Lesiones de las plaquetas

Otro de los elementos celulares que con elevada frecuencia se emplean son las plaquetas que en
conjunción con el endotelio vascular participan activamente en la hemostasia primaria. Se
consideran como pequeñas células anucleadas, tienen una vida media de hasta 12 días, presentan
una forma discoide con diámetro de 2-4 mm, los limites normales oscilan de 150-450 x 103/mL en
función del método empleado para su cuantificación. El principal requerimiento energético es el
ATP, es producido por la combinación de la glucólisis y de la fosforilación oxidativa. En presencia de
glucosa, la fosforilación oxidativa aporta 55% del ATP, en ausencia de glucosa su contribución se
incrementa a casi 90%. La fosforilación oxidativa adquiere un papel crítico en ausencia de oxígeno ya
que el aumento de ácido láctico se incrementa de 3-5 veces.

Conservación de las plaquetas23,24 Las condiciones de preparación y almacenamiento influyen

determinantemente en la retención de las propiedades de las plaquetas; por lo que hay dos
aspectos de gran importancia que deben ser tomados en cuenta:

• Su sobrevida después de ser transfundidas.

• La actividad hemostática, medida por su capacidad para acortar el tiempo de sangría en el paciente
trombocitopénico.

Entre las variables que se ha demostrado que podrían afectar estas propiedades se encuentran: •
Solución de anticoagulante/preservativa.

• Temperatura de almacenamiento:

• Condiciones de centrifugación

• Cantidad de leucocitos en concentrados plaquetarios.

• Contenedores y tipo de plásticos.

La reducción del pH es inversamente proporcional a la concentración de ácido láctico, así como el

nivel de oxígeno plasmático es inversamente proporcional a la cantidad de plaquetas por unidad de
volumen. En condiciones de almacenamiento con temperaturas de 20-24°C, las principales fuentes
de energía son a través de la fosforilación oxidativa y de la vía glucolítica, esta última se ve
favorecida por bajas concentraciones de oxígeno; la alta producción de ácido láctico es neutralizada
por la combinación con bicarbonato sódico plasmático y ácido carbónico, este último se disociará en
dióxido de carbono y agua. Se ha comprobado que con un pH de 6.0 las plaquetas adoptan la forma
esférica, mostrando una marcada reducción de su sobrevida.25

También se ha señalado que el pH puede variar por la presencia de:

• Activación o fragmentación de leucocitos que compiten con las plaquetas por los nutrientes
contenidos en el plasma, así como la liberación de enzimas, sustancias vasoactivas y citocinas.26

• Por la actividad metabólica de los glóbulos blancos que contaminan el concentrado plaquetario
que tienen la tendencia a producir mayor cantidad de ácido láctico.

Por diferentes grados de activación de las plaquetas durante el proceso de preparación y depósito, la
viabilidad de las plaquetas transfundidas al término de su periodo de conservación, depende en gran
parte del mantenimiento de un pH de 6.0 o más alto.27-32 Con estos antecedentes se ha sugerido
que las lesiones de almacenamiento son una forma de apoptosis.33 Durante los últimos 15 años ha
surgido un gran interés en el desarrollo de métodos para la conservación de plaquetas, tanto en
estado líquido como congeladas. Esta situación refleja la necesidad de los bancos de sangre de
mantener un depósito suficiente de plaquetas para cubrir las crecientes demandas clínicas.

Funciones hemostáticas y de señalización de las plaquetas transfundidas

Los estudios metabólicos han revelado un deterioro gradual de la integridad plaquetaria durante el
almacenamiento, un proceso denominado lesión de almacenamiento plaquetario. Evidencia reciente
demuestra que las plaquetas almacenadas también pierden respuestas de señalización a agonistas
fisiológicos con deterioro de la activación, secreción y agregación de las células. Por otra parte, el
almacenamiento conduce a una ganancia en las propiedades de activación plaquetaria, tales como
liberación de micropartículas y aparición de epítopos superficiales para su depuración por
macrófagos. Nuevas técnicas para medir la formación de trombos inducidos por el flujo y la
coagulación dependiente de plaquetas proporcionan evidencia de que la actividad hemostática de
las plaquetas disminuye durante el almacenamiento. Además de la inhibición farmacológica, se
deben considerar nuevas estrategias de almacenamiento, como la supresión metabólica, para
preservar mejor la funcionalidad de las plaquetas, limitando al mismo tiempo la expresión de los
marcadores de aclaramiento. La comprensión de los cambios que se producen en asociación con la
lesión de almacenamiento de plaquetas y el uso de métodos de almacenamiento actualizados
ayudará a generar plaquetas para la transfusión con una función hemostática óptima y un tiempo de
circulación largo después de la transfusión.

Las plaquetas juegan un papel crítico en la hemostasia. De hecho, las hemorragias pueden ser
causadas por trastornos plaquetarios tanto cuantitativos como cualitativos. Terapéuticamente, los
concentrados de plaquetas se utilizan para la transfusión a pacientes trombocitopénicos con
sangrado. Además, estos concentrados se utilizan cada vez más profilácticamente para prevenir

Hemorragia en pacientes con trombocitopenia por tratamiento con quimioterapia. Sin embargo, la
vida útil de los concentrados de plaquetas almacenados se limita a 5 a 7 días por una variedad de
razones. En este informe, damos una visión general de los conocimientos actuales de las alteraciones
funcionales en las plaquetas almacenadas y las posibles consecuencias de la terapia de transfusión
de plaquetas.

TRANSFUSIÓN EFECTIVA DE PLAQUETAS

El propósito de la transfusión a pacientes trombocitopénicos es suministrar un número suficiente de

células donantes con propiedades hemostáticas similares a las de las propias plaquetas del paciente.
Esto implica que tras el daño vascular o ruptura, las plaquetas donantes necesitan cambiar de
reposo, células no adhesivas a elementos altamente reactivos y pegajosos. Además, se supone que
las plaquetas donantes permanecen en la circulación durante un período normal de tiempo. Por lo
tanto, el concentrado ideal de transfusión contiene plaquetas con un bajo estado de activación, una
alta tendencia de activación y la ausencia de marcadores de su destrucción y eliminación.

En los primeros estudios, la actividad hemostática de las plaquetas transfundidas se dedujo de su

capacidad de acortar el tiempo de sangrado de la piel, pero esta técnica parecía ser relativamente
insensible.1 Las técnicas más refinadas, basadas en la transfusión de plaquetas (radiomarcadas) y el
análisis del recuento de plaquetas Incremento, reveló una marcada reducción en el tiempo de
circulación, cuando las plaquetas almacenadas se comparan con plaquetas frescas. La explicación de
esta reducción de la supervivencia plaquetaria puede buscarse en reacciones inmunológicas (por
ejemplo, púrpura de trombocitopenia posttransfusión) o en características de superficie alteradas
que desencadenan el aclaramiento de las plaquetas.4,5 Sin embargo, La literatura actual
proporciona pruebas sustanciales, lo que indica que los cambios en las propiedades funcionales
también afectan a la supervivencia plaquetaria.

RESPUESTA DE LAS PLAQUETAS EN LA HEMOSTASIS

La comprensión de los procesos de formación de trombos después de una lesión vascular ha

aumentado considerablemente por la disponibilidad de modelos de trombosis experimental y
ratones modificados genéticamente.6,7 Además, los estudios de cámara de flujo ex vivo con sangre
humana y murina han permitido desentrañar las vías de activación intracelular Que desencadenan la
formación de trombos en condiciones fisiológicamente relevantes.8-10 La exposición de las fibras de
colágeno conduce a la detención de plaquetas y la activación a través de una interacción de
receptores adhesivos.

Junto con la glicoproteína Ibα, que permite la unión reversible al factor de von Willebrand unido al
colágeno (vWF) y ralentiza las plaquetas circulantes, la integrina receptora adhesiva α2β1 y el
receptor de señalización GPVI conjuntamente inician la adhesión firme y la activación de las
plaquetas por el colágeno. Las respuestas plaquetarias posteriores incluyen la movilización de Ca2 +,
la activación de la integrina αIIbβ3 y la unión al fibrinógeno, la formación de pseudópodos, el cambio
de forma y la formación de tromboxano A2. Otra respuesta clave es la exocitosis como resultado de
la fusión de gránulos, causando la expresión de CD62 (P-selectina) en la superficie plaquetaria y la
liberación de los agentes paracrinos ADP, ATP y Gas6,7,14. Todos estos procesos median la
formación de plaquetas Agregados. En una etapa final de activación, las plaquetas también expresan
fosfatidilserina procoagulante en su superficie de membrana externa, que se requiere para la
función óptima del proceso de coagulación. La trombina, generada en la superficie tanto de las
plaquetas procoagulantes como de las micropartículas, amplifica la activación plaquetaria y
fragmenta el fibrinógeno para formar fibrina, estabilizando así el agregado plaquetario a un coágulo .
6,17 Por último, la retracción del coágulo dependiente de plaquetas es necesaria para la formación
estable del tapón y la detención persistente del sangrado.

PRUEBAS DE PREPARACIONES DE PLAQUETAS ALMACENADAS

Las investigaciones para preservar la calidad de las plaquetas almacenadas se centraron inicialmente
en su metabolismo y estado energético. Los concentrados de plaquetas mantenidos en plasma
anticoagulado se suplementaron con glucosa para mantener una elevada proporción intracelular de
ATP / ADP. Se introdujeron bolsas de aire transparentes para reducir la producción de lactato
anaeróbico y preservar un pH de plasma neutro.18 Los parámetros metabólicos de los concentrados
de plaquetas almacenados, por ejemplo, pCO2, pO2, pH, lactato y glucosa, son todavía ampliamente
utilizados. La integridad plaquetaria se deduce a menudo de los ensayos que miden la función
celular general (dis), tales como el volumen medio de plaquetas, la respuesta de choque hipotónico,
la extensión del cambio de forma y la reacción de "remolino". De hecho, por razones prácticas, los
controles de calidad de las plaquetas almacenadas se limitan a menudo a estos ensayos
convencionales, aunque ha quedado claro que reflejan propiedades que sólo son indirectamente
relevantes para la función hemostática de las plaquetas. Más bien, detectan una pérdida sustancial
de integridad celular o una pérdida general de la función plaquetaria durante el almacenamiento
prolongado. Originalmente, el término lesión de almacenamiento de plaquetas se usó para indicar la
pérdida de integridad plaquetaria o función plaquetaria en general. Sin embargo, ahora se reconoce
que las plaquetas pueden perder o ganar varias de sus funciones, incluso cuando se almacenan en
plasma nativo.

En los últimos años, la prueba de la función plaquetaria se ha desplazado a la evaluación de los

procesos de señalización y propiedades de activación relevantes para la hemostasia. La citometría de
flujo se utiliza para detectar alteraciones superficiales que reflejan la activación de las plaquetas,
como la activación de las integrinas, la secreción del contenido de los gránulos y la exposición a la
fosfatidilserina.20 Existe un rápido aumento en el uso de la adhesión plaquetaria, agregación y
ensayos de coagulación dependientes de plaquetas para determinar la pérdida de Durante el
almacenamiento.21,22 Esta investigación ha demostrado que la lesión del almacenamiento de
plaquetas afecta muchas funciones diferentes de la célula, pero todavía hay poca penetración en el
impacto de cada uno de estos cambios en el comportamiento hemostático después de la transfusión
de plaquetas. La razón principal es la trombocitopenia de los pacientes transfundidos, lo que ha
dificultado la evaluación de la función plaquetaria con pruebas distintas de la citometría de flujo.

Por lo tanto, se están desarrollando nuevas tecnologías para estudiar los procesos de activación a
bajos recuentos de plaquetas. Las herramientas prometedoras son dispositivos de cono y placa y
cámaras de flujo para el análisis de agregación inducida por cizallamiento y formación de
trombos.9,13,23 Uno de los sistemas de cámara de flujo recientemente descritos cuantifica la
formación de trombos después de la perfusión de sangre trombocitopénica anticoagulada sobre un
colágeno (Fig. 2A) .24 Otro ensayo adecuado es la medición de la generación de trombina en el
plasma trombocitopénico. En la automatización calibrada

Trombograma, las plaquetas se activan para proporcionar una superficie procoagulante, lo que
facilita la formación de trombina.17,25 La actividad proteasa de la trombina se mide continuamente
por escisión de un sustrato fluorescente de trombina (Figura 2B). Incluso con un recuento bajo de
plaquetas, este método detecta la respuesta procoagulante de las plaquetas.24 Es probable que
estas técnicas proporcionen información importante sobre la función hemostática de las plaquetas
después de la transfusión.

FUNCIÓN PLAQUETA ASOCIADA A LA LESIÓN DE ALMACENAMIENTO

Después del almacenamiento de plaquetas, su adhesión estable a las superficies adhesivas se

muestra disminuida (Tabla 1). La adhesión disminuida a vWF bajo cizallamiento es probablemente
causada por cambios estructurales en el complejo receptor de vWF, GPIb-V-IX. Las plaquetas liberan
metaloproteinasas, que escinden las cadenas GPIbα y GPV de este complejo y alteran su función
adhesiva.26-28 Otros investigadores informan que el almacenamiento plaquetario conduce a la
agrupación de receptores GPIb-V-IX, que tras la transfusión aumenta la depuración de las plaquetas
circulación. Por lo tanto, existen varias maneras en las que un almacenamiento prolongado puede
afectar la adhesión estable y la consiguiente agregación de plaquetas en una superficie de colágeno
vWF.21,22 Pérdida en la morfología de la forma del disco y un pequeño aumento en el punto de
nivel basal de Ca2 + Además, el almacenamiento compromete la señalización a la movilización de
Ca2 + por receptores acoplados a Gproteínas (epinefrina, ADP, tromboxano A2 y receptores de
trombina) oa tirosina quinasas (receptores de colágeno) 22, 40 Esto ilustra una tendencia reducida
de las plaquetas almacenadas a activarse,

Que se apoya en el análisis de los patrones de fosforilación de la tirosina, mostrando una

disminución de la fosforilación inducida por trombina de múltiples bandas durante el
almacenamiento.54 Además, la secreción inducida por agonistas, tal como se deduce de la
exposición superficial

De la CD62 granular (P-selectina), disminuye con el tiempo de almacenamiento.22,29 Normalmente,

esta caída en las respuestas de activación después de la estimulación agonista se acompaña de un
aumento de la expresión superficial de los marcadores de activación plaquetaria, lo que sugiere que
el estado de activación de las plaquetas aumenta durante el almacenamiento . Inicialmente, hay una
exposición lenta de CD62 y una ligera activación de la integrina αIIbβ3 acompañada de
reorganización del citoesqueleto de actina. En una etapa posterior, las plaquetas almacenadas
comienzan a exponer la fosfatidilserina, lo que hace que las células sean procoagulantes22. Sin
embargo, la exposición a la fosfatidilserina es también un marcador para la eliminación in vivo. 44,47
La actividad procoagulante de las plaquetas almacenadas se estimula adicionalmente mediante el
desprendimiento gradual de micropartículas procoagulantes, que parece estar unido a la
reorganización citoesquelética mediada por αIIbβ3.51

Los receptores purinérgicos plaquetarios, P2Y1 y P2Y12 para ADP, y P2X1 para ATP, son propensos a
la desensibilización a través de mecanismos de activación autocrina. 55 A primera vista, esto puede
explicar el deterioro gradual de la activación y agregación de la integrina inducida por ADP durante
el almacenamiento de plaquetas. Sin embargo, las pruebas recientes demuestran que las plaquetas
que se mantienen en plasma resisten la desensibilización del ADP y del receptor de ATP debido a la
presencia de ectonucleotidasas solubles, que degradan el ADP y el ATP liberados.56 Esto es
relevante para el uso de soluciones plaquetarias porque un contenido reducido Del plasma aumenta
la desensibilización del receptor purinérgico y, por lo tanto, disminuye las respuestas de agregación
in vitro.48 La activación de la integrina αIIbβ3 y la activación del ligando denominan respuestas de
señalización externas, tales como la propagación de plaquetas a través de las tirosina quinasas de
proteína (Src y kinasas de adhesión focal) Otro evento de señalización fuera de la αIIbβ3 es la
retracción de los coágulos que contienen plaquetas, que se produce en una fase tardía de la
coagulación. La retracción del coágulo de plaquetas en los concentrados aumenta con el tiempo de
almacenamiento, lo cual es una indicación de que la señalización αIIbβ3 aumenta con el
almacenamiento.53,58 En resumen, la literatura actual apunta a un doble efecto del
almacenamiento sobre las propiedades plaquetarias hemostáticas: Marcadores de activación
superficial y señalización de integrinas) y una respuesta reducida hacia los agonistas (disminución de
la adhesión, secreción y agregación). La lesión de almacenamiento de plaquetas produce así
plaquetas con un estado de activación aumentado y una tendencia de activación disminuida.

LA LESIÓN DE ALMACENAMIENTO Y EL DESPACHO DE PLAQUETAS

Se ha informado de que el almacenamiento de plaquetas durante más de 48 horas reduce

significativamente el efecto beneficioso de la transfusión de plaquetas en pacientes
trombocitopénicos. El almacenamiento prolongado acorta el tiempo de circulación de las células
transfundidas, probablemente debido a cambios en la superficie celular.59 La expresión de CD62 y
fosfatidilserina conduce al reconocimiento de plaquetas por los macrófagos ya la posterior
eliminación de la circulación4. También pueden estar involucrados otros cambios en la superficie, El
estado de las integrinas activadas (αIIbβ3) y la presencia de pseudópodos.41 El almacenamiento a
temperatura más baja (4 ° C), en particular, induce el agrupamiento de GPIb-V-IX, que genera
epítopos de reconocimiento para la integrina αMβ2 (Mac-1) de Macrófagos y, por lo tanto, aumenta
la eliminación de las plaquetas de la circulación.34 A diferencia de la eliminación dependiente de
CD62, la depuración a través de αMβ2 es un proceso bastante lento4, pero se han hecho esfuerzos
para reducirlo. En ratones, la modificación de GPIbα por galactosolación de sus residuos de β-N-
acetilglucosamina impide el reconocimiento por los macrófagos, y esto prolonga el tiempo de
circulación de las plaquetas almacenadas en frío34,35. Sin embargo, una publicación reciente
muestra que este no es el caso de Galactosylation de plaquetas almacenadas en frío humano, 60
sugiriendo una contribución conjunta de los marcadores de superficie en el aclaramiento de las
plaquetas después de la transfusión. Como se discutió anteriormente, el complejo GPIb-V-IX
también puede verse afectado por la escisión por metaloproteinasas de matriz. Nuevamente en los
ratones, la inhibición de la metaloproteinasa ADAM17 da lugar a una mayor recuperación
plaquetaria después de la transfusión y una función hemostática mejorada.37 La prevención de los
cambios de superficie inducidos por el almacenamiento utilizando inhibidores de plaquetas, por
ejemplo prostaciclina o óxido nítrico, puede proporcionar otra forma de prolongar la circulación
plaquetaria Típicamente, la interacción de GPIb-V-IX con vWF -que se evalúa mediante la medición
de la actividad de cofactor de ristocetina dependiente de GPIb de las plaquetas- disminuye sólo
ligeramente al almacenarse.26 Además, los multímeros de vWF en plasma no parecen ser , Lo que
sugiere que la actividad de la metaloproteinasa de la matriz en los concentrados de plaquetas
almacenados es baja.

RECUPERACIÓN DE PLAQUETAS DESPUÉS DE LA TRANSFUSIÓN

Hay algunos indicios de que los defectos de almacenamiento de plaquetas se pueden restaurar
después de su transfusión a los pacientes. Las mediciones de recuento de plaquetas no informarán
sobre la recuperación secundaria de la función plaquetaria. Curiosamente, se han aplicado varias
pruebas ex vivo para investigar las respuestas de adhesión y agregación postransfusión, tales como
la adhesión a perlas recubiertas de colágeno.38,49 Los experimentos de flujo, midiendo la formación
de trombos dependientes de colágeno y ADP bajo cizallamiento, GPVI y P2Y después de la
transfusión de plaquetas a los pacientes.24

SUPRESIÓN DE LA LESIÓN DE ALMACENAMIENTO DE PLAQUETAS POR ARRESTOS METABÓLICOS

Los intentos previos para limitar la lesión de almacenamiento de plaquetas se basaron en la

inhibición farmacológica, por ejemplo, (a) utilizando agentes que aumentan los niveles de AMP
cíclico y (b) compuestos donantes de óxido nítrico.62-64 Aunque se hicieron algunos progresos,
Agentes antes de la transfusión han dificultado seriamente su amplia aplicación. En un enfoque
alternativo, la detención metabólica se ha utilizado para interferir con el desarrollo de los cambios
plaquetarios durante el almacenamiento. Las observaciones anteriores habían demostrado que las
plaquetas pueden sobrevivir a un período de escasez de energía en medio libre de glucosa en
presencia del inhibidor de la resíntesis de ATP mitocondrial, la antimicina A.65 a 37 ° C, esto conduce
a una caída en la carga de energía adenilada del metabolismo , Que se expresa como la relación (ATP
+ 1/2 ADP) / (ATP + ADP + AMP). Este parámetro representa el equilibrio entre la producción y el
consumo de energía y es un marcador sensible para el estado energético de la célula. La caída de la
carga de energía adenilada se acompaña de una pérdida gradual de la capacidad de las plaquetas
para secretar y
agregar. La restauración de la carga de energía de adenilato por 1 hora de incubación en exceso de
glucosa restaura la función plaquetaria.

En comparación con las plaquetas almacenadas en condiciones normales, las plaquetas suprimidas
metabólicamente siguen siendo de baja expresión de CD62, pero siguen perdiendo su capacidad de
agregación al almacenamiento.68 El resultado de este enfoque mejora dramáticamente cuando la
privación de energía es seguida de almacenamiento a 4ºC. En primer lugar, las plaquetas están
agotadas por energía mediante incubación a 37ºC en tampón que contiene glucosa, que hace que las
células sean inactivas. A continuación, las suspensiones de plaquetas se enfrıan a 4 ◦ C y se
almacenan hasta 48 horas. Cuando se recalienta en medio rico en glucosa, la expresión de CD62
permanece baja, mientras que la agregación inducida por receptor de trombina se recupera
sustancialmente. Las plaquetas almacenadas en frío, suprimidas metabólicamente, también
conservan la mayor parte de su capacidad para adherirse a una superficie revestida con vWF o
fibrinógeno en un flujo

Un inconveniente de este enfoque para el enfriamiento de las plaquetas es que tienden a exponer
epítopos que son reconocidos por los macrófagos, desencadenando su eliminación de la circulación
(véase más arriba). Así, aunque las funciones plaquetarias podrían ser mejor conservadas después
del agotamiento de la energía y el almacenamiento en frío, después de la transfusión, las plaquetas
desaparecerían rápidamente de la circulación con poco beneficio para el paciente trombocitopénico.
Un ensayo de fagocitosis in vitro, basado en la coincubación de

Plaquetas con células monocíticas maduras, muestra que la eliminación de las plaquetas
almacenadas puede separarse en 3 fases.69,70 En primer lugar, existe la unión de plaquetas a
monocitos, que está mediada en parte por la CD62 de plaquetas con el ligando-1 de glicoproteína de
selectina P Como contra-receptor en los monocitos. En segundo lugar, existe la expresión de
fosfatidilserina en las plaquetas almacenadas, lo que desencadena la fagocitosis a través de
receptores de barrido. En tercer lugar, existe el agrupamiento del complejo GPIb-V-IX que acompaña
al enfriamiento, probablemente causado por perturbaciones en las cadenas de azúcar de superficie.
Las moléculas de GPIbα agrupadas son reconocidas por los receptores de la integrina αMβ2 en los
monocitos, causando nuevamente fagocitosis34. La privación metabólica de plaquetas tiene poco
impacto en su unión a monocitos, pero suprime la expresión de marcadores de fagocitosis y, por
tanto, el proceso fagocítico. Además, la expresión de los epítopos de fagocitosis parece ser
dependiente de la energía, ya que el almacenamiento de las plaquetas deficientes metabólicas a 4ºC
previene un aumento de la fagocitosis debido a la temperatura fría.