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métodos en virus diagnóstico: A partir de ELISA para la próxima generación de secuenciación

Neil Boonham una , ene Kreuze si , Stephan invierno C , René van der Vlugt re , Ene Bergervoet re ,
Jenny Tomlinson una , Almiar Mumford una , *
una los Food & Ambiente Agencia de Investigación (FERA), Sand Hutton, York YO41 1LZ, Reino Unido

si Internacional Potato Center (CIP), PO Box 1558, Lima 12, Perú

C Deutsche Sammlung von Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, en alemán), Departamento de virus de plantas, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania

e Planta Investigación Internacional, Droevendaalsesteeg 1, 6708 PB Wageningen, Países Bajos

nformación del artículo abstracto

Artículo historia: A pesar del desarrollo aparentemente continua de los métodos más nuevos y cada vez más elaboradas para la detección e identificación de virus, muy pocos de estos nuevos métodos de
Disponible línea 19 diciembre 2013 ser adoptados para uso rutinario en los laboratorios de ensayo, a menudo a pesar de las muchas y variadas ventajas afirmado que poseen. Para entender por qué la tasa de absorción de

nuevas tecnologías es tan bajo, requiere una sólida comprensión de lo que hace una buena herramienta de diagnóstico de rutina para comenzar. Esto se puede hacer mirando a los dos
palabras clave: métodos de detección de virus de plantas establecidas más éxito: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y, más recientemente, la reacción en cadena de la polimerasa en
Molecular diagnósticos en tiempo real PCR
tiempo real introducido (PCR). Mediante el examen de las características de este par de tecnologías, se hace evidente que comparten muchos beneficios, tales como un formato estándar de
ámpara ensayos multiplex, Luminex Siguiente Generacion
la industria y los altos niveles de repetición y reproducción. Estos métodos se combinan para hacer que sean accesibles a los laboratorios de ensayos, que son fáciles de establecer y
El campo de secuenciación pruebas
robustos en su uso, incluso con los usuarios nuevos y sin experiencia. Por lo tanto, para garantizar el establecimiento de nuevas técnicas, es necesario no sólo proporcionar bene fi cios que

no se encuentran con ELISA o PCR en tiempo real, sino también para proporcionar una plataforma que es fácil de establecer y utilizar. En el diagnóstico de virus de plantas, la evolución

reciente pueden ser agrupados en tres áreas principales: (1) las técnicas que se pueden realizar en el campo o en lugares pobres en recursos (por ejemplo, mediada por bucle isotérmica

ampli fi cación LAMP); (2) métodos multiplex que son capaces de detectar muchos virus en un solo ensayo (por ejemplo, Luminex rebordear arrays); y (3) los métodos adecuados para el

descubrimiento de virus (por ejemplo, la secuenciación de próxima generación, NGS). métodos basados ​en el terreno no son nuevos, con estar disponibles dispositivos de flujo lateral (LFD)

para la detección de un número de años. Sin embargo, la adopción generalizada de esta tecnología sigue siendo pobre. La lámpara no ofrecen ventajas signi fi cativas sobre LFD, en

términos de sensibilidad y aplicación genérica, pero todavía se enfrenta a retos en términos de establecimiento. Es probable que la principal barrera para la adopción de tecnologías basadas

en el terreno fi es de comportamiento in fl uencias, en lugar de especí fi ca las preocupaciones sobre el rendimiento de las tecnologías en sí mismas. Para superar esto, una nueva relación

tendrá que desarrollar entre los laboratorios de pruebas centralizadas que ofrecen servicios y las pruebas que requieran; una relación que actualmente se encuentra en su infancia. Mirando

más hacia el futuro, el descubrimiento del virus y los métodos múltiplex parecen converger como NGS se hace cada vez más barato, más fácil de realizar y puede proporcionar altos niveles

de multiplexación sin el uso de virus específico reactivos. Así que en última instancia, el principal desafío desde una perspectiva laboratorio de pruebas de rutina no será una de las

inversiones en plataformas que incluso podría ser externalizados a los servicios de secuenciación comerciales, pero uno de los que tienen habilidades y experiencia para analizar los grandes

conjuntos de datos generados y su posterior interpretación. En conclusión, sólo el tiempo dirá cuál de la próxima generación de los métodos actualmente en desarrollo se convertirán en los

diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. Y mientras que la tecnología en sí tendrá que ofrecen ventajas de rendimiento sobre los

métodos existentes con el fin de suplantar a ellos, es probable que haya factores humanos Así que en última instancia, el principal desafío desde una perspectiva laboratorio de pruebas de

rutina no será una de las inversiones en plataformas que incluso podría ser externalizados a los servicios de secuenciación comerciales, pero uno de los que tienen habilidades y experiencia

para analizar los grandes conjuntos de datos generados y su posterior interpretación. En conclusión, sólo el tiempo dirá cuál de la próxima generación de los métodos actualmente en

desarrollo se convertirán en los diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. Y mientras que la tecnología en sí tendrá que ofrecen ventajas

de rendimiento sobre los métodos existentes con el fin de suplantar a ellos, es probable que haya factores humanos Así que en última instancia, el principal desafío desde una perspectiva

laboratorio de pruebas de rutina no será una de las inversiones en plataformas que incluso podría ser externalizados a los servicios de secuenciación comerciales, pero uno de los que tienen

habilidades y experiencia para analizar los grandes conjuntos de datos generados y su posterior interpretación. En conclusión, sólo el tiempo dirá cuál de la próxima generación de los

métodos actualmente en desarrollo se convertirán en los diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. Y mientras que la tecnología en sí

tendrá que ofrecen ventajas de rendimiento sobre los métodos existentes con el fin de suplantar a ellos, es probable que haya factores humanos sólo el tiempo dirá cuál de la próxima

generación de los métodos actualmente en desarrollo se convertirán en los diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. Y mientras que la

tecnología en sí tendrá que ofrecen ventajas de rendimiento sobre los métodos existentes con el fin de suplantar a ellos, es probable que haya factores humanos sólo el tiempo dirá cuál de la

próxima generación de los métodos actualmente en desarrollo se convertirán en los diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. Y

mientras que la tecnología en sí tendrá que ofrecen ventajas de rendimiento sobre los métodos existentes con el fin de suplantar a ellos, es probable que haya factores humanos por ejemplo,

el comportamiento de los usuarios finales, los laboratorios y los responsables políticos, la disponibilidad de conocimientos técnicos adecuados, que en última instancia determinan cuáles se establezcan. Por lo tanto factores no pueden ser ig

Crown Copyright © 2013 Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.

abreviaturas: PCR, reacción en cadena de la polimerasa; ELISA, enzima-ensayo inmunoabsorbente ligado; LAMP, loop-mediada isotérmica de amplificación fi; LFD, lateral fl ow dispositivo; NGS, siguiente generationsequencing; NASH, nucleico de hibridación
mancha de ácido; FRET, la transferencia de energía de resonancia fluorescente fl; NASBA, secuencia de ácido nucleico basado catión fi cador; RPA, recombinasa polimerasa cación fi cador; HDA, helicasa dependiente de amplificación fi; RFLP, la restricción de
ongitud de fragmentos polimorfismo; ICAN, isotérmica y quimérico primerinitiated ampli fi cación de ácidos nucleicos; RCA, círculo rodante ampli fi catión; MIA, ensayo inmunológico microesfera; TSPE, objetivo específico cebador de extensión.

* Correspondiente autor. Tel .: 44 1904 462140.

Email habla a: rick.mumford@fera.gsi.gov.uk (R. Mumford).

0168-1702 / $ - see front matter. Crown Copyright © 2013 Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2013.12.007
 N. Boonham et al. / Virus de Investigación 186 (2014) 20-31 21

1. Introducción que a pesar de muchos avances tecnológicos, sigue siendo un proceso altamente impredecible y costoso.

Como resultado, la producción de antisueros tiene que ser llevado a cabo en laboratorios especializados. Esto

los publicación de una ligado a enzimas ensayo inmunoabsorbente (ELISA) método para la detección está en marcado contraste con los métodos basados ​en ácidos nucleicos de detección, donde las secuencias
de Plum pox virus (PPV; género del genoma viral están dirigidos utilizando enfoques moleculares genéricos, que son accesibles para muchos y

potyvirus, familia Potyviridae) y Arabis virus del mosaico (ArMV; género un coste relativamente bajo. Los costes de desarrollo de antisueros, especialmente cuando se expresa y

nepovirus, familia Secoviridae) por Clark y Adams (1977) fue un gran avance en el virus diagnóstico, dando purifica proteínas de virus recombinantes se utilizan como antígenos o, cuando los anticuerpos monoclonales

comienzo a una nueva era de las pruebas métodos y tecnologías que han surgido para definir deben ser preparados, son significativamente más alta y a menudo no coinciden con el tamaño del mercado

phytodiagnostics modernas. Antes de esto, el diagnóstico del virus era del dominio exclusivo de especialistas proyectada para el reactivo de prueba o kits de ELISA putativos.
con años de experiencia en el reconocimiento y la descripción del virus Los síntomas en los ejércitos, suplementado
con complejo y incómodo métodos tales como bio-ensayos en plantas indicadoras y el uso de elaborar técnicas
como la electrónica de transmisión microscopía. Los métodos serológicos habían estado en uso durante
algún tiempo antes de ELISA fue desarrollado, ya sea para fines de diagnóstico (por ejemplo, inmuno-específica En segundo lugar, el método ELISA detecta antígenos virales. En general es e fi ciente y sensible e

electrón microscopía; Derrick de 1972 ) O para determinar virus taxonómico relaciones (por ejemplo, incluso donde los virus que no pueden ser purifica, sensible y específico de detección de virus por ELISA se

Ouchterlony gel difusión ensayo; Bercks, 1967 ). Sin embargo, estos métodos tenían una gama de puede lograr, utilizando antisueros producidos contra las proteínas de virus recombinante (por ejemplo, Steel

inconvenientes por ejemplo, el uso de grandes cantidades de antisuero crudo o estar limitado por su formatear,et al., 2010 ). Sin embargo antisueros a menudo carecen de la resolución para identificar correctamente las
y por tanto sólo un pequeño número de muestras podría ser probado. los introducción de ELISA cepas de virus, que están estrechamente relacionados, pero que tienen un fenotipo distinto, a menudo

entonces revolucionó virus diagnóstico por la simplificación de la detección y el acortamiento de la hora requerido
debido al carácter straindetermining no se refleja en una proteína de la cubierta variación

para alcanzar resultados concluyentes ( Torrance y Jones, 1981 ). Más lejos mejoras llegaron a través del
uso de anticuerpos monoclonales, cuales mejora de la sensibilidad del ensayo y la especificidad ya
través de modi fi caciones del formato de la prueba ELISA, por lo que el más versátil ensayo para la por ejemplo, PVY NTN - la cepa de necrosis del tubérculo de virus Y de la papa ( PVY; género

detección del virus simple y sensible. ELISA fue rápidamente investigación laboratorios y se convirtieron potyvirus, familia Potyviridae) o porque las proteínas de cubierta de virus están tan altamente conservadas en un

en la principal herramienta de pruebas de virus en áreas como cría (por ejemplo, la evaluación de la género en particular (por ejemplo, género begomovirus,

resistencia a virus), cuarentena (p.ej, Proyección de material importado) y cationes fi cado (por ejemplo,
para asegurar plantación es decir materiales sin virus). Se ha establecido como el más método
ampliamente utilizado para la detección de virus en los cultivos, la sustitución de otros métodos más
complicados. Por ejemplo, ELISA tiene en gran parte sustituido pruebas de injerto inoculación de virus
que infectan a fruta árboles incluyendo cítricos ( EPPO, 2004a ) O frutas de hueso ( EPPO, 2004b, 2005 ).
Debido a su velocidad, su facilidad de aplicación, el uso y la interpretación de resultados, ELISA es
sumamente adecuado para de alto rendimiento de pruebas. por ejemplo, en 2005, más de 1 millón de
prunus muestras se ensayaron por ELISA, como parte de la campaña de erradicación de PPV de
Canadá (Thierry Poiré, ACIA, personal la comunicación) La clave de este ha sido el comercial disponibilidad
de equipos, reactivos y antisueros, lo que permite un alto grado de estandarización y comparabilidad.
Esto es ayudada además como reactivos serológicos se proporcionan a través de una limitado número de proveedores
nucleico única planta; ya sea en paralelo o como ensayos multiplex ( Dovas et al., 2002; Wintermantel y
comerciales y públicos, lo que permite la consistencia y transferibilidad de los protocolos. Estos
aspectos, apoyados por un largo historial de Experiencia en el uso de ELISA, permitir que el diagnóstico parámetros
adecuado para muchas situaciones, incluyendo la vigilancia, la erradicación, certi fi cación de las plantas
de la técnica, es decir, la sensibilidad, la especificidad, reproducibilidad y repetibilidad, para ser evaluado
( Vidal et al., 2012 ). Del mismo modo que proporcionar una validación eficaz, permitiendo que las
pruebas sean usado fiable y con proporcionar confianza en el estatus sanitario de cultivos probado,
ayudando a prevenir la propagación de enfermedades virales. Dado que por lo mucho indización de los
virus de rutina en los principales cultivos de todo el el mundo es Actualmente basado en ELISA, esto ha
dado lugar a la norma aceptada operando procedimientos para muchos virus y cultivos que hacen que el virus
proceso de prueba comparativo y transparente. Como resultado ELISA tiene volverse establecido como el
estándar global para la industria detección de virus en cultivos agricolas.
Sin embargo, mientras ELISA tiene muchos ventajas para la detección del virus de rutina ( Torrance y
Jones, 1981 ), Siendo rentable, robusta, fácil de usar y escalable para probar un gran número de
muestras, sino que también tiene varios escollos que limitan su uso como universalmente aplicables prueba
para el virus de la planta diagnóstico. En primer lugar, ELISA y sus diversos formatos exigir antisueros de
alta calidad, para permitir que la sensible y específica la unión a viral antígenos. La producción de tales
antisueros requiere virología la experiencia y la capacidad de purificar viriones o viral La capa / otro proteínas
como antígeno. Este es un proceso largo,
familia geminiviridae) que los anticuerpos no pueden ser utilizados para discriminar entre especies
dentro de ella. Por lo tanto, en una serie de situaciones, por ejemplo cuando identificación de
específico especies virales / se requiere cepas, ELISA a menudo no es apropiado.
En tercer lugar ELISA se usa ampliamente como una herramienta de diagnóstico para evaluar el
estado fitosanitario de plantas, con fines de cuarentena o virus certi fi cación, y se ha convertido en una
parte integral de la indexación patógeno. Cuando un grupo de diversos patógenos tiene que ser probado en
un cultivo, por ejemplo, el cribado patatas de siembra para patógenos viroides, virales, bacterianas y
fúngicas, ELISA carece de la flexibilidad y compatibilidad que es inherente a algunos métodos moleculares.
métodos basados ​en ácidos nucleicos permiten varios ensayos a realizar sobre una preparación de ácido
Hladky, 2010; Papayiannis et al., 2011; Panno et al., 2012 ). Así, mientras ELISA es todavía un método muy
madre, el saneamiento y cuarentena, especialmente cuando específica virus necesidad de ser detectado
de forma fiable, los métodos basados ​en ácidos nucleicos son más genéricas y proporcionan una
plataforma que es más flexible para hacer frente a una gama más amplia de preguntas de diagnóstico.
Tras el despliegue desarrollo y la escala amplia de ELISA, el desarrollo del método nuevo se ha
centrado en la detección de ARN viral y ADN. Mientras que los métodos basados ​en la hibridación
punto de ácidos nucleicos (NASH) han sido muy utilizados para algunos virus y particularmente para
los viroides, la técnica que ha sido explotado con mayor éxito se basa en la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR). Los métodos de PCR para la detección de virus eran fi publicado primera en la
década de 1990 ( Vunsh et al., 1990 ) Y, teóricamente, que ofrece los niveles exquisitos de usuario de
especificidad y sensibilidad. Mientras que el primero puede lograrse a menudo, este último es con
frecuencia debajo de las expectativas, especialmente para el ensayo basado en la PCR convencional
(utilizando electroforesis en gel para la resolución de los resultados). Aunque se han publicado
muchos ensayos de PCR para la detección de virus de plantas, muy pocos métodos convencionales
de PCR se han utilizado de forma rutinaria en los laboratorios de diagnóstico, debido a una serie de
cuestiones prácticas, pero, en particular, problemas de contaminación post-PCR. Efectivamente la
sensibilidad que atrajo a muchos usuarios a PCR se convirtió en su mayor problema como las
pequeñas cantidades de ADN liberados en el medio ambiente de laboratorio, tras la apertura de los
tubos después de ciclos térmicos eventualmente podría ser detectado por el método de PCR,
resultando en problemas recurrentes con resultados falsos positivos .
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PCR (Q-PCR). Inicialmente desarrollado para fi cación cuanti en la expresión génica estudios, en el que el
tiempo en el cual ampli fi cación se observa a ocurrir es relacionada con la inversa de registro de la
cantidad de ser objetivo amplificado, este método fue adoptado rápidamente para diagnóstico (aplicaciones
Mumford et al., 2000 ). Una razón clave es que el fluorescente señal era generada dentro del tubo de PCR
cerrado y podría ser detectado ya sea durante amplificación fi ( 'en tiempo real') o en el final de la misma (‘end términos generales, el reto de isotérmica catión amplificador por lo tanto es permitir imprimación de
punto') sin abrir el tubo; sellando efectivamente en el riesgo de contaminación. Me gusta convencional
recocido requeridos para PCR. Hay una serie de enfoques para la generación de sitios de unión de
PCR muchos diferentes encarnaciones de PCR en tiempo real se han desarrollado y evaluado para virus pruebas,
predominantemente las principales diferencias eran de alrededor el diferentes formas de señal podrían
ser generados dentro de la reacción a medida que progresado. Estos eran o métodos basados ​en sonda
(por ejemplo, TaqMan TM, de baliza molecular, sondas Scorpion) o no la sonda métodos (p.ej, verde SYBR,
cebadores lux). Posiblemente el más ampliamente utilizado en virus diagnóstico ha sido TaqMan TM Las
sondas basadas en la 5 ' -3 ' exonucleasa la actividad de Taq polimerasa y de Resonancia Fluorescente Energíasecundaria que contiene los sitios de una sola hebra de unión a cebador. Mientras que los métodos
Transferencia de actividad (FRET) de pares de colorantes fluorescentes denominan reporteros y extintores.
métodos basados ​en sondas tienen la adicional ventaja de que tres (o más) oligonucleótidos
ndependientes necesitan de obligar a la diana dentro de la reacción para generar la señal la reducción
de la probabilidad de señal fi c no especificada. En química no sonda tales como SYBR verde, la fusión de
pro fi les menudo se utiliza para discriminar cebador artefactos de reales ampli fi cación, lo que añade
pasos para la prueba siendo realizado, que no son necesarios en los ensayos basados ​en basada en
pruebas las químicas. Del métodos basados ​en sonda exploraron, TaqMan TM sondas parecen ser los más
establecidos, aunque esto es probablemente debido a que pueden ser uno de los primeros enfoques adoptó
y por lo tanto la técnica más familiar usado, en lugar que poseer cualquier específica ventajas de
rendimiento sobre otra Investigacion Los sistemas. PCR en tiempo real técnicas para la detección de virus
se inicialmente desarrollado para aplicaciones que requieren mayor sensibilidad ( Boonham et al., 2009 ) O
donde los métodos de anticuerpos podría No ser usado ( Boonham et al., 2004 ). Sin embargo, más
recientemente, en tiempo real PCR métodos han sido desarrollado para objetivos donde ELISA podría ser
utilizado basado puramente en el rendimiento (es decir, la sensibilidad / especificidad) y criterios
necesarios para las tres principales razones prácticas. Primeramente, PCR en tiempo real es más rápido
para establecer comparación con el desarrollo anticuerpos para recién virus descritos. En segundo lugar,
a técnica es de más genérico aplicabilidad de ELISA, especialmente en la rutina laboratorios buscando
para llevar a cabo pruebas para bacterias, hongos y potencialmente invertebrado identi fi cación, donde
os métodos de ELISA son menos bien establecido. Por último, mientras que el coste por prueba de
ELISA es menos de PCR en tiempo real (por prueba los costes de reactivos son típicamente 50% más
alto que para ELISA), la costo de puesta a punto de hacer un anticuerpo es considerablemente más, por lo
tanto el coste a largo plazo beneficio tiene que ser significantes para hacer el generación de un nuevo
anticuerpo una propuesta viable. Así, parece ese PCR en tiempo real está aquí para quedarse; permite de
alto rendimiento las pruebas en una relativamente bajo por muestra coste, velocidad inigualable para
establecer una nuevo ensayo y su éxito ha hecho bajar el costo de capital de la equipos a menos de una
décima parte de atrás que los años en torno a diez.
2. isotérmica ampli fi cación y campo de detección
métodos de amplificación isotérmicos comparten con PCR el concepto central de la extensión de
especí-diana fi c cebadores por una ADN polimerasa (o en algunos casos, una ARN polimerasa). En
unión, de manera que la amplificación fi puede ocurrir sin los ciclos repetidos de desnaturalización y
cadena sencilla del cebador sin ciclos térmicos, incluyendo métodos basados ​en: métodos no
térmicos de desnaturalización del molde; la transcripción de ARN; desplazamiento de cadena
alrededor de una plantilla circular; nicking o degradación parcial de los productos de extensión de
cebadores para permitir la extensión o rondas adicionales de cebado; y la formación de estructura
isotérmicos (e. Leona et al., 1997 ), Se ha renovado el interés en la investigación de estos métodos
para aplicaciones en laboratorios o con pocos recursos para las pruebas de campo in-. Dado que
estos métodos se basan en la amplificación fi a una temperatura única, en lugar de los ciclos
térmicos, que pueden realizarse utilizando menos equipo mucho más simple, que demandan
potencia.
2.1. métodos isotérmicos establecidos
Un enfoque conceptualmente simple para lograr isotérmica catión amplificador de ADN es la de
separar las hebras de la plantilla de doble hebra por medios no térmicos. Helicase dependiente de
amplificación fi (HDA) ( Vincent et al., 2004 ) Y recombinasa polimerasa Ampli fi cación (RPA) ( Piepenburg
et al., 2006 ) Son dos ejemplos de este enfoque. HDA utiliza una helicasa para separar las hebras de
ADN de doble cadena que permite la unión y la extensión por la ADN polimerasa del cebador a una
temperatura constante de aproximadamente 65 ◦ C. Los tiempos de reacción para HDA están
generalmente en el rango de 30-90 min. Este método sostiene ampli fi cación de productos
relativamente cortos de aproximadamente 70-120 pb. HDA se puede realizar a una temperatura
única, pero la inclusión de una breve incubación a 95 ◦ C antes de la adición de las enzimas HDA se
ha demostrado que aumentar la sensibilidad.

RPA utiliza una recombinasa que forma un complejo con los cebadores para iniciar catión
amplificador sin desnaturalización térmica. RPA no requiere una etapa de desnaturalización inicial
pero la sensibilidad se incrementa si la reacción se agita después de 5 min de incubación. La reacción
se incuba a una temperatura de reacción baja (entre 37 y 42 ◦ C) que puede ser fácilmente sostenido
por un instrumento de baja potencia. Sin embargo, el uso de una baja temperatura de reacción puede
dar lugar a la generación de más no específica ampli fi artefactos de cationes que se observa
típicamente en los métodos de amplificación isotérmicas, que utilizan temperaturas de reacción más
altas. La principal ventaja de RPA es sus cortos tiempos de reacción, que son típicamente <30 min.

los resto de esta revisión se centrará en algunos de los nuevos métodos que están siendo desarrollado NASBA es un método para isotérmica ampli fi cación de ARN basado en la transcripción ( Compton,
ahora y que puede establecerse en los próximos años. Esto se basará en las lecciones aprendidas 1991 ). A modi fi ed cebador se utiliza para incorporar la secuencia del promotor de la ARN
durante el desarrollo y subsecuente establecimiento de ELISA y PCR en tiempo real como los métodos polimerasa de T7 en un ADN de doble cadena intermedia, funcionalizar el promotor y que resulta en
de diagnóstico de rutina de éxito, la aceptación ese el problemas que tienen esas tecnologías - la transcripción de una monocatenario producto de ARN a una temperatura de reacción de 41 ◦ C.
velocidad, sensibilidad, especificidad, robustez y coste eficacia - son tan correspondiente a la subsecuente NASBA se ha usado para la detección de un número de patógenos de plantas en conjunción con
éxito de estos nuevos métodos, ya que estaban en el anterior décadas. Por tanto, si tenemos en cuenta sondas de baliza molecular, en un formato denominado a veces AmpliDet ( Klerks et al., 2001 ). Este
el gran reto de Moviente diagnóstico de distancia de los laboratorios de referencia centralizados en el formato, en el que la fluorescencia se monitoriza en tiempo real para detectar la hibridación de la
campo o más específicamente al punto de decisión haciendo, entonces debemos considerar el mismo sonda con el amplicón monocatenario, es un sistema de tubo cerrado y permite la cuantificación de la
rendimiento y calidad garantía características como lo hacemos para métodos basados ​en laboratorio. Estassecuencia diana, pero requiere el uso de un instrumento con fluorescencia en tiempo real el
son puntos considerado y discutido en la siguiente sección. seguimiento de la capacidad. NASBA requiere la desnaturalización de la plantilla para permitir la
hibridación del cebador antes de la adición de las enzimas no termoestables,
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haciendo reacción configurar un proceso de dos etapas. NASBA se considera que es una muy sensible método
de los ensayos de PCR en tiempo real comparables y típicamente superior a la de la PCR convencional ( Tomlinson
de detección pero con reacción relativamente largo veces (Típicamente 90 min).
Ambos NASBA y HDA realizan de manera óptima con una de dos pasos térmica per fi l y como
tales no son verdaderamente isotérmica. RPA requiere, además, la tubos sean agitado manualmente,
después de varios minutos de ampli fi cación, a lograr óptimo actuación. Cada una de estas
características hace que estos químicas menos adecuados para su uso en el lugar, lo que aumenta el
tiempo y complejidad de cación fi cador.
2.2. Otro isotérmica métodos de amplificación fi
Dos más lejos isotérmica métodos de amplificación, que han sido aplicada a la detección de
patógenos de las plantas, son círculo rodante ampli fi cación (RCA) y Isotérmica y quimérico cebador-iniciado
Ampli fi cación de Los ácidos nucleicos (ICAN). En su formato más simple, la RCA se utiliza para amplificar
ácidos nucleicos circulares que utilizan el desplazamiento de la hebra actividad de ADN Phi29 polimerasa.
RCA seguido por fragmento de restricción longitud polimorfismo (RFLP) se ha utilizado para el
diagnóstico de geminivirus que tienen pequeños monocatenario circular DNA genomas ( Haible et al.,
2006 ). Los métodos más complejos basados ​en RCA hacer uso de sondas de candado circularizable ( Banér
et Alabama., 1998 ) a proporcionar plantillas para cación fi cador. usos ICAN quiméricos (5 '- ADN-ARN-3 ') cebadores
con una termófila RNasa H que introduce una mella en la unión entre las porciones de ADN y de ARN
de la cebadores, y un ADN polimerasa con desplazamiento de cadena actividad cuales continúa extensión
del sitio de mella ( Mukai et Alabama., 2007 ).
2.3. mediada Loop isotérmica catión amplificador (LAMP)
los isotérmica métodos de amplificación discutido hasta ahora tienen cada uno varios ventajas. Sin
embargo, en el contexto de la elaboración de métodos para en el lugar de uso, factores tales como
tiempo de reacción (> 1 h en el caso de HDA, NASBA, y ICAN) y la complejidad del diseño del ensayo
(RPA, RCA para objetivos no circulares) son potencial desventajas. Una alternativa isotérmica enfoque
de amplificación es cebadores de diseño tales que el productos de amplificación contienen de unión
único cebador Stranded sitios. LAMP es el más comúnmente utilizado método para tomar esta Acercarse,
utilizando tres pares de cebadores (interna, externa y lazo cebadores), a generar una ampli producto fi
cación que contiene monocatenario regiones de bucle a la que los cebadores pueden unirse sin modelo
desnaturalización ( Notomi et al., 2000 ) A una temperatura de reacción de alrededor de 65 ◦ C. Los
cebadores internos introducen selfcomplementarity en el ampli producto catión fi, causando bucles
para formar, mientras extensión de los cebadores externos provoca el desplazamiento de el extensión productos
simple vista pero sólo cuando las concentraciones objetivo son altos y esto tiende a ser subjetiva, no
de los cebadores internos. Los productos de la lámpara reacciones consiste en orientados
alternativamente repeticiones de la secuencia diana. los Además de los cebadores bucle acelera
catión amplificador cebando en el bucle regiones que son de la orientación incorrecta para el interno cebadores
contaminación arrastre de que los métodos que requieren tubos de reacción que se abran. Un
a encuadernar. cebadores bucle aumentan la sensibilidad y reducir los tiempos de reacción, y se
requieren para un rendimiento aceptable de algunos ensayos. Sin embargo, a acomodan cebadores
bucle requiere una más región de adecuado secuencia, que tal diseño de dos cebadores de bucle puede
no ser posibles, y muchos ensayos han sido reportados en el literatura, que lograr rendimiento
aceptable sin bucle cebadores, o con sólo un cebador de bucle. A descrito recientemente fi
modificación de la reacción LAMP incorpora una o más 'tallo' cebadores, que se unen a la porción
central de doble hebra de cada repetición de la ampli región ed fi, para mejorar aún más el
rendimiento y ensayo aumentar las opciones de diseño de cebadores ( Gandelman et al., 2011 ). Como LÁMPARA
usando reactivos, que no lo hacen de inhibición de la amplificación fi, lo que les permite ser utilizado
usos al menos seis regiones de unión del cebador, es posible el diseño ensayos con alto especificidad
mediante el posicionamiento de cada cebador en el sitio de desajustes entre las especies objetivo y no
objetivo. LÁMPARA Los ensayos han sido reportado con la sensibilidad que se aproxima
23
et al., 2007 ). LAMPARA no requiere desnaturalización inicial de plantilla y, más recientemente
desarrollado hebra desplazando ADN polimerasas visualización más rápida cinética de la reacción, de
manera que los tiempos de reacción del LAMP puede ser reducida a <30 min. LAMP, en común con otros
métodos isotérmicos de amplificación de ADN, puede ser modi fi para la detección de dianas de ARN
mediante la adición de transcriptasa inversa para la reacción. En RT-LAMP, la transcripción inversa y la
amplificación fi de cDNA proceden simultáneamente en una única temperatura de alrededor de 65 ◦ C.
Significativamente para las pruebas en el lugar, LAMP ha informado a ser tolerante de algunas sustancias
que son inhibidoras de PCR ( Kaneko et al., 2007 ), Permitiendo potencialmente Lámpara que se utiliza en
conjunción con simpli fi ed métodos de extracción de ácido nucleico.
En el contexto específico de las pruebas in situ de patógenos de plantas, algunas de las características de
ensayo son particularmente deseables, incluyendo la velocidad de la amplificación fi, simplicidad de trabajo flujo
(es decir, que requiere pocas manipulaciones) y la tolerancia de los inhibidores, todos los cuales se exhiben por
la química LAMP.
2.4. plataformas de detección
Una prueba basada en el ácido nucleico para un objetivo particular comprende no sólo el
mecanismo para el ácido nucleico de cationes amplificador, pero también un medio de determinar si
ha ocurrido la amplificación fi. Algunos métodos de detección son ampliamente aplicables y pueden
utilizarse para detectar los productos de diversos métodos de amplificación incluyendo LAMP. El ef
extremadamente alta fi ciencia de los resultados de LAMP en la generación de su fi cientemente
grandes cantidades de producto de amplificación para permitir el uso de métodos de detección
relativamente insensible, que no pueden ser utilizados con menos e fi cientes amplificador químicas
de cationes. Un método común y ampliamente aplicable para la detección de productos de
amplificación es la electroforesis en gel; sin embargo, esto es demasiado engorroso y consume
mucho tiempo para su uso fuera del laboratorio y en común con la PCR convencional,
2.5. detección libre de dispositivos
Una consecuencia de la alta ampli fi cación e fi ciencia de LAMP es que la generación de
pirofosfato de magnesio (un subproducto de la polimerización de ADN) provoca un aumento
mensurable en la turbidez medida que avanza la reacción. Esta turbidez puede ser observado a
dar resultados concluyentes para todos los ensayos ( Wastling et al., 2010 ). Dado que se requiere
ninguna manipulación fi cación post-amplificador, este método presenta un menor riesgo de
número de reacciones de cambio de color se puede utilizar para la detección de punto final,
incluyendo la adición de colorantes intercalantes tales como SYBR Green o PicoGreen en su fi
concentraciones suficientemente altas para producir un cambio de color visible, o la adición de
polímeros fluorescentes sondas y catiónicos. Sin embargo, en las concentraciones necesarias estos
reactivos son inhibitorios para LAMP, así se deben añadir al final de la reacción, de nuevo requiriendo
los tubos a ser abierto y creando así un alto riesgo de contaminación al aplazamiento y de resultados
falsos positivos en las pruebas posteriores. reacciones de cambio de color alternativo se han descrito
en un formato de tubo cerrado. Estos incluyen calceína más MnCl 2, lo que provoca un cambio de color
naranja-verde color, y azul naftol hidroxi (HNB), que resulta en un cambio de color del violeta al azul.
El cambio de color con calceína y MnCl 2 se ha informado que ser culto fi más dif de interpretar que
otros métodos y se ve mejor bajo iluminación ultravioleta. Mientras que el cambio colorimétrico
observado con HNB ha informado a ser fácilmente interpretables por los usuarios finales ( Wastling et
al., 2010 ), el
24 N. Boonham et al. / Virus de Investigación 186 (2014) 20-31

cambio puede ser sutil y la claridad de los resultados puede ser algo ensayo-dependiente ( Tomlinson muy grandes cantidades de ADN o ninguno en absoluto, a diferencia de PCR, donde la cantidad de fi ADN ampli ed comienza a

et al., 2010a ). Para evitar este problema de una interpretación enfoque alternativo ha sido desarrollado disminuir a muy bajas títulos de objetivo. Por supuesto, las ventajas significativas de amplificación isotérmica fi cación son los más

por incorporando ligandos en productos de amplificación, de tal manera que los productos se pueden detectado
propensos a realizarse en la transferencia de los diagnósticos de laboratorios de referencia bien equipados en laboratorios dotados de

en un inmunoensayo lateral fl ow dispositivo (LFD) a El final de reacción ( James et al., 2010; recursos mal o incluso fuera en el campo; la realización de diagnósticos en el punto de toma de decisiones. Los métodos son

Tomlinson et al., 2010b ). los ligandos pueden ser incorporada durante catión amplificador utilizando la típicamente robusto, requieren simple o incluso la extracción de ácido no nucleico que se ha realizado (aparte de interrumpir el tejido a

etiqueta nucleótidos o cebadores, o por medio de sondas añadidas al final de el reacción. amplicón detecciónensayar en un tampón adecuado) y se puede realizar en un equipo relativamente simple. Los métodos tienen el potencial para
usando este método tiene el inconveniente de que requiere típicamente tubos de reacción que ser proporcionar un rendimiento (sensibilidad y especificidad) similar a PCR en tiempo real, sin embargo, el uso de equipo rudimentario

abierto para permitir que el ampli fi ed producto a ser aplicado a la LFD. Los dispositivos son disponible cuales
(por ejemplo, calentadores de bloque caliente simples) y, potencialmente, por parte de especialistas no diagnósticos (es decir, aquellos

ncorporar detección LFD en un casete cerrado ( Goldmeyer et al., 2008 ), pero el por dispositivo costo con habilidades básicas de laboratorio, en lugar de entrenado biólogos moleculares). Existen otros métodos para fi pruebas de campo

es más alto que el uso de LFD en o bien una simple formato de tira reactiva o carcasa abierta de los virus, las pruebas de inmuno-cromatográfico base serológica-a saber, (es decir, LFD). Estos dispositivos son simples y de bajo

convencional. Todo estas la presentación de informes métodos no se requiere un medio de incubación costo, pero existen las mismas paralelas entre los métodos isotérmicos y LFD como entre ELISA y PCR en tiempo real. Es decir, el

de la reacción a una temperatura de 65 ◦ C (tal como un bloque de calor o baño de agua) y como ninguno coste asociado a la generación de nuevos reactivos serológicos para problemas de enfermedades emergentes, o en situaciones donde

es el resultado completamente -Equipo libre. los métodos serológicos (LFD o ELISA) no son lo suficientemente sensibles como para detectar el agente patógeno causante de la

enfermedad. Estos dispositivos son simples y de bajo costo, pero existen las mismas paralelas entre los métodos isotérmicos y LFD

como entre ELISA y PCR en tiempo real. Es decir, el coste asociado a la generación de nuevos reactivos serológicos para problemas

de enfermedades emergentes, o en situaciones donde los métodos serológicos (LFD o ELISA) no son lo suficientemente sensibles

como para detectar el agente patógeno causante de la enfermedad. Estos dispositivos son simples y de bajo costo, pero existen las

mismas paralelas entre los métodos isotérmicos y LFD como entre ELISA y PCR en tiempo real. Es decir, el coste asociado a la

2.6. Detección dispositivos generación de nuevos reactivos serológicos para problemas de enfermedades emergentes, o en situaciones donde los métodos

serológicos (LFD o ELISA) no son lo suficientemente sensibles como para detectar el agente patógeno causante de la enfermedad.

Varios diferente enfoques se pueden utilizar para controlar las reacciones en tiempo real. La
primera consiste en incorporar fluorescente FL, colorantes intercalantes o sondas en el mezcla de
reacción y el control de la reacción usando una fluorescente lector. El segundo es medir continuamente el
turbiedad generada por el precipitación de pirofosfato de magnesio. Una tercera es por el incorporación
3. Métodos de Multiplex
de fi termoestable y re fl luciferasa en el de reacción, permitiendo la generación de pirofosfato para ser medido
por un aumento de bioluminiscencia en una tecnología referido como el BART (Ensayo bioluminiscente
Hasta ahora, en esta revisión, el foco ha estado en ensayos simple, capaz de detectar de forma
en tiempo real) ( Gandelman et al., 2010 ). Estas enfoques basados ​en dispositivos de detección tienen
fiable un solo objetivo en cada prueba individual. Sin embargo, en muchos escenarios de ensayo de
algunos bastante genérica ventajas sobre el enfoques sin dispositivo descrito anteriormente, a pesar
muestras para múltiples virales o incluso de otros patógenos que se requiere. Como se discutió
de sistema de información utilizado (es decir, luminiscencia, fluorescencia o turbiedad). En primer
previamente, la indexación de las patatas de siembra es un ejemplo en la detección de múltiples
lugar, un dispositivo electrónico puede ser utilizado para ambos supervisar la de reacción, así como
patógenos se lleva a cabo de forma rutinaria. En estos casos, la capacidad para realizar pruebas multiplex
Incubar la reacción a una constante temperatura. Así ampli fi cación y detección se llevan a cabo por
(es decir, la capacidad de detectar más de un patógeno en un único ensayo) ofrece enormes bene fi costo
una soltero instrumento en tiempo real, sin ningún tipo de fi cación postampli manipulaciones. En
cios, especialmente en una situación en la que un gran número de muestras necesitan ser probados. En
segundo lugar, la utilización de un dispositivo electrónico, sin embargo simple, puede permitir conectividad
la siguiente sección se describen y discuten el desarrollo de tales métodos; centrándose en los últimos
a Internet, lo que permite automatizado de almacenamiento y transferencia de datos, y permitir
avances que ofrecen el potencial de alto rendimiento de la prueba.
garantizado datos integridad, que es importante para los sistemas de garantía de calidad. los ventajas
de LAMP se realiza usando un dispositivo se resume en la Genie II instrumento (Optigene, Horsham,
Surrey, Reino Unido). Ensayos a realizar en este tipo de plataforma también son rentables, con una estimado
coste de componentes de alrededor de $ USD 2-5 para una sola prueba.

3.1. métodos Multiplex: Basado serológica-

Un método para expandir la capacidad de detección inmunológica multiplex de ELISA es el ensayo

Tiempo real fluorescencia el seguimiento de las reacciones de LAMP, utilizando intercalante colorantes producido por Luminex (Austin, Texas, EE.UU.). Las perlas de esta matriz tienen un diámetro de 6,5 m, y
tales como SYBR Green, ofrecen más ventajas sobre el detección de luminiscencia o turbidez. Estos
métodos permiten más lejos El análisis del producto en términos de la temperatura a la cual el ampli fi
ed masas fundidas de ADN o recocidos. LAMP productos contienen estructuras de diferentes
ongitudes que contiene repeticiones concatenadas de el objetivo secuencia que fusión / recocido a una
fi c temperatura específica, determinada por la longitud y el contenido de G / C de la diana. Después ampli
fi cación, reacciones pueden ser sometidos a una fusión gradual o etapa de recocido con fluorescencia monitoreo,
péptidos, anticuerpos, polisacáridos, lípidos o oligonucleótidos ( Joos, 2004 ). Como un resultado
con el fin de discriminar específica productos de amplificación de inesperado inespecífico artefactos, y
por lo tanto proporcionando adicional con fi anza en el resultado obtenido.
En términos de aplicaciones, química isotérmica podría ser utilizado en el de laboratorio y algunas
de las ventajas de los métodos tal como una lámpara mayo probar beneficioso para los usuarios finales
a base de laboratorio. Por ejemplo tolerancia de inhibir compuestos pueden permitir el uso de
extracción simple técnicas o puede ser beneficioso cuando el ácido nucleico ha sido extraída de una matriz
fi culto dif, resultando en arrastre de inhibidor compuestos. Además la cinética de reacción de la
ámpara de tienden a dar resultados que son fáciles de interpretar; ya sea de amplificación
inmunológico microesfera cordón universal (MIA) ( Joos et al., 2000; Vignali, 2000 ). Esta matriz basado
en perlas permite la detección simultánea de un gran número de patógenos (hasta cinco cien) y es
comparable a los métodos desarrollados para ELISA. MIA se basa en lo universal bead-array (xMAP)
se tiñen internamente con dos uorochromes fl. Actualmente hay más de quinientas cuentas de
diferentes combinaciones de colores disponibles. Estas perlas son paramagnéticos y pueden ser
atraídos por un imán. Esto permite que los procedimientos de lavado muy rigurosas, lo que puede
significativamente reducir los problemas de fondo en la detección de patógenos de plantas en matrices
de culto complejas o dif fi. Los granos se pueden acoplar covalentemente, ya sea con proteínas,
diferente virus-específico anticuerpos se pueden acoplar a diferentes cuentas internamente teñidos (
'direcciones de talón') y estos diversos granos entonces se pueden combinar para crear personalizados
'conjuntos de microesferas' para la detección de especí fi co combinaciones de virus de plantas. El
procedimiento de ensayo inmunológico basado en perlas es idéntica a la Sandwich doble anticuerpo
estandarizada (DAS)-ELISA y como tal se puede integrar sin problemas en los flujos de trabajo
existentes. En resumen, muestras de plantas preparados en el ELISA estándar tampón se transfieren a
una placa de 96 pocillos de microtitulación estándar y se incubaron con el conjunto de microesferas
recubierta de anticuerpo. Durante esta etapa de incubación, los virus son capturados por el
 N. Boonham et al. / Virus de Investigación 186 (2014) 20-31 25

Higo. 1. Descripción general de la La tecnología xMAP de Luminex. Las muestras se preparan y se transfirieron a una placa de 96 pocillos de microtitulación (parte superior izquierda) y una mezcla de anticuerpos conjugados con el conjuntos de microesferas se añade (medio superior). Durante

la etapa de incubación, los patógenos se unen a los anticuerpos de captura y anticuerpos secundarios a continuación, conjugado con un fluorescentes reportero, se añaden (parte superior derecha). Las muestras se miden en un analizador Luminex (izquierda inferior) y se presentan

gráficamente los resultados (inferior derecha). Si no es patógeno la actualidad no fl reportero fluorescente será detectado, dando como resultado ninguna señal (como se representa en el panel central inferior). Las muestras positivas están representados en los otros 4 paneles.

anticuerpos adjunto a perlas individuales. Después de una etapa de lavado corto, empleando magnético captura
costos, a través de reducciones significativas en mano de obra y consumibles (por ejemplo, placas y

de las perlas, las muestras son posteriormente se incubaron con el apropiarse de mezcla de reactivos).

anticuerpos secundarios, todos conjugado con el mismo reportero uorochrome FL. Después de segundo
etapa de incubación y una la posterior etapa de lavado magnético, el son muestras analizado. Durante
el análisis de las diferentes cuentas y el adjunto reportero FL uorochrome se detectan utilizando una ow
pequeña fl basado en láser citómetro o un analizador de imágenes basada en LED. En esto análisis
una pre-de fi número Ned de cuentas individuales de cada específica dirección son interrogado por el
analizador tanto por su interior color (el 'Bead-dirección') y la presencia, o ausencia, de la fl uorochrome unido
al anticuerpo secundario. La presencia de una se traduce en particular de virus en una señal positiva
para el fl uorochrome en combinación con el virus-específico del grano de direcciones (consulte Figura
1 ). Similar a una estándar DAS-ELISA la cantidad de virus presente en la muestra es correlacionado
con el nivel promedio (media) de la fluorescencia medida en el virus-específico perlas (intensidad
media de fluorescente, MFI).
En comparación con estándar La tecnología DAS-ELISA de este procedimiento no sólo permite la detección
detección, limita el número de ensayos que pueden ser detectados con precisión en un solo tubo. Mumford
serológica de múltiples analitos en una solo pocillo de una 96-placa, pero también es mucho más
rápido. Todo el procedimiento generalmente no toma más de 3-4 h, incluyendo la muestra la preparación
(por protocolos de contraste típicos DAS-ELISA toman 1-2 dias). los mayor medidas de ahorro de tiempo
incluyen el uso de prede fi nido talón mezclas, estable durante un período prolongado de tiempo, lo que
suprime la necesidad de pre-recubrimiento de placas de ELISA y mejorado fl uid-dinámicas lo que
permite tiempos de incubación más cortos. Cuando se compara con ELISA estándar a prueba, una
ventaja adicional de Luminex xMAP La tecnología es límites de detección mejorados y una dinámica
mucho mayor rango ( Rao et al., 2004 ) y también un ahorro considerable en
En general, esta tecnología basada en perlas ya ha demostrado su valor para una verdadera
detección múltiple, que permite la detección de hasta varios cientos de analitos en una sola prueba, a
través de una serie de campos, incluyendo diagnóstico humano ( Kellar, 2003 ), Microbiología de los
alimentos ( Dunbar et al., 2003 ) Y la detección de patógenos de plantas ( Bergervoet et al., 2008 ).
3.2. métodos Multiplex: ácido nucleico a base de
Como se discutió anteriormente multiplexación tecnologías que permiten la detección simultánea
de múltiples virus en un único ensayo, puede reducir en gran medida el tiempo, coste y mano de obra
asociados a las tecnologías de detección convencionales sola reacción (simplex). Un enfoque similar
se puede utilizar con técnicas moleculares, para aprovechar la flexibilidad logrado mediante la
detección de ácido nucleico, mientras que la ampliación de la capacidad de multiplexación mucho
más allá de la que puede conseguirse usando PCR en tiempo real. En términos de multiplexación,
esta tecnología tiene limitaciones técnicas, mediante el cual distinguir con precisión las diferentes
señales fluorescentes resultantes de múltiples colorantes indicadores y el extintor utilizados para la
et al., 2006 ). La próxima generación de TaqMan TM máquinas pueden elevar este nivel de
multiplexación pero esto es todavía un largo camino fuera de la verdadera detección multiplex de 10
o 20 virus en una sola prueba. gama de plataformas basadas en hibridación (por ejemplo,
microarrays) existen y ofrecen la posibilidad de ampliar los límites de las pruebas múltiplex en
cientos, si no miles de objetivos
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( Boonham et al., 2007 ). Sin embargo estas plataformas en que no se aplica de alto rendimiento a menos dos señales positivas. Un ensayo multiplex xTAG desarrollado recientemente para los nueve
prueba pero de hecho más adecuado para la detección de nuevo y raro (virus Boonham et al., 2007 ). pospiviroids conocidos ( tabla 1 ; Van Brunschot et al., Manuscrito en preparación) demostró la utilidad
Esto se discute más en Sección 5 de esta revisión. de este enfoque.

Uno plataforma que ofrece un muy alto grado de múltiplex nucleico ácido detección es el Luminex MagPlex-TAG
Si bien los métodos de multiplexado ofrecen bene fi cios reales en situaciones donde el cribado de
sistema de talón. Esta La tecnología tiene demostrado su valor para la detección multiplexada de patógenos alto rendimiento para múltiples virus u otros agentes patógenos, todavía se limita a detectar blancos ''
en clínico (ajustes Mahony et al., 2007; Lin et al., 2011; Liu et al., 2011 ) y el detección multiplex de los conocidos. En común con ELISA, PCR en tiempo real y otros métodos específicos, utilizando específico
virus ( foord et Alabama., 2013 ). Esta sistema incorpora los mismos 6,5 m carboxilado, superparamagnéticosondas, existe un límite para el grado de variación de patógenos que pueden ser detectados y por lo tanto
perlas de poliestireno como el sistema xMAP (discutidos encima). Estas cuentas también están no serán detectados nuevos patógenos o cepas y, por tanto perder. Por lo tanto en diagnóstico virología
etiquetados internamente con un espectralmente distinto fluorescente colorante y cada dirección de también necesitan herramientas para el diagnóstico de estas nuevas e inusuales patógenos. Una vez más
grano distinto es pre-acoplado con un altamente específica anti-MagPlex-TAG oligonucleótido secuencia. los últimos avances en tecnología molecular pueden proporcionar la respuesta a este desafío.
Diferentes cuentas pueden ser distinguen por su espectral direcciones y, cuando combinado, hasta 150
de ácido nucleico diferente secuencia objetivos a ensayar simultáneamente en una sola reacción.

4. secuenciación de nueva generación en el diagnóstico viral

Al igual que en otros campos de la ciencia de la llegada de la próxima generación de secuenciación

los experimental aproximación del ensayo xTAG (esbozado en Figura 2 ) (NGS) tecnologías ha dado lugar a una revolución en el descubrimiento del virus y nuevas e interesantes
mplica una genérico multiplexado inverso paso de la transcriptasa-PCR, seguido por una multiplexado paso posibilidades para el diagnóstico; la aplicación de secuenciación masiva en paralelo se acerca, y análisis de
asimétrica PCR denominado Target Speci fi c Cebador Extension (TSPE). En este lineal ampli fi cación la bioinformática posteriores para las secuencias virales, lleva la promesa de la rutina, la detección genérica
paso, uno o más cebadores específico a la multiplexado producto de amplificación fi son extendido en el presencia
de virus y otros agentes patógenos por igual. De hecho, un número de enfoques se fi RST publicó en 2009
de biotina CTP. el 5 '- fin del TSPE cebador contiene una secuencia 24nt adicional, el 'antiTAG'. Tras la la aplicación de NGS para identificar diversos virus de plantas, el uso de diferentes plataformas de
TSPE reacción, los productos son luego hibridadas a la MagPlex-TAG grano mezcla (MagPlex-TAG / secuenciación y preparaciones de ácidos nucleicos como material de partida ( Adams et al., 2009; Al
anti-MagPlex-TAG hibridación). Tras una etapa de lavado corto empleando magnético la captura de la perlasRwahnih et al., 2009; Kreuze et al., 2009 ) Y muchos otros han seguido desde entonces. Mientras que
/ microesferas, una molécula indicadora fluorescente fl es Se utiliza para detectar biotina Incorporated. diferentes plataformas de secuenciación se han utilizado (principalmente Roche 454 y Illumina) que puede
El producto bead-TSPE complejos son detectado en los instrumentos Luminex de manera similar hacer una diferencia en el costo, facilidad de secuencia de montaje y identificación, las distinciones claves
como estaba descrito anteriormente para la método xMAP serológica. se encuentran en las técnicas de purificación de ácidos nucleicos empleadas.

los específico de esta ciudad método es determinado en dos niveles. por primera vez en el inicial marcha Mientras que algunos enfoques, tales como círculo rodante ampli fi cación ( Ng et al, 2011a.; Hagen
atrás paso transcriptasa PCR en los que bien la específico de la ciudad cebadores o su naturaleza et al., 2012 ) Están claramente limitados a ciertos tipos de virus (es decir, virus de ADN circular), otros
genérica determina si una virus específico es ampli ed fi o un grupo (o particular, género) es ampli ed fi. Alternativamente
son más ampliamente aplicables a cualquier tipo de virus. Varios estudios han tenido éxito simplemente
varios loci de un objetivo particular organismo puede ser ampli fi ed la generación de más amplicones mediante la secuenciación de ARNm total ( Al Rwahnih et al., 2009; Wylie y Jones, 2011; Wylie et al.,
que puede ser detectado en el subsiguientes reacciones de TSPE. El segundo nivel de especificidad proviene2012a, b, 2013 ). Sin embargo, un inconveniente de este enfoque es que, en particular con los virus con
de la utilización de múltiples cebadores de TSPE dirigidos contra varios objetivos ampli ed fi en la etapa títulos bajos, una enorme cantidad de secuencia se 'desperdiciado', ya que la mayoría secuencia será
primera. diferentes estrategias puede ser aplicado. Ya sea diferentes cebadores de TSPE se dirigen ARN huésped. Adams et al. (2009) abordado este problema mediante el uso de una planta infectada por
contra el mismo amplicón o más de un amplicón por objetivo puede ser detectado cada uno por su propia hibridación sustractiva; enriqueciendo de este modo para cualquier ARN no vegetal y limitando la
mprimación TSPE. A raíz de estas estrategias (o una combinación de ambos) significa que siempre cantidad de secuenciación requerida. A pesar de las mejoras de este tipo, la secuenciación total de
una especial y pre-de fi nido Se requiere patrón de señales de TSPE positivos para identificación de un mRNA no puede capturar de manera óptima algunos virus que carecen de las secuencias poliA terminal
virus o virus. El potencialmente alto nivel de multiplexación también se puede utilizar para mejorar la utilizado para enriquecer ARNm. Otro método utilizado frecuentemente ha sido el aislamiento dsRNA
fiabilidad de la prueba. la inclusión de una planta-específica de control interno función lata como un seguido por azar cDNA de síntesis ( Coetzee et al., 2010; Roossinck et al., 2010; Al Rwahnih et al., 2011 ).
ARN extracción control, durante el uso de ambos género-específico y virusspeci fi c marcadores en una Dado que los ARN de plantas endógenas no forman extensas estructuras de doble cadena, pero
prueba identi fi ca muestras de virus-positivas en por lo intermedios replicativos de virus de ARN de hacer, este enfoque enriquece fuertemente para nucleico
viral

tabla 1
dentificación de pospiviroids en un ensayo de xTAG multiplex. La presencia de un pospiviroid particular es confirmada por tanto un producto genérico pospiviroid TSPE (PospiUni) y un viroide-específico TSPE producto. Nad5 representa el control de
extracción de ARN incorporado en el ensayo.

Objetivo TSPE

NADS Pospi Uni PSTVd CSVd CEVd CLVd IrVd MPVd TASVd TCDVd TPMVd
√ √ √
Patata tubérculo husillo (PSTVd)
√ √ √
Chrysanthemum stunt (CSVd)
√ √ √
Agrios exocortis (CEVd)
√ √ √
columnea latente (CLVd)
√ √ √
Iresine (IrVd)
√ √ √
mexicano papita (MPVd)
√ √ √
Tomate stunt apical (TASVd)
√ √ √
Tomate enano clorótico (TCDVd)
√ √ √
Tomate Planta macho (TPMVd)
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Higo. 2. Resumen de la La tecnología Luminex xTAG. Después de una extracción total del ácido nucleico (1) una transcriptasa inversa multiplex se realiza PCR para amplificar el deseado viral objetivos (2). Después de la eliminación del exceso de cebadores un fi
Plantilla Speci c Primer Extension (TSPE) la reacción en presencia de dCTP biotinilado genera etiquetados específicos de virus fi c amplicones con un 5 '- xTAG secuencia (3). Estos xTAG se hibridan a sus específicas c perlas (4) y los productos de TSPE
detectada por fluorescente estreptavidina marcada en combinación con el fi c talón dirección específica (5).

ácidos. Sin embargo, algunos virus, tales como virus de ADN, poco producir o no ARN de doble cadena y de
nuevo pueden pasarse por alto el uso de este enfoque. En efecto Roossinck et al. (2010) en un ecogenomic
basado dsRNA enriquecimiento encuesta identi fi ed casi exclusivamente ARN virus con un sesgo particular
para los virus de ARN de doble cadena. Un enfoque alternativo para enriquecer viral secuencias en una de
manera imparcial ha sido combinar sencillo cationes purificó para enriquecer para partículas semejantes al
2009; Untiveros et al., 2010; Cuellar et al., 2011; Zhang et al., 2011; Bi et al, 2012.; Fuentes et al,
virus (VLP) seguido de ácido nucleico extracción y alta rendimiento secuenciación ( ng et Alabama., 2011a, b; Adams
et al., 2013A ). Sin embargo, es probable que todavía demasiado pronto para decir si la VLP protocolos de
purificación son verdaderamente universal, siendo su fi cientemente capaz de capturar la diversidad real de
todos planta los virus. Otra táctica que está ganando en popularidad ha sido secuencia, y montar, plantar
pequeños RNAs ( Kreuze et al., 2009 ). ARN pequeños secuenciación y ensamblaje (SRSA) golpea
ligeramente en el
sistema de defensa anti-viral eucariota natural a base de silenciamiento de ARN, que genera
pequeña 21-24 nt pequeños ARN (sRNA) moléculas correspondiente a la invasión de los virus ( Mlotshwa
et al., 2008 ) Y enriqueciendo así para las secuencias virales. El enfoque hace uso óptimo de
plataformas de secuenciación que producen grandes cantidades, pero las secuencias relativamente
cortas y se ha utilizado con éxito para identificar muchos virus de plantas diferentes ( Kreuze et al.,
2012.; Kashif et al, 2012.; Li et al, 2012.; . Loconsole et al, 2012a, b; Sela et al, 2012.; Wu et al,
2012.; De Souza et al, 2013.; Hwang et al, 2013.; Kreuze et al., 2013 ), Pero es también e fi ciente con
viroides ( Li et al, 2012.; Wu et al., 2012 ) Y los virus de invertebrados y vertebrados animales ( Isakov y
col., 2011; Ma et al., 2011; Wu et al., 2012 ), Lo que demuestra la utilidad universal de SRSA. Sin
embargo, mientras que SRSA
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tiene demostrado su pena en el identificación de nuevos y conocidos los virus de infectado organismos, la fácilmente disponible para los laboratorios de pruebas de rutina en todo el mundo y, sin duda, ha
corta longitud de poses sRNA secuencias particulares desafíos para montaje de secuencias del contribuido a la continuidad del éxito del método. De la balsa de los métodos de post-ELISA desarrollado,
genoma completo, especialmente cuando son muestras infectados con varias cepas o estrechamente NASH y PCR convencional se han usado con éxito y su adopción ha sido razonablemente generalizada.
relacionados defectuoso sub-viral moléculas están presentes. Sin embargo, PCR en tiempo real es el método a base de ácido nucleico que realmente se ha
establecido en los laboratorios de pruebas en todo el mundo. Tal vez no es de extrañar, entonces, que
A pesar de el cual muestra método de preparación se aplica, cualquier método podría sólo convertido comparte muchas de las características de ELISA, que han conducido a este amplio establecimiento.
utilizado ampliamente si es fácil de usar, relativamente rápido y no demasiado costosa. Mientras que los Como ELISA se basa en un formato estándar de la industria (de nuevo el 96 y, más recientemente, la
protocolos rápidos y fáciles tienen estado publicado para la mayoría de las técnicas fi cación muestra puri placa de 384 pocillos) en el mismo espacio de alto rendimiento de la prueba. Ha tenido buena captación
mencionados, kits comerciales sólo están disponibles para el total de ARN, ARNm y pequeña ARN fi cación genérica en muchos campos fuera del phytodiagnostics que ha impulsado la competencia entre los
puri. Ácido nucleico Pasos de la preparación antes de la secuenciación, cuales incluir pasos en serie de fabricantes de instrumentos y la reducción del precio de los reactivos, recipientes de plástico y equipos.
igaduras de adaptador y el enriquecimiento de la PCR puede ser enteramente subcontratado a Como ELISA, PCR en tiempo real que trabaja basado en un protocolo de base genérica, incluyendo las
proveedores de secuenciación o llevarse a cabo en la casa para ahorrar costes. Para hacer un uso condiciones de reacción de ciclado, que se utilizan para cada prueba, por lo que es más simple para
máximo de la siempre creciente rendimiento de NGS secuenciadores, y para reducir el por coste muestra, las establecer las pruebas para muchos objetivos utilizando el mismo método básico. Finalmente, los niveles
muestras son a menudo 'etiquetados' mediante la inclusión de un ADN corto 'código de barras' durante muestra generales de conocimientos básicos necesarios para ejecutar ELISA y PCR en tiempo real son similares;
preparación y combinado en una carrera de secuenciación. Los kits para la códigos de barras y de con los operadores que necesitan ser competentes técnicos de laboratorio en lugar de los biólogos
moleculares expertos. En los últimos años PCR en tiempo real ha comenzado incluso ser utilizado como
aumento de volumen hasta 96 muestras están disponibles, y cada muestra a continuación, puede ser de-enrevesado
después de una carrera con una conjunto muestra usando especí fi camente diseñado algoritmos un método de primera elección en comparación con ELISA, algo que sería impensable hace 10 años.
Las razones para esto son varias veces más, pero probablemente uno de los más signi fi cativa es la
computacionales. Mientras que cada uno de los pasos anteriores pueden haber sido más o menos estandarizado,
montaje y identificación de contigs virales es aún no sencillo y presenta su propio conjunto de desafíos, en previsibilidad. Mientras que la producción de anticuerpos es a menudo mucho tiempo, costoso e
particular en relación con los nuevos virus y variantes de virus y cuando incompleta secuencias son adquirido. impredecible, desarrollo de ensayos basados ​en PCR es rápido, barato y rara vez falla. Sumado a esto el
Diferentes soluciones han sido presentados específica situaciones ( Isakov y col., 2011; Li et al., 2011; ahorro por adelantado en el tiempo (y por lo tanto dinero) la diferencia de precios, tanto el equipo por
Vodovar et al., 2011; Wu et al., 2012 ) y varios paquetes de software tienen estado desarrollado para análisis prueba y para, ha acortado considerablemente. métodos Por lo tanto, si el antisuero no está disponible,
de virus humanos ( Wang et al., 2013 ). Sin embargo, ninguno de ellos presenta una solución integrada basado en la PCR, a menos que se van a probar muestras muy grandes (en tiempo real cada vez PCR)
se están convirtiendo en la primera opción para las nuevas y emergentes amenazas de virus. Donde las
abordar cada una de las diferentes cuestiones. los desarrollo de automatizado y universalmente aplicable bioinformática
tuberías para el análisis de datos de NGS especí fi camente para el descubrimiento y el diagnóstico del líneas celulares de anticuerpos monoclonales aseguran un suministro a largo plazo de reactivo y donde
lleva a cabo ELISA para un adecuado nivel de sensibilidad y especificidad, parece poco probable que se
virus sigue siendo una desafío, que debe cumplirse antes de que estas tecnologías lata formar parte de diagnóstico
viral corriente principal. cayó de la mayoría de los laboratorios de ensayo en un futuro próximo. Sin embargo, para las nuevas
amenazas de la inversión necesaria para hacer nuevos reactivos, sugiere que la PCR en tiempo real se
convertirá poco a poco los más utilizados en los laboratorios de pruebas de diagnóstico en todo el
mundo. Muchos de los nuevos métodos 'en el bloque' se han descrito en esta revisión. El tiempo dirá
cuál de estos va a establecerse en los próximos 10 años y que se renunció a la historia.

Uno particularmente interesante aplicación de virus basado en NGS identificación ha sido vector
habilitado metagenómica (VEM) donde son insectos muestreada para identificar los virus presentes en
el medio ambiente ( Ma et al., 2011; . Ng et al, 2011a, b; Rosario et al., 2012, 2013 ). Ng et al. (2011a) utilizando
un enfoque VEM de moscas blancas, eran posteriormente capaz de con fi rm un recién identi fi ed
begomovirus en Chenopodium ambrosiodes con síntomas virales, que estaba creciendo en el muestreado
eco-sistema y por lo tanto demostrar la eficacia de la técnica para la supervisión proactiva de virus de
plantas. Rosario et al. (2013) de una forma más la adaptación completa de el VEM Acercarse dirigido su
encuesta a los depredadores de insectos en la parte superior el ecosistema, dragón de moscas.
Usando este método fueron capaces de identificar nuevas Mastrevirus y alphasatellite-como genomas. Algunos de los métodos en fase de desarrollo y ofrecer evaluación capacidades únicas, por ejemplo el campo métodos de

Así insectos pueden hacer efectivamente ser utilizado como especies centinela para vigilar en prueba, tales como LFD y métodos de amplificación isotérmicas, tales como la lámpara, y los métodos de ensayo paralelas, como

particular ambientes para la presencia o introducción de nuevos virus. matrices y NGS. Campo de métodos de prueba permiten a los usuarios finales para acelerar la toma de decisiones mediante la

generación de resultados en el punto en el que se muestrea el material. El éxito y el establecimiento de estos métodos serán en gran

medida depende de varios factores, ya sea de forma independiente o, más probablemente actuando en concierto. En primer lugar, la

necesidad real de las ventajas generadas por la toma de decisiones rápida. Esto puede estar relacionado con la capacidad del usuario

para tomar esas decisiones de manera efectiva, ya que los laboratorios de ensayo a menudo proporcionan no sólo los resultados, sino

que también proporcionan asesoramiento y asume responsabilidad alguna por los resultados generados. Así, pueden llegar a ser más

establecida con personal remoto especialista, como agrónomos o inspectores fitosanitarios, que son más capaces de hacer frente a los

resultados producidos. En segundo lugar, con la velocidad y facilidad con la que los resultados se pueden lograr, hacer el métodos fi t

5. Discusión como parte de un proceso de inspección fi ef ciente o crean una distracción para el proceso de inspección. Por último, el por prueba y

la plataforma de costo puede desempeñar un papel significativo; potencialmente no de forma individual, ya que muchos LFD son más

A pesar de que tradicional métodos (en inoculaciones planta en particular anfitrionas y electrón microscopia)
baratos (por lo general $ 4-8 USD por prueba) que las pruebas de laboratorio (por lo general $ USD 10-50 por prueba dependiendo del

todavía se utilizan para el diagnóstico de virus en rutina pruebas laboratorios, la adopción mundial de tipo y volumen, el aumento de los costos de estos últimos apoyados por el valor del asesoramiento , el apoyo y la garantía de siempre),

ELISA en el 1970-80s era una avance masivo y cambió la faz de viral diagnósticos. Eso proporcionado pero en combinación con los otros factores enumerados que son más capaces de hacer frente a los resultados producidos. En

una plataforma que puede ser usado genéricamente para gama de diferentes virus con muy poco modi segundo lugar, con la velocidad y facilidad con la que los resultados se pueden lograr, hacer el métodos fi t como parte de un proceso

fi cación. Es robusto y fácil realizar; que requiere poco entrenamiento y experiencia para generar constantemente
de inspección fi ef ciente o crean una distracción para el proceso de inspección. Por último, el por prueba y la plataforma de costo

altos niveles de actuación. Se lleva a cuestas a una industria formato de la prueba estándar, a saber, la puede desempeñar un papel significativo; potencialmente no de forma individual, ya que muchos LFD son más baratos (por lo general

placa de 96 pocillos, que lleva con eso estandarizado equipo por ejemplo, pipetas, puntas, placa lectores, $ 4-8 USD por prueba) que las pruebas de laboratorio (por lo general $ USD 10-50 por prueba dependiendo del tipo y volumen, el

etc .; que son todos formateada a la misma huella genérico. Esto tiene ayudado a bajar los costos de aumento de los costos de estos últimos apoyados por el valor del asesoramiento , el apoyo y la garantía de siempre), pero en

materiales y hacer combinación con los otros factores enumerados que son más capaces de hacer frente a los resultados producidos. En segundo lugar,

con la velocidad y facilidad con la que los resultados se pueden lograr, hacer el métodos fi t como parte de un proceso de inspección fi

ef ciente o crean una distracción para el proceso de inspección. Por último, el por prueba y la plataforma de costo puede desempeñar

un papel significativo; potencialmente no de forma individual, ya que muchos LFD son más baratos (por lo general $ 4-8 USD por prueba) que las pruebas de laboratorio (por lo general $
 N. Boonham et al. / Virus de Investigación 186 (2014) 20-31 29

voluntad por encima se combinan para determinar establecimiento de los métodos. Por supuesto, la clave factorresolución de una propuesta realista en el laboratorio de rutina ( . Monger et al, 2010a, b; . Adams et
es que este enfoque es un cambio significativo desde el norma y puede tomar algún tiempo para que la al, 2013a, b; Harju et al., 2012 ), Con el rápido desarrollo y despliegue de un rendimiento de alta
técnica de detección, tal como PCR en tiempo real, como una continuación de ( Adams et al., 2012 ).
confianza de la fin de usuario para la construcción y la madurez de los laboratorios de ensayo de crecer, aceptando
que algunas muestras ya no se enviarán al laboratorio, pero que continuarán proporcionando un papel Dado que la capacidad de las muestras múltiplex en las plataformas de secuenciación es muy alta,
de apoyo, donde el la velocidad de las pruebas de campo proporciona una ventaja significativa. ya que el rendimiento de las plataformas se hace más grande que hay una posibilidad muy real de
que, en el término medio, el coste de la muestra por de NGS se convertirá asequible en las
situaciones de diagnóstico de rutina, para las muestras donde existe la necesidad de prueba para
múltiples objetivos; eclipsando eficazmente algunas de las plataformas de multiplexación tal como
los paralelas o métodos de ensayo multiplex (arrays, Luminex y NGS) parece que converger considerablemente
en el rendimiento cuando se mira en el medio y largo plazo, sin embargo, están actualmente siendo matrices. A más largo plazo se puede prever que un día los precios bajarán hasta un punto en que
separada puramente en precio. Algunos de los factores que harán las pruebas en paralelo métodos éxito proporciona un NGS resultado para una muestra será más bajo que el precio de una sola prueba de
en el corto plazo son la necesidad de proporcionar una trabajo flujo como simple como prueba simple (por ELISA o PCR. Incluso en los costos actuales, mientras que un solo NGS corren podría costar hasta $
ejemplo, usando ELISA o en tiempo real PCR) pero proporcionar ahorro de costes signi fi cativo más 8000 USD (incluyendo todos los reactivos, preparación de muestras y el tiempo del personal), la
pruebas simplex siendo realizado lado a lado. Esta ventaja en el precio por lo general viene con el escala enorme capacidad de secuenciación disponibles podría permitir hasta 24 muestras a combinar, 350.
de multiplexación logra, es decir, mayor es la multiplexación se requiere la más barato el costo por objetivo En un contexto diagnóstico, donde típicamente muestras se someten a múltiple, paralela ELISA, PCR
se vuelve. Esto probablemente también proporciona Interacción con la simplicidad: cuanto mayor es el u otras pruebas, este costo es muy comparable. No sólo eso, sino que el método será
costo El ahorro, mayor será la probabilidad de un laboratorio de rutina es invertir en una mayor complejo método.completamente genérico ( 'no específica'), que no requiere objetivo especí fi co reactivos y será
Mientras que significativo aparece en la multiplexación superficie a una hacia adelante paso obvio se refiere capaz de detectar cualquier virus presente en la muestra, ya sea de esperar o no (por ejemplo, lo que
a rendimiento, significantes aplicaciones para pesadamente pruebas multiplexados (dicen por encima de demuestra el papel de los nuevos virus en la etiología de la enfermedad). Por supuesto que la
10 blancos) no lo hacen abundan en el laboratorio de rutina. De este modo se establece simples flujos de tecnología llega a este punto, que va a generar sus propios desafíos. Con el fin de convertir esta
trabajo (Potencialmente como los logrados con el grano arrays) volverse significativo con el fin de lograr el visión del futuro en una realidad habrá la necesidad absoluta para caracterizar las comunidades
ahorro de costo modesto asociado con bajos niveles de multiplexar (1-10 objetivos). virales naturales que existen en plantas sanas y ser capaz de separar estos de la presencia de virus
que causan enfermedades. En última instancia los postulados de Koch son todavía muy pertinente a
este respecto.

Muy muy matriz multiplexada se han desarrollado técnicas (por ejemplo, www.bio-chip.co.uk ) Y
estas matrices son por lo general dirigidos a virus descubrimiento y resolución de problemas de
enfermedades complejas. A pesar de que el bombo que rodea algunos diagnósticos signi fi cativa
logra mediante el técnicas ( Wang et al., 2003 ), Estos ejemplos son bastante pocos y lejos Entre. Esta
es el área donde NGS ya está eclipsando el formación técnicas, predominantemente debido a que el
modo de acción es simplemente mejor adecuado para la tarea en cuestión. arrays de descubrimiento
Virus dependen efectivamente en el hibridación cruzada de las sondas, diseñado para conocida virus, a habilitar En conclusión, sólo el tiempo dirá cuál de la próxima generación de los métodos actualmente en desarrollo se
detección de nuevos virus. Mientras que las sondas pueden ser diseñado en regiones conservadas y convertirán en los diagnósticos de rutina del futuro. Esto se determinará a través de una combinación de factores. La primera

muchas variantes de las sondas pueden ser desplegado en matrices de alta densidad, el diseño de consideración obvia es que la tecnología en sí tendrá que ofrecen ventajas de rendimiento sobre los métodos existentes con

estas sondas es una complejo perspectiva. La mayor gama de diseño y protocolos experimentales son construido
el fin de suplantar a ellos y esta revisión demuestra el potencial para lograr esto para un número de tecnologías emergentes.

para obtener un buen detección y la discriminación de la estrecha relación secuencias, y el desarrollo La segunda consideración será el acceso a recursos y conocimientos. Las tecnologías como NGS requieren grandes

de sondas y métodos para lograr esto es relativamente sencillo y la bioinformática está relativamente inversiones: un considerable gasto de capital inicial, los gastos de costes de funcionamiento continuo y la inversión signi fi

bien entendido. A la inversa, la desarrollo de sondas y de bajo rigor protocolos que hibridaron de forma cativa en la experiencia y la biología molecular bioinformática. Esto hace que la tecnología NGS (tal como existe

cruzada con aún desconocido virus secuencias, sin embargo, por sí solos discriminarlos de hibridación actualmente), sólo es adecuado para laboratorios centralizados bien financiados. Sin embargo, esta situación no es nueva y

cruzada eventos entre las sondas y una abundancia de la secuencia de anfitrión, es una experimentalmente los mismos criterios una vez aplicado a técnicas tales como PCR en tiempo real. las fuerzas del mercado han cambiado esa
desafiando proposición. NGS en el otro usos mano bioinformáticas herramientas de búsqueda para situación, donde el capital y los costes de reactivos se han desplomado por PCR en tiempo real. Esto ha reducido en gran

buscar similitudes de secuencia Entre los secuencias generadas y una cada vez mayor, libremente disponible
medida el nivel de entrada para los laboratorios a adoptar esta tecnología y se ha establecido en muchos laboratorios ahora.

base de datos de secuencias conocidas. Esto no sólo hacer el métodos más eficaces en este Además de técnicas tales como la lámpara, diseñadas como las tecnologías de campo para pruebas visuales, ofrecen un

momento, sino también los que se convertirán Cada vez más eficaz como la base de datos de enorme potencial para los laboratorios donde los recursos y conocimientos son escasos. Por lo tanto es posible prever un

secuencias conocidas aumenta con el tiempo. futuro en el que un número aún mayor de laboratorios de todo el mundo son capaces de llevar a cabo, el diagnóstico

molecular de rutina diana específica. Estos serán vinculados a centros más grandes, que actúan como laboratorios de

referencia; proporcionar conocimientos para apoyar el diagnóstico existentes y desarrollar otros nuevos, cada vez más

basada en enfoques que no son objeto de identificar amenazas nuevas y emergentes. Sin embargo, mientras que los

factores ligados a la propia tecnología jugará un papel en la adopción futuro, es probable que los factores humanos que son

propensos a ser la fi cante más significativo para decidir qué nuevos métodos sean ampliamente adoptados y cuáles fallan.

En última instancia, los comportamientos y en la influencia de los usuarios finales, los laboratorios y los políticos van a ser

cruciales. Por lo tanto estos factores no pueden ser ignorados y compromiso temprano con las partes interesadas de

En el a más largo plazo sin embargo los métodos de NGS y pruebas paralelas comenzar a converger importantemente.
diagnóstico es esencial. En última instancia, los comportamientos y en la influencia de los usuarios finales, los laboratorios y

El conductor principal en el desarrollo de NGS es personalizado medicina, específicamente la secuencia de todo los políticos van a ser cruciales. Por lo tanto estos factores no pueden ser ignorados y compromiso temprano con las partes
humano genomas a un costo muy bajo. Por lo tanto el paso del tiempo en el coste por par de bases es cayendo interesadas de diagnóstico es esencial. En última instancia, los comportamientos y en la influencia de los usuarios finales,
a un ritmo increíble. En relación con esto disminución de la los costes de consumibles son otra mejoras, a los laboratorios y los políticos van a ser cruciales. Por lo tanto estos factores no pueden ser ignorados y compromiso

saber, más simple, Más rápido y protocolos disminuciones en los costes de la secuenciación plataformas. Un Illumina
temprano con las partes interesadas de diagnóstico es esencial.

Mi-Sec es ya un tercio del precio de un Roche 454-FLX. Pero todavia genera aproximadamente 10 veces
más datos, en una la mitad de las veces y en una décima parte del coste. En conjunto, esto sugiere que en
el futuro la generación de grandes cantidades de datos de secuencia de una voluntad de muestras continuarán
siendo cada vez más fácil, más rápido y más barato. ya el costos de NGS está haciendo el descubrimiento
del virus y la enfermedad
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