Siembra en medios de cultivo y determinación de bacterias gram positivas y

negativas de acuerdo a sus tinciones

Resumen
Los microorganismos estan ampliamente distribuidos en distintos ambientes aun en
ambientes hostiles, como en aguas termales, el gran lago salado, los desiertos, entre otros.
Sin embargo, hay lugares en la tierra donde no ha sido demostrada la presencia de los
mismos, como en los volcanes en ebullicion. Una de las maneras mas sencillas para
demostrar , en el laboratorio la existencia de microorganismos de un determinado ambiente,
es por eso que es importante realizar este tipo de montajes para determinar que tipo de
bacterias estan presentes en los diferentes medios, para este caso se realizaron tomas de
muestras en diferentes zonas de la Universidad Distrital donde posteriormente se realizaron
los respectivos cultivos con el fin de identificar y determinar las diferentes formas y
agrupaciones bacterianas a partir de tecnicas para teñir y colorear estructuras importantes,
diferenciar las bacterias Gram postivas y Gram negativas utilizando tecnicas de coloracion
Gram.

Palabras clave
Gram postivas, Gram negativas, Tinción, colorantes, Bacterias, Esporas,
Introducción
El mundo de los microorganismos es muy amplio y su estudio requiere una
formación específica para manejar microorganismos, que entienda sus actividades
para que se pueda magnificarlas o utilizarlos como fábricas de bioprocesos o
bioindicadores de contaminación, que diseñe y ponga en marcha proyectos en el
área, siempre desde una perspectiva de respeto a la naturaleza y preservación del
medio ambiente. La realización de este trabajo práctico y teórico nos brinda la forma
más clara de identificación cuando se realiza la coloración Gram, para así poder
identificar las bacterias ( Gram+ y las Gram -). Al identificar las bacterias Gram
positivas decimos que tiene una pared celular muy gruesa formada por una capa de
peptidoglicano, ácido lipoteicoico y ácido láctico: A diferencia de las bacterias Gram
negativas que tienen una capa delgada de peptidoglucano una membrana externa
compuesta por lipoproteínas; Su pared en menos rígida de esta forma al realizar la
coloración Gram negativa que evidencia que hay una decoloración a diferencia de
las Gram positiva que no se decolora.

Medios de cultivos
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, éste debe reunir
una serie de condiciones tales como: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante. (Santambrosio,Ortega, 2009) .
Los medios de cultivos deben contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismos contaminante, los
medios de cultivo deben contener como mínimo carbono, nitrógeno, azufre, fósforo
y sales inorgánicas. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio
artificial debe tener unas condiciones físicas tales como la temperatura , humedad y
presión de oxígeno adecuadas . El Agar es el principal agente solidificante utilizado
en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al
enfriarse a 40°C. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes
complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano.
- Clasificacion de medio de los cultivos.
● Líquidos: Líquidos Usualmente se denominan caldos ya que contienen
los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con
un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
(Santambrosio,Ortega, 2009) .
● Sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales
se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel.
Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo
(Santambrosio,Ortega, 2009) .

Los medios de cultivos tienen diferentes propósitos según el estudio y se clasifican

en:
- Medios de enriquecimiento: Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en
medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de
microorganismo en relación con el número de otros tipos de microorganismos
que puedan estar en el inóculo. Un medio de enriquecimiento puede contener
sustancias que favorezcan el crecimiento del microorganismo que nos
interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos
presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está
determinada únicamente por la composición química del medio usado, sino
que en un medio dado puede ser variada significativamente modificando
otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación,
aireación, etc. (Santambrosio,Ortega, 2009).
- Medios selectivos: Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se
diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de
microorganismos específicos. (Santambrosio,Ortega, 2009).
- Medios diferenciales: No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten
el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero sí contienen
indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los
microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan
para la identificación de los microorganismos.(Santambrosio,Ortega, 2009).
- Medios selectivos diferenciales: A veces se combinan en un mismo medio las
características de ser selectivo y diferencial. (Santambrosio,Ortega, 2009).
El agar es un polisacárido compuesto por galactosa, un azúcar simple, cuando se
disuelve en agua a alta temperatura y luego se enfría, adquiere una consistencia de
gelatina. El agar tiene varias funciones una de ellas es espesar preparaciones
gastronómicas y aclarar bebidas como la cerveza pero el más utilizado en el
laboratorio sirve como un medio de cultivo para el desarrollo de hongos y de
bacterias.

En la actualidad, se emplean diferentes técnicas para la caracterización e

identificación de bacterias, hongos y levaduras en el laboratorio. Entre estas, se
encuentran las técnicas fenotípicas que consisten en realizar una caracterización
macroscópica, evaluando caracteres como color, textura, forma, entre otras, y
microscópica, con ayuda de tinciones como la Tinción de Gram para bacterias y
Tinción de Azul de lactofenol para hongos (ISO 4833, 2003).

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones

adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología
por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los organismo en análisis.
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque,
además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener
resultados reproducibles. Para su almacenamiento, los medios de cultivo,
generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad
y protegidos de la luz solar directa (ISO 4833, 2003).

Composición de los medio de cultivo.

EMB
Es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido
desarrollo y pocas exigencias nutricionales. Es nutritivo por la presencia de peptona
que favorece el desarrollo microbiano, permite el desarrollo de todas las especies de
la familia Enterobacteriaceae. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar
la lactosa y/o sacarosa está dada por los indicadores eosina y azul de metileno.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico
brillo metálico (Britania 2010).

Fórmula:
Peptona 10.0 g
Lactosa 5.0 g
Sacarosa 5.0 g
Fosfato dipotásico 2.0 g
Eosina 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
Agar 13.5 g
Agua purificada 1000 ml
pH final: 7.2 ± 0.2

Sabouraud
Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos,
particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo). En el medio de
cultivo, la peptona, la tripteina y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH
ácido, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y
levaduras. El agar es el agente solidificante (Britania, 2015).

Fórmula: (gramos por litro)

Peptona 5.0
Tripteína 5.0
Glucosa 40.0
Cloranfenicol 0.05
Agar 15.0
pH final: 5.6 ± 0.2

Agar Nutritivo
Medio de cultivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne
constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo
bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar
es el agente solidificante (Britania, 2015).

Fórmula: (gramos por litro)

Pluripeptona 5.0
Extracto de carne 3.0
Cloruro de sodio 8.0
Agar 15.0
pH final: 7.3 ± 0.2

Metodología y materiales

- Caja de petri con agar nutritivo

- Mechero
- Estufa
- Cinta de enmascarar
- Portaobjetos - cubreobjetos
- Diferentes cultivos bacterianos
- Colorantes básicos ( Cristal violeta , lugol , alcohol acetona, Safranina, azul
de metileno)
- Colorantes Ácidos ( tinta china)
- Aceite de inmersión
 - Microscopio
- Asa esterilizada

● Preparación de medios de cultivos

Para la preparación del medio se usó la caja de petri donde anteriormente fueron
esterilizadas por la autoclave y así evitar una contaminación de hongos, esporas
que pueden afectar en las muestra tomadas. En cada caja petri se había dispuesto
el agar de EMB 36 g/H ( eosina- azul de metileno) , sabouraud 20 g/H , agar nutritivo
20g /H y caldo nutritivo 13g/H. Cada una de las cajas petri se destaparon en
diferentes lugares de la universidad, para este caso el agar nutritivo se tomó en el
laboratorio de kumangi, el de sabouraud en el avenida circunvalar y el EMB en el
baño de laboratorios de la sede B de la universidad Distrital. Posteriormente se
dejaron expuestas por unos 15 minutos, después de este periodo se tapó
adecuadamente para así observar los microorganismos que crecieron durante una
semana después de la toma de muestras.
● Observación de bacterias
Para poder observar y análisis de las colonias bacterianas se usaron dos métodos,
uno que fue el montaje húmedo y el otro por una preparación sólida. Para la
preparación húmeda se usa para determinar bacterias como cocos, bacilos y
espirilo, para ello se realizó el siguiente procedimiento.
- Montaje húmedo: Limpiar el portaobjetos con alcohol , esterilizar el asa pasando
repetidamente por el mechero hasta obtener una coloración roja en la punta del asa,
tomar con el asar previamente estéril una pequeña muestra del cultivo, depositar la
muestra lentamente sobre el portaobjeto y evitar que se formen burbujas
posteriormente observar en el microscopio con un objetivo de 40x y 100x usando el
aceite de inmersión. Cabe aclarar que para estos montajes siempre se realizaron
cerca al mechero para evitar cualquier tipo de contaminación que afecte la muestra .

- Montaje en medio sólido: Depositar un portaobjeto una gota de agua destilada,

tomar el asa esterilizada una pequeña muestra del medio de cultivo, adicionar
alcohol y flamear la muestra por unos pocos minutos sobre el mechero, finalmente
cubrir la preparación con un cubreobjetos y observar en el microscopio con los
objetivos 40x y 100x usando este último el aceite de inmersión. Cabe aclarar que
para estos montajes siempre se realizaron cerca al mechero para evitar cualquier
tipo de contaminación que afecte la muestra .

Para la tinción de colorantes básicos permiten observar claramente la morfología de las

bacterias ya que tienen el mismo índice de refracción de luz por lo tanto al momento de
observarlas por el microscopio serán transparentes, por eso es importante realizar este tipo
de montajes ya que permiten caracterizar algunas estructuras externas y que clase de
agrupación pueden formar las bacterias. Para realizar este montaje se realizó el siguiente
procedimiento: Esterilizar el asa flameando la punta, dejar enfriar el asa en los extremos de
la caja de petri, tomar una pequeña muestra, tomar otra muestra del tubo donde se
encuentra el cultivo inocuo y depositarla en el portaobjeto haciendo un frotis, fijar la muestra
a través de calor regulando la temperatura y evitar un sobrecalentamiento, adicionar el
colorante ( cristal violeta, lugol y fucsina).
 - Tinción con colorante ( tinta china): Los colorantes ácidos (aniónicos) están
cargados negativamente, por lo tanto van a ser repelidos por los componentes
orgánicos de las estructuras celulares, por lo que no penetran la célula,sino, que tiñe
el medio donde se encuentran. Este tipo de colorantes se emplea para observar la
forma de la célula ( Montoya, 1999). Para hacer ese procedimiento hay que hacer
una disolución tomando el cultivo de muestra y agua, agregar una gota del colorante
( tinta china) sobre la muestra, extender el cultivo teñido en un portaobjeto hasta
obtener una película fina finalmente dejar secar la muestra a temperatura ambiente.
Cabe aclarar que la muestra no se fija con la llama del mechero se debe dejar
condensar para reducir la intensidad de la luz. Este procedimiento se realizó cerca
al mechero para evitar cualquier tipo de contaminación por hongos o esporas.
● Tinción Gram: Las tinciones diferenciales se caracterizan porque no tiñen de
forma homogénea a todo tipo de células, la tinción Gram es una de las más
importantes en microbiología porque permite diferenciar a las bacterias en
Gram negativas y positivas , con relación a la diferencia de la pared celular.
En esta coloración los reactivos como cristal violeta colorante primario tiñen
las bacterias y la solución fijando un color de azul más fuerte.
(Montoya,1999). El alcohol cetona actuará como decolorante al eliminar de la
pared celular de las Gram negativas la capa lipídica, permitiendo que el
colorante. Para este procedimiento se preparó y se fijó un frotis agregando
cristal violeta durante menos de un minuto, lavar con agua para eliminar el
exceso de colorante , cubrir con lugol durante un minutos y lavar con agua
para eliminar el exceso de colorante, cubrir el frotis con alcohol acetona
durante unos 30 segundos y lavar rápidamente con agua, agregar el
colorante fucsina y lavar la muestra con agua para eliminar el exceso de
colorante dejando secar, finalmente observar la muestra al microscopio con
los objetivos 40X y 100X este último con aceite de inmersion.
● Coloración de esporas bacterianas: Para teñir una endospora es
indispensable utilizar una coloración especial , verde Malaquita , la Safranina
y el calor como fijador, para este procedimiento se preparó y se fijo un frotis
de la muestra a partir de los cultivos de muestra dispuestos en clase, cubrir
con Verde Malaquita , flamear la muestra, Repetir este procedimiento por
unos cinco minutos evitando que el Verde Malaquita se evapore, seque o se
ebulla, enfriar la preparacion durante unos cinco minutos , lavar el exceso de
colorante, dejar secar la prepracion y finalmente observar al microscopio con
los objetivos de 40X y 100X. Cabe aclarar que este procedimiento se realizo
cerca al mechero para evitar contaminacion de la muetra.

Resultados
Se identificaron la bacterias E. coli y el hongo C. albicans que de acuerdo a la
tinción de gram se determinaron si eran bacterias gram positivas o gram negativas
correspondientemente:
 agar nutritivo

EBM

saboroud
 liquido

agar nutritivo gram positivas

Discusión
La técnica de tinción en bacterias se diferencian dos grandes grupos las
grampositivas que se tiñen de color azul violeta y las gramnegativas adquieren un
color rosa o rojo. esto se debe a la diferencia estructural de la pared, puesto que la
pared de una célula gram positiva está formada por una única capa homogénea de
20 a 80 nm de grosor de peptidoglicano o mureína, situada por fuera de la
membrana celular. Por el contrario, la pared de la célula gram negativa es más
compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada por una
membrana externa (Pírez & Mota, 2010).

Se evidencio en el laboratorio que Escherichia coli es un bacilo gram negativo,

anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu Escherichia, estos son
microorganismos en forma de bastón y miden aproximadamente de 1-3 μm de largo
y 0,5 μm de diámetro. Estas, son bacterias gram negativas pues su envoltura
celular está caracterizada por una estructura multilaminar. La membrana interna
está compuesta por una doble capa de fosfolípidos que se encarga de la regulación
del paso de nutrientes, metabolitos y macromoléculas. La capa externa, está
compuesta por un peptidoglucano delgado junto con un espacio periplásmico que
contiene una elevada concentración de proteínas. La membrana externa compleja
consiste en otra doble capa de fosfolípidos que incluyen lipopolisacáridos (García &
Rodríguez, 2010). Lo que permite inferir que el resultado es positivo debido a que
Escherichia coli es un bacilo gram negativo.

A su vez se pudo observar que Candida albicans, es un hongo gram positivo en el

que se pueden distinguir en forma de levadura, corroborando con la literatura “la
tinción de Gram mejora mucho la observación en fresco, pues pueden distinguirse
más fácilmente las células levaduriformes. La presencia de pseudohifas o hifas y
células inflamatorias en un frotis se valora más que la de blastosporas en relación
con una posible infección. La presencia de hifas o pseudohifas sugiere infección por
Candida albicans. Por lo que un cultivo positivo sólo demuestra la presencia de
levaduras, pero no de infección, sobre todo en ausencia de clínica sugestiva” (Silva,
2007).

En cuanto a la tinción de cápsula, utilizando tinta china que de acuerdo con

Kunjapu, “es un sistema complejo de tipo coloidal basado en partículas de pigmento
finas de carbón, dispersas en un disolvente acuoso u orgánico”. Se puede decir que
es la base preferente de la tinción negativa en el laboratorio clínico, en donde es
utilizada en el diagnóstico microbiológico que permite contrastar las muestras
mediante una sustancia opaca a los fotones, que aumenta el contraste con el medio
externo, es decir, que tiñe el fondo y resalta las células que quedan sin color, de tal
modo que es una tinción no invasiva; es un método rápido y económico que no
requiere una etapa de hidrólisis en la preparación y que además, muestra una
buena correlación con técnicas costosas que consumen más tiempo (Vásquez, et
al., 2016), es por esto que es implementada para ver la cápsula de las bacterias. La
cápsula es “una envoltura externa, ubicada por fuera de la pared celular, mucosa,
que forma un gel que se adhiere a la célula” (Pírez & Mota, 2010). Debido a que
esta estructura tiene un alto contenido de agua se tiñe levemente por los colorantes,
además como en el caso de la tinción negativa (con tinta china) que utiliza tintes
ácidos, que poseen un cromógeno negativo que no penetra a la célula de la bacteria
a causa de la carga negativa que se encuentra en la pared celular, puesto que este
elemento no se tiñe con las bases (Isa, 2014).

El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva

débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células
vegetativa . Cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas
(Iañez, 2003). Algunos géneros bacterianos producen en su interior formas de
resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones
ambientales son desfavorables formándose una espora por cada forma vegetativa.
Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior (Instituto Superior de Formación Profesional, 2019). Las
endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. El calor modifica la permeabilidad de la endospora y
permite la entrada del colorante a través de las capas externas de la endospora, el
lavado con abundante agua produce la decoloración de las formas vegetativas así
como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por último con un
colorante de contraste, la safranina (Vázquez, et al., 2010).

● Agar nutritivo Medio sólido que se prepara añadiendo agar a un caldo

nutritivo. Existen diversas clases de agar nutritivo comercializadas, El agar-
agar, (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son
las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la
introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las
interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar
presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de
los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que
son mesófilas. Un comportamiento notable del agar es que una vez fundido
(a 100ºC), no gelifica (solidifica) hasta los 45ºC. En este margen de
temperatura hasta el límite de solidificación de 45ºC se dice que el agar está
en sobrefusión.
En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.

● emb en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de

bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando
producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono.
bullet El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o
carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas
bacterias.
Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.

P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno maneja en los prácticos. Se trata

de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras
sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y
violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al

violeta cristal, y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a
las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas
membranas externas). En cambio, las Enterobacterias están evolutivamente
adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de
vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio. En su faceta de
medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de
Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción
de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio
 gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus
alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro;
además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias,
fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la
acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren
como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el
esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de
cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

● El Agar Sabouraud Dextrosa y el Sabouraud Dextrosa Broth son

medios originalmente desarrollado para el cultivo de dermatofitos. al
ser un agar tan taltammente especializado desarrolla el cultivo para
solo algunas formas microscopicas, en día se utiliza para el
aislamiento y cultivo de todo tipo de hongos. La peptona es la fuente
de nitrógeno necesaria para conseguir crecimientos conjuntamente
con la Glucosa a alta concentración. Esta alta concentración de
Glucosa favorece a los hongos frente a las bacterias que no toleran
estas concentraciones. El pH ácido es óptimo para el crecimiento
fúngico , pero no para las bacterias en general salvo las acidófilas.
Este medio está recomendado para el estudio de las características
morfológicas de las colonias de los hongos . El Agar Sabouraud
Cloranfenicol y Gentamicina-Cloranfenicol , incorpora en su
formulación un antibiótico ( Cloranfenicol) de amplio espectro que
inhibe a un amplio rango de bacterias Gram positivas y negativas, pero
también tiene efectos inhibitorios sobre varios hongos patógenos. La
presencia de Gentamicina (Aminoglucósido) proporciona unas
inhibiciones bacterianas más selectivas . El Sabouraud con
Cloranfenicol y Cicloheximida , es un medio muy selectivo donde se
inhiben crecimientos de hongos saprofitos y levaduras, favoreciendo el
aislamiento de dermatofitos . El Sabouraud Emmons con
Cloranfenicol, tiene una disminución del contenido en Glucosa y un
ajuste de pH a 7.

Conclusiones

Bibliografía
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