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UNIVERSIDAD DE LA SABANA
INGENIERÍA QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA 2020-I

PRÁCTICA No. 4: Reacción en cadena de la polimerasa

OBJETIVOS

• Amplificar el gen 16S rDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

• Diferenciar aislamientos de bacterias mediante análisis de restricción del gen 16S rDNA.

1. INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTO DE LA PCR.

La reacción en cadena de la polimersa (Polymerase chain reaction - PCR) es una técnica que consiste en la
amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico a partir de unas pocas copias de ADN que finalmente
se convierten en millones de copias. Actualmente, la técnica es aplicada en diversos campos como la
epidemiología, genética forense, clasificación de microorganismos, genotificado, detección de mutantes,
ingeniería genética y secuenciación masiva del ADN. La PCR es una herramienta que se ha convertido en uno de
los pilares de los laboratorios de biología molecular de todos el mundo. Su fortaleza radica en su habilidad de
proveer un resultado rápido y preciso que gracias a su sensibilidad y especificidad, ha dado lugar a múltiples
aplicaciones, tanto en investigaciones clínicas y herramientas de diagnóstico, como en investigación básica.
Adicionalmente, el costo-beneficio de las diferentes técnicas ha permitido que su implementación como
herramienta de rutina sea accesible. La técnica fue desarrollada en 1983 por el científico Kary Mullis, quién la
desarrolló inicialmente para diagnosticar enfermedades infecciosas y construir filogenias basadas en ADN. En
1993, Mullis recibió el premio nobel en Química junto a Michael Smith por dicho trabajo.

Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia
del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora, etc). Básicamente se trata
de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello, debemos realizar de manera in vitro lo que
hacen las células in vivo para replicar su ADN. Se debe disponer en la reacción del ADN de la especie objeto de
estudio. Además, debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos (primers en inglés) que actúen
como cebadores para la ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos es crucial dado que han de
delimitar la región a amplificar, ser específicos y tener temperaturas de anillaje similares para que amplifiquen
correctamente. Se necesita también añadir al tubo de reacción los 4 tipos de desoxirribonucleótidos (dNTPs)
que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) de manera equimolar y finalmente la Taq-polimersa (aislada
de la bacteria Thermus aquaticus) que es resistente a altas temperaturas. Una vez tenemos todos los
componentes mezclados en la reacción (Figura 1), tenemos que favorecer la síntesis de ADN y para ello:

a) Facilitamos la desnaturalización del ADN elevando la temperatura, por ejemplo, a 94°C durante 30 – 60
segundos.

b) A continuación, permitimos el alineamiento de los cebadores u oligonucleotidos a la región de ADN

complementaria a una temperatura establecida (dicha temperatura dependerá de la secuencia de los mismos
y del grado de especificidad que queremos tener), durante 30 – 60 segundos.

c) Finalmente, se eleva la temperatura de nuevo (a 72°C) para facilitar la extensión o síntesis de ADN a
partir de los cebadores, en dirección 5’ a 3’, durante 30 – 120 segundos, dependiendo del tamaño de
fragmento que se quiere amplificar.
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d) Estos tres pasos (a – c) constituyen un ciclo de la PCR. Para obtener una cantidad adecuada
deamplicones (fragmentos amplificados) se debe repetir al menso 25 veces cada ciclo. La reacción se lleva a
cabo en un termociclador, que de forma automática simula los pasos requeridos en cada ciclo al aumentar y
disminuir la temperatura.

Figura 1. Tomado de: http://www.microbiologyinfo.com/polymerase-chain-reaction-pcr-principle procedure-

types-applications-and-animation/

e) Una vez terminados los ciclos, se añade un paso de extensión a 72°C para asegurar que
cualquiercadena de ADN sencillo sea extendida. Para almacenar la reacción en el termociclador, se añade un
paso final por tiempo indefinido a 4-15°C.

f) El número de amplicones final dependerá del número de ciclos que se hayan hecho, donde
elcrecimiento será exponencial, siguiendo la regla general de No. copias = 2 x 10 c (c=número de ciclos).

g) Para visualizar los fragmentos generados por la PCR, se separan y observan los fragmentos mediante
una electroforesis en del de agarosa. El tamaño del producto obtenido se determina mediante comparación
con un marcador de peso molecular conocido.

NOTA: Una polimerasa normal puede amplificar entre 0.1 y 10 kilo bases. Conforme los ciclos avanzan, la
polimerasa pierde actividad y comete más errores, por lo que se recomienda no utilizar un numero de ciclos
muy grande.

2. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

2.1. Reacción en cadena de la polimersa (PCR)

Materiales y equipos Procedimiento
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- 10X Standard Buffer - Haga el cálculo de lo que necesitará de cada

- Oligonucleotidos (universales para bacterias): componente y haga un mix - Haga
GM3F: 5’ AGAGTTTGATCMTGGC 3’ la mezcla (mix) de la PCR
GM4R: 5’ TACCTTGTTACGACTT 3’ - Reparta el mix en cada tubo
- Agua milliQ - Ponga de último el ADN (en cada tubo)
- Agarosa
Equipos:
- TAE 1X
- Termociclador
- Tampón de carga
- Cámaras de electroforesis
- Marcadores de peso molecular
- Fuente de poder
- Puntas
- Micropipetas
- Eppendorf
El mix de los componentes se prepara como muestra la tabla de abajo:

- Se prepara un mix para que sea más fácil el montaje de la muestra, pues poner los reactivos encada tubo de
reacción de cada muestra es mas tedioso.
- En este caso, se hacen calculo para 9 muestras, los 6 de los genomas (ver resultados) hipotéticosque se van a
amplificar, más un control positivo y un control negativo, para una suma total de 8 reacciones.
- Se multiplica por 9 teniendo en cuenta que por el pipeteo se pierde parte del mix.
Reactivo Concentración Concentración final Volumen MIX (9 reacciones)
Standard Buffer 10X 1X

MgCl2 10 mM 0.75 mM

dNTPs 10 mM 0.2 mM

Oligo 1 10 uM 0.2 uM

Oligo 2 10 uM 0.2 uM

Taq polimerasa 10 un / ul 1 un

Agua milliQ

TOTAL MIX 45 ul

ADN molde 5 ul

TOTAL MIX 50 ul

- Una vez preparado el mix, se reparten en los 8 tubois de reacción (6 ADN problema, 1 control positivo y 1
control negativo) 45 ul de mix.
- Posteriormente se pone el volumen (5 ul) de ADN correspondiente.

La reacción:

94°C72°C 14°C
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94°C 48°C 72°C
180 segundos 20 segundos 20 segundos 60
segundos 5 minutos infinito
x 30 ciclos

- El termociclador se puede programar cada vez que se utiliza o se puede guardar el programa para futuros
análisis similares.

Figura 2. Mix en tubos de reacción.

2.2. Visualización PCR

- Preparara gel de agarosa al 1.5 % en T.A.E. 1X

- Cargar 5 ul del marcador de peso molecular HyperLadder II (Bioline). Ver las características delmarcador en
los anexos.
- Cargar toda la muestra de las PCR
- Correr el gel a 100V por 30 minutos
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Laboratorio de Biotecnología Informe No.

4.

Grupo No.
Integrantes: Laura Montilla, Juan Novoa y Andrés Ocampo
Fecha en que realizó el laboratorio: 17/04/2020

1. Complete los volúmenes:

Concentració MIX (9
Reactivo Concentración final Volumen
n reacciones)
Standard
10X 1X 4,5 40,5
Buffer
MgCl2 10 mM 0.75 mM 3,375 30,375
dNTPs 10 mM 0.2 mM 0,9 8,1
Oligo 1 10 uM 0.2 uM 0,9 8,1
Oligo 2 10 uM 0.2 uM 0,9 8,1
Taq
10 un / ul 1 un 4,5 40,5
polimerasa
Agua milliQ     29,925 269,325
TOTAL MIX     45 ul 405
ADN molde     5 ul 45
TOTAL MIX     50 ul 450

2. PCR virtual

2.1. En la página de “In silico PCR Amplification” (ver: http://insilico.ehu.es/PCR/) seleccione el

género de bacterias Desulfotomaculum.

2.2. Utilice los siguientes primers para amplifcar el gen ribosomal 16S rDNA y hacer la
amplificaciónvirtual:

Primer 1 GM3F (5' a 3’): AGAGTTTGATCMTGGC Primer 2

GM4R (5' a 3’): TACCTTGTTACGACTT

y seleccione todos los genomas disponibles de Desulfotomaculum (“APLY TO ALL Desulfotomaculum”). Los
demás parámetros los deja como están por defecto.

Nota 1: Unos de los primers no tiene en una de sus posiciones una A, T, G ó C...tiene una “M”. Es por lo tanto,
un primer degenerado. Consulte lo que es un primer degenerado.

2.3. Click “Amplify”

2.4. Repita el procedimiento cambiando “Allow 1 mismatches...” y discuta la diferencia de los resultados de los
dos análisis (Pista: también consulte que es un “mismatch” y tenga en cuenta el comentario de la Nota 1).

2.5. Adjunte una figura (incluya la leyenda) de los geles de electroforesis que se generan. ¿Se ve una sola banda
por muestra? ¿Si son amplicones del mismo gen, se deberían ver una o varias bandas en cada muestra
(responda interprete y discuta este resultado)?
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2.6. En la parte inferior del gel se ve el numero de bandas y el tamaño de cada banda que se genera con la PCR
virtual de cada genoma. Si da click en alguna de las últimas, se abre la secuencia correspondiente de
nucleotidos que amplifica la PCR virtual. Descargue (copie en un archivo de texto o word) una secuencia de
cada genoma (son 6 genomas en total).

2.7. Haga blast (de nucleotidos – nucleotidos) de alguna de las secuencias descargadas y adjunte el resultado
(pantallazo de los resultados)
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3. A.R.D.R.A. Amplified rDNA (Ribosomal DNA) Restriction Analysis. (“Análisis de restricción

deamplicones de genes ribosomales”).

3.1. Consulte para que sirve la técnica de A.R.D.R.A (Resuma brevemente).

3.2. Simule una restricción del gen 16S rDNA de cada genoma, utilizando las secuencias descargadasdel
punto 1.1.6. con dos de las siguientes enzimas, las que usted elija: “Alu I”, “HaeIII”, “Hind III” y
“Rsa I”. Use la plataforma de NEBcutter que utilizamos la práctica pasada para hacer la restricción
virtual.

Nota 2: Recomendaciones: i) use el mismo marcador de paso molecular (100 bp DNA Ladder), y ii) use el mismo
porcentaje de agarosa = 1,4 - 2% para todas las restricciones) para cada simulación.

3.3. Adjunte una figura (incluya la leyenda) de las restricciones virtuales de cada enzima (una
figurapara de cada enzima) usando algún programa de edición de imágenes, de forma que pueda
comparar los patrones de corte generados para los diferentes genomas.

3.4. Discuta: de acuerdo los resultados obtenidos, ¿estas enzimas permitirían lograr el
objetivoprincipal de la técnica de A.R.D.R.A.? recuerde que usted tiene la información taxonómica
de cada genoma para respaldar su discusión.

Saludos!