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mamarias de cerdos transgénicos, con un gen que tenía un promotor
poderoso, construido a partir de secuencias aisladas de la beta-actina de pollo
y la beta-globina de conejo.
Muchas otras proteínas se han aislado de genes humanos normales, para el
tratamiento de diferentes enfermedades (ver tabla 14.1 en la diap. 71).
En relación a la prevención de enfermedades, se han desarrollado vacunas
transgénicas multipropósito, o sea que la persona puedes ser inmunizada,
simultáneamente, para más de una enfermedad, con la aplicación de una sola
vacuna. Un ejemplo es la aplicación de vacunas recombinantes, para que
sistema inmune produzca simultáneamente anticuerpos contra la hepatitis y
la viruela. Para otros ejemplos ver tabla 14.2 en diapositiva N°71.
Otras terapias para el control de enfermedades como la hemofilia o la
talasemia (anemia hereditaria), utilizan la transgénesis en células madre, como
las células de la medula ósea. A dichas células se les implanta, por
transfeccion, el nuevo gen normal; estas células son luego reimplantadas en la
medula ósea, originando células maduras, como las del sistema sanguíneo,
expresando la proteína normal.
Otros sistemas de expresión de genes, son llamados heterologos, porque la
transgénesis ocurre entre organismos de diferentes especies. Un ejemplo, de
años recientes, es la experimentación con la expresión de genes humanos en
plantas. Para ilustrar este caso, tenemos el gen para la producción del
Lactogeno Placentario Humano (hPL3), expresado, exitosamente, en plantas
de tabaco (Nicotiana tabacum L, cv Xanthi), utilizando como vector de
clonación el sistema Agrobacterium.
Pareciera que las plantas transgénicas, tienen un gran potencial para la
producción masiva de moléculas o productos para la salud, por su posibilidad
de producir gran biomasa, y la menor resistencia social a su manipulación en
investigación, cuando se compara con la mayor resistencia social al uso de
animales o humanos.

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Otras aplicaciones de la ingeniería genética, tienen que ver con sus
aplicaciones en los diferentes campos del conocimiento e investigación
desarrollados por el hombre.
En el campo de las investigaciones Forenses, es una herramienta de primer
orden, donde los perfiles o secuencias de ADN, permiten determinar
identidades por la presencia o no de secuencias repetitivas hipervariables
dispersas; hacer identificaciones de género en restos humanos por
determinación de secuencias específicas de los cromosomas Y para identificar
personas del sexo masculino, o la presencia de indels (secuencias cortas de
pocos pb que agregan o se pierden) en el gen de la amelogenina, en el
cromosoma X, para identificar restos humanos del sexo femenino.
Para el análisis de secuencias de ADN en estudios de organismos Ancestrales
o extintos o fósiles. Una aplicación muy visible en este campo, es el análisis
genético para la ubicación geográfica del origen del hombre a partir de la
comparación homologa de secuencias mitocondriales y/o del cromosoma Y,
de restos antiguos con las de secuencias presentes en el hombre moderno o
actual. Al comparar secuencias modernas (Homo sapiens) con muestras
ancestrales, como las del Homo erectus africano, o las de restos de origen
africano, asiático o europeo como los Australopitecos o Neandertales.
Finalmente, estudios comparativos de sus secuencias de ADN, muestran los
más altos porcentajes de homología, entre las secuencias del H. sapiens y el H.
erectus, indicando que el origen del hombre, incluido el europeo moderno, es
africano.
En los años más recientes y actualmente, la ingeniería genética se desarrolla
rápidamente, posiblemente por las investigaciones multidisciplinarias
corporativas. Algunos grupos integran ingenieros genéticos, físicos, químicos
e ingenieros de otras áreas industriales, generándose nuevos conocimientos,
y proceso innovativos. Un ejemplo es la producción de nano-catalizadores,
para acelerar y masificar procesos de transgénesis o en la creación de
genotecas. Estos equipos cuentan con filamentos de silicona, unidos a
microespirales de poliacrilamida, que aceleran procesos de transferencia de
fragmentos de ADN a células de forma controlada.

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Otros escalamientos tecnológicos involucran estudios de interacciones de
polímeros o superficies con células o moléculas de ADN y/o proteínas, con
aplicaciones biofuncionales, como la protección de superficies en ambientes
marinos, como biosensores ambientales, para procesos de separación de
sustancias, liberación o suministro de medicamentos, ingeniería genética e
ingeniería de tejidos.
En el año 2019, se reportan nuevos resultados de la aplicación de las
tecnologías más recientes, para la ingeniería genética, como es el uso de la
tecnología CRISPR /cas que permite editar genes, cortando y pegando
secuencias de ADN. En este año He Jiankui, reporta que luego de la fertilización
in vitro, utilizo esta técnica para editar el gen CCR5, que expresa proteínas
utilizadas por el VIH para introducirse en células humanas; la edición bloqueo
un receptor para este virus en células humanas.
Hoy día, en el 2020, la ingeniería genética, en el diseño de vacunas, tiene el
desafio de desarrollar una nueva vacuna, para liberarnos del ente biológico
que nos tiene encuarentonados, el coronavirus o COVID-19 o el SARS-CoV-2.

EXITOS, CUIDENSE Y BUENA SALUD!

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