Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
REACCIONES ENZIMÁTICAS DE OXIDO-REDUCCIÓN 2.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD SDH-CIT, CITOCROMOS Y
CITOCROMO OXIDASA
Sección 1 Grupo: 3IM2
Introducción:
La succinato deshidrogenasa o succinato
coenzima Q reductasa es una flavoproteína
ligada a la membrana interna mitocondrial que
interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de
transporte de electrones y que contiene FAD
(flavín-adenín-dinucleótido) unido covalente, los
electrones pasan directamente a la cadena. Es
una enzima integral de membrana, y es una
ferrosulfoproteina. Cataliza reacciones de
óxido-reducción, así que su clasifica como una
enzima oxidorreductasa.
La subunidad mayor del succinato
deshidrogenasa contiene FAD+, cuatro átomos
de hierro y cuatro átomos de azufre
ácido-lábiles. La subunidad menor es una
ferro-sulfuro-proteína que contiene cuatro
átomos de hierro y cuatro de azufre
ácido-lábiles.
La molécula de FAD+ del enzima, es el aceptor
de electrones de la reacción. En general la
función bioquímica del FAD es oxidar los
alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida
los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es
debido a que la oxidación de un alcano (como el
succinato) a un alqueno (como el fumarato) es
suficiente exergónica como para reducir el
FAD+ a FADH2, pero no para reducir el NAD+
a NADH. Es poco usual hallar una unión
covalente entre el FAD+ y una proteína; en la
mayoría de los casos, el FAD+ se encuentra
unido a su enzima asociado de forma no
covalente (unión débil y transitoria). por lo que
en este caso el FAD actúa como grupo prostético
y no como un coenzima móvil, como lo hace
normalmente.
El FADH​2 del succinato deshidrogenasa, al no
poder desprenderse del enzima, debe oxidarse
nuevamente in situ. El FADH​2 cede sus dos
hidrógenos a la ubiquinona (coenzima Q) que se
reduce a ubiquinol (QH2) y abandona el enzima,
difundiendo en la bicapa lipídica hasta alcanzar
en siguiente complejo enzimático de la cadena
respiratoria.
La succinato deshidrogenasa actúa separando los
átomos de hidrógeno que se hallan en posición
trans de los átomos de carbono metilénicos del
succinato.
Este enzima posee algunas características de un
enzima alostérico: es activada por el succinato,
el fosfato, el ATP y el coenzima Q reducido , y
es inhibido por el malonato, un análogo
estructural del succinato.
La enzima Citocromo oxidasa es la última de la
cadena de transporte de electrones respiratoria
de las mitocondrias situada en la membrana
mitocondrial. Recibe un electrón de cada uno de
cuatro moléculas de citocromo C, y los
transfiere a una molécula de oxígeno molecular
que se reduce dos moléculas de agua.
Objetivos:
Determinar la función e importancia de enzimas
del Ciclo del ácido cítrico y cadena de transporte
de electrones para llevar a cabo las reacciones.
Argumentar la importancia de los cofactores y
coenzimas de las enzimas oxidorreductasas y el
impacto de sus inhibidores.
Resultados

Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Coloracion 5 0 4 5 3 1 2
Tabla 1. Actividad deshidrogenasa succínica.
Mayor intensidad 5 y menor intensidad 0
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 endógeno que reduce una pequeña cantidad de
azul de metileno además de que la reacción fue
Se más lenta. En el tubo 4 al minuto se observa el
Hub Cam obse azul de metileno se está reduciendo a una
o un No bio a Lige rva velocidad en comparación con el tubo testigo y
Se liger hay color ro un al final de la reacción, el tubo tiene un aspecto
torno No o cam mora cam liger No similar tubo 1 sin embargo esto no es lo
Colo de hubo cam bio do bio o hay esperado puesto que el tubo contenía malonato
racio color cam bio a de oscu mora cam camb de sodio (1 mL) que es un inhibidor competitivo,
n cafe bio cafe color ro do bio io es decir que tiene una forma similar al sustrato
Tabla 2. Determinación de la actividad del que en este caso es el succinato, y no permite
sistema de citocromos y citocromo oxidasa. que la enzima catalice la reacción, este efecto se
debe a que hubo una mal preparación de los
Discusion tubos en donde se colocó más concentración del
En la determinación de la actividad de la sustrato, de igual manera en el tubo 5 no se
deshidrogenasa succínica en la primera imagen encontró lo que se esperaba puesto que se
se observa que los tubos al inicio de la reacción observa al azul de metileno reducido en menor
todos tenian una coloración azul en algunos ya proporción a pesar de que tenía el inhibidor (0.5
se observa que se estaba llevando a cabo la mL). Por otra parte en los tubos 6 y 7 se
reacción debido a una tonalidad verde. En la esperaba encontrar evidencia de que había
segunda foto que se tomó al minuto de ocurrido la reacción con una decoloración del
incubación y presentan pequeños cambios de receptor artificial de electrones con diferente
coloración unos más que otros como en el tubo 1 intensidad debido a que había menor proporción
que se observaba la reacción casi terminada. Al del inhibidor; sin embargo se observa que la
pasar 1.09 min se dio por terminada la reacción reacción no sucede puesto que tiene coloración
con el tubo 1 teniendo un total de tiempo de 2.09 azul, esto también se puede deber a una mala
min. Al terminar la reacción (imagen 3), en el preparación de los tubos y ademas de que se
tubo 1 se tomó como el testigo en donde se combinaron los extractos obtenidos de otras
tenían todas las condiciones favorables para que secciones de laboratorio puesto que se el
se llevará a cabo la reacción entre el succinato extracto original se terminó.
de sodio, el SDH-cit que producía FADH​2 y En el experimento de determinación de la
reduce el azul de metileno de que era el aceptor actividad de deshidrogenasa succínica al ser una
artificial de electrones que presentaba un cambio reacción anaeróbica, es decir, sin presencia de
de color de azul a incoloro nos indicaba que oxígeno y para evitar que el azul de metileno se
ocurre la reacción, esto es un ejemplo de lo que volviera a oxidar se utilizó una capa de aceite
ocurre en el ciclo de Krebs y pasa a cadena de vegetal, es también por eso que en los tubos la
transporte de electrones para después la reacción se presenta en la parte de abajo ya que
producción de ATP. En el tubo 2 se observa que es la que tiene menor contacto con la superficie
no hay reacción ya que a pesar de que existe y donde hay menos oxígeno.
succinato de sodio y azul de metileno este se
presenta en su estado oxidado y no hay En la fotografía de determinación de actividad
reducción porque no hay enzima que pueda del sistema de citocromos y citocromo oxidasa
llevar a cabo la reacción. En el tubo 3 se observa se observa los 8 tubos en los cuales cada uno
que existe un ligero cambio de color a pesar de tenía diferentes condiciones que nos iban a
que no hay sustrato para llevar a cabo la indicar cómo actúa la enzima en la reacción de
reacción sin embargo como la enzima proviene oxidorreducción de acuerdo al medio. En el
de un extracto crudo este contiene succinato primer tubo (viendo de izquierda a derecha) tuvo
una coloración café que nos indica que la
p-fenilendiamina se oxido y se polimeriza y no
se condeso por la falta del α-naftol. En el
segundo tubo no se presentó coloración debido a
que no existía en el medio la enzima para que
ocurriera la reacción de oxidorreducción, este
tubo solo contenía al α-naftol con agua. En el
tubo número 3 se observó nuevamente que la
reacción fue fue positiva, es decir, que la
p-fenilendiamina se polimerizar sin embargo se
puede observar un color más claro que el primer
tubo debido a que el tubo 3 contenía KCN que
es un inhibidor, además de que la reacción tardó
más efectuarse. El tubo 4 fue nuestro testigo
negativo puesto que sólo contenía agua y la
enzima, y no contenía p-fenilendiamina que
donaba los electrones para que ocurriera la
reacción, el color que se observa es el color del
extracto. Por otra parte en el tubo 5 fue nuestro
testigo positivo que contenía agua, enzima y
p-fenilendiamina; en este tubo se observó una
coloración morada que se debe a la
condensación del p-fenilendiamina con el
α-naftol que se produjo un compuesto llamado
azul de indofenol que junto con el color de la
enzima (rojo-naranja claro) se forma el color que
se observa, este tubo fue el que determinó el
final del experimento con un tiempo de 2
min.Los siguientes tubos se compararon con el
testigo positivo y el negativo. En el siguiente
tubo (6) se observó la rapidez con la que actuaba
la enzima porque solo había α-naftol, agua y el
p-fenilendiamina por lo tanto se observó solo
una ligera coloración morada. En tubo 7 se
observó que no hubo reacción debido a que
existía KCN como inhibidor, a diferencia del
tubo 3 este si contenía α-naftol y solo se observa
la coloración de la enzima. Por último en el tubo
8 se observa que no se lleva a cabo la reacción
debido que no hay enzima, además de que existe
el KCN que no deja el paso de electrones para
que la p-fenilendiamina se condense.
succínica requiere de su coenzima (FAD+) para
que se pueda llevar a cabo la reacción.
Otra cosa que se observó que para obtener el
extracto de la enzima sólo se hizo una vez a
diferencia de la deshidrogenasa láctica, esto se
debe a que el FAD en la deshidrogenasa
succínica está unido covalentemente y en la
deshidrogenasa láctica esta en union transitoria.
Conclusion
La reacción de la deshidrogenasa succínica
requiere de FAD que después se reduce y pasa a
cadena de transporte que se evidencia con la
reducción del azul de metileno.
En el extracto crudo una enzima se encuentra el
sustrato endógeno.
El azul de metileno es una indicador de
reacciones enzimáticas óxido-reducción.
El sistema de citocromos y citocromo oxidasa
ayudan a catalizar las reacciones de
oxidorreducción, en la célula.
El aceite vegetal sirve para generar una capa de
entre el experimento y el medio ambiente.
Bibliografía:
Murray R.K. Mayes P.A, Rodwell. V.W, (2003)
“Harper's Illustrated Biochemistry” Editorial
Lange Medical Books McGraw-Hill 26°Ed
pp.93-95
Conn E.E Stump, P K Bruening G. “
Bioquimica Fundamental, Editorial Limusa
Wiley S.A. 4ta Edicion pp 475-500

La diferencia entre la deshidrogenasa succínica

y el sistema de citocromos, este último puede
estar presente o no y aun asi la reaccion se va
dar porque existe un donador de electrones y
receptor de electrones solo que la reacción de va
dar mas lento, por otro lado la deshidrogenasa