Evaluación de toxicidad de

surfactantes por inhalación en

células de pulmón.
Abstract
Hay pocos datos disponibles para excipientes: Administrados por vía de
inhalación. Este estudio evalúa el potencial in vitro de la toxicidad de tres
surfactantes (Polisorbato 20, Polisorbato 80 y Poloxámero 188) mediante el uso
de una interfase aire-liquido original (ALI) método de exposición comparado
con el modelo líquido-líquido (L/L). Dos pruebas de toxicidad en células se
llevaron a cabo en células BE-AS-2B, una línea celular epitelial bronquial
inmortalizada humana; medición de la actividad de Lactato Deshidrogenasa y el
ensayo de la proliferación de las células XTT. Nosotros encontramos que el
Polisorbato 20 aparentemente es más toxica que el Polisorbato 80, y el
Poloxámero 188. Un incremento de la toxicidad de Polisorbato 20 en el sistema
L/L como se muestra en comparación a la exposición de ALI. Una toxicidad
también fue observada por Polisorbato 80 pero a una mayor concentración y
sin diferencia entre las exposiciones L/L y ALI. No fue observada una toxicidad
a mayor concentración por el Poloxámero 188.
Poloxámero 188 parece ser el mejor candidato de los 3 muestreados, para las
formulaciones galénicas designadas para la inhalación tal como bioterapias.
Para evaluar la citotoxicidad de excipientes por inhalación se usó la exposición
ALI en lugar del modelo L/L.
Introducción
La toxicidad de excipientes a veces es considerada como secundaria al de los
ingredientes activos. En efecto, los excipientes pueden ser fuentes
subestimadas de toxicidad intrínseca la cual depende de la dosis y la vía de
administración. Actualmente, el uso de excipientes está basado en datos
históricos. Sin embargo, hay menciones por uso industrial que hace la
Administración de Drogas y Comida (FDA), la Agencia de Mediciones Europeas
(EMA) y el Consejo Internacional Farmacéutico de Excipientes (IPEC). Incluso
con esas menciones, la evaluación de riesgos para algunos excipientes parecer
estar incompleta. Surfactantes, tal como los Polisorbatos y el Cloruro de
Benzalconio son comúnmente usados para las formulaciones galénicas para
inhalación, pero los datos sobre su toxicidad por inhalación no están
disponibles.
Además, gracias a sus características farmacológicas, la inhalación podía
proporcionar una solución para la administración de nuevas bioterapias, tal
como anticuerpos monoclonicos, que están siendo desarrollados cada vez más
hoy. Tomando en cuenta la especificación de la inhalación, nosotros evaluamos
el potencial in vitro de la toxicidad de los excipientes mediante el uso de una
interfase original aire-liquido (ALI) método de exposición.
Material y métodos
Tres surfactantes fueron seleccionados; Polisorbatos 20 y 80 que ya son
usados en formulaciones para inhalación y Poloxámero 188 como un potencial
candidato para la vía de inhalación. Todos los surfactantes fueron suplidos por
Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).
Polisorbato 20, Polisorbato 80 y 10% Poloxámero 188 fueron filtrados y
esterilizados. Un 10% del volumen de solución stock (V/V) in PBS fue
producido por otros surfactantes excepto por el 10% de Poloxamero 188 que
estaba disponible como una solución. Fueron esterilizados mediante un filtro de
0,22 micrómetros. La baja disolución, utilizada para realizar las exposiciones,
fue obtenida de la solución stock por disolución en el medio de cultivo. Las
concentraciones utilizadas se detallan a continuación.
Líneas de células BEAS-2B, suplidas por ATCC (Manassas, USA), como las
células bronquiales epiteliales humanas, células inmortalizadas por vía
transfección del antígeno T, usado. Esta línea de células es un buen modelo
para el estudio toxicológico por aerosol.
Dos modelos de exposición fueron comparados: un modelo clásico
liquido/liquido (L/L) y un modelo (ALI) aproximando las condiciones de
exposición vía de inhalación y la comparación de dos modelos
La exposición L/L fue realizada en placas de 6 pocillos (Corning Inc., New York,
USA) tratadas previamente con fibronectina en 0.01 mg/ml e inoculada con
600,000 células en 2 ml por pocillo, para ambas pruebas LDH y XTT, el
Polisorbato 20 fue probado en diferentes concentraciones: 0.6%, 1%, 2%; para
Polisorbato 80: 1%, 2%, 4% y para Poloxámero 188: 5%, 10%.
Las exposiciones ALI fueron realizadas en places de 6 pocillos con insertos.
Los insertos fueron pretratados con fibronectina con 0.02 mg/ml, inoculada con
400,000 células por inserto en 1,5 ml de medio cultivo y 2 ml de medio cultivo
que fueron añadidos a cada pocillo. 24 horas después de sembrar, cuando las
células estaban en confluencia, fueron expuestas a surfactantes con un
sistema en aerosol nasal (AptarPharma, Le Neubourg, France). Las
exposiciones realizadas mediante spraying con 50 microlitros de surfactantes
muestreados, a una distancia de 3,2 cm (optima distancia de medición a cubrir
la superficie del inserto). Para ambas pruebas LDH y XTT, el Polisorbato 20 fue
probado en diferentes concentraciones: 0.6%, 1%, 2%; para Polisorbato 80:
1%, 2%, 4% y para Poloxámero 188: 5%, 10%. Para acercarse lo más posible a
las condiciones de exposición por inhalación in vivo, solo se realizó una
exposición en las células, los tensioactivos se mantuvieron 15 minutos y la
exposición se detuvo limpiando las células con el medio. Los resultados se
compararon con sus valores de control y son el promedio de al menos 3
experimentos independientes.
Para determinar la toxicidad de esos productos químicos, se realizaron dos
pruebas de toxicidad celular, es decir, la medición de la actividad de la lactato
deshidrogenasa (LDH) y el ensayo de proliferación celular XTT.