LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA 2. RECONOCIMIENTO DE BIOMOLÉCULAS

I. EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Los seres vivos y todo el material que de ellos se deriva, está formado por
diferentes tipos de compuestos que se pueden identificar (cualificar) y cuantificar.
Conocer cuáles son esas sustancias, permite generar ideas sobre la posible
función, propiedades y usos que estas puedan tener. La identificación cualitativa
se realiza por medio de reacciones específicas, cuyo producto es coloreado y de
fácil detección.

En esta práctica se pretende contestar las siguientes preguntas: ¿Cuál es la

composición mayoritaria en términos de las biomoléculas del material (muestras) a
estudiar en el laboratorio? ¿Cómo actúan los reactivos (tabla 1) que permiten
detectar la presencia de biomoléculas en las diferentes muestras? Para esto
último se debe hacer una investigación exhaustiva que le permitirá establecer sus
resultados esperados a partir de la naturaleza química del reactivo y del contenido
de las diferentes biomoléculas en cada una de las muestras. Así mismo es
importante que en este proceso identifique en cada caso cuáles son sus patrones
de comparación positivos y negativos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Todos los organismos vivos están constituidos por compuestos químicos de

tamaño y masa muy variables denominadas biomoléculas. Estas sustancias se
clasifican en inorgánicas y orgánicas, siendo el agua la sustancia inorgánica más
importante para la vida, pues la inmensa mayoría de las reacciones bioquímicas
se desarrollan en medios acuosos. Una pequeña fracción en masa corresponde a
gases, sales, ácidos y a los iones. Las biomoléculas orgánicas como las proteínas,
lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, están involucradas prácticamente en
todos los procesos y propiedades fisicoquímicas de los seres vivos pertenecientes
a los diferentes niveles de organización biológica.

Proteínas

Son macromoléculas de elevado peso molecular, caracterizadas por su gran

variabilidad estructural y enorme diversidad de funciones biológicas, sin embargo,
tienen en común el ser polímeros de α- L – aminoácidos codificados
genéticamente y ordenados en secuencias lineales unidas entre sí por enlaces
peptídicos. La variedad estructural se debe a las múltiples ordenaciones o

1
secuencias que pueden adoptar los veinte aminoácidos de los cuales están
constituidas y que naturalmente se repiten muchas veces dentro de sus
estructuras moleculares espaciales. Las proteínas de cada ser vivo,
independientemente del dominio biológico al que pertenecen, son específicas, a
punto de que una célula típica posee aproximadamente unas tres mil de ellas
diferentes. Se ha establecido que las proteínas que desempeñan la misma función
presentan ligeras variaciones estructurales (secuencia de aminoácidos) en las
distintas especies.

La organización espacial de una proteína se expresa en cuatro niveles, que se

denominan la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.

Carbohidratos

Son la fuente primaria de energía para los seres vivos, constituidas

fundamentalmente por los grupos funcionales hidroxilo y carbonilo. De acuerdo
con la naturaleza química, los azúcares más simples, de acuerdo al número de
monómeros que los conforman, son los monosacáridos como la glucosa, ribosa y
fructosa. De la misma forma, de las combinaciones de dos monosacáridos se
forman disacáridos como la sacarosa, maltosa, lactosa, entre otros. Los
polisacáridos pueden ser lineales o ramificados como la celulosa, almidón y el
glucógeno. La celulosa es un polímero lineal cuya función es estructural, es el más
abundante en las paredes de las células vegetales. El almidón es la molécula de
almacenamiento de glucosa (energía) en las plantas y en los animales es el
glucógeno. Estos compuestos son polímeros de glucosa que forman cadenas
lineales y ramificadas, en el almidón la cadena lineal o amilosa consta de
aproximadamente 200 unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos α-1,4
y la ramificada o amilopectina resulta de la unión de glucosas por enlaces α-1,4 y
α-1,6. La estructura del glucógeno es similar a la del almidón, pero con mayor
cantidad de moléculas de glucosa y más ramificado. La celulosa es un polímero
lineal con enlaces β-1,4.

Lípidos

Son biomoléculas orgánicas de naturaleza química diferente, a las mencionadas

anteriormente se caracterizan por ser hidrofóbicos, es decir, insolubles en agua,
pero solubles en solventes orgánicos como el cloroformo, benceno, alcohol,
acetona, y otros. Esto último debido a su estructura donde sobresalen los ácidos
grasos de cadena larga (saturados o insaturados) y el glicerol. Las grasas
insaturadas son líquidas (aceites) y se encuentran abundantemente en los
vegetales, mientras que las saturadas (mantecas) son sólidas y están presentes
en los tejidos animales. Son fuente de energía, hacen parte de la membrana
celular como responsables de la permeabilidad selectiva; algunos lípidos
complejos regulan funciones celulares y otros actúan como moléculas de señales
químicas. Los lípidos más importantes son las grasas o triglicéridos, los
fosfolípidos y los esteroides como el colesterol.

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Ácidos nucleicos

Son polímeros de los nucleótidos (base nitrogenada, azúcar de cinco carbonos y

grupo fosfato), su función es la de portar la información genética necesaria para
que los organismos produzcan todos los factores necesarios para la vida como lo
son las proteínas y otros ácidos nucleicos como el ARN. Su nombre se debe a que
fueron aislados de los núcleos celulares. Dentro de las células los ácidos nucleicos
se encuentran combinados con proteínas básicas denominadas histonas, a estas
asociaciones supramoleculares se les denomina nucleoproteínas. Dependiendo
del tipo de azúcar (pentosa) que poseen en su estructura los ácidos nucleicos se
dividen en dos clases principales, el que tiene ribosa se llama ácido ribonucleico
(ARN) y el que tiene desoxirribosa es el ácido desoxirribonucleico (ADN). Estos
ácidos nucleicos no solo se encuentran formando el material hereditario en las
células procariotas y eucariotas sino también en organelos como los ribosomas,
mitocondrias y cloroplastos lo que evidencia la versatilidad evolutiva de estas
biomoléculas de acuerdo con su localización y función.

Reconocimiento de biomoléculas

La identificación de las proteínas se hace con el reactivo de Biuret que contiene

cobre en solución alcalina, el cual forma un complejo con los enlaces peptídicos
de péptidos y proteínas, da color rosado en los primeros y púrpura (morado) en las
últimas.

Para reconocimiento de cualquier carbohidrato, oligosacárido, polisacárido o

monosacárido se usa la prueba de Molisch, los dos primeros previamente se
hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos, los cuáles se
convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural, que reaccionan con α-
naftol formando un producto observable como un anillo de color rosado, violeta o
morado.

En cuanto a los lípidos que contienen ácidos grasos en su estructura hay una
reacción particular para reconocerlos, la de saponificación, en la cual los
compuestos se hidrolizan en un medio básico y se obtienen las sales de los ácidos
grasos, es decir jabones, detectables por agitación.

Otros lípidos fundamentales son insaponificables y tienen como núcleo estructural

el ciclo pentanoperhidrofenantreno que se identifica con la prueba de Lieberman-
Burchard en esta a una solución en cloroformo se le adiciona anhídrido acético y
ácido sulfúrico, observándose una reacción coloreada que inicia rojo y progresa a
verde-azul. Inicialmente los esteroides como el colesterol se convierte a derivados
sulfato y acetato que lentamente se someten a sulfonación en diferentes
posiciones, para luego eliminar los grupos SO 3H, produciendo insaturaciones en
forma repetitiva y finalmente polienos y esteroides aromáticos.

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El reconocimiento de los ácidos nucleicos se puede realizar con el reactivo de
difenilamina, debido a que en condiciones ácidas reaccionan las desoxirribosas de
los nucleótidos de purina formando un compuesto de color azul con el ADN.

Tabla 1 Reactivos utilizados para la identificación de diferentes moléculas de

importancia biológica
BIOMOLÉCULA REACTIVO
PROTEÍNAS Biuret
CARBOHIDRATOS α-naftol, ácido sulfúrico
ÁCIDOS NUCLEICOS Difenilamina
COLESTEROL Cloroformo, anhídrido
acético y ácido sulfúrico
LÍPIDOS NaOH
SAPONIFICABLES

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Materiales por grupo:

2 gradillas
24 tubos de ensayo
1 pinza para tubo
3 pipetas graduadas (1, 5 y 10 mL)
1 pipeteador
2 vasos de precipitados (50 mL y 250 mL)
3 goteros
Materiales y reactivos generales (el volumen de los reactivos está calculado para
10 grupos) todos los reactivos con duplicado:
α-naftol (100 mL)
Reactivo de Biuret (100 mL)
NaOH 15% (200 mL)
Cloroformo (100 mL)
Anhídrido acético (100 mL)
Ácido sulfúrico concentrado en gotero (50 mL) y en frasco sin gotero (50 mL)
Reactivo de difenilamina fresco: 1 g de difenilamina en 100 mL de ácido acético
glacial y se agregan 2 mL de ácido sulfúrico concentrado.

Tabla 2. Soluciones patrones negativos o positivos para esta práctica

PATRONES
Solución de rafinosa 1%
Agua destilada
Caseína al 1% en bicarbonato al 0,9%
Fosfatidilcolina al 1% en cloroformo
Extracto de ácido nucleico (1/4 de pastilla en 50 mL de agua
destilada)
Solución de colesterol al 1% en cloroformo

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IV. PROCEDIMIENTO

Preparación de extractos (a cargo del auxiliar de laboratorio, no se hace

diagrama de flujo de estos procedimientos).

Extracto de papa criolla: macerar cubitos de papa adicionando 8 mL de agua,

centrifugar durante 10 minutos y obtener el sobrenadante en un tubo debidamente
marcado.
Extracto de harina de trigo: adicionar a 2 g de harina de trigo, 100 mL de agua
caliente y filtrar con gasa doble. Obtener el filtrado en un vaso debidamente
marcado.
Extracto de cebolla cabezona: pelar y cortar en fragmentos pequeños 5 cebollas
cabezonas y para cada una: colocarla en el mortero y macerar con 50 mL de NaCl
al 5%, (mantener a 40oC), filtrar con gasa o muselina y recoger el filtrado en un
vaso de precipitados de 100 mL, adicionar 1mL de SDS al 1% (dodecil sulfato de
sodio), colocar en tubos tapa rosca y mezclar levemente por inversión 10 veces,
dejar en reposo por 10 minutos, transcurrido este tiempo, rotar lentamente cada
tubo y simultáneamente adicionar por las paredes, 3 mL de isopropanol, se debe
observar un precipitado blanco, colectarlo con una pipeta pasteur o gotero y
separar en un tubo marcado.
Extracto hidrofóbico de hígados de pollo: cortar en trozos pequeños 30 g de
hígados de pollo con poca sangre, macerar en mortero y adicionar, en varias
porciones, ATA en relación 1,5mL/g de tejido (45 mL en total). Agregar
aproximadamente 2,0 g de arena lavada, macerar y centrifugar a 4000 rpm por 10
minutos, desechar el sobrenadante y tomar el residuo, pasar a cápsula de
porcelana y adicionar la mezcla de etanol- éter-cloroformo 2:2:1 en 1,5 mL/g de
tejido (45 mL en total), luego centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos, tomar el
sobrenadante evaporarlo hasta la mitad de su volumen original y guardar, este es
el extracto a usar.

Identificación de biomoléculas

Para cada prueba de reconocimiento (tabla 1) y de acuerdo con su fundamento

teórico descrito previamente en está guía, usted debe seleccionar patrones o
parámetros de comparación negativos y positivos (tabla 2), los primeros también
se llaman blancos y son sustancias en las que se espera un resultado negativo de
acuerdo con su naturaleza química, por lo tanto, no cambiará el color del reactivo
utilizado para la identificación. En los segundos se espera una prueba positiva
porque contienen las biomoléculas con los grupos necesarios para que ocurra la
reacción con los reactivos de reconocimiento y se observaran productos
coloreados.

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Además, para cada prueba de identificación también se deben seleccionar 1
muestra o material de prueba de la tabla 3, teniendo en cuenta su composición
molecular para una correcta interpretación de los resultados.
A. Reconocimiento de carbohidratos.

Numere tres tubos de ensayo, en un tubo adicione 2 mL del patrón negativo

seleccionado (tabla 2), en otro tubo 2 mL del patrón positivo seleccionado (tabla
2), en el tercero 2 mL de una muestra elegida de la tabla 3. Adicione 2 gotas de
reactivo de Molisch y mezcle cuidadosamente. Con los tubos inclinados agregue
1mL de ácido sulfúrico concentrado el cual forma una capa de ácido debajo de la
fase acuosa. Observe la coloración del anillo formado en la interfase, use los
patrones positivos y negativos como modelo de comparación y registre lo que se
observa en tablas. Para interpretar sus resultados, en todas las pruebas no olvide
tener en cuenta el color inicial de patrón o muestra y el color esperado de la
prueba positiva.

B. Reconocimiento de proteínas.

Numere tres tubos, en un tubo de ensayo adicione 3 mL del patrón negativo

seleccionado (tabla 2), en otro tubo de ensayo 3 mL del patrón positivo
seleccionado (tabla 2), en el tercero 3 mL de una muestra elegida de la tabla 3.
Agregue a todos los tubos 2 mL de reactivo de Biuret, agite, observe lo que
sucede y regístrelo en su tabla de datos.

C. Reconocimiento de lípidos saponificables

Numere cuatro tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada
patrón (positivo y negativo de tabla 2), en el tercero 1 mL de una muestra (tabla 3).
Agregue 3 mL de NaOH al 15% a cada tubo y una perla para ebullición, coloque al
baño maría durante 20 min (EN LA CABINA DE EXTRACCIÓN), adicione 3 mL de
agua destilada y agite fuertemente. Observe y compare con los patrones elegidos.

D. Reconocimiento de lípidos insaponificables

Numere cuatro tubos de ensayo, en un tubo de ensayo adicione 2 mL del patrón

negativo seleccionado (tabla 2), en otro tubo de ensayo 2 mL del patrón positivo
seleccionado (tabla 2), en el tercero 2 mL de una muestra elegida de la tabla 3.
Adicione a todos los tubos 3 mL de cloroformo y mezcle, luego agregue 1 mL de
anhídrido acético cuidadosamente por las paredes del tubo y agite, finalmente
coloque 3 gotas de ácido sulfúrico también por las paredes y observe la coloración
de la interfase al minuto y a los 15 minutos. Compare y registre sus resultados.
E. Reconocimiento de ADN

Numere tres tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada
patrón (positivo y negativo de tabla 2), en el tercero 1 mL de una muestra (tabla 3).
A cada tubo adicione 1 mL de agua destilada, suspenda la muestra, agregue 1 mL

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de difenilamina, mezcle bien y caliente al baño maría por 10 minutos, sin dejar que
haya ebullición, luego enfríe a baño de hielo, observe durante 10 minutos y
registre los resultados en las tablas correspondientes.
Tabla 3 Composición molecular de las muestras utilizadas en esta práctica

MUESTRAS
Harina de trigo (100 g)
Extracto de papa criolla (100
g)
Leche entera (250 mL)
Leche descremada (250 mL)
Leche deslactosada (250 mL)
Clara de huevo (100 g)
Aceite de cocina de soya
(100 g)
Gelatina (100 g)
Pedazos de papel (100 g)
Cerebro de vaca (100 g)
Yema de huevo (100 g)
Cebolla cabezona (100 g)
Hígado de pollo
Fuente: Tabla de composición de alimentos Colombianos. Bogotá: Bienestar Familiar, 2005 .
COMPOSICIÓN
Proteína 10,5 g. Grasa total 1 g. Carbohidratos 76,1
g
Proteína 1,9 g. Lípidos 0,1 g. Carbohidratos 21,6 g
Proteína 8 g. Grasa total 8 g. Carbohidratos 12 g.
Colesterol 25 mg.
Proteína 6 g. Grasa total 0,2 g. Carbohidratos 11 g.
Colesterol 0 mg.
Proteína 8 g. Grasa total 4,5 g. Carbohidratos 11 g.
Colesterol 20 mg.
Proteína 10,9 g. Carbohidratos 0,73 g. Triglicéridos
0,17 g. Agua 88,2 g.
Grasa saturada 14,9 g, Grasa moninsaturada 43,0 g.
Grasa poliinsaturada 37,6 g.
Proteína 12,7 g.
Carbohidratos 95,0 g.
Grasa total 7,60 g. Esteroides 2000 mg.
Carbohidratos 0 g. Proteínas 10,1 g.
Grasa total 30,87 g. Esteroides 2,4 g. Proteína 16.7
g. Carbohidratos 1,78 g.
Agua 89,11 g. Proteína 1,1 g. Carbohidratos 9,34 g.
Ácidos nucleicos: 0,93%. Triglicéridos 0,1 g.
Proteína (g) 19 g. Grasa total 4.38 g. Colesterol mg.
Glúcidos 5.30 g

V. BIBLIOGRAFÍA

Badui, Salvador. (2010). Química de los Alimentos. 4 ed. México: Pearson Addison
–Wesley.

Curtis, Helena y Barnes, Sue. (2008). Biología. 8 ed. Buenos Aires: Médica
Panamericana.

Plummer, David T. (1981). Bioquímica práctica. Barcelona: Mc Graw-Hill

Latinoamericana.

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 PREINFORME / IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS

PREINFORME Nombre ____________________________ Grupo __________

Realice todos los numerales del preinforme: título y consulta, fichas técnicas,
procedimiento en diagramas de flujo, resultados esperados y bibliografía de
acuerdo con las indicaciones de su profesor. Recuerde que solo entregará por
escrito el título, las fichas técnicas, diagramas de flujo, resultados esperados y
bibliografía. En su quiz de laboratorio (oral o escrito) se le evaluarán sus
diagramas de flujo y la consulta.

1. Consulta. Copie y llene la siguiente tabla para todas las muestras de la tabla 3
con las que va a trabajar. Fíjese en los modelos. En la columna “Nombre de las
biomoléculas que contiene” escriba varios de las más abundantes que se puedan
identificar con los reactivos de reconocimiento a usar en esta práctica. En la
columna de “Tipo de biomolécula” sea lo más específico posible, indique si es
carbohidrato, lípido, proteína o ácido nucleico, y aclare por ejemplo para los
carbohidratos si se clasifican como monosacáridos, disacáridos o polisacáridos,
reductores o no, y en los lípidos simples (tipo) o complejos (tipo), saponificables o
no. Utilice la información de esta tabla, junto con el fundamento teórico de la guía
para plantear sus resultados esperados
Nombre de las biomoléculas
Muestra Tipo de biomolécula
que contiene
X Almidón Carbohidrato, polisacárido
Y Proteínas
Proteínas
Sacarosa Carbohidrato, disacárido
no reductor
Z Glucógeno Carbohidrato,
homopolisacárido

2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Forma de
eliminar
Ácido sulfúrico

α-naftol

Sulfato de

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 cobre
(Reactivo de
Biuret)
Hidróxido de
sodio
(Reactivo de
Biuret)
Cloroformo

Anhídrido
acético
(Difenilamina)
Difenilamina

Ácido acético
glacial
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O),
inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C),
nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Utilice signos de
peligrosidad SGA

3. Bibliografía. Normas APA

4. Procedimiento

4.1 Reconocimiento de carbohidratos. Prueba de Molisch

Resultado esperado _________________________________________________

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

Diagrama de flujo:

4.2 Reconocimiento de proteínas

4.2 Reconocimiento de Proteína. Biuret

Resultado esperado _________________________________________________

__________________________________________________________________

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________________________________________________________________
4.3 Reconocimiento de lípidos saponificables (saponificación)

Resultado esperado________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________

Diagrama de flujo:

4.3. Reconocimiento de lípidos saponificables

Resultado esperado _________________________________________________

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

4.4. Reconocimiento de lípidos insaponificables (Lieberman)

Resultado esperado _________________________________________________

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

Diagrama de flujo:

4.5. Reconocimiento de ADN con difenilamina

Resultado esperado _________________________________________________
__________________________________________________________________

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__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Diagrama de flujo:

INFORME Nombre__________________________________ Grupo ________

1. Tablas de resultados con fotos de tubos debidamente marcados.

Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento e incluya los patrones
(positivo y negativo) y muestra debidamente nombrados y descritos (evite limitarse
a escribir tubo 1, tubo 2) y describa en forma organizada las observaciones en
cada tubo y si la prueba puede considerarse positiva o negativa.
2. Discusión de resultados
Para la elaboración del análisis de resultados use toda la información de la guía
(fundamento teórico y procedimiento), la consulta y resultados esperados en su
preinforme, así como los resultados obtenidos. No olvide que el análisis no se
resuelve a manera de cuestionario, explique en forma concreta tanto las pruebas
positivas como las negativas y redacte con citas en normas APA.
Para cada prueba explicar en forma concreta:
-El fundamento químico para la identificación de cada biomolécula (reactivo,
composición, explicación de reacción, ecuación química de reacción con patrón
positivo, prueba positiva, etc).
-La relación con los patrones positivos o negativos usados en la práctica y las
observaciones.
-Si hay presencia de carbohidratos, tipos de lípidos, proteína y ácidos nucleicos en
cada muestra, de acuerdo con la consulta del preinforme y las tablas de
composición molecular de la guía.
-Describir brevemente sus resultados esperados y si lograron o no verificarlos
durante la práctica.
3. Bibliografía: redacte la bibliografía con normas APA, que corresponda con las
citas usadas en el análisis de resultados.

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