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Método Molecular de FISH y enzima
involucrada en procesos de biotecnología
“amilasa y uso en la industria de panificación”
(marzo de 2020)
Romer sabogal Vargas, 1079180682, Diego Alexander Ladino Lozada,
1022422565, Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD
Resumen
los objetivos fundamentales en el uso del método de Fish son
En el desarrollo de la temática propuesta se pretende analizar el
principalmente:
método molecular de Fish a través de una problemática identificada
en el sector alimentario, los métodos moleculares se han vuelto una
herramienta fundamental para poder realizar controles patogénicos e
identificación de microorganismos en la industria alimentaria; estas
técnicas evolucionan rápidamente pretendiendo mejorar las
condiciones de calidad e inocuidad durante el proceso de elaboración
de un producto de índole alimentario. Otro tema a analizar es el
estudio de las enzimas y sus acciones e importancia dentro de los
procesos industriales, las enzimas son biocatalizadores naturales y
otros sintéticos que han permitido la evolución en campo alimentario
y de la transformación, si bien están presentes y hacen parte de todas
las reacciones químicas actuando como aceleradores de procesos
metabólicos, uno de ellos y mas importante llevado a cabo por
enzimas lácticas interventoras en el proceso de fermentación de
hidratos de carbono a glucosa importante en la generación de energía.
En esta ocasión se estudiará la acción de la amilasa y su función
adyacente en la conservación del pan.
Palabras claves: amilasa, enzima, técnica molecular, fermentación.
Abstract
In the development of the proposed theme, the intention is to analyze
the Fish molecular method through a problem identified in the food
sector, molecular methods have become a fundamental tool to carry
out pathogenic controls and identification of microorganisms in the
food industry; These techniques evolve rapidly trying to improve the
conditions of quality and safety during the elaboration process of a
product of a food nature. Another topic to analyze is the study of
enzymes and their actions and importance within industrial processes,
enzymes are natural biocatalysts and other synthetics that have
allowed evolution in the food field and transformation, although they
are present and are part of all chemical reactions acting as
accelerators of metabolic processes, one of them and more
importantly carried out by intervening lactic enzymes in the process
of fermentation of carbohydrates to glucose important in energy
generation. On this occasion, the action of amylase and its adjacent
role in the preservation of bread will be studied.
Key words: amylase, enzyme, molecular technique, fermentation.
1
I. OBJETIVOS MÉTODO MOLECULAR DE FISH
 Visualización de la ploidía. o Mapeo de cromosomas.
 Cambios en la localización de nucleótidos;
 translocaciones, inversiones y microdeleciones.
(Aguilar Villalba, 2017)
 Identificar el uso del método de fish en tratamiento
de aguas.
 Identificación de principales microorganismos
presentes en el tratamiento de agua.
II. OBJETIVOS ENZIMAS EN PROCESOS FERMENTATIVOS
 Establecer la importancia de las enzimas en la
industria
 Determinar la importancia de la enzima amilasa en
los procesos fermentativos del pan
 Analizar el desarrollo de un problema expuesto a la
textura del pan y la acción enzimática desempeñada
como papel importante en mejorar esta condición
III. METODOLOGÍA MÉTODO MOLECULAR DE FISH
La FISH es una técnica que combina la biología
molecular y las técnicas histoquímicas para detectar
secuencias específicas de nucleótidos pudiendo
marcar porciones cromosómicas o hasta cromosomas
enteros en células metafásicas (células en división) o
núcleos celulares fijados. Esta detección se realiza
con el empleo de sondas de DNA fluorescentes
(marcadas con fluorocromos), que pueden ser de
diferentes tipos en función de las estructuras que son
capaces de detectar: sondas específicas de gen o
locus, sondas centroméricas, sondas subteloméricas y
sondas de pintado cromosómico. . Dentro de sus
numerosas aplicaciones, esta técnica es útil en la
detección de alteraciones numéricas y estructurales
cromosómicas (ploidias y reordenamientos
genómicos), para mapear de cromosomas metafásicos
e incluso para detectar bacterias y otros
microorganismos. Además, es de gran utilidad ya que
permite la monitorización de enfermedades
(seguimiento de una terapia antitumoral,
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cuantificación de células genéticamente alteradas…)
y la localización precisa de los puntos de rotura
cromosómicos en turmores, en la búsqueda de nuevos
genes implicados en el cáncer, y detectar y localizar
genes de interés ya conocidos. La FISH presenta
numerosas ventajas frente a otras técnicas
citogenéticas convencionales (cariotipo de bandas G)
sobre todo a la hora del diagnóstico clínico para la
detección de tumores y aberraciones cromosómicas,
presentando una alta sensibilidad y especificidad,
además de ser una técnica relativamente rápida (24
horas). (Aguilar Villalba, 2017)
IV. METODOLOGÍA DE ENZIMAS EN PROCESOS
FERMENTATIVOS
 Los enzimas son catalizadores específicos: cada enzima
cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un
único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una
reacción catalizada por un enzima:
1. a sustancia sobre la que actúa el enzima se
llama sustrato.
2. El sustrato se une a una región concreta del enzima,
llamada centro activo. El centro activo comprende (1)
un sitio de unión formado por los aminoácidos que
están en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio
catalítico, formado por los aminoácidos directamente
implicados en el mecanismo de la reacción
3. Una vez formados los productos el enzima puede
comenzar un nuevo ciclo de reacción (vasco, 2020)
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser
proteínas y de actuar como catalizadores. Como proteínas,
poseen una conformación natural más estable que las demás
conformaciones posibles. Así, cambios en la
conformación suelen ir asociados en cambios en la
actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más
directa sobre la actividad de un enzima son:
 pH
 temperatura
 cofactores
V. TÉCNICA DE FISH EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
L a técnica de Fish, también llamada hibridación in situ con
sondas fluorescentes permite la detección de ácidos nucleicos,
más concretamente rRNA, mediante la unión o hibridación de
una sonda marcada con un fluorocromo. Se basa en la
hibridación directa de la célula con una sonda específica de
una región del rRNA mediante cuatro fases, fijación y
permeabilización, hibridación, lavado y por último la
2
visualización realizada mediante un microscopio de
epifluorescencia. La fijación y permeabilización permiten la
penetración de la sonda fluorescente. Durante la hibridación se
produce la unión entre la sonda fluorescente y la secuencia de
interés. El lavado se utiliza para la eliminación de aquella
sonda que no se ha unido y, por último, la visualización
permite la detección e identificación morfológica del
microorganismo de interés (Martínez y Otero, 2013; Amann et
al., 2001). En la identificación de Streptomyces mediante
FISH, se ha detectado la importancia de la presencia de ácido
micólico (ácido graso e hidrófobo) y la capacidad de generar
arabinogalactanos en la pared celular, lo que la hace altamente
impermeable a la célula. Por otra parte, la similitud de la
secuencia 16S-rRNA entre las diferentes especies de
Streptomyces deriva en la imposibilidad de diseñar sondas
específicas para las mismas, lo que provoca que únicamente se
pueda realizar la identificación de los microorganismos a nivel
de género (Carr et al., 2005; Asquith et al., 2018; Chaves et
al., 2018)
Problema a solucionar: La geosmina y 2-MIB forman parte
de los compuestos TOC, los cuales producen malos olores y
sabores en el agua al ser un metabolito volátil aromático.
Dichos compuestos, aunque se encuentren en una
concentración entre 0.07% y 0.9% producen malos sabores
(Auffret et al., 2011). Como consecuencia, la presencia de
estos compuestos supone un elevado coste para aquellas
empresas que se dediquen a la depuración del agua residual, la
acuicultura y producción de vino y cerveza (ya que empeoran
las cualidades organolépticas). (Lylloff et al. 2012; Azaria y
Van Rijn, 2018).
VI. OTROS ENSAYOS EN LA TÉCNICA MOLECULAR DE FISH
En la lucha contra las enfermedades infecciosas, se ha hecho
necesaria la optimización de la especificidad, sensibilidad y
rapidez de técnicas de diagnóstico tradicional; sin embargo,
con el auge de la investigación y la necesidad de diagnósticos
oportunos y eficaces, han surgido técnicas de laboratorio con
fundamento en biología molecular aplicadas en programas de
prevención, control y tratamiento. Entre las alternativas
diagnósticas propuestas a estos retos, se describen técnicas
como la reacción de cadena de polimerasa, hibridación de
sondas de ADN, secuenciación de genomas, secuenciación
paralela, también conocida como masiva o de nueva
generación (NGS), piro secuenciación, Polimorfismo
amplificado aleatorio ADN (RAPD) y Polimorfismo de
Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP) entre otras,
cuya introducción en los laboratorios busca brindar apoyo en
la obtención de resultados altamente confiables.1
La Reaccionen Cadena de la Polimerasa (RCP) ha sido la
principal herramienta diagnóstica que ha aprovechado las
bondades de la biología molecular al punto de alcanzar gran
versatilidad como técnica de análisis. La especificidad, el
rendimiento y la fidelidad de la RCP se encuentra
directamente influenciada por los diferentes componentes que
la integran como la mezcla de reacción, régimen de ciclare y
la ADN polimerasa; la técnica permite la amplificación
selectiva de cualquier segmento de ADN, conocer las
secuencias que lo flanquean, obtener una secuencia de ADN
concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped.
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Sus aplicaciones son variables e ilimitadas, ejemplo de ello, es
la posibilidad de realizar estudios de expresión genética,
secuenciación directa de secuencias amplificadas, detección de
mutaciones, seguimiento de la efectividad de tratamiento de
enfermedades, diagnósticos de enfermedades genéticas e
infecciosas y en ciencia forense en la identificación de restos
biológicos, determinación de paternidad y pruebas periciales
en criminalística.
La secuencia del ADN consiste en determinar el orden de las
bases A, C, G y T en un fragmento de ADN; este método fue
descrito por Sanger en 1977, y permite obtener la secuencia de
un fragmento determinado de ADN, un gen o parte de este, y
ser empleado en la actualidad. Este método ha ido
evolucionando con el tiempo y en la actualidad se han
implementado diferentes tipos de secuencias, destacándose la
secuencia paralela, masiva o de nueva generación (NGS), que
permite la exploración de genomas completos de humanos u
otras especies; y la piro secuencia, con la cual es posible
determinar la secuencia de una molécula de ADN,
identificando bases individuales, o secuencias cortas de ácidos
nucleicos en posiciones determinadas. La hibridación, es un
método que se basa en la unión de dos cadenas sencillas de
ácidos nucleicos que producen estructuras de doble hebra, las
cuales son híbridos de ADN, ARN-ARN o ADN- ARN.8,9 El
método de hibridación se basa en el desarrollo de dos
moléculas de ácidos nucleicos: una homogénea de secuencia
distinguida como sonda y la otra heterogénea de secuencia
desconocida, la cual contiene la secuencia diana que se quiere
analizar. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla, provienen
de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restricción, o
de oligonucleótidos sintéticos.
Existen otras técnicas moleculares que han aportado
significativamente a la investigación como los denominados
marcadores RAPD (Polimorfismo amplificado aleatorio
ADN), quienes con base en la RCP, gracias a ellos es posible
la detección de los polimorfismos existentes en la secuencia de
ADN a estudiar y los RFLP (Polimorfismo de Longitud de
Fragmento de Restricción), los cuales expresan las diferentes
entre individuos en secuencias específicas del ADN y que son
reconocidas por diferentes enzimas que cortan dichas
secuencias, y da origen a pequeños fragmentos que pueden ser
analizados a través de electroforesis (Torres, 2017).
VII. ENZIMAS EN PROCESO DE BIOTECNOLOGÍA
ALIMENTARIA. “AMILASA EN CONSERVACIÓN DEL PAN”
Las amilasas (EC 3.2.1.1) son enzimas que catalizan la
hidrólisis de enlaces glicosídicos a 1,4 presentes en el
almidón, glicógeno y otros polisacáridos. El almidón está
compuesto por dos polímeros de glucosa: la amilosa, que
presenta únicamente enlaces a-1,4 y la amilopectina, que
adicional a los enlaces a1,4, posee sitios de ramificación a1,
[1]. La industria del almidón es una de las
principales usuarias de amilasas para la hidrólisis y
modificación de esta materia prima con el fin de obtener
glucosa, maltosa y oligosacáridos, que pueden ser
3
convertidos en jarabes de fructosa y dextrosa. La glucosa
obtenida, también puede ser fermentada para producir etanol,
aminoácidos y ácidos orgánicos [2]. Sin embargo, para la
conversión enzimática de almidones es necesario utilizar
amilasas termoestables, ya que estas son adicionadas luego de
un paso de gelatinización que requiere temperaturas entre
70 °C y 110 °C. (monica quintero, 2008) E comienzo del uso
de las enzimas en la molinería y panadería es a partir del año
1850, cuando a los panaderos y molineros les va llegando
información de que la harina de malta daba color al pan.
Entonces la miga era más húmeda y se conservaba más tiempo
por lo que la alfa amilasa de la malta de la cebada aumentaba
la fermentación con la generación de azúcares fermentables
(maltosa) a partir del almidón. Más tarde se descubrió que la
enzima activa de la soja blanqueaba la miga y mejoraba la
firmeza del gluten a través de la acción de la lipoxigenasa.
Problema a solucionar: En los últimos años el uso de
tecnología enzimática en alimentos ha crecido, y en el área de
panificación también es ampliamente utilizada. En especial las
amilasas, las cuales son utilizadas como agente
antienvejecimiento, dando suavidad y textura a los
panificados, alargando su vida útil. (Mora, 2017)
La amilasa bacteriana que empezó a utilizase en las masas
fermentadas mostró que la miga era aún más húmeda y que
conservaba más tiempo el pan fresco, pero una sobre
dosificación de amilasa bacteriana producía una miga
excesivamente húmeda, lo que ya no era deseable. En la
actualidad la pentosanasa es objeto de estudio en la industria
panadera ya que esta enzima ha permitido reacción de
hidrólisis aumenta la absorción de agua en la masa,
aumentando la tenacidad y disminuyendo ligeramente la
extensibilidad. Como consecuencia, se produce una mayor
retención de gas y un mayor impulso en el horno debido al
retraso en la formación de la miga. Los preparados
enzimáticos de pentosa nasas se añaden con el propósito de
frenar el envejecimiento rápido del pan. Se ha podido observar
que retardan la velocidad de retrogradación del almidón. Al
mismo tiempo, dichas enzimas retienen agua durante la
cocción y posteriormente esta agua puede ser suministrada
gradualmente al almidón, lo que permite mantener más tiempo
el pan tierno (Tejero, 2009).
VIII. OTROS ENSAYOS EN LA APLICACIÓN DE AMILASA EN
BUSCA DE LA CONSERVACIÓN DE LA TEXTURA DEL PAN
Las enzimas son una herramienta clave en la industria
alimentaria. Su importancia no solo radica en las ganancias
que se obtienen de su uso o producción, sino que mejoran los
procesos de fabricación y las propiedades sensoriales de los
alimentos. Dando lugar a nuevas áreas de aplicación, como
diseño de biosensores y envases activos en donde enzimas de
tipo oxido-reductasas garantizan la calidad y vida de anaquel
de los productos. Dada la demanda, se han requerido de
estrategias más rápidas y sensibles, como el uso de la
tecnología del ácido desoxirribonucleico recombinante,
metagenómica e ingeniería de proteínas para encontrar
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enzimas con mejores propiedades. La inversión en este campo
podría detonar la economía de países emergentes.
Las enzimas pueden obtenerse a partir de tejidos animales,
tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación
utilizando microorganismos seleccionados. El uso de enzimas
a nivel industrial se ve limitado por la disponibilidad-costo, es
por ello que los microorganismos como fuente de enzimas
versus plantas y animales ofrecen importantes ventajas como:
espacios de producción reducidos, no son estacionales, poseen
un rápido crecimiento sobre medios de cultivo económicos, la
mayoría de las enzimas son secretadas al medio de cultivo lo
que facilita su recuperación. Además, las enzimas microbianas
son más estables y su producción es más conveniente y segura.
Por esta razón, 50% de las enzimas son producidas por hongos
y levaduras, 35% por bacterias, y 15% por plantas y animales.
La mayoría de las enzimas hidrolíticas extracelulares,
utilizadas en alimentos, son producidas por organismos
pertenecientes a los géneros Bacillus y Aspergillus. Por otro
lado, la tecnología del ADN recombinante mediante diversas
técnicas ha permitido la expresión de enzimas vegetales,
animales y microbianas en microorganismos huéspedes de alta
producción como Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger entre otros,
resolviendo la disponibilidad y la obtención de enzimas
mejoradas con características diversas. A. Obtención de
enzimas a partir de fuentes no-cultivables: metagenómica. La
mayor parte de las enzimas con aplicación industrial en
alimentos proviene de fuentes microbianas cultivables, sin
embargo, se estima que solo se conoce entre el 0.001-15% del
microbiota de una muestra. Para explicar ese fenómeno se ha
argumentado que se desconocen los requerimientos
nutricionales y las condiciones fisicoquímicas necesarias para
el desarrollo de gran número de grupos microbianos. Como
alternativa a este problema ha surgido la metagenómica, con la
que se accede al material genómico representativo de una
comunidad microbiológica sin necesidad de cultivar a los
microrganismos (Ramírez, 2018).
IX. CONCLUSIÓN
 la incorporación de enzimas, nuevas o mejoradas,
en diversos sectores de la industria de los
alimentos tiene un futuro promisorio ya que
pueden incluirse para la obtención en una variedad
amplia de alimentos procesados en áreas como
panificación, jugos, saborizantes, lácteos, cárnicos
entre otros.
 Es claro que la aplicación de las enzimas en la
industria de los alimentos seguirá creciendo, ya
que los consumidores exigen nuevos y mejores
alimentos con características nutricionales y
funcionales que repercutan en su salud.
 La FISH es una técnica útil a la hora de visualizar
células en división, aunque también se puede
aplicar a células tanto parafinadas como
congeladas.
 Técnica rápida, con gran especificidad y
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sensibilidad, incluso en células pequeñas.
 No obstante, su precisión se puede ver alterada por
una variedad de factores como la calidad de la
sonda y de la fijación, los reactivos de detección y
la temperatura de desnaturalización.
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