Moléculas antioxidantes y métodos para su determinación: revisión

bibliográfica.
Ardila Ospina, J.A & Parra Barajas, E.M​1
1​
Estudiantes del Programa de Biología. Universidad del Tolima. 2019
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Introducción:
Un antioxidante se define como una molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación de
un sustrato oxidable, confiriéndole electrones, es decir, actuando como agente reductor
(Alomar, M. s,f). Al ser la principal fuente de energía el oxígeno para los seres vivos, estos
le utilizan constantemente, liberando como productos radicales libres que deben ser
neutralizados por los antioxidantes, para evitar el estrés oxidativo y causar daños en las
células de un tejido. Dichas moléculas pueden ser de tipo endógeno (sintetizadas por el
organismo), como las catalasas, las glutatión-S-transferasas y las tiorredoxinas; y de tipo
exógeno (consumidas a través de la dieta), como las vitaminas, betacarotenos, licopenos y
flavonoides. La presencia de los antioxidantes es ampliamente conocida en alimentos
frescos y crudos, ya que aún no se encuentran dispuestos a la oxidación producto de la
manipulación para el procesamiento (Alomar, M. s,f).
Dentro de las moléculas con estas propiedades se destacan los flavonoides, pigmentos
naturales que protegen a los organismos del daño producido por agentes oxidantes como
los rayos ultravioleta, la polución ambiental y las sustancias químicas externas; éstas
moléculas son generadas por el metabolismo secundario de vegetales desde una ruta
biosintética mixta (ruta del ácido shikímico y ruta de los policétidos) (López. M, 2002). Su
acción antioxidante depende de la capacidad de reducir radicales libres y quelar metales,
impidiendo las reacciones catalizadoras de los radicales libres (López. M, 2002).
Los flavonoides están compuestos por dos anillos fenilos (A y B), ligados por un anillo
pirano (Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J. 2009).

Fig. 1. Estructura de flavonoide con numeración de cada ciclo. Fuente: Escamilla. C, Cuevas. E &
Guevara. J (2009).

Los flavonoides responden a la luz controlando los niveles de auxinas (hormonas vegetales)
reguladoras de crecimiento, intervienen en la diferenciación de las plantas y potencian la
polinización al conferir coloración (Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J. 2009), por ende
son encontrados en los frutos, las semillas de los siguientes alimentos, siendo el más
consumido la quercetina del té (Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J. 2009):
 1) Ácido elágico: se encuentra en frutas como la uva y las verduras.
2) Antocianidinas: pigmentos responsables de los colores rojo-azulado y rojo de las
cerezas.
3) Catequina: se encuentra en el té negro y verde.
4) Citroflavonoides: como la quercetina, limoneno, hesperidina, rutina y naranjina. El
sabor amargo de la naranja, del limón y el de la toronja lo otorga la naranjina; y el
limoneno se ha aislado de la lima y el limón.
5) Isoflavonoides: tales como la genisteína y la daidzeína, presentes en los alimentos
de soya como tofu, leche, porotos, proteína vegetal, tempeh, miso y harina.
6) Kaempferol: encontrándose en brócoli, puerros, endibias, remolacha roja y rábanos
7) Proantocianidinas: que aparecen en las semillas de las uvas, en el extracto de
corteza de pino marino y en el vino tinto

Clasificación de los flavonoides:

Tabla. 1. Clasificación y estructura de los flavonoides. Modificada de Escamilla. C, Cuevas. E &

Guevara. J. (2009).

Según Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J (2009) “la actividad antioxidante de los
flavonoides resulta de una combinación de sus propiedades quelantes de hierro y
secuestradoras de radicales libres”, además de esto, inhiben las oxidasas lipooxigenasa,
ciclooxigenasa, mieloperoxidasa y la xantina oxidasa; evitando así la formación de especies
reactivas de oxígeno y de hidroperóxidos orgánicos. Se reconoce que también inhiben
enzimas involucradas indirectamente en los procesos oxidativos, como la fosfolipasa A2; al
mismo tiempo que estimulan otras con propiedades antioxidantes como la catalasa y la
superóxido dismutasa (Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J. 2009).
 Fig. 2. Clasificación de flavonoides: estructuras. Tomada de: Castañeda. A & Guerrero. J.A (2016).

Tras atravesar la ruta biosintética del shiquimato y acetato-malonato, en los tipos de

flavonoides ocurren modificaciones durante varios estados que resultan en la extensión
de la hidroxilación, metilación, isoprenilación, dimerización y glicosilación de los mismos,
produciendo O y C-glicósidos (Castañeda. A & Guerrero. J.A. 2016).
- Flavonas y flavonoles: flavonoides más comunes presentes en vegetales, son
pigmentos amarillos sin ser carotenos. Las flavononas y los flavanonoles son
compuestos ligeramente amarillos o incoloros (Castañeda. A & Guerrero. J.A. 2016),
por lo cual no son atendidos a pesar de que sus glicósidos (hesperidina y naringina),
encontrados en la corteza de los cítricos son actualmente de interés microbiológico e
industrial. La quercetina es uno de los flavonoles más ampliamente distribuidos entre
los alimentos; es un tricíclico polihidroxilado, que en su forma natural se encuentra
glicosilado formando parte de la rutina (quercetin-3-rutinósido), de la isoquercitrina
(quercetin-3-O-glucósido) o de otros glicósidos siendo la aglicona de todos ellos
(Erickson. D. 2010). Actúa como protector frente a las especies reactivas de
oxígeno, mediante la neutralización de radicales libres como aniones superóxido,
óxido nítrico y peroxinitritos entre otros. El efecto antioxidante también podría
deberse a su capacidad para inhibir enzimas como la xantina oxidasa, lipooxigenasa
y NADPH oxidasa, impidiendo la muerte celular. Además puede incrementar la
producción de antioxidantes endógenos. Existen una serie de factores que
condicionan el contenido en quercetina en las mismas, entre ellos se encuentran: la
localización en el vegetal, generalmente las mayores concentraciones están en las
partes externas; la época del año en la que se desarrolla la planta, los vegetales que
crecen mayoritariamente en verano contienen más cantidad de flavonoides, aunque
esto no sucede en todos los tipos vegetales; la cantidad de luz y el clima del lugar
donde se cultiva la planta, la producción de flavonoides se encuentra estrechamente
relacionado con la respuesta a la exposición a la luz, por lo que en los países con
más horas de sol las plantas tienen mayor contenido. También influye la
temperatura, los climas cálidos favorecen la síntesis de quercetina; el grado de
madurez del fruto, a mayor madurez mayor contenido (Vicente. L, Prieto. M &
Morales. A. 2013).
- Antocianinas: son actualmente el grupo de pigmentos hidrosolubles detectables por
la región visible del ojo del ser humano, más importante debido a su papel en la
 planta. Estas moléculas favorecen la atracción de polinizadores para la dispersión de
semillas y la protección de la planta contra los efectos de la radiación ultravioleta y la
contaminación viral o por agentes microbianos (Garzón, G. 2008). La gama de
colores que abarcan dichas moléculas comprende desde el rojo, malva, rosa, violeta
hasta el azul en varias flores y frutos, además de vegetales y cereales. Este color
depende del número y orientación de grupos hidroxilo y metoxilo de la molécula
(Garzón, G. 2008); por un lado, los incrementos en la hidroxilación producen
desplazamientos hacia tonalidades azules mientras que los incrementos en las
metoxilaciones confieren coloración roja (Garzón, G. 2008).
Se habla también de la aplicación de los pigmentos antociánicos en la reducción de
enfermedades coronarias, cáncer, diabetes, de los efectos antiinflamatorios y del
mejoramiento de la agudeza visual (Garzón, G. 2008).
Según Garzón, G (2008), las antocianinas siempre presentan sustituciones
glicosídicas en las posiciones 3 y/o 5 con mono, di o trisacáridos que incrementan su
solubilidad. Dentro de los sacáridos glicosilantes se encuentran la glucosa,
galactosa, xilosa, ramnosa, arabinosa, rutinosa, soforosa, sambubiosa y gentobiosa.
Otra posible variación en la estructura es la acilación de los residuos de azúcares de
la molécula con ácidos orgánicos, los cuales afectan el tono de las antocianinas
dirigiendo el desplazamiento a tonalidades púrpuras.
A pesar de catapultarse como posibles sustitutos de los colorantes artificiales,
matrices alimentarias o productos farmacéuticos o cosméticos, son limitadas debido
a su baja estabilidad durante el procesamiento y el almacenamiento, además de su
pH, temperatura, presencia de oxígeno y ácido ascórbico, concentración y actividad
de agua de la matriz.

Los agentes antioxidantes de los anteriores compuestos y otros, se miden en equivalencias

de la capacidad antioxidante basada en Trolox, un análogo soluble de la vitamina E, que es
usado como un punto de referencia para determinar la capacidad antioxidante de una
mezcla de alimentos (Pellegrini. N, Pannala. A, Yang. M & Rice. C.1999). Es medido a
través de dos métodos, el ensayo de decoloración ABTS y DPPH que se definirán a
continuación:

- ABTS: o ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico, es un compuesto químico utilizado

para observar la cinética de la reacción de enzimas específicas. Se utiliza
comúnmente como sustrato con H​2​O​2 para una enzima peroxidasa o enzimas azules
de oxidasa. Su uso permite seguir la cinética de la reacción de las peroxidasas, o de
cualquier enzima productora de peróxido de hidrógeno, o cuantificar la cantidad de
peróxido en una muestra. Es también utilizado en la industria alimentaria y en
investigación agrícola para medir la capacidad antioxidante de los alimentos, donde
el compuesto se convierte en catión radical tras la adición de persulfato de sodio. El
catión radical es de color azul y absorbe luz a 734 nm. En su forma catiónica radical
es reactivo a los antioxidantes, incluidos los fenoles, tioles y la vitamina C, por tal
motivo al entrar en contacto, se convierte a su forma neutra y pierde su color. Esta
reacción se monitoriza espectrofotométricamente y equivale igualmente, al ensayo
de capacidad antioxidante Trolox (TEAC), pues se compara la reactividad de los
 antioxidantes con el análogo de la vitamina E anteriormente nombrado (Huang. D,
Ou. B & Prior. D. 2005).
- DPPH: es un método desarrollado por Blois (1985) con el objetivo de determinar la
actividad antioxidante mediante el uso de un radical libre estable
α-difenil-β-picrylhydrazyl o DPPH. Se basa en la medición de la capacidad de
eliminación de antioxidantes hacia él mismo. El electrón impar del átomo de N en el
DPPH se reduce cuando recibe un átomo de H ade los antioxidantes. El DPPH se
caracteriza por ser un radical libre estable en virtud de la deslocalización del electrón
libre sobre la molécula en su conjunto pues las moléculas no se dimerizan. Esta
deslocalización da lugar a un color violeta intenso con una absorción en solución de
etanol a aproximadamente 520 nm y esta se desvanece a medida que el electrón se
empareja. Es un método rápido, simple y económico, ampliamente utilizado para
medir la capacidad de los compuestos para actuar como captadores de radicales
libres o donantes de hidrógeno, así como para evaluar la actividad antioxidante de
los alimentos y cuantificar antioxidantes en sistemas biológicos complejos de
muestras sólidas o líquidas, como el grano de trigo, vegetales, hierbas en solventes
como etanol, metanol, alcohol o benceno; o para jugos de frutas, aceites de semillas
y vinos, respectivamente. Es un método conveniente para el ensayo antioxidante de
cisteína, glutatión, ácido ascórbico y compuestos aromáticos. El método DPPH se
puede utilizar en solventes orgánicos acuosos y no polares y se puede usar para
examinar los antioxidantes tanto hidrófilos como lipófilos (Kedare. S & Singh. R.
2011).
Métodos de extracción​:
- Extracción: la extracción de los diferentes flavonoides se realiza a partir del material
vegetal fresco, aunque esta también puede realizarse con el material vegetal seco
siempre y cuando el proceso de secado no altere la composición de los flavonoides.
El material vegetal debe molerse finamente para de esta forma facilitar la extracción
de los compuestos flavonoicos; estos compuestos se pueden extraer indistintamente
debido a la solubilidad que estos presentan en diferentes solventes orgánicos. Los
flavonoides que poseen un gran número de grupos hidroxilos insustituidos o
azúcares son considerados compuestos polares, por lo que son moderadamente
solubles en solventes polares como: etanol, metanol, butanol, acetona, DMSO,
agua. Para antocianidinas se trata el material vegetal con MeOH conteniendo HCl
1%, (v7v) donde la extracción es inmediata, evidenciándose por el cambio de color
de la solución.

- Aislamiento y purificación: es una etapa importante para la separación e

identificación de los flavonoides presentes en el extracto y es posible efectuarse a
través de técnicas cromatográficas para la determinación de flavonoides en extractos
crudos de plantas o en fracciones son especialmente utilizadas la cromatografía de
papel (CP) y la cromatografía de capa fina (CCF). Por otro lado, son indispensables
para la separación de flavonoides la CP preparativa, la CCF, la cromatografía de
columna (CC) y especialmente la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
El revelado del cromatograma se realiza a la luz ultravioleta a una longitud de onda
de 366 nm, donde aparecen muchos flavonoides como puntos coloreados; estos se
intensifican o cambian de color cuando se someten a vapores de amoníaco,
 pudiéndose estimar de esta forma el tipo de flavonoide presente en el extracto. Con
el uso de reactivos asperjados se aumenta grandemente la sensibilidad del
cromatograma en la detección de flavonoides, sobre todo cuando los flavonoides
son invisibles a la luz ultravioleta o se encuentran como constituyentes menores; los
cuatro reactivos más utilizados con este objetivo son AlCl3, Complejo Difenil-ácido
bórico-etanoamina (Naturstoffreogenz A), Acido sulfanílico diasotado (DSA) y
Borohidruro de sodio/HCl.
- Cromatografía de capa fina: es un método de análisis rápido, el cual requiere
muy pequeñas cantidades de muestra; se pueden utilizar como soporte
celulosa, silica gel y poliamida. La localización de los flavonoides en CCF es
la misma que en papel: los platos pueden revelarse a la luz ultravioleta (366
nm) con la presencia o ausencia de vapores de amoníaco y/o asperjando con
cualquiera de los reactivos de colores descritos anteriormente. Esta técnica
es usada con los siguientes propósitos:
1. Investigar el solvente para posible uso en cromatografía de columna.
2. Análisis de fracciones para columna cromatografica.
3. Identificación de flavonoides por co-cromatografía.
4. Aislamiento de flavonoides puros en pequeña escala. Cromatografía
de Columna, la cual consiste en la aplicación de una mezcla de
flavonoides (en solución) a la columna, la cual cuenta con un
poderoso adsorbente y la subsecuente elución secuencial de los
compuestos individuales con solventes apropiados. Se emplea para la
separación de flavonoides a nivel preparativo y los adsorbentes más
comúnmente utilizados en esta técnica son silica gel, poliamida,
celulosa y sephadex
- Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Esta técnica (HPLC) puede ser usada
para la separación, determinación cuantitativa e identificación de flavonoides.
Muestra niveles de resolución y sensibilidad mucho mayor que la cromatografía de
papel o de capa fina, por lo que es usada para chequear la homogeneidad de las
muestras aisladas por otras técnicas. La cromatografía de fase inversa es
comúnmente utilizada; con esta técnica los compuestos más polares eluyen primero.
Se usan sucesivamente solventes como H2 O/MeOH, H2 O/MeOH/ HOAc y H2
O/acetonitrilo en variadas proporciones para cromatografiar flavonas, flavonoles,
dihidroflavonoides, catequinas, antocianidinas y glicósidos de flavonoides, utilizando
sistemas de elución isocráticos o por gradientes. En una típica separación de
flavonoides glicosilados, dos solventes A (1% HOAc) y B (MeOH) pueden usarse en
variada proporción a través de toda la corrida; por ejemplo comenzando por 20 % de
B en A y finalizando con 80 % de B en A. Los flavonoides eluídos por HPLC son
normalmente captados por medio de un detector UV a 280 nm, debido a que
muchos de ellos presentan un máximo de absorción UV entre 270 y 290 nm.
Utilizando un detector con arreglo de diodo se puede monitorear el eluyente a dos
longitudes de onda simultáneamente (ej: 254 y 280 nm) (25).

Referencias:
- Alomar, M. s,f. Antioxidantes: captadores de radicales libres o sinónimo de salud.
Sociedad Argentina de Medicina Estética. Buenos Aires, Argentina.
- Castañeda. A & Guerrero. J.A. 2015. Pigmentos en frutas y hortalizas rojas:
antocianinas. Temas selectos de tecnología de alimentos, 25-33. Universidad de las
Américas. Puebla, México.
- Erickson. D. 2010.Quercetina. Medciclopedia. Madrid, España
- Escamilla. C, Cuevas. E & Guevara. J. 2009. Flavonoides y sus acciones
antioxidantes. Rev Fac Med UNAM Vol. 52 No. 2. México DF, México.
- Garzón, G. 2008. Las antocianinas como colorantes naturales y compuestos
bioactivos: revisión. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 3, 2008 27 - 36. Universidad
Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia.
- Huang. D, Ou. B & Prior. D. 2005. The Chemistry Behind Antioxidant Capacity
Assays", J. Agric. Food Chem., 53 (6): 1841–1856
- Kedare. S & Singh. R. 2011. Genesis and development of DPPH method of
antioxidant assay. J Food Sci Technol. 2011 Aug; 48(4): 412–422. Published online
2011 Feb 25.
- López. M, 2002. Flavonoides. Revista Offarm. Vol. 21. Núm. 4. Páginas 11-164.
Elsevier.
- Pellegrini. N, Pannala. A, Yang. M & Rice. C. 1999. Antioxidant activity applying an
improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol. Med. 1999,
26, 1231-1237
- Vicente. L, Prieto. M & Morales. A. 2013. Eficacia y seguridad de la quercetina como
complemento alimenticio. Rev. Toxicol. (2013) 30: 171-181. Universidad de
Salamanca. Pamplona, España