Evaluación de producción de Alignato mediante cultivo de Azotobacter

vinelandii

Juan Esteban Novoa.

Introducción:

Los alignatos se clasifican como polisacáridos lineales con una alta gama de aplicaciones
industriales, debido a su uso como agente de suspensión y acondicionamiento del medio en el cual
se quiere llevar a cabo una reacción o crecimiento bacterial. Estos alignatos pueden ser
producidos principalmente por dos tipos de bacteria: El género Azotobacter y Pseudomonas (Hay,
2013.) así como se puede variar su concentración de producción según las fuentes de nitrógeno y
carbono, vitales para su crecimiento y función del metabolismo.

Metodología:

Primero, se realizó la activación de la cepa de Azotobacter vinelandii (ATCC® 12518) en medio

Ashby suplementado con agar y se procedió a incubar durante 48 horas a 30°C. La fermentación se
realizó en un erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio de cultivo. La composición de dicho
medio por litro de agua desionizada se registró como: glucosa 40 g; extracto de levadura 3.0 g;
MgSO4.7H2O, 0.4 g; NaCl, 0.4 g; KH2PO4, 0.16 g; K2HPO4, 0,64 g; CaCl2.2H2O, 84 mg;
NaMoO4.2H2O, 2 mg; FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg; CoCl2, 1.2 mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg;
MnCl2. 4H2O, 0.09 mg; ZnSO4. 7H2O.

Para ello, se preparó una solución de glucosa 40% p/v (se pesó la glucosa y se adicinó poco a poco
en 60 ml de agua, manteniendo agitación). En tubos tapa rosca se dispendó 10 ml de esta solución
de glucosa.

Posteriormente, Se preparó 50 ml de una solución de microelementos 10X, la cual se preparó

pesando: CaCl2.2H2O, 84 mg; NaMoO4.2H2O, 2 mg; FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg; CoCl2,
1.2 mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg; MnCl2. 4H2O, 0.09 mg; ZnSO4. 7H2O, 1.2 mg. (disueltos
inicialmente en 30 ml de agua destilada y luego aforado a 50 ml). En tubos tapa rosca se dispensó
5 ml de esta solución de microelementos.

Por aparte se prepararon las 10 soluciones de macroelementos y fuente de nitrógeno (85 ml cada
una), la cual se obtiene pesando para cada solución:extracto de levadura 0.3 g; MgSO4.7H2O, 0.04
g; NaCl, 0.04 g; KH2PO4, 0.016 g; K2HPO4, 0,064 g; disolviendo en 75 ml de agua destilada,
ajustando el pH a 7.2 con NaOH o HCl entre 0.2 M y 1 M y aforando a 85 ml. (También se pueden
preparar los 850 ml y distribuir en 10 erlenmeyers)

Luego se esteriliza en condiciones asépticas (al lado del mechero o en cabina de flujo laminar, con
tapabocas, manos limpias, micropipeta limpia y puntas estériles) adicionar 0.5 ml de la solución de
glucosa y 0.25 ml de la solución de microelementos al erlenmeyer de 20 ml que contiene los 9.25
ml de la solución de macroelementos. Se Toma con el asa microbiológica dos porciones de
bacterias crecidas en el medio Ashby y resuspender en los 10 ml de medio de cultivo presentes en
el erlenmeyer de 20 ml, e incubar durante 36-48 h a 30°C y 200 rpm.

Pasado ese tiempo, se mezclaron los restantes 9.5 ml de glucosa y 4.75 ml de solución de
microelementos con la solución de macroelementos presente en el erlenmeyer de 500 ml; se
adicionaron también al erlenmeyer de 500 ml para iniciar la fermentación lo previamente crecido
de la bacteria en el Erlenmeyer de 20 ml. (Todo lo anterior en condiciones asépticas) Incubar
durante 48 h a 30°C y 200 rpm. Pasado ese tiempo almacenar en frio a 4 °C. Se determinó cantidad
de proteínas y azpucares reductores por el método de biuret y DNS respectivamente.

Análisis y resultados:

Primero, se determina la cantidad de azúcares reductores mediante el método de DNS, para el

cual se hace uso de la curva de calibración presentada en informes anteriores que corresponden a
los estudiantes Juan Esteban Gonzáles y Steven Agudelo.

mg/ml Abs
0,1 0,04
0,2 0,132
0,3 0,258
0,4 0,341
0,5 0,42
0,6 0,528
Tabla1. Resultados Curva de calibración

Concentración vs Abs
0.6

0.5

0.4
Absorbancia

0.3 y = 0.9677x - 0.0522

R² = 0.9959
0.2

0.1

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
mg/ml
 Gráfico 1. Curva de calibración DNS.

Absorbancia mg/ml
0,963 1,04908546
Tabla 2. Resultados concentración azúcares reductores

Para obtener la concentración de proteínas, se recurre al método de Biuret, donde se hace uso de
las curvas de calibración presentadas en los anteriores informes, también por los mismos
estudiantes.

mg/ml Abs.
0 0
0,33 0,079
0,66 0,123
1 0,177
1,33 0,2
Tabla 3. Curva de calibración BIuret

Concentración vs Abs.
0.25
y = 0.1495x + 0.0165
0.2 R² = 0.9664
Absorbancia

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mg/ml

Gráfica 2. Curva de calibración Biuret

Seguido de estos resultados, se obtuvo la cantidad de alignato, biomasa, nitrógeno consumido y
sustrato consumido, donde Thompson (Thompson, et al. 2017) expone un contenido de 10% de
nitrógeno, 0,8% de amoniaco, 1,8% de fósforo y 1% de fosfato en el extracto de levadura. Los
resultados son los siguientes:

Sustrato consumido (g) 3,762

Biomasa (g) 0,2617
Alignato (g) 0,2563
Nitrógeno consumido (g) 3,534
Tabla 4. Resultados obtenidos

Dados estos datos, se procede a calcular los correspondientes rendimientos

0,2563
𝑌p/s= 3,762 ∗ 100 = 6,81%

0,2617
𝑌p/n= ∗ 100 = 7,40%
3,534

0,2617
𝑌p.b/s= 3,762 ∗ 100 = 6,95%

0,2563
𝑌p.a/n= 3,534 ∗ 100 = 7,25%

Se puede observar que los mayores rendimientos obtenidos fueron aquellos que son comparados
con el nitrógeno. Esto se debe principalmente a que la bacteria presente concentra una mayor
fijación por el nitrógeno en orden de aumentar su metabolismo, lo que aumenta la producción de
alignato y biomasa (Cuesta A, Monsalve J, Meza M, Zapata A, Trujillo M. 2014). Debido a la
afinidad de la bacteria por el nitrógeno para maximizar su metabolismo , Kazemzadeh
(Kazemzadeh, Sadat, Fouladagar. 2017) expone que una cantidad de 0,6g/100ml de extracto de
levadura junto con 2g/100ml de lactosa, aumenta el rendimiento de la producción al obtenerse
3,58g de alignato, así como las condiciones óptimas del ambiente a la cual se expone, las cuales
son a una temperatura de 25°C y un pH de 7,6. El tiempo de fermentación cumple otro papel
importante, ya que representa el tiempo en el cual se puede alcanzar un mayor crecimiento de en
la población de la bacteria. Esta se llevó a cabo por 24h, donde según Saribay (Saribay. 2003) la
bacteria alcanza su número de duplicado máximo para después permanecer constante. Sin
embargo también especifica que en el medio se es importante una cantidad de 4mg/100ml de ion
fosfato para que se dé una óptima fijación. Dado el amplio número de bacterias que se pudo
haber conseguido en el medio y una concentración cerca de 0,070mg/100ml de fosfato que se
usó, se pudo haber inhibido el proceso de fijación de nitrógeno mediante la inhibición de la
enzima nitrogenasa (Saribay. 2003).

Con respecto a los azúcares reductores, Mejía, Segura y Galindo (Mejía, et al. 2010) establecen
que después de un periodo de 24h, la concentración de glucosa aproximadamente es de 5mg/ml.
Con respecto al casi 1mg/ml así mismo se afirma una alta tasa de consumo de la fuente de
carbono por parte de la bacteria, que se justifica con el medio en el cual no se pudo haber dado
una correcta fijación del nitrógeno.

La viscosidad obtenida experimentalmente fue de 1,39 cP. La literatura reporta un valor de 130cP
(Cuesta A, Monsalve J, Meza M, Zapata A, Trujillo M. 2014). Cuesta, Monsalve, Peña, Galindo y
Trujillo-Roldán (Cuesta, et al.) Establecen que la viscosidad puede incrementarse como mejora de
diseño con respecto a valores de viscosidad baja, con el uso del jugo de caña de azúcar como
fuente de carbono.

Conclusiones:

1. La producción de alignato presentó rendimientos de biomasa y alignato de 7,40% y 7,25%

con respecto al nitrógeno y de 6,95% y 6,81% con respecto a la fuente de carbono. Estos
rendimientos se basan en las condiciones y adecuación del medio del cultivo, donde se
pueda garantizar una atmósfera óptima. Así mismo como el uso de otros agares diferentes
al Asgby, como lo puede ser el Burk (Sadoff, Berke. 1970.)
2. El tiempo de fermentación en la práctica fue óptimo para garantizar el crecimiento
máximo de las células del cultivo-

Referencias:

1. THOMPSON, Kyle A.; SUMMERS, R. Scott; COOK, Sherri M. Development and

experimental validation of the composition and treatability of a new synthetic bathroom
greywater (SynGrey). Environmental Science: Water Research & Technology, 2017, vol. 3,
no 6, p. 1120-1131.
2. ALVAREZ, Angélica María Cuesta, et al. Estrategias de cultivo en la producción de
alginatos por Azotobacter vinelandii.
3. KAZEMZADEH, Somayeh; NAGHAVI, Nafiseh Sadat; FOULADGAR, Masoud. Submerged
Alginate Biopolymer production by Azotobacter chroococcum Isolated from soil. Advances
in Bioresearch, 2017, vol. 8, no 2.
4. SARIBAY, Gul Fidan. Growth and Nitrogen Fixation Dynamics of Azotobacter chroococum
in Nitrogen-free and OMW Containing Medium. Spesifikasi Kompos dari Sampah Organik
Domestik, 2003.
5. CUESTA, Angelica M., et al. EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTERNATIVOS
PARA LA PRODUCCIÓN DE ALGINATOS POR Azotobacter vinelandii.
6. SADOFF, H. L.; BERKE, E.; LOPERFIDO, B. Physiological studies of encystment in
Azotobacter vinelandii. Journal of bacteriology, 1971, vol. 105, no 1, p. 185-189.
7. HAY, Iain D., et al. Microbial alginate production, modification and its applications. Microbial
biotechnology, 2013, vol. 6, no 6, p. 637-650.