Crecimiento de Células Nerviosas Motoras sobre Material Modificado
Superficialmente por Polimerización por Plasma
E. Zuñiga-Aguilar1, R. Godínez1, MA. Morales2, F. Cifuentes2, O. Ramírez-Fernández1, J.
Morales3, R. Olayo3
1
Universidad Autónoma Metropolitana, Departamento de Ing. Eléctrica, Distrito Federal, México, iaraszu@hotmail.com
2
Universidad Nacional Autónoma de México, Departamento de Biología Celular y Fisiología, Distrito Federal, México
3 Universidad Autónoma Metropolitana, Departamento de Física, Distrito Federal, México
Abstract— The aim of this work is to study the growth and
adhesion of motor nerve cells on a surface recovered by
polypyrrol through polymerization by plasma and prove if all
yours electro physiologic and biochemical proprieties don’t be
modificated by the polymer. It is used the neuronal cell line
NG108-15, that were seeded on covers objects polymerized by
plasma, the growth and the cellular adhesion on the material was
monitored through the acquisition of images by inverted
microscope. In order to observe the specific protein sintesys of
this kind cell, we were used inmunochemical techniques,
applying specific antibodies against surface markers, the samples
were observed through fluorescence microscopy. The electrical
functionality with polymer was verified applying
electrophysiology techniques of current and voltage clamp. One
concludes that a suitable neuronal growth was obtained on the
polymerized material and that the characteristic electrical and
morphologies were not affected by the presence of polymer.
Palabras claves— poli pirrol, motoneuronas, polimerización
por Plasma.
I. INTRODUCCIÓN
Los cultivos celulares son un procedimiento tecnológico de
mantenimiento y estudio de células vivas en un medio
artificial que permite reproducir, de forma bastante fiable, las
condiciones biológicas que las células tienen en su lugar de
origen. Las áreas de aplicación potencial de los cultivos
celulares se han ido ampliando de forma progresiva, por lo
que constituyen ya una técnica habitual en muchos
procedimientos de investigación [1, 2].
Tales cultivos deben de ser mantenidos en condiciones
idóneas para su crecimiento. En particular, la superficie de
cultivo debe presentar características adecuadas para que las
células crezcan y se adhieran en esta, por lo que se han hecho
estudios para evaluar la adhesividad celular sobre materiales
polimerizados [3].
La polimerización por plasma puede usarse para sintetizar
materiales que modifiquen sólo las propiedades superficiales
en entornos libres de contaminantes químicos o patógenos.
Además, debido a la alta energía cinética que adquieren las
partículas cargadas en el plasma, los materiales que se
sintetizan se adhieren fuertemente a la superficie del
biomaterial [4].
J. Folgueras Méndez et al. (Eds.): CLAIB 2011, IFMBE Proceedings 33, pp. 120–123, 2013.
www.springerlink.com
Las superficies ricas en aminas tienen gran influencia en la
adsorción de proteínas y en la adhesión celular, ya que
proveen sitios para la inmovilización de biomoléculas. En la
literatura se encuentran reportes de que el polipirrol
sintetizado por plasma crea una capa superficial rica en
grupos amina, siendo un material conductor utilizado como
sustrato para el sembrado de células excitables. [5, 6].
Por lo que se decidió realizar el sembrado de células
neuronales sobre material polimerizado por plasma, para
evaluar la funcionalidad de este como superficie de
crecimiento celular sin que altere las características
morfológicas y funcionales de las neuronas.
II. METODOLOGÍA
El crecimiento celular debe de ser hecho bajo condiciones
adecuadas que permitan su reproducción en poco tiempo, por
lo que es necesario crear los protocolos necesarios para los
fines requeridos.
A. Protocolo de Cultivo Celular
La línea celular NG108-15 en su forma diferenciada, se
considera un modelo de motoneurona; la línea celular, fue
adquirida de ATCC No. HB-12317. Las células fueron
sembradas en platos de cultivo de 35 mm con 2 ml de DMEM
(No. De Catalogo: 12100-046 Dulbecco, Diffco)
suplementado con 10% de FBS (No. Cat. 16000, Gibco), 1%
de L-Glutamina (No. Cat. G-1517), 1% de Antibiótico-
Antimicotico (No. Cat. 15240 Gibco) y 1x de suplemento
HAT (No. Cat. 21060, GIBCO 50x), las cajas fueron
colocadas en la incubadora en condiciones óptimas de
atmosfera y temperatura (5 % CO2 y 37 ºC).
B. Polimerización por Plasma
Se utiliza la polimerización por plasma con descarga
luminiscente, debido a que solo requerimos recubrir con una
capa muy delgada de polipirrol los materiales a cubrir. Los
cubre objetos fueron colocados en el reactor de plasma, a una
frecuencia de oscilación de 30 watts por 10 min, a una presión
de vacío de 3x10-2 Torrs. Al obtener el recubrimiento de los
 Crecimiento de Células Nerviosas Motoras sobre Material Modificado Superficialmente por Polimerización por Plasma 121

materiales estos se guardaron y colocaron bajo luz UV para primer cultivo neuronal se aplicó como anticuerpo primario
asegurar su esterilidad en experimentos posteriores. V-CHAT de cabra con una dilución 1:800 y el secundario
FITC de conejo con dilución 1:400. Al siguiente cultivo
C. Sembrado Celular sobre el Material Polimerizado celular se aplico Sinaptofisina (SYN) de ratón con dilución
1:800 y como anticuerpo secundario Texas Red de ratón (tR)
Una vez obtenido el crecimiento en platos de cultivo, se hecho en caballo con dilución 1:200, para el ultimo cultivo se
despegaron las células con 1ml de Tripsina + EDTA, se utilizo Periferina hecha en ratón con dilución 1:500 y
colocó el material polimerizado dentro de platos de cultivo sin anticuerpo secundario Texas Red de ratón (tR) hecho en
tratar, se sembraron las células aplicando la técnica de micro caballo con dilución 1:200 todas las muestras fueron
cultivo, aplicando 400µl de DMEM (No. De Catalogo: 12100- montadas en glicerol. Y se verifico la presencia de los
046 Dulbecco, Diffco) suplementado con 10% de FBS (No. anticuerpos observando cada una de las muestras a través de
Cat. 16000, Gibco), 1 % de L-Glutamina (No. Cat. G-1517), microscopía de fluorescencia.
1% de Antibiótico-Antimicótico (No. Cat. 15240 Gibco) y 1x
de suplemento HAT (No. Cat. 21060, GIBCO 50x), los platos III. RESULTADOS
fueron colocados en la incubadora en condiciones óptimas de
atmosfera y temperatura (5%CO2 y 37ºC). La polimerización de los cubreobjetos por plasma
utilizando un monómero de pirrol, recubrió con una capa
D. Registros Electrofisiológicos delgada la superficie del material sobre el cual se realizó el
sembrado celular.
Para la medición de los potenciales de acción se utilizo el
amplificador DAGAN, las células fueron bañadas con
solución extracelular de mamífero, se utilizaron pipetas de
vidrio de boro silicato (World Presicion Instruments, glass
1BBL NO FIL 4IN), las pipetas fueron estiradas con el
estirador horizontal (SUTER INSTRUMENTS, Model P-97),
obteniéndose resistencias de 60 MΩ, se utilizó KOOCCH3 +
KCl (3M) como solución conductora para el interior de la
micro pipeta. Se aplicaron pulsos de corriente a partir de -
0.005nA con incrementos de 0.01 nA entre pulsos. Para la
medición de corrientes iónicas se utilizó el amplificador
AXOPATCH 200A, se comenzó con un voltaje de
mantenimiento de -65 mV y posteriormente observando el Fig. 1 Material modificado superficialmente por polimerización por plasma
comportamiento celular se decidió cambiar el voltaje de
mantenimiento a -80mV para así descartar inactivación de El crecimiento de las células nerviosas motoras sobre el
canales voltaje dependientes. Posteriormente se aplicaron material polimerizado no se vio afectado por la presencia de
pulsos rectangulares de voltaje (pulsos comando) con este, ya que se obtuvo una buena adhesión y proliferación
incrementos de 10 mV entre cada pulso a partir del voltaje de celular, observándose el crecimiento y extensión de neuritas.
mantenimiento para modificar transitoriamente el potencial de
membrana, y de esta manera evocar corrientes iónicas de Na+
y K +.

E. Inmunocitoquímica

Las células fueron fijadas a los cubre objetos con una

solución de paraformalaldehído al 4 % por 10 min, se lavaron
las muestras 3 veces con PBS con 10 min de reposo entre cada
lavado, se permeabilizó la membrana de cada una de las
muestras con TRITON en PBS por 10 min., se lavaron 3
veces con PBS con 10 min de reposo entre cada lavado, las
muestras se bloquearon con 1 % de suero de caballo diluido
en PBS por 30 min. Se aplicaron los anticuerpos primarios a Fig. 2 Crecimiento de células neuronales sobre el material polimerizado
cada uno de los cubre objetos con células neuronales, al (Contraste de Fases, Barra 50 micras, ampliación original x 100)

IFMBE Proceedings Vol. 33

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Al tener el crecimiento de las células sobre el material, se
prosiguió a comprobar que las propiedades eléctricas de las
células no se vieran alteradas por la presencia del polímero.
En la Figura 2 se presenta un potencial de acción inducido
por la inyección de corriente despolarizante. A partir de un
potencial de membrana de -50 mV y se estimula la célula con
corriente despolarizante y se observa el primer potencial de
acción registrado al alcanzar el voltaje umbral de disparo.
Io  0.1nA 
0nA 
‐0.1nA 
‐0.2nA 
Fig.2 Potencial de acción registrado en una célula nerviosa motora sembrada
sobre el material polimerizado
Para observar de manera más detallada que las propiedades
eléctricas de las células nerviosas motoras no son afectadas
por la presencia del polímero, se midieron las corrientes de
Na+ y K+ inducidas por la aplicación de pulsos despolarizantes
de fijación del voltaje como se aprecia en la Figura 3.
Fig.3 Corrientes iónicas de Na+ y K+ en la célula nerviosa motora (pulsos
comando de estimulación con incrementos de 10 mv entre cada pulso a partir
de un potencial de mantenimiento de – 80 mV)
Se observa la aparición de corrientes negativas rápidas de
Na+ provocadas por la apertura de estos canales,
posteriormente se presentan las corrientes tardías positivas de
K +.
IFMBE Proceedings Vol. 33
E. Zuñiga-Aguilar et al.
Una vez comprobada la funcionalidad eléctrica
proseguimos a realizar las pruebas inmunocitoquimicas para
evidenciar que la síntesis de proteínas se mantenía en la
células.
Por microscopía de fluorescencia se observó la presencia
del anticuerpo dirigido hacia la Periferina típica de las células
nerviosas del sistema nervioso periférico, la cual se
encontraba presente en los somas neuronales y axones.
Fig.4 Periferina presente en las neuronas sembradas sobre el material
polimerizado (Microscopia de fluorescencia, Barra=20 micras, ampliación
original x 400).
El anticuerpo dirigido hacia sinaptofisina revela la
presencia de sinapsis neuronal en el cultivo sobre el material
polimerizado, ya que esta es una proteína que se encuentra en
la membrana de las vesículas sinápticas.
Fig.5 Sinapsis neuronal marcada por el anticuerpo hacia sinaptofisina
(Microscopia de fluorescencia, Barra=20 micras, ampliación original x 400)
Por último se observó la presencia de transportadores
vesiculares de acetilcolina en la terminales nerviosas de las
células nerviosas motoras sembradas sobre el material
polimerizado, ver Figura 6.
 Crecimiento de Células Nerviosas Motoras sobre Material Modificado Superficialmente por Polimerización por Plasma 123

REFERENCIAS
1. Freshney R I (1994) Biology of the cell cultured. Ed. Culture of animal
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2. Iturralde M, Coll J (1984) Cultivo de células animales”. Med Clin
Cap.82: 273-280
3. Vázquez B, San Román del Barrio J, Méndez J (2005) Los polímeros
biodegradables y sus aplicaciones biomédicas. Revista de plásticos
modernos: Ciencia y tecnología de polímeros, Vol. 34 (586): 361-367
4. Morales J, Osorio C, Montiel R, Vazquez H, Olayo R, Olayo M G, Cruz
G J, Pérez E (2008) Autoensamble de capas de polímeros ionicos sobre
polietileno funcionalizado por plasma de pirrol, Superficies y Vacio Vol.
21(3):1-4
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Olayo M G, Cruz G J, Olayo R (2006) Cultivo de Hepatocitos sobre
Fig.6 Transportadores vesiculares de acetilcolina marcadas por el anticuerpo vidrio modificado con un polímero de pirrol sintetizado por plasma. XIX
(Microscopia de fluorescencia, Barra=20 micras, ampliación original x 400). Congreso Nacional de Polímeros
6. Gilmore K, Kita M, Han Y, Gelmi A, Higgins M, Moulton S, Clark G,
Kapsa R, Wallace G (2009) Skeletal muscle cell proliferation and
Se observa en todas las imágenes de fluorescencia el differentiation on polypyrrole substrates doped with extracellular matrix
marcaje superficial por los anticuerpos dirigidos a proteínas components. Biomaterials , Vol.30: 5292–5304
específicas que son sintetizadas por las células nerviosas
motoras utilizadas en los cultivos sobre el material
polimerizado.

IV. CONCLUSIONES
El material recubierto con pirrol por plasma con un tiempo
de exposición de 10 min, presento buenas características de
biocompatibilidad celular durante el sembrado de las
motoneuronas sobre de este, ya que este promovió el
crecimiento y adhesión celular, esto debido a que el pirrol
presenta una superficie rica en aminas que tienen gran
influencia en la absorción de proteínas y adhesión celular,
proviendo sitios de inmovilización para biomoléculas, las
características morfológicas de las células no se vieron
afectadas por la presencia del material, así como los procesos
de diferenciación de las células en el polipirrol.
En el registro de las células nerviosas motoras sobre el
material polimerizado, las células conservaron sus
características eléctricas, viéndose la presencia de potenciales
de acción y corrientes iónicas de sodio y potasio durante la
estimulación eléctrica de las células motoras nerviosas, por lo
tanto el pirrol además de ser un material rico en aminas en su
superficie y promover la adhesión y crecimiento celular, este
posee características de transporte de carga eléctricas
sensibles a la humedad de su entorno que lo pueden convertir
en un material conductor biocompatible.
Las pruebas inmunológicas realizadas a las células
nerviosas motoras presentaron en cada una de ellas la
presencia de las proteínas características de este tipo celular y
se verifico que el material no afecto la síntesis de dichas
proteínas, por lo que su morfología ni su fisiología celular se
vieron afectadas.

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