MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, según los
holandeses. Las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660
y 1665 cuando Malpighi observa al microscopio los capilares sanguíneos. A mediados del siglo XVII,
Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez
protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió
diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se
desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando
Abbe publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión
sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000 Aº. A principios
de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos, sin conseguir
aumentos superiores a 500X o 1000X. Actualmente, el desarrollo de la óptica ha permitido mejorar la
definición de los microscopios de luz, contando con una amplia gama de microscopios de este tipo.
Sin embargo, el límite de resolución de estos microscopios no permite observar estructuras que estén
a una distancia menor a 0,2 µm, por lo que se han desarrollado otros tipos de este instrumento tales
como el microscopio electrónico. Esta guía resume las partes y características del microscopio óptico
compuesto, que será la principal herramienta utilizada durante todo el semestre para los laboratorios
de Biología Celular.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

El microscopio óptico ha sido por más de dos siglos la principal herramienta de trabajo de los
biólogos.
Una célula animal típica mide de 10 a 20 µm de diámetro, lo que es unas 5 veces más pequeño que la
partícula más pequeña visible al ojo humano desnudo. Las células animales no-solo son pequeñas,
sino que también son incoloras y transparentes. La descripción de sus detalles internos se debe en
gran parte, a que durante la última parte del siglo XIX, se desarrollaron variadas tinciones que
permitieron aumentar el contraste lo suficiente como para hacer evidentes las diferentes estructuras
intracelulares.
Aunque existen diferentes tipos de microscopios, todos están formados esencialmente por los
mismos componentes. A modo de repaso, recordaremos que sus componentes se han agrupado en
tres sistemas principales:

A. Sistema Mecánico:

Pie: Corresponde a la base de sustentación del aparato.

Columna: sostiene el espejo o el sistema de iluminación, el condensador, platina y el tubo con el
sistema óptico de amplificación.
Platina: plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos que
atravesarán la preparación. Consta de pinzas para sujetar la preparación, la que es desplazada por un
carro móvil.
Tubo o Cañón: en su extremo superior lleva la lente ocular y en el inferior la lente objetiva. Se
denomina tubo binocular si posee dos lentes oculares.
Revólver o Tambor: Corresponde a una pieza giratoria en el extremo inferior del tubo. Moviliza por
rotación los diferentes objetivos de que dispone el microscopio.
Tornillos de Focalización: los microscopios tienen dos tornillos: macrométrico el que se utiliza para un
enfoque grueso, y el micrométrico que completa el enfoque de precisión. El tornillo micrométrico
trae una escala graduada y cada marca indica un avance de dos micrómetros (µm).

B. Sistema de Iluminación:

Fuente luminosa: Puede ser natural o artificial (luz blanca, ultravioleta, monocromática, etc.).
Espejo: tiene por función recibir la luz de la fuente luminosa y reflejarla sobre el condensador. Cuando
se usa la luz natural (difusa) se emplea la cara plana del espejo y si la luz proviene de una fuente
cercana (concentrada) se usa la cara cóncava. Los microscopios modernos no usan espejos pues su
fuente de luz se ubica bajo el condensador.
Condensador: Está formado por un sistema de lentes que enfoca la luz en el plano superior de la
preparación. Existen condensadores de Abbe compuestos de dos lentes (A.N.=1,20), condensadores
de tres lentes (A.N.=1,40) y condensadores acromáticos corregidos de sus aberraciones esféricas y
cromáticas.
Diafragma Iris: Por debajo del condensador se dispone un diafragma regulable que gradúa la cantidad
de luz que llega a la preparación.
Anillo porta filtro: Corresponde a un anillo de metal situado bajo el condensador en el cual puede
colocarse un filtro de color. Al usar luz artificial rica en radiaciones rojas y amarillas de mayor longitud
de onda, es recomendable el uso de filtros azules o verdes que absorban las radiaciones de mayor
longitud de onda aumentando así el poder de resolución del aparato.

C. Sistema de Amplificación:

Lentes oculares. Son sistemas ópticos ubicados en la parte superior del tubo del microscopio.
Consistentes en un cilindro hueco que lleva dos lentes (simples o compuestos). La lente superior se
denomina ocular y la inferior, de campo o colectora. A veces se usan también los oculares de
compensación, que en combinación con los objetivos apocromáticos corrigen la aberración cromática
restante de los objetivos. Así el objetivo apocromático corregido concentra más los rayos azules, en
tanto que los oculares compensadores concentran más los rojos. Como resultado de la interacción la
imagen aparece incolora. Los oculares se designan por su aumento (6X, 8X, 10X, 15X, 20X). Esto es
importante por cuanto el aumento del microscopio es igual al producto del aumento del ocular por el
del objetivo. En resumen, la función de los oculares es aumentar la imagen real e invertida dada por el
objetivo y corregir algunos defectos de la misma, de manera que el ocular actúa como una lupa
formando una imagen virtual, aumentada y derecha de la imagen real dada por el objetivo.
Lentes Objetivas: Corresponden a sistemas de lentes ubicados inmediatamente encima del objeto o
preparación. Estas lentes dan una imagen aumentada, real e invertida. Existen diversos tipos de
objetivos, los que se clasifican según el medio interpuesto entre la lente y el objeto:
 - Objetivos a seco: En estas lentes el medio interpuesto entre la lente y el objeto (preparación) es
aire. Pueden ser apocromáticos o corrientemente acromáticos.
- Objetivos de inmersión: El medio interpuesto es un líquido viscoso transparente con un índice de
refracción mayor que el del aire. Existen lentes de inmersión en agua o aceite (comúnmente aceite de
cedro; n = 1,515). En general este aceite tiene un n semejante al del vidrio que cubre la preparación
(cubreobjetos) (n = 1,52). Su función es concentrar los rayos que se habrían perdido por refracción en
el portaobjetos.

Además, el microscopio tal como lo conocemos hoy tiene tres características fundamentales:
• Poder de aumento: capacidad del microscopio de entregar imágenes aumentadas.
• Poder de definición: capacidad del microscopio de dar imágenes nítidas de contornos
precisos.
• Poder de resolución: capacidad del microscopio de mostrar separados dos puntos, que a ojo
desnudo parecen como juntos.
• Poder de penetración: capacidad del microscopio de mostrar a foco dos puntos que están en
distintos planos.

Poder de aumento: el aumento de un microscopio óptico está dado por el producto entre el aumento
de la lente objetiva que se está usando y el aumento de la (o las) lente(s) ocular(es):

Aumento Total = aumento lente objetiva X aumento lente ocular

Poder de resolución: Al definir esta capacidad del microscopio, obligadamente debe mencionarse el
concepto de Límite de resolución (LR), el que se define como la mínima distancia que debe haber
entre dos puntos para que éstos sean vistos como entidades separados.

Poder resolución = 1 / LR

El LR de un microscopio puede calcularse usando la fórmula de Abbe:

L.R = K _λ__
AN

Esta ecuación es valida incluso para el ojo. El símbolo λ es la longitud de onda de la luz usada para
iluminar el objeto (0,5 μm para luz blanca), K es una constante que depende del índice de refracción
del medio que hay entre el objeto y la lente objetiva (0,61 para microscopio óptico), y AN es la
apertura numérica.

Apertura Numérica (AN): Los objetos dispersan la luz. De esta manera, los rayos de luz que chocan
con un punto son dispersados, formando un cono de luz.
El ángulo de apertura α, se forma entre el rayo que pasa exactamente por el centro de la lente y el
último rayo que entra por la periferia de la lente objetiva. Este ángulo permite medir la cantidad de
luz que puede ingresar en el objetivo.
Si se observan los valores de AN de las diferentes lentes objetivas de un microscopio dado, podrá
apreciarse que la AN aumenta con el aumento de cada lente, es así que en la tabla siguiente se
muestran los aumentos de las diferentes lentes objetivas y sus respectivas AN.
 TABLA I
Aumento Objetivo AN
4X 0,1
10X 0,25
40X 0,65
100X 1,25

La fórmula de Abbe muestra que para aumentar la resolución, es decir disminuir el límite de
resolución, se pueden manipular sólo un pequeño número de variables: la longitud de onda de la luz
que se usa (λ) y la apertura numérica (AN) del objetivo con que se está realizando la observación Y es
principalmente respecto a la manipulación de la longitud de onda donde se han hecho la mayoría de
las mejoras, creándose diferentes tipos de microscopía que serán analizados más adelante en los
laboratorios.

OBJETIVOS

• Conocer la estructura y el funcionamiento del microscopio de luz.

• Aplicar las normas de uso y cuidado del microscopio óptico.
• Observar distintos tipos de muestras para comprender su funcionamiento.

PALABRAS CLAVES

• Difracción y refracción de la luz, límite y poder de resolución, poder de penetración, poder de

aumento y poder de definición.

ACTIVIDAD PRÁCTICA

A. Evaluación del conocimiento previo que cada alumno posea respecto a las partes del
microscopio y de su utilización.

B. Cada alumno, observará una muestra de papel milimetrado con una letra impresa.
Enfocar la letra con la lupa (4,5x u otro según el caso). Realice las siguientes actividades.

Con un papel milimetrado mida la distancia entre el lente objetivo y la preparación en el

portaobjeto.
Usando las líneas del papel milimetrado determine el diámetro del campo observado, luego el
radio y a partir de éste calcule el área del campo.
Usando las líneas del papel milimetrado determine el tamaño de la letra.
 C. Enfocar la letra con el objetivo de 10x. Realice las siguientes actividades:

Describa como se ve la letra (derecha, invertida, difusa, etc.)

Desplace la platina a la derecha y a la izquierda ¿en qué dirección se mueve la letra?
Usando las líneas del papel milimetrado calcule el área del campo observado y compárelo con el
observado a través de la lupa.

D. Pasar al objetivo de 40x y responder lo siguiente:

¿La iluminación experimenta cambio?

Mida la distancia entre el lente objetivo y la preparación y compárela con las distancias obtenidas
con la lupa y el objetivo de 10x.

E. Se entregará a cada alumno una preparación de hilos de colores para evaluar la correcta
colocación en la platina y el correcto enfoque 10x.

Describa como varia la profundidad en la observación de hilos de colores cuando se cambia de

objetivo 10x al de 40x.
Determinar con cual de los dos aumentos se obtiene:

Mayor amplitud de campo

Menor distancia de trabajo
Mayor poder de resolución

BIBLIOGRAFÍA

 Abbas AK, Lichtman AH, Pober J. 2002. Inmunología Celular y Molecular. 4º Edición. Ed.
McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, España.
 Alberts B, Bray D, Lewis J. 2002. Biología Molecular de la Célula. Ediciones Omega S. A.
Barcelona.
 Darnell JH, Baltimore. 1994. Molecular Celll Biology. Scientific American Books, N.Y.
 De Robertis E, Hib J, Ponzio R. 2000. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo. Bs. Aires.
 Lodish, H. et al. 2002. Molecular Cell Biology. 5º Ed.
 Mathews, van Holde. 1999. Bioquímica. Mac Graw Hill-Interamericana. Madrid.
 Spotorno A, Hoecker G. 1993. Elementos de Biología Celular y Genética. Editado por el
Departamento de Biología Celular y Genética. Facultad de Medicina. Universidad de Chile.