Ejercicio experimental 2. Identificación de las células del sistema inmune.

OBJETIVO

• Identificar los diferentes componentes celulares de la respuesta inmune en sangre

periférica humana a través de sus características morfológicas y de afinidad por
colorantes.
¿CÓMO?
A través de una tinción basada en la tinción de Wright que se describe a continuación:

MATERIALES
• Microscopio óptico
• Portaobjetos
• Lanceta estéril
• Cronómetro
• Alcohol
• Aceite de inmersión
 Colorante de Wright
 Buffer de fosfatos, pH=7.0

TÉCNICA

-Limpiar el dedo pulgar (de la mano que menos ocupe la persona voluntaria) con agua y
con jabón. Desinfectarlo posteriormente con alcohol.
-Con la lanceta estéril realizar una punción en la parte apical del dedo de forma paralela
a la huella digital del dedo pulgar.
-Depositar una gota de sangre de (aproximadamente 40 µl) en un extremo de un
portaobjetos.
-Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del
portaobjetos de manera que se pueda obtener una fina película de sangre (monocapa). El porta
absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por encima de ella para no dañar las células.
Dejar secar a temperatura ambiente.

-Colocar el frotis de sangre sobre la bandeja de tinción.

- Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.
- Tras 1-3 min, añadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con
movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metálico.
- Se deja actuar de 5 a 10 min.
- Lavar con agua.
- Dejar secar aireando el portaobjetos
- Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando aceite
de inmersión.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos
teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los
bordes.
Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido
de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:

1. Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa
casi todo el glóbulo.
2. Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande,
redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis.
3. Polimorfonucleares: núcleo fragmentad. Pueden ser eosinófilos, con abundantes
granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos.
Con una adecuada tinción se conseguirá los siguientes aspectos morfológicos de las células:
1. Forma y dimisiones de la célula
2. Aspecto de la cromatina.
3. Citoplasma
4. Granulación
Ejercicio experimental 3. Identificación órganos linfoides.

OBJETIVO

• Identificar la estructura macroscópica y localización de los diferentes órganos

linfoides primarios y secundarios a través de sus características morfológicas e
identificar las células que en ellos residen por su afinidad por colorantes.

¿CÓMO?

A través de la disección de órganos linfoides en ratones y la tinción de Wright.

MATERIALES

• Microscopio óptico
• Portaobjetos
 Caja petri
• Equipo de disección
• Agujas
• Guantes
• Jeringa de 1mL
• Tela de organza
• Tabla de disección
• Cronómetro
• Alcohol
• Aceite de inmersión
 Colorante de Wright
 Buffer de fosfatos, pH=7.0

FUNDAMENTO

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir células hematopoyéticas se basan en el
empleo del colorante de Wright, constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de
metileno. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH
de las diferentes estructuras celulares, de forma que tienen carácter básico aquellas que fijan en
mayor medida la eosina (Colorante ácido). Mientras las que poseen propiedades ácidas fijan
principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras
basófilas presentes en el núcleo o en el citoplasma se tiñen de azul, mientras que otros
componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren un color rosado.

PRCEDIMIENTO

1) Localización de los órganos linfoides.

- Sacrificar al ratón por dislocación cervical.
- Fijar el ratón a la tabla de disección.
- Rociar alcohol sobre el ratón para facilitar el manejo del mismo.
- Realizar una incisión en V en la piel del ratón en región abdominal del mismo, retirar con
cuidado la piel del ratón hacia los lados y comenzar la extracción de los ganglios
linfáticos, bazo y timo. (Apoyarse con el esquema)
- Depositar 3 ganglios en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Depositar el timo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Depositar bazo en 0.5 mL de PBS en una caja petri.
- Disgregar todos los órganos con la ayuda del embolo de una jeringa de 1 mL y tela de
 organza.
- Una vez obtenidas las suspensiones celulares, colocar una gota de la suspensión
celular en un portaobjetos limpio y desengrasado y dejar secar
- Cubrir el portaobjetos con 1-2 mL de colorante de Wright.
- Tras 1-3 min, añadir un volumen igual de Buffer de fosfatos pH=7.0, homogenizar con
movimientos suaves hasta que la mezcla adquiera un brillo verde metálico.
- Se deja actuar de 5 a 10 min.
- Lavar con agua.
- Dejar secar aireando el portaobjetos.
- Observar al microscopio óptico con el objetivo de 40X y posteriormente a 100X utilizando
aceite de inmersión.

2. Observar al microscopio las preparaciones de bazo, ganglios y timo.

ANEXO 1. Esquema de localización de los órganos linfoides primarios y secundarios en

ratón

Sup erficial cervicals

ANEXO 2. Características de los órganos linfoide primarios y secundarios

Al microscopio se verá:

Bazo: Dominio predominante de glóbulos rojos teñidos de color rojo por la eosina. No
tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo

núcleo que ocupa casi toda la célula.
◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño, poco frecuente, núcleo
grande, laxo y redondo.
◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con una
gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas.

Ganglio: No se observan eritrocitos.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un

solo núcleo que ocupa casi toda la célula.
◙ Macrófagos: son los leucocitos de mayor tamaño, poco frecuente, núcleo
grande, laxo y redondo.
◙ Células dendríticas: Mayores que los linfocitos muy poco frecuentes, con
una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas.

Timo: No se observan eritrocitos.

◙ Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un

solo núcleo que ocupa casi toda la célula.

Anexo 3. Cortes histológico de Timo, Bazo, Ganglios y Placas de Peyer.

Timo
El timo está rodeado de una delgada cápsula de tejido conectivo que se proyecta hacia el
interior como septos dividiendo al órgano en lobulillos. En cada lobulillo se aprecia una corteza
de linfocitos densamente agrupados y una médula más clara. El timo carece de nódulos linfoides
y está sostenido por células reticulares epiteliales. Los corpúsculos de Hassall son exclusivos
del timo y se localizan en la médula. Son estructuras redondeadas y acidófilas constituidas por
células epiteliales aplanadas dispuestas en forma concéntrica, que pueden sufrir queratinización
y calcificación en la zona central.
Lobulillos Zona cortical Corpúsculo de Hassall

PLACAS DE PEYER

Las placas de Peyer están formadas por agregados de nódulos linfoides situados en la lámina
propia y submucosa de intestino delgado, particularmente íleon. Se pueden apreciar en
ocasiones los centros germinales. El tejido linfoide difuso entre dichos folículos linfoides está
formado por linfocitos T.

GANGLIOS LINFÁTICOS

En periferia se distingue el tejido conjuntivo capsular fibroso por debajo del cual aparece el seno
subcapsular como un espacio vascular que en determinados puntos es difícil de apreciar, en la
parte cortical se observan folículos secundarios y tejido linfoide difuso quedando una porción
central correspondiente a la zona medular rica en vasos sanguíneos y senos linfáticos.

Bazo
La sección esplénica muestra una cápsula fibrosa de la que se desprenden trabéculas o septos
que dividen parcialmente al parénquima esplénico. El bazo consta de una porción conocida
como pulpa blanca o pupa roja. La pulpa blanca está situada periarteriolarmente (alrededor de
las ramas de la arteria esplénica central) formando estructuras envolventes o vainas
cilíndricas conocidas como vaina linfoide periarteriolar que se mantienen parcialmente
separadas de la pulpa roja por una capa de tejido linfoide laxo conocida como zona marginal.
Dentro de la pulpa blanca las células linfoides se distribuyen tanto de forma dispersa como
agrupadas en folículos. La pulpa roja formado por senos venososo y cordones celulares
(cordones de Billroth).

Bazo: cápsula (a), la pulpa roja

(b), la pulpa blanca (c) y las
trabéculas (d).