ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE CEPAS NATIVAS DE Frankia EN Alnus Acuminata H.B.K.

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE CEPAS NATIVAS DE Frankia
EN Alnus acuminata H.B.K.
PRESENTADO POR: ANA MARIA REY OBANDO

CÓDIGO 186207
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRIA INTERFACULTADES EN MICROBIOLOGIA
BOGOTÁ, D.C. ENERO DE 2006

1
1
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado especialmente a mi amado esposo, Diego,

Quien fue el inspiradador de esta investigación, reflejo de su pasión hacía los sistemas silvopastoriles
Motor de mi vida y el mejor ejemplo de trabajo, esfuerzo y dedicación. Por que veo en él, el mejor reflejo del
verdadero maestro y por el inmenso amor que cada día me demuestra haciendo de mis triunfos los suyos!
A mi querida madre: Helen Mujer de ejemplo y lucha. Por darme lo mejor con sus enseñanzas, palabras y los
mejores consejos
La búsqueda de la verdad y el bienestar no debe ser

producto de la destrucción del medio ambiente!
Ana María Rey Obando
El amor, la perseverancia y el esfuerzo por generar conocimiento en

las relaciones simbióticas entre microorganismos eficientes y árboles
multipropósito nativos, permitirán contribuir en el País, al
desarrollo de sistemas de producción amigables con el ambiente, que
logren ser entendidos y acogidos por las nuevas generaciones
Diego Chamorro Viveros
1
AGRADECIMIENTOS
Doy mis agradecimientos:
Al Doctor Fernando Rodríguez Villamizar, por su compartir sus conocimientos, por creer en mi
apoyándome en el cumplimiento de esta meta que me permite crecer como persona y profesional
A la Doctora Margarita Carú, por compartir generosamente sus conocimientos científicos que me
permitieron escalar en esta nueva meta
Al Doctor Rolando Barahona, por sus contribuciones, consejos científicos y personales
A Gina Marcela Amado, Mi Ingeniera!, por su apoyo y demostración de la verdadera amistad
A Graciela Lancheros, por ser ejemplo de honestidad y lealtad
A José Gordillo, por sus enseñanzas y apoyo, producto de la experiencia de la vida
A Andrómeda Celeste, su valiosos apoyo y por compartir sus conocimientos y tiempo
A mis compañeros del postgrado, Anabella, Jazmín, Oscar y Daniel, por su amistad y sinceridad
A Jorge Rodríguez, por su colaboración incondicional y desinteresada en la ejecución de este trabajo
A Kelly y Santiago, mis queridos estudiantes, gracias por su colaboración
A Elizabeth y Fabian, mis pupilos, por su colaboración en los muestreos y pruebas bioquímicas
A CORPOICA y en especial a los funcionarios del Programa de Fisiología y Nutrición Animal. por el
apoyo en la ejecución de este trabajo
A Colciencias, por el financiamiento de esta investigación
Al Grupo técnico de Colacteos y todos los ganaderos que permitieron la recolección de nódulos en sus
fincas
A la Facultad de Ciencias y Posgrado de Microbiología Interfacultades de la Universidad Nacional de

Colombia, por permitirme continuar con mi formación profesional
¡A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la culminación de este trabajo, mil
gracias!
1
“El director de Tesis, el Presidente de Tesis y el Consejo Examinador de Grado, no serán
responsables de las ideas emitidas por el candidato”
(Artículo 217, estatutos de la Universidad Nacional de Colombia)
1
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 3
2.1. Los Sistemas ganaderos del trópico alto Colombiano 3

2.2. Alnus acuminata H.B.K. 3
2.2.1. Hábitat 5
2.2.2. Morfología 6
2.3. Fijación biológica del nitrógeno (FBN) 8

2.3.1. Genética de la fijación biológica del nitrógeno 9
2.4. Taxonomía de Frankia Brunchorst 12
2.4.1. Morfología y fisiología 13
2.4.2. Hábitat 15
2.4.3. Nódulos 15
2.4.4. Condiciones de aislamiento y cultivo 19
2.4.5. Diversidad genética en Frankia 20
2.4.6. La comparación de pequeñas subunidades del rRNA 16S 22
3. MATERIALES Y MÉTODOS 25
3.1. Localización 25
3.2. Clasificación de las zonas de influencia de los Departamento de Nariño y Cundinamarca 29
3.3. Recolección de muestras de suelo y raíces noduladas en Alnus acuminata en Nariño y
Cundinamarca 30
3.3.1. Lavado y desinfección de nódulos 31
3.3.2. Conservación de los nódulos 31
3.3.3. Aislamiento de cepas nativas de Frankia 32
3.3.4. Codificación de las cepas aisladas 33
3.3.5. Caracterización fenotípica de cepas de Frankia 33
3.3.6. Caracterización macroscópica y microscópica 33
3.3.7. Crecimiento de Frankia en diferentes fuentes de nutrientes 35
3.4. Evaluación en vivero de las cepas de Frankia en Alnus acuminata H.B.K. 37
3.4.1. Producción de plántulas experimentales de A. acuminata 37
3.4.2. Preparación de inóculos de Frankia 38
3.4.3. Inoculación de A. acuminata con las cepas de Frankia 39
1
3.5. Análisis estadístico 41
3.5.1. Diseño experimental 41
3.5.2. Variables experimentales 42
3.6. Identificación molecular de los aislados de Frankia 44
3.6.1. Preparación de las muestras de Frankia 44
3.6.2. Amplificación la región variable V2-V3 del gen 16S rDNA de Frankia por la reacción en cadena
de la polimerasa PCR 44
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48
4.1. Caracterización ambiental, edáfica y microbiológica de los sitios experimentales 48

4.2. Características de los nódulos recolectados de A. acuminata 51
4.2.1. Lavado y desinfección de nódulos 52
4.2.2. Aislamientos de Frankia obtenidos por Departamento 52
4.3. Características macroscópicas de los cultivos de Frankia 55
4.3.1. Características microscópicas de los aislados de Frankia 61
4.3.2. Evaluación de la producción de biomasa celular de Frankia en diferentes fuentes nutricionales y
pH 65
4.4. Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de los suelos 68
4.5. Evaluación de las cepas en Alnus acuminata en fase de vivero 70
4.5.1. Número de hojas (No/planta) 75
4.5.1.1. Nariño 75
4.5.1.2. Cundinamarca 76
4.5.2. Diámetro basal (mm) 76
4.5.2.1. Nariño 76
4.5.3. Altura (cm) 78
4.5.3.1. Nariño 78
4.5.4. Peso seco foliar (g/planta) 80
4.5.4.1. Nariño 80
4.5.5. Producción de materia seca total (g MS/planta) 82
4.5.5.1. Nariño 82
4.5.6. Longitud de raíz (cm) 85
4.5.6.1. Nariño 85
4.5.7. Peso seco radicular (g MS/planta) 86
4.5.7.1. Nariño 86
4.5.8. Número de nódulos (No/planta) 87
4.5.8.1. Nariño 88
2
4.6. Análisis de los resultados de la composición química de plantas de A. acuminata 91
4.6.1. Proteína cruda y nitrógeno total 91
4.6.1.1. Nariño 93
4.6.2. Concentración de fósforo 97
4.6.2.1. Nariño 97
4.7. Identificación molecular de los aislados de Frankia 99
4.7.1. Resultados de la amplificación la región variable V2-V3 del gen 16S rDNA de Frankia por la
reacción en cadena de la polimerasa PCR 99
4.7.2. Alineación de nucleotidos de las secuencias parciales obtenidas para las cepas de Frankia 101
5. CONCLUSIONES 104
6. RECOMENDACIONES 106
8. BIBLIOGRAFÍA 107
ANEXO 1 122
ANEXO 2 125
ANEXO 3 126
3
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Productos codificados por los genes nif y sus funciones en la FBN 11
Tabla 2. Información general de las zonas de recolección de las muestras en Nariño 26
Tabla 3. Información general de las zonas de recolección de las muestras en Cundinamarca 26
Tabla 4. Estaciones de información climática en Nariño y Cundinamarca 26
Tabla 5. Codificación de las cepas de Frankia aisladas 33
Tabla 6. Evaluación mineral de fuentes alternativas de nutrientes 36
Tabla 7. Tratamientos evaluados en la fase de vivero 41
Tabla 8. Condiciones de concentración de DNA genómico de Frankia 44
Tabla 9. Análisis microbiológico del las muestras de suelo de Alnus acuminata 49
Tabla 10. Relación entre el número de esporas y el porcentaje de colonización de micorrizas asociadas a A.
acuminata de Cundinamarca (a) y Nariño (b) 50
Tabla 11. Morfología de las cepas de Frankia en medio líquido BAP aisladas de Nariño 53
Tabla 12. Morfología de las cepas de Frankia en medio líquido BAP aisladas de Cundinamarca 54
Tabla 13. Análisis de nutrienes del extracto de raíz de Alnus acuminata 59
Tabla 14. Crecimiento de las cepas en diferentes fuentes nutricionales y pH 65
Tabla 15. Análisis fisicoquímicos de los suelos utilizados en la evaluación de las cepas de Frankia en vivero 68
Tabla 16. Análisis microbiológico de los suelos empleados en este estudio 68
Tabla 17. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Nariño 71
Tabla 18. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Nariño 72
Tabla 19. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de
Cundinamarca 73
Tabla 20. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de
Cundinamarca 74
Tabla 21. Respuesta del efecto de la inoculación con Frankia aisladas de Nariño en las variables de composición
química en A. acuminata a los 125 días de edad después de la inoculación 92
Tabla 22. Respuesta del efecto de la inoculación con Frankia aisladas de Cundinamarca en las variables de
composición química en A. acuminata a los 125 días de edad después de la inoculación 93
1
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Sistemas silvopastoriles con Alnus acuminata. Chiquinquirá 4

Figura 2. Alnus acuminata H.B.K. Chiquinquirá (Boyacá) y Mosquera (C.I. Tibaitatá) 5
Figura 3. Detalle de hojas y ramas de Alnus acuminata H.B.K. 6
Figura 4. Frutos femeninos (a) y masculinos (b) de Alnus acuminata H.B.K. 7
Figura 5. Frutos femeninas y semillas de A. acuminata 7
Figura 6. Estructuras especializas de aislamientos de Frankia crecidas en medio BAP libre de
nitrógeno. 14
Figura 7. Formas y tamaños de nódulos de Frankia en Alnus acuminata 15
Figura 8. Formación de nódulos de Frankia en raíces de A. acuminata 18
Figura 9. Grupos filogenéticos de plantas actinorrizas y de Frankia 21
Figura 10. Modelo de la estructura secundaria de SSU rRNAs 24
Figura 11. Mapa de las zonas de recolección de las raíces noduladas en Cundinamarca 27
Figura 12. Mapa de las zonas de recolección de las raíces noduladas en Nariño 28
Figura 13. Recolección de los nódulos en bosques de Alnus acuminata 30
Figura 14. Corte de un lóbulo de nódulo y crecimiento de Frankia en medio sólido y líquido BAP 32
Figura 15. Esquema general del montaje de las muestras 35
Figura 16. Prueba de crecimiento de Frankia en diferentes fuentes nutricionales 36
Figura 17. Germinador y plántulas de Alnus acuminata 38
Figura 18. Extracto acuoso de raíz de Alnus acuminata 38
Figura 19. Preparación de inóculos de Frankia en turba estéril 39
Figura 20. Siembra de los tratamientos experimentales en plántulas de A. acuminata 40
Figura 21. Organización por bloques de la inoculación en A. acuminata con cepas de Frankia 40
Figura 22. Plántulas de A. acuminata para ser transportadas al laboratorio 42
Figura 23. Plantas de Alnus acuminata listas para su evaluación 43
Figura 24. Plantas Alnus acuminata durante el proceso de muestreo 43
Figura 25. Termociclador Biorad 45
Figura 26. Preparación del gel de agarosa 45
Figura 27. Esquema general del proceso del producto de PCR para la corrida por electroforesis 46
1
Figura 28. Precipitación y temperatura promedio de marzo y abril de 2004 de las zonas de recolección
de las muestras en Nariño 48
de las muestras en Cundinamarca 48
Figura 30. Diversidad en la morfología y el tamaño de los nódulos recolectados 51
Figura 31. Nódulos antes y después del lavado con peróxido de hidrógeno al 10% 52
Figura 32. Bosque de A. acuminata en Nariño zona de mayor obtención de aislamientos de Frankia
(Pasto, Cubijan Alto, Finca Los Arrayanes) 55
Figura 33. Bosque de A. acuminata de Cundinamarca zona de mayor obtención de aislamientos de
Frankia (Usme, Finca Villa Nataly) 56
Figura 34. Formación de pigmentos blancos de la cepa de Frankia CN49 57
Figura 35. Crecimiento de Frankia sobre los cortes de nódulos en medio BAP libre de antibiótico 58
Figura 36. Crecimiento de Frankia a los 30 días en medio líquido BAP con extracto de raíz 60
Figura 37. Crecimiento a los 30 días de incubación en medio BAP sin extracto de raíz 60
Figura 38. Crecimiento en medio líquido BAP de las cepas AacI y AacIII 61
Figura 39. Hifas septadas características de Frankia 61
Figura 40. Vesículas de Frankia en medio BAP libre de nitrógeno 61
Figura 41. Producción intra y final de esporangios típicos de Frankia 62
Figura 42. Secuencia de formación de esporangios (100x) 63
Figura 43. Estructuras especializadas del aislamiento de Frankia medio líquido BAP libre de
nitrógeno 64
Figura 44. Conservación de las cepas Frankia en medio BAP sólido y líquido BAP con glicerol 64
Figura 45. Producción de biomasa celular de tres cepas Frankia en condiciones controladas 67
Figura 46. Amplificación de productos purificados de cepas de Frankia. 100
Figura 47. Alineamiento en nucleotidos de las secuencias parciales obtenidas para Frankia 103
2
RESUMEN
Esta investigación estuvo enfocada en la evaluación integral de cepas nativas de Frankia

asociadas con Alnus acuminata H.B.K. y contempló el aislamiento, caracterización fenotípica,
evaluación de la efectividad y la identificación molecular. La zona de influencia de este proyecto fue el
Bosque Alto Andino Colombiano, representado por los Departamentos de Nariño y Cundinamarca. La
recolección de muestras de raíces noduladas fue realizada en bosques nativos de A. acuminata en los
Municipios de Pasto, Sapuyes, Pupiales y Tangua en Nariño y Facatativa, Mosquera, Funza y la
localidad de Usme en Cundinamarca. Se obtuvieron 25 aislamientos en Nariño y 26 en Cundinamarca.
Microscópicamente las cepas presentaron un micelio ramificado, esporangios inter y finales y

producción de vesículas; macroscópicamente, los cultivos presentaron producción de micelio no aéreo,
de formas y colores contrastantes, de crecimiento aerofílico y microaerofílico características
morfológicas propias del género Frankia. Las cepas mostraron diferencias en la utilización de fuentes
de nutrientes, logrando mayor crecimiento con el ácido pirúvico y pH de 6.5, que permitió clasificarlas
dentro del Grupo B. Adicionalmente, se logró estimular la producción de biomasa celular con la
adición del 10% del extracto de raíz de A. acuminata al medio BAP.
Con el fin de valorar la efectividad y eficiencia de los aislados, se realizó en el C.I. Tibaitatá de
CORPOICA, bajo un diseño de bloques completos al azar, una evaluación sistemática en vivero en
plántulas de A. acuminata, a los 45, 90 y 125 días después de la inoculación. El sustrato utilizado fue
representativo de los suelos de los sitios de recolección de las cepas, a los cuales se le realizó análisis
fisicoquímicos y microbiológicos con el fin de establecer la línea base.
En todos los muestreos, los aislados mostraron la capacidad de asociarse con el hospedero
original, por lo cual, fueron clasificados como típicos y a medida que aumentaba la edad de la
actinorriza, se consolidó la diferencia entre los tratamientos, mostrando amplia variabilidad en las
respuestas dasométricas, microbiológicas y nutricionales Los tratamientos que mostraron
consecuentemente mayores respuestas en las variables evaluadas fueron el T16:CN49 procedente del
Municipio de Pasto, Vereda Cubijan Alto y la cepa T4:CC17 aislada de la Localidad de Usme, vereda
Olarte.
I
En el Departamento de Nariño, las plantas inoculadas con la cepa CN49 se caracterizaron por
superar al testigo en: producción de materia seca total en un 157, 226 y 221.3%; longitud radicular en
un 47.8, 167.2 y 52.3%; peso seco radicular 344, 245 y 251%, en el número de nódulos en un 211,
180.9 y 167.1% y en la composición química superó con un 600% y 1100% en la producción de
proteína cruda y fósforo respectivamente.
Las plantas de A. acuminata inoculadas con la cepa T4:CC17 procedente de Cundinamarca

presentaron superioridad al testigo en: altura en un 48.1, 66.9 y 58.8%; en producción de materia seca
en un 458.8, 275 y 261.9%, en longitud radicular en 182.9%, 19.9 y 124.7, en el peso seco radicular en
454.54, 270.83 y 263.2%, en el número de nódulos 408, 654.7 y 350.9%. Adicionalmente, superó al
testigo en un 464.7% y 574.3% en la producción de proteína cruda y fósforo.
Los productos de la región variable V2-V3 de las pequeñas subunidades de rRNA amplificados
por PCR, mostraron pesos moleculares de 450 a 500 pb para las cepas nativas CN49, CN17 y los
controles AacIII y AacI.
Al comparar las secuencias parciales de SSU del 16S rRNA, de las cepas nativas de Frankia con
la base de datos del Genbank, estas fueron clasificadas dentro del grupo de las bacterias Gram positivas
con altas concentraciones de G+C (Actinomicetos) (100%), presentando un 90% de identidad con el
grupo de las proteobacterias-Cyanobacterias y para el alineamiento realizado en el EMBI, se presentó
una identidad de 80% con bacterias no cultivables de comunidades microbiales de la rizósfera de
bosques.
La alineación y comparación de las secuencias parciales de los aislados nativos frente a la cepa
de Frankia alni Acn14a aislada de Alnus sp (Número de acceso al Genbank M8846), mostraron una
homología del 64% y 60% y una identidad del 23% y 31% para CC17 y NC49 respectivamente y entre
las cepas nativas del 41%.
Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran la gran diversidad de las cepas
nativas de Frankia, influidas por el genotipo y la oferta ambiental del Bosque Alto Andino
Colombiano del cual fueron recolectadas.
II
1. INTRODUCCIÓN
Frankia es un actinomiceto perteneciente a la familia Frankiaceae que establece asociación

simbiótica mutualista con diversos grupos de angioespermas no leguminosas e induce la formación de
nódulos fijadores de nitrógeno. Los primeros aislamientos de Frankia fueron realizados por Torrey et
al. en 1978 en la Universidad de Harvard (Benson & Silvestre, 1993). Posteriores estudios permitieron
demostrar la capacidad de este actinomiceto para establecer simbiosis con un alto número de plantas
denominadas actinorrizas, trabajo que ha sido complementado en diversos estudios (Baker, 1982,
Benson et al., 1983, Diem & Mommergues, 1983, Lechevalier, 1984, Horriére, 1984, Hafeez et al.,
1984, Murry et al, 1984, Lechevalier & Lechevalier, 1989, Simonet et al., 1989, 1994, Carrasco et al.,
1992. Rouvier et al., 1996, Carú 1993, 1996 y Carú et al., 1990, 1997 y 2000).
Las plantas actinorrízicas son arbustos o árboles que habitan diversos ecosistemas, se adaptan a
condiciones ambientales extremas y poseen una gran capacidad de crecer en suelos de baja fertilidad o
después de algún disturbio. Son frecuentemente las pioneras en el desarrollo de la sucesión de la
comunidad vegetal y son de rápido crecimiento. Estas plantas están constituidas por 8 familias, 4
géneros y 200 especies (Berson & Silvestre, 1993; Huguet et al., 2004). Entre los grupos más
representativos de estas especies en América del Sur se encuentran las Coriarieceas, Myricaceaes y
Betuláceas, a esta última familia pertenece la especie Alnus acuminata H.B.K. ssp acuminata (Romero,
1999; Restrepo, 2003).
En Colombia esta especie es conocida como aliso o cerezo y se encuentra naturalmente en los
bosques secos, húmedos y muy húmedos del montano y montano bajo (CONIF, 1996). Alnus se
caracteriza principalmente por sus efectos como mejorador del suelo y recuperación de praderas
degradadas, atributos asociados a la incorporación de hojarasca, efecto de sombra, retención de
humedad, ciclaje de nutrientes y alta capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico (279 a 400 Kg de
N/ha/año). Esta capacidad varía según la especie, condiciones edafoclimáticas y las técnicas aplicadas
por los investigadores (Tarrant & Trappe, 1971; Wivistad et al., 1984; Carlson & Dawson, 1985; Alf &
Huss, 1995 y Restrepo, 2003).
Entidades de investigación como CORPOICA, vienen generando información e impulsando la

utilización en ganadería de especies leñosas perennes fijadoras de nitrógeno como A. acuminata
1
conformando sistemas silvopastoriles, estrategia de gran impacto para la recuperación de suelos y
praderas degradadas de Pennisetum clandestinum Hoch, con miras a lograr sistemas de producción
ganaderos económicamente rentables, ambiental y socialmente sostenibles. Para mejorar estos
procesos, CORPOICA ha planteado la necesidad de estimular los beneficios que ofrece A. acuminata
por medio del aislamiento, identificación y multiplicación de cepas nativas de Frankia.
Las cepas de Frankia poseen características morfológicas de infectividad y efectividad que

varían entre sí, lo cual indica la existencia de compatibilidad pero no de eficiencia entre los endófitos
de especies de Alnus, para lo cual, se requiere el aislamiento, selección y evaluación de cepas nativas
con alta capacidad de asociación, rápido crecimiento y alta fijación de nitrógeno (Normand & Lalonde
1982; Griffiths & McCormick, 1984; Clawson et al., 1998; Clawson & Benson, 1999 y Nickel et al.,
2001).
Investigaciones realizadas en Colombia enfocadas al estudio de la inoculación de Frankia

asociada con A. acuminata y Alnus jorullensis, han contribuido de manera importante al análisis de la
simbiosis y de la especificidad de esta interacción (Lepineux, 1983; Carlson & Dawson, 1985;
Moncada et al., 1987; Niño et al.; 1987; Gonzáles et al., 1988; Muñoz, 2003 y Restrepo, 2003). Sin
embargo, poco se ha profundizado en el conocimiento de las características de las cepas nativas de
Frankia como su morfología, utilización de fuentes de carbono y nitrógeno, resistencia a antibióticos y
capacidad fijadora de nitrógeno, así como en su identificación genética, parámetros que permitirán
seleccionar cepas de Frankia de mayor infectividad y efectividad en sistemas silvopastores basados en
A. acuminata del Trópico Alto Colombiano.
Con el fin de generar ésta información ésta investigación estuvo orientada al estudio de la
simbiosis actinorrítica, aislando e identificando cepas nativas de Frankia asociadas con A. acuminata
en los Departamentos de Nariño y Cundinamarca y en la evaluación del efecto de la inoculación de
estas cepas en fase de vivero con A. acuminata.
2
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Los Sistemas ganaderos del trópico alto Colombiano
En el trópico alto de Cundinamarca y Nariño, la producción ganadera bovina de leche

especializada es una de las principales actividades económicas, lo cual obedece en gran parte a la
abundante dotación de sabanas y bosques con que cuentan estas regiones (Holmann et al., 2003).
Desafortunadamente, estas explotaciones han surgido después de la tala y quema de los bosques alto
andinos o de niebla, resultando en agroecosistemas con escasa cobertura arbórea, suelos desprotegidos y
susceptibles a la erosión. Adicionalmente, la producción de ganado lechero en forma tradicional, implica
un alto uso de fertilizantes y agroquímicos, los cuales ocasionan grandes problemas ambientales e
incrementan los costos de producción (Giraldo & Bolivar, 1999, Chamorro et al., 2002; Chamorro, 2004).
En la búsqueda de sistemas de producción más sostenibles, tanto biológica como

económicamente, los sistemas silvopastoriles son una alternativa a mediano y largo plazo. La
incorporación de árboles en las praderas, principalmente especies fijadoras de nitrógeno, además de
ofrecer un ambiente de confort para animales, pueden ser utilizadas como barreras rompevientos, para
control de erosión y mejorar la fertilidad de los suelos, originando beneficios productivos, ecológicos y
económicos. Adicionalmente, los árboles ofrecen otros productos como leña, madera, frutos, productos
medicinales e industriales, tutores de cultivos, ayudan a la división de lotes y demarcación de linderos en
fincas, preveen refugio de avifauna silvestre, proporcionándole otros ingresos al productor y ofreciendo
mayor estabilidad económica a la empresa ganadera (Londoño et al., 1999, Giraldo & Bolívar, 1999,
Chamorro, 2004).
2.2.Alnus acuminata H.B.K.
ORDEN: Fagales
SUBCLASE: Hamamelidae
FAMILIA: Betulaceae
NOMBRE COMÚN: Aliso, chaquiro, fresno, cerezo, abedul, aile.
3
SINÓNIMOS: Alnus acuminata var. spachii Regel; Alnus ferruginea var. aliso Lorentz
& Hieron. Alnus jorullensis var. acuminata (Kunth) Kuntze; Alnus
pringlei Fernald; Betula arguta Schltdl. Alnus arguta (Schltdl.) Spach
(Furlow, 1979)
A. acuminata es una especie arbórea promisoria para ser incorporada en estos sistemas ganaderos
conformando sistemas silvopastoriles (Figura 1), por su efecto benéfico en la recuperación de praderas
degradadas, conservación de la biodiversidad y mejoramiento del suelo, atributos asociados
principalmente a la incorporación de hojarasca de rápida degradación, efecto de sombra, retención de
humedad, ciclaje de nutrientes y alta capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico debido a su
asociación simbiótica con el actinomiceto Frankia (Normand & Lalonde, 1982; Lepineux, 1983; Griffiths
& McCormick, 1984; Carlson & Dawson, 1985; Moncada et al., 1987; Niño et al., 1987; Gonzáles et al.,
1988; Benson & Silvestre, 1993; Clawson et al., 1998; Clawson & Benson, 1999; Nickel et al., 2001;
Muñoz, 2003; Restrepo, 2003 y Chamorro et al 2004).
Figura 1. Sistemas silvopastoriles con Alnus acuminata. Chiquinquirá
El nombre de Alnus acuminata, proviene del latín al: cerca, lan: río, que obedece a su habitad de
crecer cerca de los ríos y otras fuentes de agua (Romero, 1999. Pertenece a la familia de las Betulaceae, en
donde se incluyen alrededor de 70 especies de árboles y arbustos que se deshojan en invierno,
encontrándose establecidas en zonas frías (Gutiérrez, 2004) (Figura 2).
4
Figura 2. Alnus acuminata H.B.K. Chiquinquirá (Boyacá) y Mosquera (C.I. Tibaitatá)
A. acuminata es nativa de América Central y del Sur se extiende desde el noreste de México hasta
el norte de Argentina y los Andes de Perú y Bolivia (CATIE, 1995). Se ha introducido con éxito en el sur
de Chile y en Nueva Zelanda (Furlow, 1979). En Colombia se encuentra en la región Andina y en la zona
cafetera (Velandia & Torres, 1991; CONIF, 1996).
Este árbol es un recurso forestal de gran potencial, debido a su rápido crecimiento, a su asociación
con fijadores de nitrógeno y a sus ventajas ecológicas, de tal manera que los bosques de aliso juegan un
importante papel en la protección de las cuencas hidrográficas, en el control de la erosión, al tiempo que
son empleados en sistemas agroforestales (Gutiérrez, 2004).
2.2.1. Hábitat
Según Holdridge (1951), A. acuminata se ubica en formaciones ecológicas de bosque húmedo

montano bajo y bosque muy húmedo montano bajo. Puede desarrollarse en una variedad de condiciones,
prosperando naturalmente en suelos de diversa índole, desde profundos, bien drenados, limosos, limo
arenosos de origen aluvial o volcánico hasta suelos muy pobres, superficiales y compactados. Sin
embargo, para su buen crecimiento requiere suelos con contenidos constantes y muy altos de humedad
como en las riberas de los ríos y las pendientes húmedas. Su crecimiento es favorecido por condiciones de
precipitación entre 2000 y 5000 mm anuales y un rango de temperatura varía de 4 a 27ºC, pudiendo
soportar temperaturas que bajan temporalmente a 0ºC. Aunque, A. acuminata es susceptible a heladas, que
pueden ocasionarle la muerte en fases iniciales de crecimiento. La altitud más baja a la que esta especie se
5
adapta es a los 880 msnm y la más alta 3450 msnm (CONIF, 1995; CATIE, 1995; Romero, 1999,
Chamorro, 2004).
2.2.2. Morfología
Puede alcanzar alturas entre 15 a 35 m, con un diámetro de tallo a la altura del pecho que fluctúa
entre 35 y 80 cm. El tronco presenta una forma cilíndrica ligeramente ovalada, con una ramificación
alterna (García et al., 1989; CATIE 1995 y CONIF, 1996), cuando es joven es pubescente, en su parte
terminal es de forma triangular y de intenso color azulado; La copa es angosta, irregular y abierta
(Romero, 1999).
Las ramas se disponen de modo alterno y las ramillas se presentan angulosas y de color marrón
rojizo. Sus hojas son simples, alternas con estípulas, elípticas u ovaladas, con borde finamente dentado o
aserrado y de punta aguda; El limbo es peciolado y ovalado, el tamaño varía entre 8 a 20 cm de largo y de
3 a 6 cm de ancho, sus nervaduras son pinnadas con 12 a 16 pares de nervios secundarios muy rectos y un
poco ásperos y bien diferenciados; El ápice es agudo a obtuso, a veces acuminado y la base es obtusa
(Romero, 1999) (Figura 3).
Figura 3. Detalle de hojas y ramas de Alnus acuminata H.B.K.
Presenta flores masculinas y femeninas, separadas en la misma rama. Las flores aparecen en
inflorescencias alargadas en la misma rama, siendo el cáliz un poco más difícil de distinguir y la corola
presenta una coloración amarillenta. Las inflorescencias femeninas, son espigas de forma cilíndrica u
ovoide, semejantes a conos cortos erectos de 0.7 cm a 2.5 cm de largo y 0.5 cm a 1.3 cm de diámetro. La
flor masculina tiene un tamaño que varía de 1 a 2 cm de largo y 1,2 cm de ancho, aproximadamente
(Romero, 1999) (Figura 4).
6
a
b
Figura 4. Frutos femeninos (a) y masculinos (b) de Alnus acuminata H.B.K.
Las semillas se encuentran adheridas a la pared del fruto femenino con un número de 100 a 120
semillas/fruto. Son de pequeño tamaño de 0,65 mm de ancho por 1,34 mm aproximadamente. Su forma es
elíptica, plana, aladas angostas y livianas, lo que facilita su movimiento y dispersión ya sea por el viento o
por el agua (CATIE, 1995; Romero, 1999) (Figura 5).
Figura 5. Frutos femeninas y semillas de A. acuminata
El sistema radicular de A. acuminata es poco profundo, amplio, extendido y es inducido a la

formación de nódulos fijadores de nitrógeno por Frankia (García et al., 1989; Russo, 1990). En América
7
Latina, el primer reporte sobre la existencia de nódulos en las raíces de los alisos, fue efectuado por
Castellanos (1944) citado por CATIE (1995). Más tarde, Holdridge (1951) mencionaba el excelente
crecimiento del pasto bajo la sombra de alisos, debido a esta asociación. En A. acuminata fue Rodríguez
Barrueco en 1966, quien demostró la fijación por los nódulos radicales. Según Niño et al. (1987), la
infectividad y el desarrollo inicial de los nódulos de Frankia asociada con A. acuminata, son similares a lo
observado en otras especies de Alnus.
La asociación simbiótica producida entre la planta y la bacteria tiene una gran importancia
ecológica, ya que las especies actinorrícicas se comportan como pioneras en el desarrollo sucesional de
comunidades vegetales en suelos pobres en nitrógeno, siendo algunas de ellas de gran valor en la
recuperación y protección de suelos degradados y erosionados (Dawson, 1990; Akkermans et al., 1989;
Benson & Silvester, 1993).
2.3.Fijación biológica del nitrógeno (FBN)
El nitrógeno es un elemento clave en la fertilidad de los suelos y en el desarrollo sostenible de los

sistemas agropecuarios de producción de alimentos. Junto con el fósforo (P), el potasio (K) y el magnesio
(Mg), el N es una fuente esencial para el crecimiento de las plantas y en muchas situaciones puede limitar
la producción de los cultivos. El nitrógeno en el suelo se incorpora a través de la FBN, lluvias adición de
materia orgánica y fertilizantes (Mafongoya et al., 2004).
Algunos microorganismos solos o asociados realizan la tarea de extraer el N2 del aire y lo

transforman de su forma gaseosa a NH4+. Aunque en el aire se contiene cerca de 78% de N 2, solo entra al
sistema biológico cuando es fijado, al ser combinado con elementos como el C, H y O, estructura que lo
hace aprovechable por las plantas (Orozco, 1999). El nitrógeno es el nutriente mineral que más
frecuentemente limita la producción de plantas, por lo que su fijación biológica representa la clave para
incrementar las fuentes de proteínas del mundo viviente (Quiespel, 1974, Citado por Carú et al., 2000).
Los árboles incrementan su acceso a nutrientes y reducen sus requerimientos a través de varios
procesos como la FBN. Uno de las principales funciones de la FBN por los árboles es mejorar la fertilidad
de los suelos y ofrecer adicionalmente forrajes, madera frutos y productos no madereros. En algunos casos
la simbiosis que se da en la FBN es formada entre árboles no leguminosos y actinomicetos como Frankia.
La simbiosis por actinorrizas ha sido muy poco estudiadas en agroforestería a comparación de la
8
asociación rizobios y leguminosas, aunque los métodos para los estudios de ambos tipos de simbiosis son
similares (Giller, 2003).
El proceso de FBN se lleva gracias a la acción de la nitrogenasa, la cual es un complejo

enzimático cuya forma es heterodímera conformado por una subunidad grande compuesta por cuatro
subunidades polipeptídicas iguales y otra pequeña, compuesta por dos subunidades aparentemente
idénticas. Ambas subunidades de la nitrogenasa contienen átomos de hierro y azufre, y la subunidad
grande contiene adicionalmente molibdeno. La nitrogenasa no solo es capaz de reducir al dinitrógeno
molecular, sino que también actúa sobre una gran cantidad de substratos como el acetileno, trinitrógeno,
alquilacetilenos y ciclopropeno (Orozco, 1999).
La actividad de la nitrogenasa se ve incrementada con un pH cercano a la neutralidad, un nivel

alto de humedad, baja tensión de oxígeno, abundante cantidad de compuestos carbonados, compuestos
energéticos (ATP) y una baja concentración de compuestos de N (Orozco, 1999).
Las cepas de Frankia, poseen la habilidad de fijar nitrógeno en condiciones in vitro, llegando a
fijar desde 10 a 200 nmol C2H4 mg proteína-1.h-1 (Hafeez et al., 1984; Murry et al., 1984). La FBN por
plantas actinorrizas en medio naturales puede variar por las condiciones climáticas, con una tasa de
fijación anual que oscila entre 40 a 350 kg/ha/año (Dittert, 1992, citado por Dilly et al., 2000; Huss-
Danell, 1997).
Con el fin de conocer el metabolismo de la fijación de nitrógeno de nódulos de Alnus incana (L),
Lundeberg & Lundquist (2004) investigaron los primeros pasos del metabolismo y actividad de la enzima
nitrogenasa en la conversión del nitrógeno atmosférico a NH 4+ en los nódulos de A. incana, el consumo de
32
energía y la importancia de las vesículas en la fijación, respiración, través de marcadores P y 15N y la
técnica de resonancia magnética espectroscópica. Se reveló la presencia del aminoácido alanina, γ-amino
ácido butírico, glutamina, ácido glutaminico, citrulina y arginina. También se determinó la cinética de la
N-amida y el α-amino por la ruta del glutamato sintetasa.
2.3.1. Genética de la fijación biológica del nitrógeno
La asociación simbiótica para la FBN es el resultado de la expresión de un grupo de genes en la

planta huésped y el microorganismo. Aún entre especies compatibles, no todos los genotipos de plantas y
bacterias están asociadas al azar, existe nodulación preferencial entre el genotipo del huésped y las cepas
9
que han estado originalmente asociadas en la naturaleza (Wilkinson et al., 1996; Lieven & Whittam,
1997). Los genes simbióticos se categorizan en genes nod que son los codifican la nodulación y genes nif
que controlan la nitrogenasa y los genes fix que afectan la FBN (Vance & Griffth, 1990).
Los genes nod, son los responsables del encrespamiento del pelo radical, la infección y la
formación de nódulos (Vance & Griffith, 1990). Son de gran importancia en la especificidad del
hospedero conocidos también como genes hsn, se clasifican en dos categorías: genes estructurales y genes
reguladores que controlan la expresión de los estructurales. La principal función de estos genes es
asegurar el intercambio de señales entre los dos simbiontes (Fisher & Long, 1992).
Denarie et al. (1993), mencionan la importancia de la producción del lipo-oligosacárido PBH

(polihidroxibutirato) extracelular, cuyo núcleo central lo sintetizan los genes nod-ABC y las síntesis de las
demás partes lo hacen diferentes genes nod específicos para cada especie. Estos factores nod, según los
mismos autores, desencadenan una serie de respuestas en las plantas, como lo es la deformación de los
pelos radicales, la estimulación de la formación del hilo de infección, la formación del primordio del
nódulo a partir de las células cordicales y la inducción de la formación del nódulo. También estimulan en
las plantas la expresión de nodulinas tempranas, proteínas del hospedero que se expresan durante la
respuesta inicial a la infección por rizobio (Fisher & Long, 1992).
Otros genes que participan en el proceso de fijación son los nif, los cuales intervienen en el proceso
de FBN. Los genes nifHDK codifican las proteínas estructurales del complejo enzimático nitrogenasa.
Otros genes nif, están envueltos en la síntesis del procesamiento del cofactor FeMo generador de energía
para la nitrogenasa, procesamiento y maduración pos-trasduccional de la nitrogenasa y regulación de la
expresión a nivel de transcripción (Teixeira, 1997). Según Ow & Ausubek (1983) los genes nif son los
más conocidos. La construcción de mutantes nif de Klebsiella pneumoniae, permitió identificar sus
funciones y de los 20 genes nif identificados en K. pneumoniae, 14 han sido encontrado en la mayoría de
los diazotrofos estudiados (Dixon et al., 1977). A pesar del intenso estudio dedicado a caracterización de
los productos y función de los genes nif, algunos genes aún permanecen sin conocerse Simon et al. (1996).
La disponibilidad del nitrógeno y el oxígeno en el medio ambiente regulan la actividad de los

genes responsables del proceso. A su vez, el producto del gen nif A, activa los genes nif H, D, K,
responsables de la formación de la nitrogenasa. Los genes ntr, controlan a varios operones entre ellos al
operón nif LA, bajo condiciones limitantes de nitrógeno y oxígeno los productos de los genes nrt A y ntr
C, activan la transcripción del operón nif LA, luego los productos de los genes nif A y ntr A, activan la
10
transcripción de todos los otros genes nif. Esto indica que bajo las condiciones nutricionales y ambientales
apropiadas se produce un efecto cascada para la producción de la nitrogenasa funcional (Dixon, 1984;
Geurts & Bisseling, 2002). Los productos codificados por los algunos genes nif y sus funciones se
presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Productos codificados por los genes nif y sus funciones en la FBN
GEN FUNCIÓN
nif H Codifican para la Fe-proteína sobre el componente II de la
nitrogenasa
nif DK Codifican para la subunidad  y  de la MoFe-proteína en el
componente I de la nitrogenasa
nif NE 2 y 2 tetramero de la FeMo-proteína, FeS-proteína sensible
al oxígeno
nif V Sintetiza homocitrato sintetasa esencial para la estabilidad del
FeMo-Co.
nif J Donador de electrones para la flavotoxina
nif A Codifica para un activador transcripcional necesario para
activar la transcripción de los genes estructurales de la
nitrogenasa.
nif T Pueden estar envueltos en la síntesis de agrupamiento Fe4:S4
nif H, D, K Codifican para la formación de los dos componentes
estructurales de la enzima nitrogenasa.
nif L Juegan un papel negativo en la actividad de la enzima
nif B, V, N, E, Q, Participan en las proteínas que actúan en las síntesis del
cofactor MO-Fe.
nif F, J Proteínas transportadoras de electrones a la nitrogenasa.
nif M,S Proteínas que hacen parte en el procesamiento del enzima
nif U Codifica para proteínas asociadas con el ion sulfuro en el
centro de la dinitrogensa reductasa
nif X Codifican para proteínas reguladores de muchas funciones
nif Y No se conoce su función
nif W Codifica para funciones necesarias en la total actividad de la
dinitrogensa
Fuente: Zubereer (2005) adaptado de Postgate (1998)
En plantas se han descrito 25 genes que inducen o que aumentan su producto durante el desarrollo
del nódulo, a estas proteínas se les denominan nodulinas siendo la más conocida la leghemoglobina en
plantas leguminosas y hemoglobina en actinorrizas, cinco de éstas están relacionadas con la asimilación
del amonio y el carbono y cinco con la morfogénesis y el control de la concentración del oxigeno. La
presencia del microorganismo, influye en la activación de estos genes, el desarrollo del nódulo y la
infectividad, sin embargo, el estado simbiótico ejerce un grado de regulación genética entre los asociados
(Verma et al. (1986) citados por Vance & Griffith, 1990).
11
2.4. Taxonomía de Frankia Brunchorst
Reino Procariote
Dominio: Bacteria
Familia : Frankiaceae
Phylum BXIV: Actinobacteria Phy. nov.
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden XIII: Frankineae
Familia I: Frankiaceae
Genero : Frankia (Lechevalier & Lechevalier, 1989)
Frankia es un actinomiceto perteneciente a la familia Frankiaceae que presenta asociación

simbiótica e induce la formación de nódulos radiculares fijadores de nitrógeno atmosférico en algunas
angioespermas no leguminosas “actinorricícas”, motivo por el cual se le han dedicados muchas
investigaciones en todo el mundo.
El primer reporte de simbiosis de Frankia en nódulos fue reportado por Woronin en 1866, quien
describió las vesículas y las hifas como un estadio del desarrollo de hongos y parásitos (Wolters, 1998).
En 1988 el género de Frankia fue propuesto en por J. Brunchorst quien planteó que el nombre Frankia
resurgiera en honor del microbiólogo suizo Frank A.B. (1839-1900), debido a que acuñó el término
“simbiosis”, aunque, Brunchorst y Frank, consideraron a Frankia como un hongo (Lechevalier &
Lechevalier, 1989; Benson & Silvestre, 1993, Wall, 2000).
Becking en 1974, revivió este género y lo clasificó como miembro de la familia Frankiaceae del
orden Actinomycetales, por el tipo de esporangios que presenta este actinomiceto. Posteriormente,
Becking propuso 10 géneros (F. alni, F. elaeagni, F. brunchorstii, F. discariae, F. casuarinae, F.
ceanothi, F. dryadis, F. purshiae y F. cercocarphi), basado la planta hospedara (Skerman et al., 1980;
Lechevalier & Lechevalier, 1989; Benson & Silvestre, 1993).
Hasta la fecha la clasificación por especie se plantea de acuerdo al hospedero con el que se asocia
y por los componentes de su pared celular. En Frankia alni (Alnus acuminata) y probablemente en otras
12
especies, se detecta la presencia de meso DAP galactosa y arabinosa en la pared celular; a diferencia del
endófito de Casuarina (Frankia casuarinae) y Myrica (Frankia brunchorstii) (Becking, 1977).
La clasificación de Frankia entre los actinomicetos, se realizó según cinco criterios relevantes
(Lechevalier & Lechevalier, 1989; Benso & Silvestre; 1993, Schwintzer & Tjepkema, 1990):
1. Morfología: Presencia de esporangios y vesículas en medio de cultivo líquido con formación de

algunos pigmentos: rojos, amarillos, naranjas, rosados, cafés, verdes y negros, los cuales se reportan de
acuerdo al aislamiento, el medio usado y estadio de crecimiento del cultivo, aunque la formación de
pigmento no es un criterio de clasificación taxonómica, si es útil para la caracterización fenotípica.
2. Composición química: Pared celular tipo III constituida fundamentalmente por ácido meso-
diaminopimélico, ácido glutámico, alanina, glucosamina y ácido murámico; los fosfolípidos
característicos del género son: fosfatidilinositol, fosfatidilinositol manósidos y difosfatidilglicerol con
ausencia de nitrógeno por lo cual es de patrón tipo PI, lo cual los diferencia del actinomiceto
Geodermatophilus que son de tipo PIII. La menaquinona predominante es la MK-9, el patrón de azúcares
presente en el género, se observa que es variable y depende de cada cepa. Algunas cepas presentan el
patrón tipo D (constituido de xilosa y arabinosa), otras el tipo E (constituido de fructosa), algunas otras
presentan el patrón B (con madurosa) y otras tantas poseen el tipo C (con galactosa y glucosa).
3. Composición en su ADN: Contiene un porcentaje de GC de 66-71% el cual está también presente en

otros actinomicetos como Geodermatophilus.
4. Homología DNA/DNA total: Con base en el parecido del genoma de una bacteria con otra,
formándose nueve grupos genómicos de Frankia, que coinciden con los grupos de especificidad de
hospedero. Los grupos genómicos 1, 2 y 3 contienen cepas del grupo de Alnus (HSG 1). Los grupos
genómicos 4, 5, 6, 7 y 8 contienen cepas del grupo de Elaeagnus (HSG 3), mientras que el grupo
genómico 9 contiene únicamente cepas de Casuarinaceae (HSG 2).
5. Demostración de infectividad y/o efectividad en plantas hospederas: Parámetro que permiten

identificar inequívocamente a una cepa que pertenece al género de Frankia.
2.4.1. Morfología y fisiología
Morfológicamente Frankia es un organismo complejo debido a que presenta un crecimiento
13
pleomórfico, creciendo en forma de filamentos no aéreos con hifas septadas y ramificadas de 0.5 a 2.0 μm
de diámetro, las cuales se diferencian en esporangios con aspectos irregulares que se desarrollan de
manera terminal, lateral o intercalada. Los esporangios contienen en su interior gran cantidad de esporas
en estado latente, que germinan para formar hifas cuando encuentran condiciones ambientales adecuadas.
En la actualidad, es un tema de investigación conocer cuales son los factores que influyen en la formación
de esporangios y en la germinación de las esporas (Lechevalier, 1984; Lechevalier & Lechevalier, 1989 y
1990) (Figura 6).
Las hifas también pueden diferenciarse para formar una estructura que constituye un rasgo
sobresaliente de Frankia, las vesículas, éstas son estructuras redondas formadas de lípidos encapsulados
de forma esférica y con un diámetro que oscila entre 2 a 6 um, son de pared gruesa y su desarrollo es a
partir del hinchamiento de las hifas ramificadas lateralmente, su función es proteger a la nitrogenasa que
se encuentra en su interior del efecto negativo del oxígeno, se puede desarrollar en cultivo y en simbiosis
(Lechevalier, 1984; Lechevalier & Lechevalier, 1990, Benson & Silvestre, 1993, Carú, 1996) (Figura 6).
A diferencia de otras bacterias Gram positivas, Frankia tiene una capa discontinua y membranosa
la cual se evidencia cuando las células se fijan en KMnO 4. Se desconoce el desarrollo o función de esta
capa membranosa que se presenta en hifas, vesículas, esporangios y esporas, tanto en la colonia como en
la planta (Torrey, 1986). A mayor concentración de oxígeno en el medio, la pared envolvente también
aumenta y las vesículas se evidencian al microscopio con mayor refringencia (Valdés et al., 1991). Esta
variación en el grosor de la pared sugiere un nivel específico de regulación del oxígeno en la vesícula que
es dependiente del mismo oxígeno (Berry, 1994). Esto se observa tanto en los cultivos bacterianos como
en los nódulos (Kleeman et al., 1994).
A B C
Figura 6. Estructuras especializadas de aislamientos de Frankia crecidas en medio BAP libre de

nitrógeno. Microscopia óptica 3 μm. A. Producción de micelio (AacIII), x400. B. Aislamiento AacIII,
esporangio maduro mostrando las esporas x400. C. Producción de micelio (AacIII) con formación de
vesículasAx400. Cortesía Carú, M. 2004. Publicado
B en Carú et al. (2000) C
14
2.4.2. Hábitat
Esta bacteria puede ser un saprofito de vida libre que se nutre de materia orgánica o que vive en
relación simbiótica con plantas actinorrizas. La población de cepas de Frankia presente en el suelo es muy
baja, motivo que no ha permitido su asilamiento directamente desde el suelo (Baker & Schwintzer, 1990).
2.4.3. Nódulos
Los nódulos son estructuras que se forman en la raíz como respuesta a la infección por la bacteria
fijadora de nitrógeno. Los nódulos actinorrízicos son perennes y tienen forma de estructuras coraloides
con muchos lóbulos; cada lóbulo es una raíz lateral modificada. El tamaño de los nódulos varía con la
planta hospedero oscilando de 3 a 5 cm de diámetro. En A. acuminata los nódulos están concentrados en
los primeros 5 cm del perfil del suelo, pueden medir hasta 6 cm de diámetro con tamaño, aspecto y
distribución variable formando grupos (Carlson & Dawson, 1985; Acero & Rodríguez, 1987; Russo,
1990) (Figura 7).
Figura 7. Formas y tamaños de nódulos de Frankia en Alnus acuminata
La presencia del oxigeno es un factor que limita la fijación biológica del nitrógeno, motivo por el
cual, los microorganismos fijadores de nitrógeno, han creado diferentes mecanismos de protección que
varía entre leguminosas y plantas actinorrizas. En las especies de Alnus, la nitrogenasa es protegida por la
15
formación de vesículas en los nódulos, las cuales presentan una envoltura constituidas principalmente por
dos haponoides, el bacteriohopanotetrol y su monoester con el ácido fenilacético (ácido feniletrol), los
cuales participan en la permeabilidad de la membrana (Leitz et al., 2003). Adicionalmente, los nódulos
presentan internamente un color rojo a rosado intenso, este pigmento se debe a la presencia hemoglobina,
la cual se asocia con la fijación de nitrógeno y la protección contra el oxígeno (Burton, 1983) (Figura 8).
Los pasos morfológicos del proceso de desarrollo de los nódulos dependen del hospedero y el
proceso es descrito por dos modelos de infección por Frankia; uno de manera intercelular y el otro
intracelular (Obertello et al., 2003). En los nódulos actinorrízicos el tejido vascular se presenta en la parte
central y las células del cortex que contienen la bacteria Frankia. Además de la estructura, también la
ontogenia de los nódulos es diferente en las leguminosas; en estas el primordio del nódulo se forma en el
cortex, mientras que en las plantas actinorrízicas se forma en el periciclo, de manera que la bacteria tiene
que atravesar casi todo el cortex de la raíz para llegar a las células nodulares (Parniske, 2000; Diouf et al.,
2003).
La infección de las células de Frankia que se asocian a los pelos radiculares de especies como
Alnus, Casuarina, Comptonia y Myrica, fue descrita por Berry & Sunell, 1990 citado por Diouf et al.
(2003), presenta un proceso intercelular en la epidermis y el cortex de las raíces. La infección comienza en
el área de la rizosfera del suelo que rodea la raíz del hospedero, mediante la quimiotaxis Frankia detecta
flavonoides e isoflovonoides secretados por la raíz del hospedero, como parte de un sistema o mecanismo
de defensa para eliminar o limitar el crecimiento de los microorganismos patógenos que se encuentran
alrededor, a su vez Frankia secreta lectinas y carbohidratos en la superficie de las células del huésped.
La comunicación bioquímica y molecular entre Frankia y el hospedero inicia con señalizaciones

selectivas que estimulan o atraen a los organismos con los cuales se establecen, produciendo una
liberación de exudados radicales ricos en vitaminas, azúcares, enzimas. La composición de estos exudados
difiere entre especies de plantas (Noel et al., 1984; Orozco, 1999). Burggraaf & Shipton (1983) y
Cerémonie et al. (1999) reportaron inductores de la deformación de los pelos radiculares en el
sobrenadante del medio de Frankia, sustancias activas que presentaron una alta concentración (10 -5 M)
con una biosíntesis similar a los flavonoides, aunque, según estos autores, diferente a la ocurrida en los
factores NOD en la interacción rizobios-leguminosas (Benson & Silvestre, 1993). Adicionalmente, se ha
descrito que Frankia ejerce una hidrólisis de lignina sobre la celulosa durante el proceso de infección
(Wolters, 1998; Diouf et al., 2003).
16
La invaginación por el plasmalema en el proceso de infección es similar al de las endomicorrizas y
Rhizobium, formando una nueva estructura denominada el hilo de infección, producto de la ramificación y
encrespamiento del pelo radicular (Diouf et al., 2003). Posteriormente, el mecanismo de infección es
similar a la simbiosis rizobio-leguminosa, en donde se activan los genes nod debido a la producción de
flavonoides en el hospedero, la bacteria escreta lipo-oligosacáridos produciendo la deformación y división
de las células cordicales. Esta activación de genes nod es un importante paso para el desarrollo de los
nódulos (Wolters, 1998).
Después de la penetración, las hifas son rodeadas por la membrana de las células de hospedero,
compuesta por celulosa, pectinas y hemicelulosas, proceso que ocasiona el desplazamiento del núcleo de
la parte central del citoplasma celular. Las células de la hipodermis y el cortex se dividen en respuesta a la
invasión de las hifas y forman el prenódulo que no es el que formará el nódulo (Parniske, 2000; Diouf et
al., 2003).
Las hifas de Frankia penetran cuidadosamente el tejido hasta la parte más profunda del córtex,
produciendo señales en las células de la raíz que deterioran el citoplasma y ocasionando que la pared
celular colapse, posteriormente, colonizan las células sobre las que se desarrolla el primordio del nódulo e
inducen la formación del nódulo maduro intracelular (Obertello et al., 2003). Este proceso ocurre de
manera similar con las hifas que no penetran el pelo radicular (Van Cheleu et al. 1997).
Cuando entra en las células de la planta inmediatamente Frankia se incrusta dentro de una capa de
material a manera de pared celular envuelta por una matriz pectinosa (Berry & Torrey, 1983). Esto crea
una encapsulación tubular, funcionalmente similar a la infección descrita por la simbiosis de rizobios y
leguminosas (Obertello et al., 2003).
Se sugiere que este material matriz también se puede usar como un substrato para colonización de
Frankia, porque las hifas embebidas en la matriz están envueltas por una zona de disolución. Se conoce
que Frankia posee enzimas pectinolíticas que pueden facilitar el proceso de infección (Séguin & Lalonde,
1989; Simonet et al., 1989). Frankia sigue su separación a través de las células dentro de estas zonas más
profundas, donde continúa dividiéndose y creciendo hasta la formación del nódulo (Berry & Torrey, 1983)
(Figura 8).
17
Figura 8. Formación de nódulos de Frankia en raíces de A. acuminata. Observe la formación de
pigmentos rojos sobre los nódulos, asociado a la presencia de antocianinas (Rodríguez, 1966)
El otro modelo de infección intercelular fue descrito en especies leguminosas tropicales como
Sesbania rostrata y Aeschynomene por Alazard & Duchoux (1990), Citados por Obertello et al., 2003.
Con excepción de Betulaceae, Casuarinae y Myricaceae, este método de infección se encuentra en
relaciones simbióticas entre Frankia y miembros de las Familias Elaeagneaceae y en otras familias de
plantas actinorrizas, en las cuales no se genera la formación del prenódulo (Obertello et al., 2003).
Frankia invade por el espacio intercelular las células epidérmicas penetrando algunas células por
invaginación, hasta llegar a las células del córtex en donde se genera el nódulo, algunas hifas crecen en los
espacios intercelulares en diferentes direcciones, colonizando fuera de las células del córtex y produciendo
células auxiliares y esporas intercaladas o terminales (Diouf et al., 2003).
Debido a que los nódulos son parte del sistema radicular de la planta, ellos al igual que las raíces
individuales, tienen un tiempo de vida definido. En el aliso bajo condiciones del suelo, los nódulos
radiculares raramente sobreviven más de diez años y continuamente durante la vida de la planta
actinorriza, se forman nuevas raíces y nódulos. Wolters (1998), describe un promedio de frecuencia de
formación de un nódulo de unos 3 años en una especie arbórea como Alnus glutinosa.
Cuando los nódulos radiculares mueren las partículas de Frankia se liberan en el suelo, de este
modo la senescencia y degeneración de los nódulos puede ser un factor importante, especialmente para
cepas sp(-), ya que permite el mantenimiento de grandes poblaciones de Frankia en los ecosistemas del
18
suelo y la rizósfera (Wolters, 1998). En el suelo puede haber muchos mecanismos que contribuyen a la
propagación de Frankia en un ecosistema, como los movimientos de agua en sedimentos húmedos o por la
lluvia, transportando así, las esporas debido a su pequeño tamaño y abundancia (Reddell & Spain, 1991).
2.4.4. Condiciones de aislamiento y cultivo
Cuando se pretende realizar el aislamiento de especies de Frankia, es importante utilizar un medio

de cultivo altamente nutritivo debido a su lento crecimiento, lo cual genera una fácil contaminación. Para
evitar esto, es necesario realizar una desinfección completa de la superficie del nódulo (Benson &
Silvestre, 1993; Murry et al., 1984; Carú et al., 2000).
Las colonias se caracterizan por no formar micelio aéreo en medio de cultivo sólido, por lo que se
les propaga en medio líquido donde el conjunto de filamentos tiene el aspecto de copos de nieve (Murry et
al., 1984; Simonet et al., 1989). En medios de cultivo líquidos, su principal característica morfológica, es
la formación de esporangios redondos, cilíndricos o muy irregulares. Sin embargo, la formación de los
esporangios y las vesículas se ven afectada por la composición de medio (Hafeez et al., 1984; Lechevalier
& Lechevalier, 1990).
Las fuentes de carbono utilizadas por Frankia para su crecimiento y desarrollo incluyen los ácidos
grasos derivados del tween, succinato, malato y algunos ácidos orgánicos como el piruvato (Hafeez et al.,
1984; Newcomb & Wood, 1987). Se ha demostrado en Frankia la existencia del ciclo del ácido cítrico,
ciclo del glioxilato y actividades enzimáticas de la gluconeogénesis. Las cepas que son capaces de utilizar
la glucosa como única fuente de carbono, la catabolizan a través de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas
(Newcomb & Wood, 1987).
Frankia es microaerofílica cuando utiliza nitrógeno atmosférico (N 2) para crecer y es

absolutamente aerobia cuando se les proporciona nitrógeno combinado como el amonio y nitratos, así
como varios aminoácidos como fuente de N para su crecimiento in vitro. La asimilación del amonio
producto de la fijación del N atmosférico se lleva a cabo por el sistema glutamino-sintetasa (Benson &
Silvestre, 1993).
La búsqueda de marcadores genéticos en Frankia a través de los patrones de resistencia y

sensibilidad a antibióticos ha puesto en evidencia la existencia de mecanismos de resistencia a los mismos
en diferentes cepas. Se sabe que hay cepas resistentes a rifampicina, estreptomicina, kanamicina,
19
tetraciclina, kasugamicina, lincomicina, gentamicina y novomicina. Sin embargo, estos microorganismos
muestran sensibilidad a ampicilina, penicilina G, neomicina, espectinomicina, thiostreptona, cloranfenicol
y eritromicina. Estos patrones de resistencia-sensibilidad a antibióticos pueden variar entre cepas (Carú,
1993; Carú et al., 2000).
2.4.5. Diversidad genética en Frankia
En el contexto de definir la diversidad los microorganismos del suelo cultivables y no cultivables,

las técnicas moleculares son de gran interés ya que permiten clasificarlos y agruparlos taxonómicamente.
El aprovechamiento de las técnicas moleculares se han incrementado, con énfasis en el estudio de métodos
nuevos para la detección de la diversidad genética y distribución de poblaciones de Frankia, así como en
el entendimiento de la relación hospedero-simbionte.
Otra técnica que permite diferenciar entre una cepa y otra es la amplificación de secuencias
intergénicas repetitivas a través de la PCR ha sido usada para entender la relación filogenética entre los
aislamientos, así como, los endófitos presentes en los nódulos de muchas plantas actinorrizas (Fernández
et al., 1989; Simonet et al., 1991; Nazaret et al., 1991; Mirza et al., 1994; Hahn et al., 1999).
Posteriormente, el análisis de un mayor número de secuencias y construcción de árboles

filogenéticos de secuencias de genes del 16S RNA, demostró que dentro del género de Frankia existen
cuatro grupos. El Grupo I son cepas infectivas en Myricacaceae, Betulaceae y Casaruarinaceae. El Grupo
II, comprende cepas presentes en los nódulos de Rosaceae, Coriariaceae y Datiscaceae, el Grupo III se
referencia a aquellas cepas asociadas con Eleagnaceas y Gymnostoma y el Grupo IV son cepas aisladas de
nódulos de diversas plantas, aunque son nif- o no Alnus. Las cepas de los grupos I, II y III son cultivables
in vitro y las del grupo III ha sido identificadas a partir de análisis del 16S rDNA in situ (Wall, 2000;
Graham, 2005) (Figura 9).
20
Myricaceae Myrica (1)
Comptonia (1)
Betulaceae Alnus (1) Frankia
Casuarinaceae Gymnistoma (2) RH Clase I
Casuarina (2) sV (aislados)
Allocasuarina (2)
Ceuthostoma (2)
Eleagnaceae Elaeagnus (1)

Hippophae (1)
Shepherdia (1)
Rhamnaceae Colletia (3) Frankia
Discaria (3) IP Clase II
Kentrothamnus (3) sV (aislados)
Retanilla (3)
Trevola (3)
Ceanothus (4)
Rosaseae Dryas (4)

Purshia (4)
Cowaniana (4)
Cercocarpus (4)
Chamaebatia (4) Frankia
IP Clase III
nsV (No aislados)
Coriariaceae Cariaria (5)
Datiscaceae Datisca (5)

Aislamientos
atípicos de
Frankia
Figura 9. Grupos filogenéticos de plantas actinorrizas y de Frankia. Fuente: Wall, 2000

El número entre los cuadros indica la distribución geográfica: (1) La mayoría de continentes. (2) De Australia al
occidente del Pacífico. (3) Del Sur de América y sureste de Nueva Zelanda. (4) Occidente de Norte América. (5)
Distribuido por zonas templadas del norte y del sur. RH: infección a través de pelos radiculares. IP: Penetración
intracelular. sV: Formación de vesículas septadas en el nódulo. nsV: no forman vesículas septadas en el nódulo
Según Benson & Silvestre (1993) los estudios de la genética de Frankia ha presentado dificultades
debido a que además de ser difícil para cultivar por su lento crecimiento, pobre formación y germinación
de esporas de muchos asilamientos, también es difícil para ser modificada genéticamente. Sin embargo, no
ha sido posible obtener mutantes, lo cual ha impedido conocer la función de muchos de sus genes.
Además no se ha logrado introducir ADN ajeno a su genoma, lo que ha impedido su manipulación
genética, esto debido a que Frankia produce una gran cantidad de enzimas que degradan el DNA
(DNAasas), impidiendo de esta forma la incorporación de DNA extraño (Taveres & Sellsted, 1998). Por
estas razones, los estudios genéticos en ésta bacteria se han tenido que desarrollar comparándola con otros
microorganismos.
Los genes ribosomales de Frankia, muestran la estructura de cualquier bacteria 16S-23S-5S;

Tienen solo dos copias de estos genes (Normand et al., 1992ab; Clawson et al., 1998; Pérez et al., 1999).
21
An et al. (1985) reportaron para las cepas de Frankia ArI4 y EuI1 un peso molecular del genoma de 8.3 x
109 y 6 x 109 respectivamente. Este peso molecular corresponde, según Benson & Silvestre (1993) entre
12.000 a 8.700 kbp, tamaños similares al genoma de Streptomyces ssp.
Debido a que las investigaciones para desarrollar métodos de mutación en cepas de Frankia no
han tenido éxito, así como tampoco se han encontrado vectores de expresión adecuados, Simonet et al.,
publicaron en 1988, la localización de los genes nif en Frankia a través de hibridaciones heterólogas con
genes de otros microorganismos diazotróficos.
Para poder diferenciar aislamientos de Frankia a partir de nódulos de árboles que han sido
inoculados con varias cepas con el fin de estudiar la competencia entre ellas, para localizar a Frankia en el
suelo y para detectar in situ las hifas de Frankia, se ha utilizado secuencias de DNA complementarias de
ciertas regiones específicas de su genoma, como lo son secuencias marcadas de los genes nif y
ribosomales (Devereux et al., 1984; An et al., 1985; Bloom et al., 1989; Maidak et al., 1994).
Los genes nifHDK de Frankia presentan dos espacios intergénicos, que ha permitido desarrollar
métodos para el análisis de estas regiones variables. Los espacios intergénicos entre los genes 16S y 23S,
han sido de gran importancia en el estudio de la diversidad genética de las cepas aisladas de Frankia, y
han permitido diseñar iniciadores específicos de especies, siendo éste espacio el más variable (Lumini &
Bosco, 1999). Es así por ejemplo que Bürgamann et al. (2004) utilizaron primers específicos para detectar
el gen nifH en Frankia como marcador molecular para estudiar la diversidad genética.
2.4.6. La comparación de pequeñas subunidades del rRNA 16S
Debido al crecimiento en el área molecular se utiliza hoy en día tanto para clasificar como para
identificar los microorganismos la subunidad ribosomal del RNA (SSU rRNA) (Neefs et al., 1993).
Los ribosomas son críticos en la función celular e interacción con un gran número de otras
moléculas entre ellas el RNA mensajero y RNA de transferencia, por lo tanto, las secuencias de las
moléculas rRNA están altamente obligadas y se han conservado marcadamente a través de la evolución,
adicionalmente, las secuencias de los genes que codifican para el rRNA, se encuentran dentro de las más
altamente conservadas ya identificadas (Lewin´s, 2001). Estas estructuras primarias están compuestas por
regiones de alta y baja variabilidad. Las regiones con secuencias variables contienen información de bajo
22
nivel filogenético, mientras que las regiones con secuencia preservadas contienen información de los
eventos evolutivos más tempranos (Achmalenberg et al, 2001).
La secuenciación del rRNA es el método de elección para determinar relaciones taxonómicas altas
(arriba del nivel de género). Debido a que la molécula de rRNA 16S contiene regiones altamente
variables, es usualmente posible encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de
una sola especie de bacteria. De esta forma, el rRNA es un excelente marcador molecular para la
reconstrucción de la mayoría de las regiones filogenéticas (Neefs et al., 1993).
Los genes de SSU rRNA están conformados o alternativamente evolucionaron regiones variables
y conservadas. Las regiones variables son sitios ideales para ser usados para construir primers y
amplificados por PCR, los cuales han permitido evidenciar DNA de organismos desconocidos y/o no
cultivables. Las SSU rRNA se encuentran en todos los organismos y contienen nueve regiones variables
(V1 a V9) esparcidos en la molécula, siendo en las bacterias de 1520 nucleótidos.
Por lo tanto, las secuencias son bases de herramientas que permitirán explorar la distribución, la
variabilidad natural microbial y el papel de los microorganismos en el ambiente, como por ejemplo la
respuesta a los cambios medioambientales (Schalenberger et al., 2001). En la figura 10 se muestra la
estructura del modelo secundario para procarióticas aplicable para SSU rRNA.
El modelo de SSU rRNA de la figura 10, fue realizado a partir del modelo de Escherichia coli el
diámetro de los círculos indica el incremento en la variabilidad. Los sitios invariables corresponden a los
cuadrados vacíos. Las áreas V1 a V9 contienen la mayor variabilidad. Las hélices P37-1 y P37-2 son
ausentes en las SSU rRNA de arqueas. Las hélices fueron numeradas separadamente por: surcos con
múltiples brazos (por ejemplo hélices 9 y 10), por presentar surcos con pseudonudos (ejemplo helices 1 y
2) o por pequeñas áreas que no presentan surcos (ejemplo hélices 2 y 32), la hélice 50 en denominada
universal, debido que hasta la fecha está presente en SSU rRNA de arqueas, bacterias y plásmidos.
Hoy en día, existen bases de datos como el Ribosomal Database Project, el GenBank y el
Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), las cuales pueden consultarse libremente, para
realizar una comparación estadística de las secuencias obtenidas de un aislamiento, contra las que ya están
publicadas.
23
Figura 10. Modelo de la estructura secundaria de SSU rRNAs. Fuente: Schalenberger et al. (2001)
24
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Localización
Esta investigación se realizó en el Centro de Investigación Tibaitatá de CORPOICA, ubicado

en la Sabana de Bogotá, en el Municipio de Mosquera en el kilómetro 14 sobre la carretera de
occidente, a los 2543 msnm. Se clasifica en la zona agroecológica Fa, es decir piso térmico frío, con
una temperatura promedio de 13°C, provincia de humedad subhúmeda, precipitación media de 751 mm
anuales; Relieve plano, suelos (Udands, Tropept), con influencia variable de cenizas volcánicas que
presentan baja evolución, generalmente profundos, bien drenados y de fertilidad moderada
(CORPOICA, 1998).
Las pruebas microbiológicas fueron realizadas en el laboratorio de biología molecular de

CORPOICA. Los análisis de composición química del forraje fueron elaborados en el laboratorio de
Nutrición del Programa de Fisiología y Nutrición Animal y los análisis fisicoquímicos del suelo fueron
realizados en el laboratorio de suelos del Programa de Recursos Biofísicos.
Las muestras se recolectaron de suelo rizosférico y raíces noduladas de Alnus acuminata

H.B.K., nativos de los Departamentos de Cundinamarca en los municipios de Funza, Mosquera,
Facatativa y la localidad de Usme (Figura 11 y Tabla 2) y en el Departamento de Nariño en los
municipios de Sapuyes, Tangua, Pupiales y Pasto (Figura 12 y Tabla 3), zonas seleccionadas por hacer
parte del proyecto “Incorporación de la especie Alnus acuminata H.B.K. en sistemas silvopastoriles
para la producción ganadera sostenible del trópico alto Colombiano”, financiado por Colciencias y
CORPOICA.
Se realizó el monitoreo de las condiciones climáticas en los meses de marzo y abril de las
zonas experimentales, fechas de recolección de las muestras, la recolección de la información fue
obtenido en las estaciones climáticas que se indican en la tabla 4.
25
Tabla 2. Información general de las zonas de recolección de las muestras en Nariño
PROPIETARIO MUNICIPIO VEREDA FINCA LOTE m.s.n.m Temp./anual
Cercado
1 Miguel Santacruz Pasto Tomboloma Itaipu 2760 12 °C
alisos
2 José Silva Sapuyes Chunguel La Montaña Las piedras 3210 11 °C
Marcelino Del Vía El El Cerca viva
3 Pupiales 2960 13.2 °C
Hierro Espino Triangulo alisos
Cubijan Los Cerca viva
4 Iván Caviedes Pasto
Alto Arrayanes de alisos
3070 13.5 °C
Julio Omar Cubijan Las
5 Ramírez
Tangua
Bajo Kuriquingas
Los alisos 3110 12.8 °C
Tabla 3. Información general de las zonas de recolección de las muestras en Cundinamarca

PROPIETARIO MUNICIPIO FINCA VEREDA LOTE m.s.n.m Temp/anual
Villa Nataly
Bogota D.C.
Vivero, Los
1 Guillermo Ramírez Localidad de Olarte 3045 12 °C
Paquilla y El alisos
Usme
Condor
Reserva forestal
Facatativa Vivero 2586 14 °C
2 CAR
El Cacique,
3 Vía Funza-Bogotá Funza 2548 14 °C
Urbano
Vía Mosquera-
4 Estado Mosquera 2516 13°C
Bogotá
Tabla 4. Estaciones de información climática en Nariño y Cundinamarca

ESTACIÓN METEREOLOGICA ZONA/FINCA DE
UBICACIÓN ESTACIÓN
/ELEVACIÓN INFLUENCIA
NARIÑO
VILLA ROSA 3000 msnm SAPUYES La Montaña
E.E. OBONUCO 2871 msnm PASTO Los Arrayanes
SAN LUIS 2961 msnm PUPIALES El Espino
WILQUIPAMBA 3048 msnm PASTO Itaipu
BOTANA 2820 msnm PASTO Las Kuriquingas
CUNDINAMARCA
Mosquera
C.I. TIBAITATÁ 2.543 msnm MOSQUERA
Funza
FINCA EL CARMEN 2.610 MSNM LA SELVA Facatativa
FINCA VILLA NATALY 3045 msnm OLARTE Usme
26
FACATIVA
FUNZA
MOSQUERA
USME
Figura 11. Mapa de las zonas de recolección de las raíces noduladas en Cundinamarca (Fuente: Encarta, 2001)
27 27
PASTO
TANGUA
SAPUYES
PUPIALES
Figura 12. Mapa de las zonas de recolección de las raíces noduladas en Nariño (Fuente: Encarta, 2001)
28
28
3.2. Clasificación de las zonas de influencia de los Departamento de Nariño y
Cundinamarca
Las zonas de influencia de este estudio pertenecen al bosque andino ubicados entre los 2300 y
los 2900 m.s.n.m. y al bosque alto andino que se consideran como la franja comprendida entre los 2900
y los 3800 m.s.n.m. (Tovar & Rubio, 2001). Para describir las características generales de las zonas de
influencia fueron consultadas en el estudio de clasificación de suelos y zonificación general de tierras
del IGAC (1985ab y 2000) y la clasificación según Holdridge (1996).
La localidad de Usme en Cundinamarca y los municipios de Sapuyes y Tangua en Nariño se

encuentran ubicados en el piso altitudinal Montano, caracterizado por biotemperaturas medias entre los
6 y 12°C, precipitaciones de 500 a 1.000 mm/año y alturas entre 3.000 y 4.000 msnm. Esta zona de
vida se conoce comúnmente como páramo. La formación de Usme fue en la época del Paleógeno en
límites con el Neógeno; se distinguen dos partes: Una inferior constituida esencialmente por lodolitas
con intercalaciones de capas de arenitas finas y una parte superior compuesta por arenitas de cuarzo de
grano grueso y conglomerados de cuarzo. Presenta un relieve ondulado a escapado, con pendientes
complejas. Los suelos están formados a partir de materiales heterogéneos, localmente influidos por cenizas
volcánicas y/o materiales orgánicos, presentan baja evolución, son generalmente superficiales y de baja
fertilidad. Las condiciones climáticas y la localización geográfica hacen de éstas tierras, áreas estratégicas
para la conservación de las aguas, la fauna y la flora de los ecosistemas de páramo.
Los Municipios de Facatativa y Pupiales se encuentran ubicados en el boque húmedo montano

bajo (bh-MB). Esta formación presenta un clima caracterizado por una biotemperatura media de 12 a
18°C, una precipitación entre 1.000 y 2.000 milímetros al año y altitudes entre 1800 y 2800 m. Relieve
fuertemente quebrado, con pendientes de 25-30%. Los suelos formados a partir de materiales ígneos en
Nariño y sedimentarios en Cundinamarca, tiene baja evolución y fertilidad moderada son generalmente
superficiales y bien drenados. Áreas aptas para la ganadería extensiva y cultivos permanentes con
prácticas adecuadas de manejo.
Los Municipios de Funza y Mosquera y Pasto se clasifican como bosque seco montano bajo
(bs-MB), esta zona se caracteriza climáticamente por presentar biotemperaturas medias entre 12 y
18°C y lluvias inferiores a 1.000 milímetros al año; ocupa una franja altitudinal que va desde los 2.000
hasta los 3.000 m. La evapotranspiración promedio anual en esta zona oscila entre 650 y 690 mm. Son
29
de relieve plano a ondulado, con pendientes hasta del 12%. Los suelos formados a partir de materiales
heterogéneos o con influencia variable de cenizas volcánicas, presentan baja evolución son
generalmente profundos bien drenados y de fertilidad moderas. Los bosques en Cundinamarca de esta
formación han desaparecido casi en su totalidad y han sido reemplazados por cultivos agrícolas y
ganadería semi-intensiva.
3.3. Recolección de muestras de suelo y raíces noduladas en Alnus acuminata en Nariño y

Cundinamarca
Para la recolección de las muestras de los nódulos de A. acuminata se siguió la metodología

planteada por Peck & Melsted (1973) y Salinas & García (1985), donde los criterios fundamentales
fueron obtener una muestra representativa de las raíces nodulas, evitar la contaminación, identificar la
muestra en forma adecuada y transportar las muestras al laboratorio lo más pronto posible (Figura 13).
Figura 13. Recolección de los nódulos en bosques de Alnus acuminata
30
Con el fin de cuantificar y monitorear la población de microorganismos presentes en el suelo
de las zonas de influencia de esta evaluación, se realizó una análisis de micorrizas arbusculares
cuantificando el número de esporas por gramo (Gerdeman & Nicolson, 1963) y el porcentaje de
colonización (Philips & Hayman, 1970), recuentos de bacterias (Girad & Rougieux, 1964), de hongos
(Girad & Rougieux, 1964), de actinomiceto (Girad & Rougieux, 1964), de fijadores de nitrógeno
(Girad & Rougieux, 1964) y de solubilizadores de fosfato (Sundara & Sinha, 1963). Adicionalmente,
se realizó un análisis de pH de los suelos por medio de potenciómetro con electrodo de vidrio,
utilizando una relación suelo y agua 1:1, agregando a 10 cm 3 de suelo 10 cm3 de agua destilada. La
mezcla se dejó en reposo durante una hora y se realizó la lectura (ICA, 1966).
3.3.1. Lavado y desinfección de nódulos
Debido la morfología irregular que presentaron los nódulos de Frankia se empleo la

metodología planteada por Schwintzer & Tjepkema (1990) y Sarma et al. (1998), variando los
procedimientos de lavado y desinfección, teniendo en cuenta tiempos y desinfectantes. Con esto se
pudo obtener nódulos libres de suelo y completamente limpios para ser macerados y/o sembrados en el
medio de cultivo tanto líquido como sólido BAP.
Para la limpieza de los nódulos se realizaron lavados con dos soluciones: hipoclorito de sodio
al 10% y peróxido de hidrógeno al 10%, adicionando el 25% de estas soluciones y el resto con agua
destilada hasta cubrir totalmente el nódulo, con el fin de evitar daños superficiales. El primer periodo
contempló dejar los nódulos sumergidos en las soluciones durante 1 a 3 horas denominados tiempo
corto, y el segundo periodo, se dejó sumergido el nódulo toda la noche con agitación constante a 100
rpm. Los tiempos fueron acompañados por lavados con agua estéril.
3.3.2. Conservación de los nódulos
Para la conservación de los nódulos se utilizó la metodología de conservación de nódulos de

rizobios planteada por el CIAT (1988), en la cual se conservar los nódulos por periodos de hasta 5 años
(Somasegaran & Hoben, 1985). Sin embargo, los nódulos de Frankia se deterioraron a los 2 meses,
presentando una coloración negra y con crecimiento de mohos en la superficie. Con el fin de observar
si aun se encontraba la cepa de interés se realizó una siembra en medio BAP, sin tener éxito.
31
Otros nódulos fueron conservados con las raíces y el suelo rizosférico y depositado en bolsas
estériles. Las bolsas fueron llevadas a refrigeración a 4° C, monitoreando diariamente cambio en la
estructura, color y contaminación en la superficie de los nódulos, estos se preservaron en muy buenas
condiciones durante un periodo de 6 meses, tiempo en que empezaron a desarrollar senescencia y
contaminación. En la siembra control se observó un buen crecimiento de las cepas aisladas de éstos
nódulos.
Otra prueba de conservación consistió, en realizar la desinfección con H2O2, y lavados

sucesivos con agua estéril (cada hora), hasta la remoción total del suelo y para retirar la humedad se
pasaron por una bomba de vacío. Posteriormente, los nódulos fueron depositados en frascos estériles
con silical gel y algodón, metodología que tuvo éxito en el mantenimiento de los nódulos.
3.3.3. Aislamiento de cepas nativas de Frankia
Después del proceso de desinfección de los nódulos, se les realizó un corte a los lóbulos, unos
fueron macerados y otros sembrados directamente en el medio benzil amina purina (BAP) modificado
por Murry et al. (1984) (Anexo 1). Cuando las colonias comenzaron su crecimiento, fueron
resembradas en medio líquido BAP, con el fin de continuar su desarrollo (Figura 14).
Con el fin de disminuir la contaminación, se adicionó en algunas replicas 5 ug/ml

estreptomicina sulfato y en otra nistatina, y así poder identificar el mejor inhibidor de agentes
contaminantes que no afectara el crecimiento de Frankia (Lechevalier & Lechevalier, 1990).
Figura 14. Corte de un lóbulo de nódulo y crecimiento de Frankia en medio sólido y líquido BAP
32
3.3.4. Codificación de las cepas aisladas
Para la codificación de las cepas aisladas se tuvo en cuenta el sistema de clasificación planteado
Lechevalier (1984), asignando un código, resultado de la combinación de tres letras y un número.
Como primera letra se empleó la C de Colombia, la segunda letra por Departamento de

recolección: Nariño: N y Cundinamarca: C. Y como tercera letra se empleó un número debido a que
algunos municipios comenzaban con la misma letra y para el número se empleó una numeración
continua conforme la cantidad de cepas aisladas por Municipio (Tabla 5).
Tabla 5. Codificación de las cepas de Frankia aisladas

C: COLOMBIA
N: NARIÑO C: CUNDINAMARCA
CN1(n): Pasto (Tamboloma) CC1(n): Usme
CN2 (n): Sapuyes (Chunguel) CC2 (n): Facatativa
CN3 (n): Pasto (El Espino) CC3 (n): Funza
CN4 (n): Pasto (Cubijan Alto) CC4 (n): Mosquera
CN5 (n): Tangua (Cubijan Bajo)
n: Corresponde al número de cepas aisladas
3.3.5. Caracterización fenotípica de cepas de Frankia
Para la caracterización y evaluación de las cepas de Frankia, se emplearon dos cepas control
(AacI y AacIII), originarias de Argentina aisladas de nódulos Alnus acuminata, evaluadas y
caracterizadas por Carú et al. (2000), en la Universidad de Chile, Departamento Forestal, Área de
microbiología.
La caracterización consistió en identificar la morfología microscópica y macroscópica de los

cultivos en medio líquido BAP sin agitación y el crecimiento con diferentes fuentes de carbono en
medio BAP modificado según la fuente
3.3.6. Caracterización macroscópica y microscópica
Para la caracterización macroscópica, se tuvo en cuenta el color, el tamaño, la forma y el

crecimiento a los 25 días, que presentaron los aislados. La identificación microscópica contempló la
observación de la presencia o ausencia de esporas, hifas septadas y la formación presencia de vesículas
fijadoras de nitrógeno en medio BAP libre de NH4+, la cual se realizó una tinción con azul de tripán.
33
Adicionalmente, se realizó un análisis estructural de las cepas CN49 y CC13, las cuales fueron
colocadas en glutaraldehído al 2.5% por 2 horas y llevadas a centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos.
Posteriormente, se mezcló cada una de las cepas en agar agua al 2% y se solidificaron por congelación.
El bloque formado de agar más las cepas, fue introducido en glutaraldehído para ser llevado al proceso
de fijación, lavado y deshidratación, que se realizó en el laboratorio de microscopia electrónica en la
facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia (Romero, 2003).
Posteriormente, se retiró el glutaraldehído y se sumergió la muestra en el amortiguador fosfato

de Millonig (1961) citado por Romero (2003) buffer pH de 7.2 por 15 minutos, proceso que permite
fijar la muestra. A la muestra se le adicionó como fijador secundario tetróxido de osmio (OsO 4) al 1%
con 2 ml de OsO4 n y 8 ml del amortiguador, finalmente las muestras fueron dejadas en el rotador en
refrigeración por 1 hora.
Para la deshidratación se utilizó etanol a diferentes concentraciones de la siguiente manera:

etanol al 70% durante 5 minutos una vez; etanol al 95% durante 10 minutos dos veces; etanol al 100%
durante 5 minutos tres veces. Para terminar la deshidratación se empleo óxido de propileno por 20
minutos, óxido de propileno más resina epoxi a una relación 1:1 por una hora y una mezcla de resina
epoxi Epon-Araldita (endurecedor DAS: Anhídro hexhidroftáltico; acelerador DMP-30: 2,4,6-
tridimetilamino metil fenol) por una hora dos veces. A unas proporciones de oxido:resina de 1:1 y 3:1
por una hora con calor y rotación.
La muestra a procesar se cortó en un tamaño de 1 mm y fue montada en un molde de plano

para obtener los bloques de medida y forma adecuados para ser cortadas en el micrótomo adicionando
resina epon-araldita líquida y se llevaron a polimerización en estufa a 60°C por 48 horas. Los bloques
fueron seccionados y fijados por calor en láminas que se colorearon con azul de toluidina durante 1
minuto retirando el exceso de colorante con agua (Figura 15).
34
Cepa Fijador OsO4
Rotador 60 °C x 1h
Deshidratación con alcohol
Molde plano
Corte en el microtómo,
tinción y observación
Figura 15. Esquema general del montaje de las muestras
3.3.7. Crecimiento de Frankia en diferentes fuentes de nutrientes
Para las evaluar el crecimiento de Frankia en diferentes fuentes nutricionales, se seleccionó

una cepa por Departamento (CN44 y CC13) y una control (AacIII). Las cepas fueron crecidas en medio
BAP durante 1 mes, a 36°C con agitación constante (150 rpm) y así obtener suficiente cantidad de
biomasa para las diferentes pruebas. Como fuente de carbono se utilizó ácido cítrico, ácido pirúvico,
almidón, celulosa, fructosa, galactosa, glucosa (control), manitol, sacarosa y xilosa, siendo
reemplazadas en el medio BAP según el carbono proporcionado a concentración de 3.6 g/C/l. Todas las
fuentes fueron evaluadas a tres pH 4.5, 6.5 y 8.
Adicionalmente, se evaluaron cuatro fuentes alternativas de nutrientes: melaza, extracto de

raíz, vinaza y quinua (Ch. quinoa). Para ello se realizó un análisis de la composición de minerales en
cada una de las fuentes y se realizó el balance de nutrientes con relación al medio base y minerales del
BAP, adicionando aquellos elementos que la fuente no proporcionara (Tabla 6). Las vitaminas fueron
adicionadas en todas las pruebas (Anexo 1).
35
Tabla 6. Evaluación mineral de fuentes alternativas de nutrientes
VINAZA QUINUA MELAZA EXTRACTO DE
BAP (pmm)
(pmm) (pmm) (pmm) RAÍZ (pmm)
Elemento
Composición
Composición
Composición
Composición
Faltante
Faltante
Faltante
Faltante
Aporte
Aporte
Aporte
Aporte
Mg 4,9 8000,0 7995,0 2100 2095 4600 4595 0 4,9
S 10,5 25700,0 25689,4 1000 989,4 18100 18089,4 100 89,4
Ca 2,7 12800,0 12797,2 1000 997,2 12700 12697,2 200 197,2
N 71 22400,0 22329 22300 22229 6000 5929 32 39
Cl 247 1500,0 1252,9 19300 19052,9 7200 6952,9 3600 3352,9
B 39,7 650000,0 649960,3 1890 1850,3 550000 549960,3 650000 649960,3
Mn 50,3 28500,0 28449,6 1,3 49 16500 16449,6 0,5 49,8
Zn 2,9 42,5 39,5 71,45 68,4 13,17 10,1 650 647
Cu 2 6,5 4,4 10,99 8,9 6,37 4,3 50 47,9
Na 1,4 nd nd 1,48 nd nd 1,4 nd nd 1,48 nd nd
Mo 0,2 454,3 454,0 245 244,7 9,46 9,2 82,5 82,2
Co 0.000011 0,5 0,5 99,93 99,9 0,46 0,4 50 50
C 4003,8 755000,0 750996,2 38300 34296,2 21000 16996,2 358000 353996,2
K 0,04 49500,0 49499,9 6500 6499,9 27400 27399,9 100 99,9
P 0,03 1600,0 1599,9 9700 9699,9 1000 999,9 100 99,9
Fe 0.0 149,5 149,5 68,95 68,95 98,93 98,93 3,5 3,50
nd: no determinado
Los aislamientos fueron evaluados por triplicado en el medio BAP ajustando según la fuente y
pH a analizar. Se dejaron crecer por periodo de 8 días (Fase logarítmica) a 36°C con agitación
constante (150 rpm) (Figura 16). El crecimiento de las cepas se cuantificó según el peso obtenido al
final de la incubación (Nittayajarn & Baker, 1989) aplicando la siguiente ecuación:
Biomasa celular de Frankia = Peso final de la cepa - peso inicial de la cepa
Figura 16. Prueba de crecimiento de Frankia en diferentes fuentes nutricionales
36
En total se analizaron 14 fuentes nutricionales, 3 pH y 3 cepas para un total con tres replicas
por prueba para un total de 378 unidades experimentales. Los datos fueron analizados estadísticamente
usando el análisis de varianza y los resultados de crecimiento de las cepas en las diferentes cepas
fueron analizados con el siguiente modelo:
Yijk = u + Pi + Cj + PC (ij)+ Єijk
donde:
Yijk = Es la variable observada en la interacción de nutriente, pH y cepa
u = Media general.
Pi = Efecto debido al nutriente
Cj = Efecto debido al pH j.
PC (ij) = Efecto de la interacción nutriente i y el pH j
Єijk = Error experimental asociado al nutriente i, pH j y cepa k.
La información recolectada en esta fase se procesó en el programa Statistical Analysis System
(SAS, 1997). La comparación de medias se realizó según la prueba de Tukey (Tukey`s Studentized
Range).
3.4. Evaluación en vivero de las cepas de Frankia en Alnus acuminata H.B.K.
3.4.1. Producción de plántulas experimentales de A. acuminata
Las semillas de A. acuminata fueron recolectadas de árboles nativos de aproximadamente 15

años de la vereda Puente Piedra en el Municipio de Saboya (Boyacá) a 2650 msnm. Se seleccionaron
manualmente las semillas sanas y homogéneas en tamaño y se desinfectaron con lavados continuos con
30% H2O2 por 10 minutos (Chatarpaul et al., 1989).
Para la obtención de plántulas de A. acuminata, las semillas se sembraron en un germinador de

2 m de largo por 1 m de ancho y 50 cm de profundidad. Se empleo una mezcla 1:3 de cascarilla de
arroz y suelo proveniente de la hacienda San Jorge del ICA (Soacha), el cual fue desinfectado con
Basamid a una proporción de 70g por 200 kg de suelo cubriéndolo con un plástico durante 8 días,
posteriormente se dejó solarizar durante 15 días. Una vez terminado el proceso de desinfección, se
procedió a sembrar 20 g de semillas de Alnus acuminata por surco. El semillero fue protegido con
polisombra durante 30 días hasta que las plántulas presentaron un tamaño de 5 cm de altura
aproximadamente (Figura 17).
37
Figura 17. Germinador y plántulas de Alnus acuminata C.I. Tibaitatá Corpoica
3.4.2. Preparación de inóculos de Frankia
Para la preparación de los inoculantes, las cepas de Frankia fueron cultivadas en caldo BAP.
Adicionalmente se les adicionó extracto acuoso de raíz (100 ml/litro) (Anexo 1, Figura 18) y fueron
llevadas a incubación a 36°C durante 20 días con agitación constante de 2500 rpm, hasta obtener
suficiente biomasa celular.
Figura 18. Extracto acuoso de raíz de Alnus acuminata
Posteriormente, los cultivos fueron homogenizados, adicionando del cultivo 30 ml en 70 g de

una mezcla de turba estéril y cal dolomita, metodología utilizada en CORPOICA Tibaitatá para la
preparación de inoculantes de rizobios (Ramírez, 1992).
Con el fin de obtener crecimiento de esporas, los inoculantes fueron mantenidos a 28ºC durante
8 días, posteriormente fueron mantenidas a temperatura ambiente, hasta su utilización. Como control
de calidad para de verificar la conservación de las cepas de Frankia se realizó después de 15 días de
mantenimiento, la siembra de los inoculantes en medio líquido BAP y se observó el crecimiento de las
cepas (CIAT, 1988) (Figura 19).
38
Figura 19. Preparación de inóculos de Frankia en turba estéril
3.4.3. Inoculación de A. acuminata con las cepas de Frankia
En la fase de vivero, se utilizó como sustrato para el crecimiento de A. acuminata suelo

representativo de cada una de los Departamentos de influencia de esta evaluación. El suelo del
Departamento de Cundinamarca fue extraído de la hacienda San Jorge del ICA y en Nariño de la
estación experimental Obonuco de CORPOICA. A los sustratos se les realizó análisis fisicoquímicos:
pH (potenciometría), Al+H (acidez intercambio KCl 1N), MO (Walkley-Back modificado), Ca, Mg K,
Na (ac. NH4, 1N, pH 7), SAT Al, CIC, C.E., Fe, Cu, Mn, Zn y B (elementos menores por Olsen
modificado), fósforo (Bray II) y N (Kjendahl), realizados en el laboratorio de suelos del Programa
Nacional de Recursos Biofísicos, Tibaitatá. Adicionalmente, se realizaron análisis microbiológicos con
el fin de conocer las condiciones iniciales.
Para la preparación de las materas, el suelo fue tamizado y mezclado con cascarilla de arroz en
proporción 1:3 con el fin de facilitar el drenaje, mantener humedad y evitar compactación. Se
emplearon vasos plásticos como materas con una capacidad de 500g y se llenaron con el sustrato,
posteriormente las materas fueron solarizadas durante 5 días y se adicionó agua a capacidad de campo
un día antes de la siembra. Las plantas de A. acuminata fueron transplantadas cuando alcanzaron una
39
altura aproximadamente de 5 cm y se inocularon con 5g/inóculo/planta (Chatarpaul et al., 1989)
(Figura 20).
Figura 20. Siembra de los tratamientos experimentales en plántulas de A. acuminata
En el vivero, las unidades experimentales se distribuyeron según el diseño de bloques

completos al azar y se sometieron a condiciones normales de temperatura, humedad relativa y
radiación solar. El material experimental se regó con regadera de jardín diariamente en las horas de la
mañana, a capacidad de campo. Se realizó un control de malezas manual a los 8 días del trasplante e
inoculación de las plantas (Figura 21)
B3
B2
N C
a B1 b
Figura 21. Organización por bloques de la inoculación en A. acuminata con cepas de Frankia.
a. Nariño (N). b. Cundinamarca (C)
40
3.5. Análisis estadístico
3.5.1. Diseño experimental
Se utilizó un diseño de tres bloques completamente al azar por Departamento, evaluando 24

tratamientos en Cundinamarcar 24 distribuidos en 21 cepas nativas, dos controles (AacI y AacIII) y un
testigo y 25 tratamientos en Nariño distribuidos en 22 cepas nativas, dos controles (AacI y AacIII) y un
testigo (Tabla 7). Cada tratamiento se evaluó por duplicado por bloque, para un total de 432 unidades
experimentales en Cundinamarca y 450 unidades experimentales en Nariño. Los datos fueron
recolectados a los 45, 90 y 125 días después de la siembra para un total de 3 muestreos.
Tabla 7. Tratamientos evaluados en la fase de vivero

Código cepa Código cepa
Tratamiento Tratamiento
Nariño Cundinamarca
CN11 T1 CC12 T1
CN12 T2 CC13 T2
CN13 T3 CC14 T3
CN21 T4 CC17 T4
CN22 T5 CC18 T5
CN23 T6 CC110 T6
CN32 T7 CC111 T7
CN33 T8 CC113 T8
CN34 T9 CC21 T9
CN41 T10 CC31 T10
CN43 T11 CC32 T11
CN44 T12 CC33 T12
CN46 T13 CC34 T13
CN47 T14 CC41 T14
CN48 T15 CC42 T15
CN49 T16 CC43 T16
CN410 T17 CC44 T17
CN411 T18 CC45 T18
CN412 T19 CC46 T19
CN51 T20 CC47 T20
CN52 T21 CC48 T21
CN53 T22 AacIII T22
AacIII T23 AacI T23
AacI T24 Testigo sin inocular 24
Testigo sin inocular T25
41
El modelo matemático utilizado para el experimento de la inoculación de las cepas Frankia en
A. acuminata, fue un diseño de bloques completos al azar con dos repeticiones por bloque:
Yij= u + Bj + Ti + Eij
En donde:
Yij = Variable de respuesta del tratamiento (Cundinamarca i1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ; Nariño
i1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ) repetición (j1,2,3): (Microbiológicas, agronómicas y químicas).
u = Respuesta media general.
Bj = Efecto debido al bloque j
Ti = Efecto del tratamiento i
Eij = Error experimental
La información recolectada en esta fase se procesó en el programa de SAS, 1997. La

comparación de medias se realizó según la prueba de Tukey (Tukey`s Studentized Range).
3.5.2. Variables experimentales
Para realizar la recolección de la información, las plantas fueron transportadas del vivero al
laboratorio (Figura 22 y 23).
Figura 22. Plántulas de A. acuminata para ser transportadas al laboratorio
42
Figura 23. Plantas de Alnus acuminata listas para su evaluación
Para el análisis de las variables se consideraron las relacionadas con el crecimiento de la planta:
Agronómicas: Altura (cm), diámetro del tallo a nivel del suelo (mm), Número de hojas, peso seco
foliar (g) y peso seco radicular (g), longitud radicular (cm) y materia seca total (g/planta).
Microbiológicas: Número de nódulos. Químicas: Los análisis químicos a nivel foliar se realizaron en el
último muestreo (125 días), determinando los contenidos de proteína cruda por Kjeldahl (Nx6.25) y
fósforo (Hanson, 1950) (Figura 24).
Figura 24. Plantas Alnus acuminata durante el proceso de muestreo
43
3.6. Identificación molecular de los aislados de Frankia
3.6.1. Preparación de las muestras de Frankia
Cada cepa de Frankia por Departamento, que presentó la mejor respuesta agronómica y de
composición química, fué identificada a nivel molecular. Para ello se crecieron en medio líquido BAP
libre de NH4+ durante 20 días a 36°C con agitación constante (150 rpm) (Murry et al., 1984).
Las cepas fueron colocadas en tubos de Eppendorf, y se les realizó el choque térmico por 24
horas a –20 °C. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 14000 rpm por 5 minutos y se
resuspendieron 200 ul de agua reactiva libre de DNAasa y RNAsas.
3.6.2. Amplificación de la región variable V2-V3 del gen 16S rDNA de Frankia por la
reacción en cadena de la polimerasa PCR
La identificación molecular de los aislados de Frankia se realizó mediante la amplificación de

una la región variable V2-V3 del gen 16S rDNA (Tabla 8), utilizando los primers Forward
5´ACTGGCGGACGGGTGAGTAA 3 y Reverse 5´CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3´ reportado por
Schmalenberger et al. (2001) y la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Tabla 8. Condiciones de concentración de DNA genómico de Frankia

REACTIVO Concentración por
Muestra (25x)
Agua Ultrapura 18 ul
Buffer TRIS-EDTA 100 ul, KCl 50 mM, pH 7.6 2.5 ul
Taq polimerasa 0.3 ul
dNTP´s 0.5 ul
Primer 1 ul
DNA 2 ul
TOTAL 24.3 ul
Para las condiciones del termociclador (Figura 25) se empleo las reportadas por Bürgmann et
al. (2004 ), con algunas modificaciones:
❖ Ciclo 1 primera denaturalización: 1 vez

• Paso 1: 94 °C 2 minutos
❖ Ciclo 2 denaturalización y templado: 30 veces
• Paso 1: 94°C 30 segundos
• Paso 2: 60°C 30 segundos
44
• Paso 3: 72°C 1 minuto
❖ Ciclo 3 extensión:
• Paso 1: 72°C 2 minutos
• Paso 2: 4°C 24 horas
Figura 25. Termociclador Biorad “cicler IQ” optical model, serie 548BR4472 USA
El gel de agarosa se preparó al 1.8% más la solución buffer TBE (Tris, ácido bórico, EDTA),
según las dimensiones: ancho, largo y alto de la caja Se calentó la solución hasta su disolución
completa y se sirvió en la caja dejándolo solidificar. Posteriormente, se trasladó el gel a la cámara
electroforesis y se adicionó del buffer TBE hasta quedar sumergido (Figura 26).
Figura 26. Preparación del gel de agarosa
A los productos del PCR se les adicionó 2.5 ul buffer de carga, 5 ul del marcador Fermentas
(Gene Rutertm DNA ladeler plus 100pb), los cuales fueron depositados en los pozos de la cámara de
electroforesis para su corrida (Figura 27).
45
a b
c d e
Figura 27. Esquema general del proceso del producto de PCR para la corrida por electroforesis
Para visualizar las moléculas de ADN de los productos del PCR, el gel fue teñido con un
agente intercalante (Bromuro de etilio), que tiene la capacidad de introducirse entre las bases apiladas
del DNA, abre un poco la doble hélice y provoca un desenrrollamiento local. Para la calibración de la
electroforesis y realizar el calculo del tamaño de los fragmentos del ADN, se aplicó en uno de los
pozos del gel una mezcla de fragmentos del ADN (patrones).
Para conocer el tamaño de los fragmentos de DNA analizados, la distancia recorrida de los
mismos se comparó con la distancia recorrida por cada uno de los fragmentos que componen el patrón
de talla molecular, el cual se colocó en uno de los pozos del gel al momento de disponer los productos
del PCR al inicio de su separación electroforética. Se midió la distancia recorrida por cada uno de los
fragmentos que componen el patrón de talla molecular (T.M).
La purificación del cada fragmento se realizó teniendo en cuenta las especificaciones del kit
Wizard® PCR Preps Systems de Promega (Clawson et al., 1998).
46
Las secuencias genómicas obtenidas fueron sometieron a un Blastsearch en la base de datos de
GenBank y en EMBI (European bioinfomatics Institute) y alineadas mediante el programa Clustal W
(Thompson et al., 1994).
47
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Caracterización ambiental, edáfica y microbiológica de los sitios experimentales
Los registros promedios obtenidos de precipitaciones y temperatura en la época de recolección

en los municipios donde se recolectaron las raíces noduladas de A. acuminata se registran en las
figuras 28 y 29.
Precipitación (mm)
Temperatura °C
de las muestras en Nariño Precipitación (mm)
Temperatura °C
de las muestras en Cundinamarca
48
Nariño presentó una temperatura promedio que osciló entre 11 y 13.5°C para los municipios de
Sapuyes y Pasto (Cubijan Alto) respectivamente, condiciones características de la zona alto andina. En
el Departamento de Cundinamarca la mayor temperatura fue registrada para los municipios de
Facatativa y Usme (12°C).
Las precipitaciones en Cundinamarca tuvieron mayores valores promedios que en Nariño, con
valores que fluctuaron entre 166.6 mm/bimensual para Usme y 92.45mm/bimensual para Facatativa.
En Nariño los reportes mayores fueron registrados en Toboloma (86.9 mm/bimensual) y los menores
en Pasto (Cubijan Alto 56.1 mm).
El pH es una de las propiedades químicas importante del suelo, por su efecto en el crecimiento
de las plantas. Las muestras de suelo circundante a la raíz de A. acuminata que reportaron un pH
fuertemente ácido en Nariño fueron Sapuyes (5.3) y Pasto (Cubijan Alto) (5.5) y en Cundinamarca
Funza (5.4). Los suelos que presentaron características medianamente ácidas fueron en Nariño Pasto
(Tomboloma), Pupiales y Tangua. En Cundinamarca, Usme (5.6), Facatativa y Mosquera presentaron
un pH de 6.1, suelos clasificados como ligeramente ácidos.
Los análisis microbiológicos que se obtuvieron en las muestras de suelo rizosférico, se indican
en la tabla 9.
Tabla 9. Análisis microbiológico del las muestras de suelo de Alnus acuminata

Fijadores de
ZONA DE RECOLECCION Porcentaje de Número de Bacterias Actinomicetos Hongos Solubilizadores de
Nitrógeno
DE MUESTRAS colonización esporas/g UFC/g x10-6 UFC/g x10-6 UFC/gx10-6 Fosfato UFC/g x10-6
UFC/g x10-6
CUNDINAMARCA
1. Usme 87 2 378 7 8 11 23
2. Facatativa 80 3 124 1 3 3 2
3. Funza 72 6 97 226 1 4 3
4. Mosquera 77 8 250 120 10 4 4
NARIÑO
1. Pasto (Tamboloma) 60 93 231 161 3 2 8
2. Sapuyes 80 17 341 106 18 4 4
3. Pupiales 80 18 342 4 8 2 3
4. Pasto (Cubijan Alto) 94 5 373 9 4 4 5
5. Tangua 94 3 391 104 1 1 2
Analizando los resultados obtenidos de la incidencia micorrítica, se observa una relación

inversa entre los valores promedios del porcentaje de colonización y el número de esporas. Éste efecto
49
posiblemente está asociado a factores ambientales, principalmente de la época de lluvia en que se
realizaron los muestreos, que estimula el porcentaje de colonización y reduce la producción de esporas
(Guerrero & Hodson, 1990) (130 mm y 66.5 mm Cundinamarca y Nariño). Por lo tanto, la época de
recolección de las muestras influyó en el alto porcentaje de colonización, lo cual es explicado en un
56% para Cundinamarca y 88% para Nariño en el número de esporas (P>0.01) (Figura 10).
a
a b
Tabla 10. Relación entre el número de esporas y el porcentaje de colonización de micorrizas asociadas
a A. acuminata de Cundinamarca (a) y Nariño (b)
Según Pereira et al. 1996 y 2000, un buen suelo se caracteriza por presentar poblaciones de
bacterias totales, bacterias fijadores de nitrógeno y hongos en el orden de 10x10 6 UFC/g de suelo,
comparando esto con los resultados obtenidos en las muestras de suelo rizosférico de Alnus acuminata,
las poblaciones microbiales presentan buenos recuentos
Con relación a las poblaciones de bacterias las zonas que presentaron los mayores recuentos
fueron Tangua (391 x106 UFC/g), Pasto (Cubija Alto) (373 x10 6 UFC/g), Usme (378 x106 UFC/g),
Sapuyes (341 x106 UFC/g) y Pupiales (342 x106 UFC/g), el menor recuento fue obtenido en Funza con
97 x106 UFC/g.
Los resultados del análisis microbiológico de las muestras, presentaron una relación directa
entre el porcentaje de colonización y las poblaciones de bacterias, los cuales concuerdan con lo
reportado por Pereira (2000), quien menciona que la presencia de micorrizas influye marcadamente en
el mayor crecimiento de las poblaciones de bacterias, lo cual explica que al aumentar las poblaciones
de micorrizas en los suelos rizosféricos de A. acuminata se aumentaron las poblaciones de bacterias en
un 72% en Nariño (P<0.01) y 47% en Cundinamarca
50
En cuanto a las poblaciones de actinomicetos los mayores recuentos se presentaron en Funza
con 226 x106 UFC/g. Según Pereira (2000), las poblaciones de actinomicetos están relacionadas con la
producción de antibióticos, lo cual puede explicar que en Funza se presentó los menores recuentos de
bacterias. Los menores recuentos de actinomicetos fueron presentados por Facatativa (1 x10 6 UFC/g),
Pupiales (4 x106 UFC/g), Usme (7 x106 UFC/g) y Pasto (Cubijan Alto 9 x10 6 FC/g).
Las poblaciones de hongos, solubilizadoras de fosfato y fijadores de nitrógeno de vida libre

fueron bajas en todas las muestras. Las poblaciones de hongos presentaron colonias que oscilaron entre
1x106 UFC/g en Funza y Tangua y 18 x106 UFC/g en Sapuyes, en las solubilizadores de fosfato y
fijadores de nitrógeno el mayor recuento lo presentó la localidad de Usme con 11 x10 6 UFC/g y 23
x106 UFC/g respectivamente.
Se puede concluir que los menores recuentos de microorganismos rizosféricos fueron

presentados en los suelos del municipio de Facatativa.
4.2. Características de los nódulos recolectados de A. acuminata
Los nódulos radicales de A. acuminata, presentaron forma coraloide, de diversos tamaños, con
gran cantidad de lóbulos dispuestos en racimos, de color rojo intenso (Figura 30).
1 2
Figura 30. Diversidad en la morfología y el tamaño de los nódulos recolectados. Cundinamarca:

Mosquera:1) Funza: 2. Nariño: Pupiales 3.
51
4.2.1. Lavado y desinfección de nódulos
Con el hipoclorito de sodio al 10%, con tiempos largos y cortos el suelo presente en los
orificios superficiales de los nódulos no fue removido totalmente. En el tiempo largo (24 horas), los
nódulos sufrieron desprendimientos de las partículas superficiales. Al realizarse las siembras de los
nódulos sometidos a los diferentes tiempos, se observó que aquellos desinfectados en el tiempo corto
(3 horas) presentaron un alto porcentaje de contaminantes que evitó el crecimiento de las cepas de
Frankia y un crecimiento escaso o nulo de Frankia en los nódulos sometidos a desinfección por largo
tiempo.
Sin embargo, los nódulos sometidos totalmente al peróxido de hidrógeno al 10% y agua
destilada, presentaron una remoción del suelo con el tiempo constante, sin causar daño o deterioro.
Dependiendo del tipo de nódulo, el tiempo de exposición al H 2O2 varió, así que en los nódulos de
mayor tamaño (≥5 cm), fue necesario dejarlos durante toda la noche y durante 3 horas los de menor
tamaño (≤4cm). Esta metodología de remoción total del suelo en los nódulos, sin causar daños en la
superficie permitió obtener los aislamientos de Frankia (Figura 31).
Figura 31. Nódulos antes y después del lavado con peróxido de hidrógeno al 10%
4.2.2. Aislamientos de Frankia obtenidos por Departamento
En las tablas 11 y 12 se muestran las características de las cepas aisladas de los dos
Departamentos. Los aislados fueron monitoreados a los 30 días de crecimiento en medio líquido BAP.
Estas cepas fueron empleadas para la producción del inoculante.
52
Tabla 11. Morfología de las cepas de Frankia en medio líquido BAP aisladas de Nariño
CÓDIGO CRECIMIENTO/
PROCEDENCIA COLOR MORFOLOGÍA COLONIA EN MEDIO LÍQUIDO BAP
AISLAMIENTO ESPORANGIOS
CN11 BC A/S Copos pequeños que se compactan formando un centro café (A)
CN12 BA A/S Copos pequeños y redondos con crecimiento en las paredes del frasco y superficial
1: Pasto (Tamboloma) (B)
CN13 BC A/S Copos con centro café oscuro compacto con formación micelial alrededor (A)
CN14 BC E/S Colonias pequeñas y adheridas a las paredes del frasco y superficial (B)
CN21 BC A/S Con crecimiento superficial, Copos Blancos y algodonosos (A)
2: Sapuyes CN22 BC A/S Colonia con consistencia algodonosa (A)
CN23 BC A/S Colonias con consistencia algodonosa y gomosa (A)
CN31 BC E/S Colonias con consistencia algodonosa (A)
CN32 BC A/S Las colonias no presentan forma uniforme. Consistencia gomosa (A)
3: Pupiales
CN33 BC A/S Las colonias no presentan forma uniforme. Consistencia gomosa (A)
CN34 CB A/S Las colonias presentan forma de copos pequeños y algodonosos (A)
CN41 BA A/S Las colonias presentan una forma de copos pequeños y algodonosos (A)
CN42 BC E/S Se presenta colonias en forma de copos pequeños y algodonosos (A)
CN43 BC E/S Se presenta colonias en forma de copos pequeños y algodonosos (A)
CN44 BC E/S Colonias algodonosas (A)
CN45 Colonia presentar un grado de contaminación muy alto, lo cual inhibió el crecimiento y desarrollo de la colonia.
CN46 BC A/S No presenta una forma definida de colonia, la consistencia es algodonosas y gomosa.
Presenta crecimiento superficial en el medio (B)
4: Pasto (Cubijan Alto) CN47 B A/N Se presenta colonias en forma de copos pequeños y algodonosos (A)
CN48 BC A/S Se presentan colonias en forma de copos pequeños, los cuales se desvanecen
uniformemente al crecer. La consistencia es algodonosas, con micelio café oscuro (A)
CN49 BC A/S Colonias irregulares y algodonosas (A)
CN410 BC A/S Morfología de la colonia irregular. Presenta color café oscuro en la parte central del
cultivo (A)
CN411 BC A/S Presenta formación de copos algodonosos y gomosos (A)
CN412 BA A/S La colonia es muy compacta y redonda (A)
CN51 BC A/S Colonia algodonosa y deforme (A)
5 Tangua CN52 BC A/S Colonia algodonosa y deforme (A)
CN53 BC A/S Colonia algodonosa y gomosa (A)
Color del cultivo: B: Blanca; C: Café; R: Rojo; A: Amarillo. Crecimiento: E: escaso; A: abundante. Producción de esporangios: S: Si; N: No. Aeróbicas: (A). Microaerofílicas: (B)
53
Tabla 12. Morfología de las cepas de Frankia en medio líquido BAP aisladas de Cundinamarca
CÓDIGO CRECIMIENTO/
ROCEDENCIA COLOR MORFOLOGÍA COLONIA EN MEDIO LÍQUIDO BAP
AISLAMIENTO ESPORANGIOS
CC11 B E/N Colonias algodonosas y deformes (A)
CC12 BR A/S Colonias pequeñas y algodonosas (A)
CC13 BC A/S Colonias con formas de copas algodonosas Crecimiento superficial (B)
CC14 BC A/S Colonias formando copos estratificado de consistencia algodonosa (A) .
CC15 B E/N Colonias pequeñas y algodonosas con centro café (A)
Colonias pequeñas algodonosas y en forma de copos, Crecimiento del micelio
CC16 B E/N
superficial (B)
1: USME Colonias pequeñas y algodonosas, Crecimiento en las paredes del medio.
CC17 BC A/S
Crecimiento superficial (B)
CC18 BC A/S Colonias en forma de copos en estrato, puntos cafés (A)
CC19 BC E/S Crecimiento de colonias formando copos con consistencia algodonosa a gomosa (A)
CC110 BA A/S Colonias en forma algodonosa con centro amarillo (A)
CC111 BR A/S Colonias en forma de copos algodonosos con centro rojo (A)
CC112 BC E/S Colonias en forma de copos que se compactan formando un centro café claro (A)
CC113 BR A/S Colonias rojas, forma compacta algodonosa (A)
2: FACA CC21 BC E/S Colonias viscosas y gomosa muy compacta (A)
CC31 B E/N Colonias gomosas y de forma compacta (A)
CC32 B A/N Colonias algodonosas y de forma compacta (A)
3: FUNZA
CC33 B A/N Colonias gomosas y de forma compacta (A)
CC34 B A/N Colonias gomosas y algodonosas (A)
CC41 BC A/S Crecimiento estratificado, formando copos grandes redondos y abundantes (A)
Colonias con micelio blanco con centro café y rojo, formación de copos grandes y
CC42 BCR A/S
redondos (A)
CC43 BC A/S Formando copos amorfos y pequeños (A)
Copos amorfos con crecimiento en las paredes del frasco y en la superficie del medio
4: MOSQUERA CC44 BC A/S
(B)
CC45 AC A/S Copos medianos con centro café. Colonias que no se compactan (A)
CC46 B A/N Colonias blancas y gomosas (A)
CC47 B A/N Colonias algodonosas con consistencia gomosa (A)
CC48 B A/N Colonias algodonosas con consistencia gomosa (A)
Color del cultivo: B: Blanca; C: Café; R: Rojo; A: Amarillo. Crecimiento: E: escaso; A: abundante. Producción de esporangios: S: Si; N: No. Aeróbicas: (A). Microaerofílicas: (B)
54
En total se lograron aislar 25 cepas en Nariño y 26 en Cundinamarca, las zonas donde se
obtuvo el mayor número de aislados fueron: en el municipio de Pasto en la finca Hato Viejo (Nariño)
con un total de 12 cepas (CN41, CN42, CN43, CN44, CN45, CN46, CN47, CN48, CN49, CN410,
CN411, CN412) y en la localidad de Usme en la finca de Villa Nataly (Cundinamarca), con 13 cepas
(CC11, CC12, CC13, CC14, CC15, CC16, CC17, CC18, CC19, CC110, CC111, CC112, CC113), esto
se debe posiblemente las buenas condiciones biofísicas de los bosques de alisos establecidos y
utilizados principalmente para conservación de agua (Figura 32 y 33).
Aunque el crecimiento de Frankia es muy lento, lo cual incrementa la probabilidad

microorganismos contaminantes que inhibe el aislamiento masivo de cepas (Lechevalier, 1984;
Lechevalier & Lechevalier, 1989 y 1990), en esta investigación se logró un alto aislamiento de cepas
en los dos Departamentos.
Figura 32. Bosque de A. acuminata en Nariño zona de mayor obtención de aislamientos de Frankia
(Pasto, Cubijan Alto, Finca Los Arrayanes)
55
Figura 33. Bosque de A. acuminata de Cundinamarca zona de mayor obtención de aislamientos de
Frankia (Usme, Finca Villa Nataly)
En el municipio de Facatativa (Cundinamarca) se presentó la menor recuperación de

aislamientos (CC21) (Tabla 12), esto se podría relacionar, con la baja cobertura arbórea de Alisos en la
zona y a la baja composición de materia orgánica que presenta la zona (<10%). Jamann et al. (1992),
consideran que la composición de comunidades de Frankia en el suelo está correlacionadas con los
niveles de materia orgánica, la cual participa como un promotor de la diversidad de poblaciones de
Frankia, por lo tanto, si la materia orgánica es baja generalmente las poblaciones de Frankia
disminuyen. Adicionalmente, Houwers & Akkermans (1989), sostienen que las zonas donde no ha
existido aliso son muy bajas en propágulos de Frankia si se realiza procesos de reforestación, hay una
mayor tendencia a una respuesta positiva a la inoculación.
En cuanto al crecimiento y producción de biomasa celular a los 20 días se observó que los
aislamientos CC11, CC15, CC16, CC19 y CC112 en Cundinamarca y CN14, CN32, CN42 y CN45 de
Nariño presentaron un bajo crecimiento, motivo por el cual, no fueron evaluadas en vivero. La cepa
CC21 aislada de Facatativa, presentó un bajo crecimiento a los 20 días, y fue necesario dejarla por 10
días más hasta obtener la biomasa suficiente para la preparación del inoculante, esto debido a que fue
la única cepa aislada de este municipio. Las demás cepas presentaron un crecimiento abundante a los
20 días lo que permitió elaborar el inóculo. Por lo tanto, es recomendable, evaluar los requerimientos
nutricionales de las cepas de crecimiento lento, con el fin de estimular in vitro su rápido crecimiento.
56
Lechevalier & Lechevalier (1989), reportan que los aislamientos de tipo B, presentan un
crecimiento sumergido en el medio líquido, por lo cual, son aerofílicas y que este tipo de aislamiento
no puede ser mantenido en medio inclinado. Los cultivos de tipo A, son microaerofílicas y se
caracterizan por formar un anillo en la superficie del medio. Adicionalmente, puede ser mantenidos en
medio inclinado. Por lo tanto, se pueden clasificar como aislamientos de tipo B las cepas CN12, CN13,
CN14, CN15, CN44 y CN46 aisladas en Nariño y de Cundinamarca las cepas CC13, CC16 y CC17,
los demás aislados se clasifican como tipo A.
4.3. Características macroscópicas de los cultivos de Frankia
Las cepas de Frankia, comenzaron su crecimiento aproximadamente a la segunda semana de

sembrados los nódulos. Las colonias se caracterizaron por presentar un crecimiento pleomórfico, con
forma de filamentos no aéreos, algunas colonias formaron pigmentos blancos, amarillos y naranjas,
similar a los reportes Lechevalier & Lechevalier (1990) y Benson & Silvester (1993) (Figura 34).
Figura 34. Formación de pigmentos blancos de la cepa de Frankia CN49
La adición de estreptomicina-sulfato y nistatina en los medios causó un crecimiento lento y

amorfo de las colonias de Frankia, caso contratario a los controles sin antibiótico.
57
En los medios sin antibiótico que presentaron contaminaciones, se realizaron pases seriados en
medio líquido BAP libre de nitrógeno, con el fin de aislar las colonias y disminuir la contaminación.
Los demás aislamientos no presentaron contaminación, lo cual está posiblemente asociado, al proceso
de desinfección realizado en los nódulos (Figura 35).
Figura 35. Crecimiento de Frankia sobre los cortes de nódulos en medio BAP libre de antibiótico
Con el fin de obtener biomasa celular de los aislamientos, suficiente para preparar los
inoculantes, se le adicionó al medio líquido BAP extracto de raíz de A. acuminata (100 ml/litro). Al
observar el crecimiento y morfología de los medios líquidos con y sin extracto de raíz, se evidenció
claramente que las cepas con extracto de raíz crecieron más rápidamente, con mayor formación de
oligosacáridos y sin contaminación.
Estos resultados coinciden con los reportes de Quispel & Tak (1978), Quispel et al (1983) y
Wolters (1998), quienes manifiestan, que la adición de extractos de plantas, benefician el crecimiento
in vitro, debido a que poseen sustancias químicas que actúan como componentes activos y nutrientes,
en el caso de las raíces de A. acuminata se presentan fenoles, minerales y compuestos orgánicos, que
en el suelo inhiben el crecimiento selectivamente de patógenos y estimulan bioquímicamente a Frankia
para su crecimiento (Tarrant & Trapper, 1971, Orozco, 1999).
En la tabla 13, se reportan los análisis de nutrientes presentes en el extracto de raíz empleado
para el crecimiento de las cepas de Frankia. Los componentes de minerales que aporta el extracto son
el Mo, Co, K, P y Fe, los cuales no están contemplados en el medio BAP. El S, Ca, Cl, B, Zn, Cu, y C
son proporcionados en mayor porcentaje y solamente el Mg es ausente. Esto demuestra, que algunos de
58
los niveles de nutrientes podrán llegar a ser reemplazados por la adición del extracto y así minimizar
costos y tiempo en la obtención de biomasa celular de Frankia debido a que cuenta con gran cantidad
de nutrientes esenciales para estimular el crecimiento de Frankia de manera libre (Murry et al., 1984).
Tabla 13. Análisis de nutrientes del extracto de raíz de Alnus acuminata

BAP EXTRACTO DE RAÍZ
Nutriente
(ppm) ppm No aporta (ppm) Aporte (ppm)
Proteína Cruda 0.02%
Carbohidratos solubles en agua 35.8%
Mg 5 0 5
S 11 100 - 89
Ca 3 200 - 197
N 71 32 39
Cl 247 3600 - 3353
B 40 650 - 610
Mn 50 5 45 -
Zn 3 650 - 647
Cu 2 50 - 48
Na 1 nd -
Mo 0 83 - 82
Co 0 50 - 50
K 0 100 - 100
P 0 100 - 100
Fe 0 3,5 3,5
* nd: no determinado
Adicionalmente, al extracto de raíz incorporado en el medio, los cultivos fueron llevados a

agitación constante a 150 rpm con una temperatura de 36°C. Esto permitió un crecimiento rápido y
uniforme de las cepas, lo cual confirma los reportes de Lechevalier et al. (1983), quienes mencionan
que el proceso de agitación duplica el crecimiento de Frankia (Figura 36 y 37).
59
Figura 36. Crecimiento de Frankia a los 30 días en medio líquido BAP con extracto de raíz.
Nótese el crecimiento microaerofílico y las características algodonosas de las colonias
Figura 37. Crecimiento a los 30 días de incubación en medio BAP sin extracto de raíz
Las colonias de Frankia en medio líquido, presentaron una consistencia gomosa y de copos de
algodón, con variedad de formas: redondas, grandes, pequeñas y amorfas, con diversidad en los
colores: blanco, café, amarillo y rojo. La mayoría de los aislados presentaron su estructura de
crecimiento sumergido en el medio líquido (microaerofílicas) sin embargo, algunas cepas se
localizaron sobre las paredes de los frascos (CC17 y CN14) o formaban anillos en la parte superior del
medio similar a las observaciones publicadas por Lechevalier & Lechevalier (1989).
Las cepas control de Frankia AacI y AacIII, fueron crecidas en medio líquido y sólido BAP
según las recomendaciones de la Doctora Margarita Carú, la cepa AacI utilizó como fuente de carbono
piruvato y la cepa AacIII glucosa (Figura 38).
60
AacI AacIII
Figura 38. Crecimiento en medio líquido BAP de las cepas AacI y AacIII
4.3.1. Características microscópicas de los aislados de Frankia
Los aislados se observaron al microscopio en láminas, utilizando la coloración en fresco con

azul tripán. Las colonias en medio líquido BAP presentaron formación de hifas septadas (Figura 39),
con un desarrollo de esporangios de manera terminal, lateral e intercalada con formas irregulares:
redondos, ovalados y largados (Figura 41). En medio líquido BAP libre de NH 4+ se estimuló la
producción de vesículas fijadoras de nitrógeno (Figura 40) (Lechevalier, 1984; Tisat & Ensign, 1987;
Schultz & Benson, 1989; Lechevalier & Lechevalier, 1989 y 1990).
Figura 39. Hifas septadas características de Frankia
a b c
Figura 40. Vesículas de Frankia en medio BAP libre de nitrógeno. a y b teñidas con azul de tripan.
Nótese la consistencia gelatinosa en la figura c
61
Figura 41. Producción intra y final de esporangios típicos de Frankia: Flechas amarillas: producción
intra y finales de esporangios típicos de Frankia
Las hifas presentaron tonalidades blancas en todas las cepas aisladas, mezcladas de diferentes
colores. En Cundinamarca, se observó en las cepas CC12, CC111, CC113 y CC42 tonalidades rojas. El
color café se presentó en Cundinamarca en un 50% y en Nariño en un 80%. La coloración amarilla por
su parte sólo se manifestó en algunas colonias de Nariño (CN12, CN41 y CN412).
62
El 25% de los aislados de Cundinamarca y el 4% de Nariño, no formaron esporangios en
medio líquido BAP, las demás cepas se caracterizaron por la formación de esporangios observándose
un color oscuro en el medio líquido. Torrey (1987), reportó que el desarrollo de los esporangios, está
asociado a condiciones de senescencia o maduración de Frankia y que presenta una relación positiva
con el descenso de la fijación de nitrógeno. Por lo tanto, las cepas que no formaron esporangios,
pueden estar relacionadas con el estadio de crecimiento de las colonias.
Los resultados obtenidos en los asilamientos de las cepas de Frankia fueron clasificados como
esporas sp-, las cuales se caracterizan por formar esporangios, ser cultivables en el laboratorio y no
formar esporas en el nódulo (Torrey, 1987; Hahn et al., 1999). Lechevalier & Lechevalier (1989)
mencionan que es muy difícil para aislar cepas de Frankia sp+ y se requieren entre otros nutrientes de
ácidos grasos para su crecimiento. En la figura 42 se muestra una microfotografía donde se puede
observar la secuencia de las cepas de Frankia (CN44) en formación del esporangio, durante 30 días en
medio líquido BAP en agitación a 1500 rpm.
Eji
A B C D
Ef
G F E
Figura 42. Secuencia de formación de esporangios (100x). Cepa CN44. Eji: Esporangio joven
intercalado; Ef: Esporangio final
La metodología de fijación, lavado y deshidratación utilizada, permitió procesar la muestra de

Frankia para observar sus estructuras especializadas. En los cortes obtenidos se pudo observar los
63
esporangios y vesículas, estructuras de mucha importancia para el reconocimiento y comparación de
las cepas con otras reportadas en la literatura (Figura 44).
A c
B D
Figura 43. Estructuras especializadas del aislamiento de Frankia medio líquido BAP libre de
nitrógeno. Microscopio de lux. A. Formación de esporangio (40x). B. Esporangio maduro con células de
diferentes edades de maduración (40x). C. Hifas septadas (20x). D. Formación de vesículas (40x)
Las cepas crecidas previamente, fueron crio-conservadas en 500 ul del medio líquido fresco de
BAP más 150 ul de glicerol al 10% y se homogenizó en el vortex. También fueron conservadas en
medio sólido BAP y llevadas a refrigeración, según las recomendaciones de Carú M. (2005) y los
reportes de Lechevalier & Lechevalier (1989) teniendo en cuenta la mayor formación de esporas que
permite una rápida activación de las cepas (Figura 44).
Figura 44. Conservación de las cepas Frankia en medio BAP sólido y líquido BAP con glicerol
64
4.3.2. Evaluación de la producción de biomasa celular de Frankia en diferentes fuentes
nutricionales y pH
En la tabla 14, se muestra el crecimiento de tres cepas de Frankia y el promedio de los datos
obtenidos durante ocho días de incubación, en 14 fuentes nutricionales y tres pH. Es importante aclarar
que las cepas mostraron capacidad de crecimiento en las diferentes fuentes, aunque, como era de
esperarse, presentaron mayor afinidad por algunas fuentes de carbono y condiciones de pH.
Tabla 14. Crecimiento de las cepas en diferentes fuentes nutricionales y pH

FUENTES CEPA CC13 CEPA CN44 CEPA AacIII Promedio todas
NUTRICIONALES (g) (g) (g) las cepas (g)
SIGNIFICANCIA ** ** ** **
Ácido cítrico 9,53b 4,38 g 4,36 g 6,09 de
Almidón 5,44 ef 7,24d 6,23 cd 6,3 d
Ácido pirúvico 16,32 a 15,86 a 15,89 a 16,03 a
Celulosa 6,0 ed 6,23 e 5,96 cdef 6,06 de
Extracto de Raíz 5,63 ef 7,07 d 7,64 b 6,78 c
Fructosa 6,23d 6,19 e 6,02 cde 6,15 de
Galactosa 7,52 c 8,21 c 5,97 cdef 7,24 b
Glucosa 5,61 ef 5,50 ef 5,52 ef 5,54 fg
Melaza 5,73 edf 5,73 ef 5,88 cdef 5,78 ef
Manitol 4,71 g 9,38 b 6,34 c 6,81 c
Quinoa 5,87 def 5,95 ef 5,84 cdef 5,89 ef
Sacarosa 5,87def 5,9 ef 5,65 def 5,81 ef
Vinaza 6,01 ed 5,77 ef 5,84 cdef 5,87 ef
Xilosa 5,42 f 5,32 f 5,41 f 5,38 g
pH g/cepa g/cepa g/cepa g/cepa
Significancia ** ** ** **
4,5 6,97 a 6,98 b 6,60 ab 6.85 b
6,5 9,69 a 7,33 a 6,74 a 7.01 a
8 6,62 b 6,85 b 6,49 b 6.65 c
El análisis de varianza indica, que existieron diferencias altamente significativas (p<0.001)

entre las fuentes nutricionales, los pH y las cepas. De igual manera, se presentaron diferencias
altamente significativas en las interacciones, entre las fuentes nutricionales con relación al pH y a las
cepas y entre el pH y las cepas.
65
En la respuesta obtenida en la evaluación de crecimiento en las fuentes nutricionales, las cepas
fueron estimuladas y produjeron mayor biomasa celular en el medio de cultivo con ácido pirúvico,
presentando valores promedios altamente significativos con respecto las demás fuentes (16.32 g cepa
CC13, 15.86 g cepa CN44, 15.89 g cepa AacIII y 16.03 g promedio de cepas), con un incremento en la
producción de biomasa celular con respecto al medio con glucosa de 191% CC13, 183% CN44 y 183
AacIII.
Teniendo en cuenta la clasificación propuesta por Lechevalier et al. (1983) las cepas CN44 y
CC13 pueden ser clasificados dentro del Grupo B, debido a la doble capacidad de utilizar ácidos
orgánicos y fuentes de carbono. De igual manera, los resultados obtenidos en esta evaluación
confirman los reportes de Benson & Silvestre (1993), quienes mencionan que las cepas de Frankia alni
(especie asociada con Alnus) fisiológicamente pertenecen al grupo B.
Así mismo, los resultados obtenidos en esta evaluación de utilización de nutrientes, son
similares las evaluaciones publicadas por Akkerman et al. (1983) quienes mencionan que muchos
aislamientos de Frankia utilizan como energía el piruvato, el acetato y el propionato. Sin embargo, no
son similares a los resultados obtenidos por Ashraf & Saijjard (1987) quienes presentaron los mejores
niveles en los medios con solución Tween-80.
Los menores crecimientos se presentaron en el ácido cítrico, la xilosa y adicionalmente para el

aislado CC13 el manitol. Es importante resaltar que según Laurent el al. (1987), la galactosa y la xilosa
son dos azúcares de gran importancia en la estructura celular de Frankia, sin embargo, las cepas no
mostraron mayor afinidad por estas fuentes nutricionales. Lechevalier & Lechevalier (1989),
mencionan que Frankia sp hospedera de A. rugosa presentan una nula capacidad de utilizar xilosa
como fuentes de carbohidratos.
Con relación al parámetro de crecimiento en diferentes pH, Burggraaf & Shipton (1982),
reportan que Frankia presenta un rango de crecimiento de pH entre 5.5 y 8, ratas de tolerancia altas
para los organismos del suelo. Analizando, la capacidad de tolerancia al pH de los aislados, se presentó
diferencias altamente significativas (P<0.001). Las cepas mostraron mayor crecimiento en el pH neutro
(9.69g/CC13; 733g/CN44; 6.74 g/AacIII y 7.01 g promedio entre cepas) con una tolerancia al nivel
66
ácido de las tres cepas (CC13 aislada de Cundinamarca, CN44 de Nariño y la control AacIII cepa
control con crecimientos de 6.97, 6.98 y 6.6 g/cepa respectivamente. En el nivel básico (pH 8) presentó
los menores valores promedios en producción de biomasa celular en todas las cepas.
Estos resultados son similares a los reportes de Murry et al. (1984), quienes, encontraron que él
óptimo pH para la actividad de la nitrogenasa medida a través de la técnica de reducción de acetileno
(ARA) y la cinética de crecimiento de Frankia fue cercana a un pH de 6.7 y que la mejor actividad de
la nitrogenasa se presentó a pH de 8. De igual, manera, son similares a los reportados en aislamientos
de Frankia de A. gutinosa, reportados por Burggraaf & Shipton (1982) y en aislados de Frankia en
Comptonia peregrina reportados por Tjepkema et al. (1981).
El análisis de varianza del crecimiento entre cepas mostró diferencias altamente significativas
entre las cepas (Figura 45). El aislamiento procedente de Cundinamarca CC13, mostró la mayor tasa de
crecimiento (7.76 g/cepa) con respecto a las demás, la cepa control AacIII obtuvo los menores valores
promedios (6.61 cg/cepa). Aunque las cepas nativas fueron seleccionadas al azar, se observó que el
crecimiento fue mayor que la cepa control, entre un 8.75 y 43.76%, indicando el potencial de las cepas
nativas.
Figura 45. Producción de biomasa celular de tres cepas Frankia en condiciones controladas
67
4.4. Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de los suelos
Los resultados de los análisis fisicoquímicos y microbiológicos de los suelos utilizados en esta
investigación se indican en las tablas 15 y 16.
Tabla 15. Análisis fisicoquímicos de los suelos utilizados en la evaluación de las cepas de Frankia en
fase de vivero
Suelos de Nariño Suelos de Cundinamarca
Análisis
E.E. de Obonuco CORPOICA Finca San Jorge (Soacha)
pH 5.4 5.5
Textura Limosa Arenosa
Materia Orgánica % 27.8 7
P mg/kg 28 59
S mg/kg 7 3
Al + H cmol/kg 2.1 0.4
SAT Al (%) 15.5 0
Al cmol/kg 1.2
Ca cmol/kg 3.5 5.9
Mg cmol/kg 0.7 1.4
K cmol/kg 0.9 1.29
Na cmol/kg 0.5 0.7
CIC cmol/kg 7.7 9.7
C.E. (dS/m) 0.5 0.8
Fe mg/kg 146 237
Cu mg/kg 3.1 4.4
Mn mg/kg 15 9
Zn mg/kg 9 8
B mg/kg 0.2 0.1
Tabla 16. Análisis microbiológico de los suelos empleados en este estudio

Nariño Cundinamarca
Tipo de análisis
n=3 n=3
Bacterias 10x106UFC/g/suelo seco 16 26
Hongos UFC/g/suelo seco 1 25
Actinomicetos UFC/g/suelo seco 9 20
Solubilizadores de fosfato UFC/g/suelo seco 46 16.5
Fijadores de nitrógeno UFC/g/suelo seco 13.5 66
Número de esporas/g/suelo seco 5 4
68
Químicamente los suelos de Nariño se caracterizaron por presentar textura media de naturaleza
limosa, es decir, con un diámetro de poros de 0.05-0.002 mm y los de Cundinamarca presentaron una
textura arenosa con un diámetro >0.2 mm. Los niveles de pH fueron 5.4 y 5.5 para Nariño y
Cundinamarca respectivamente, clasificados como fuertemente ácidos.
La materia orgánica (MO) es fuente de nutrientes para las plantas, particularmente de nitrógeno,
fósforo y azufre. En Colombia los contenidos de MO aumentan con la altura (ICA, 1966). En los
resultados químicos analizados, los porcentajes del suelo proveniente de Nariño fueron altos (27.8%) y
los de Cundinamarca medios (7%). Existe una relación entre los contenidos altos de MO y las
cantidades de boro aprovechable (ICA, 1966), esta relación se observa en los resultados de boro
presentados en suelos, en donde Nariño obtuvo niveles medios de boro (0.20 mg/kg) y los de
Cundinamarca bajos (0.1 mg/kg).
Según el ICA (1966), la capacidad de intercambio cationico representa el número total de

posiciones intercambiables o cargas negativas de la fracción coloidal expresadas en mili equivalente
(m.e) por 100 mg de suelo. En Colombia el C.I.C. de los suelos es muy variable, dentro de una misma
región, encontrándose los mayores niveles en los climas fríos. El pH presenta una tendencia directa con
los contenidos de C.I.C., teniendo en cuenta lo anterior, los niveles de C.I.C. presente en ambos suelos
son bajos en niveles de saturación. La deficiencia de Ca depende principalmente de su porcentaje de
saturación y del pH, debido a que el pH en los suelos experimentales es bajo, por lo tanto se considera
que la disponibilidad de éste elemento es menor (3.5 Nariño y 5.9 Cundinamarca)
Debido a que los dos suelos presentan niveles de sodio menores a 15 (0.5 y 0.7 para Nariño y
Cundinamarca) aunado al pH ácido, se clasifican como suelos no salinos.
En el suelo de Cundinamarca los elementos que se encontraron en niveles altos fueron, el hierro
(237 mg/kg), el potasio (1.29 cmol/kg) cobre (4.4 mg/kg) y zinc (8 mg/kg), en Nariño fueron potasio
(0.9 cmol/kg), hierro (146 mg/kg), manganeso (15 mg/kg) y zinc (9 mg/kg). El magnesio (15 cmol/kg)
en Cundinamarca y boro (0.2 mg/kg) en Nariño se presentaron en niveles bajos.
Los niveles de nutrientes principalmente B, Cu, Fe y Zn en los dos suelos pueden favorecer el
proceso de nodulación y fijación de nitrógeno, ya que el boro está asociado con la división celular y el
desarrollo de la pared celular durante la formación de los nódulos y su deficiencia de cobre reduce la
69
eficiencia en la fijación del nitrógeno, el Fe es constituyente de la nitrogenasa, proteína y la
hemoglobina y su deficiencia causa reducción en la iniciación de la nodulación, limita el desarrollo del
nódulo y la tasa de fijación de N. Con relación al Zn se ha demostrado que interviene en la síntesis de
la hemoglobina y la deficiencia reduce el número y tamaño de los nódulos (Wolters, 1998; Sylvia et
al., 2005).
Romero (1999), menciona que la tendencia de los suelos donde se desarrollan los bosques de
alisos son franco-arenosos, con un alto contenido de materia orgánica, niveles de nitrógeno, hierro y
manganeso son de medio a altos, lo cual puede ser de gran importancia en el desarrollo de A.
acuminata.
Se observó una dinámica microbial de los sustratos experimentales, asociado posiblemente a las
condiciones fisicoquímicas del suelo y principalmente a los niveles medios y altos de la materia
orgánica.
4.5. Evaluación de las cepas en Alnus acuminata en fase de vivero
Las respuestas en las variables dasométricas: número de hojas (N°/planta), diámetro basal (mm),
altura de la planta (cm), materia seca total (g/planta), altura de planta (cm), peso seco foliar (g/planta),
longitud radicular (cm) y peso seco radicular (cm) y microbiológicos: Número de nódulos, de plantas
de A. acuminata de inoculadas con cepas nativas de Frankia en fase de vivero de Nariño se indican en
las tablas 17 y 18. Los resultados dasométricos por efecto de la inoculación con cepas de Frankia de
Cundinamarca se indican en las tablas 19 y 20.
En todos los muestreos se pudo observar que las plantas inoculadas, presentaron nódulos
radiculares, por lo cual se puede afirmar, que todas las cepas fueron infectivas. Adicionalmente, las
cepas pueden clasificarse como típicas debido a su capacidad de asociarse con el hospedero original del
cual fueron aisladas (Benson & Silvester, 1993)
70
Tabla 17. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Nariño
Tratamiento Número de hojas (N°) Diámetro basal (mm) Altura (cm) Materia seca total (g)
Días 45 90 125 45 90 125 45 90 125 45 90 125
Pr >F ** ** ** ** ** ** ** ** * ** ** **
CN11 T11 4.33 abcd 5.66 efgh 7.50 abc 0.15 ab 0.25 abc 0.34 abc 11.08 ab 13.25 bc 19.33 bcd 0.36 ab 0.47 c 1.34 abc
CN12 T2 3.66 cd 6.50 cdefgh 7.66 abc 0.17 ab 0.24 abc 0.31 abc 9.16 ab 13.83 abc 17.08 cde 0.33 ab 0.63 abc 1.52 abc
CN13 T3 4.00 bcd 6.66 cdefgh 8.33 abc 0.15 ab 0.33 abc 0.35 abc 9.83 ab 13.00 bc 23 abc 0.42 ab 0.65 abc 1.63 abc
CN21 T4 4.50 abcd 7.33 cdefgh 7.83 abc 0.18 ab 0.27 abc 0.38 abc 10.90 ab 16.08 abc 21.80 abcd 0.32 ab 0.74 abc 0.95 bc
CN22 T5 5.66 ab 6.33 defgh 8.16 abc 0.20 ab 0.40 ab 0.48 a 11.73 ab 14.75 abc 19.13 bcd 0.46 ab 0.70 abc 1.22 bc
CN23 T6 3.66 cd 7.83 bcde 8.0 abc 0.18 ab 0.30 abc 0.31 abc 10.05 ab 12.75 bc 22.65 abcd 0.23 c 0.53 bc 1.48 abc
CN32 T7 4.66 abcd 8.0 bcde 9.16 ab 0.19 ab 0.29 abc 0.35 abc 11.50 ab 16.15 abc 19.43 bcd 0.48 ab 0.53 bc 0.81 c
CN33 T8 5.50 abc 5.83 efgh 8.5 abc 0.19 ab 0.33 abc 0.35 abc 11.71 ab 16.05 abc 20.50 abcd 0.46 ab 0.64 abc 1.64 abc
CN34 T9 5.0 abcd 9.50 b 9.16 ab 0.20 ab 0.31 abc 0.40 abc 11.58 ab 18.66 ab 24.66 ab 0.35 ab 0.88 abc 1.90 abc
CN41 T10 4.83 abcd 6.83 cdefgh 7.16 abc 0.18 ab 0.27 abc 0.23 c 11.51 ab 12.83 bc 18.25 bcde 0.45 ab 0.30 c 1.00 bc
CN43 T11 4.50 abcd 6.0 efgh 7.33 abc 0.17 ab 0.21 abc 0.40 abc 10.71 ab 11.16 c 19.66 bcd 0.31 ab 0.47 c 1.20 bc
CN44 T12 4.16 abcd 5.16 gh 8.16 abc 0.18 ab 0.20 bc 0.28 bc 10.91 ab 11.75 bc 20.51 abcd 0.19 b 0.29 c 1.22 bc
CN46 T13 5.83 ab 8.83 bc 7.50 abc 0.20 ab 0.33 abc 0.43 ab 12.75 ab 16.26 abc 21.45 abcd 0.51 ab 0.76 abc 1.54 abc
CN47 T14 5.83 ab 12.16 a 9.66 a 0.17 ab 0.25 abc 0.31 abc 10.58 ab 13.41 bc 21.63 abcd 0.28 ab 0.49 bc 1.37 abc
CN48 T15 6.0 a 7.33 cdefgh 9.0 ab 0.22 a 0.38 abc 0.46 ab 13.58 a 17.75 abc 20.00 abcd 0.57 ab 1.23 ab 1.68 abc
CN49 T16 5.83 ab 8.50 bcd 9.16 ab 0.22 a 0.41 a 0.50 a 13.25 a 20.58 a 26.33 a 0.67 a 1.37 a 2.41 a
CN410 T17 5.0 abcd 6.5 cdefgh 7.33 abc 0.18 ab 0.33 abc 0.40 abc 11.33 ab 15.66 abc 20.98 abcd 0.28 b 0.77 abc 1.19 bc
CN411 T18 5.16 abc 6.5 cdefgh 9.0 ab 0.20 ab 0.28 abc 0.38 abc 11.08 ab 14.08 abc 20.03 abcd 0.33 ab 0.66 abc 2.11 ab
CN412 T19 5.33 abc 7.5 cdefgh 8.5 abc 0.19 ab 0.28 abc 0.37 abc 11.83 ab 14.16 abc 17.16 cde 0.47 ab 0.65 abc 1.19 bc
CN51 T20 5.33 abc 7.66 bcdef 7.16 abc 0.20 ab 0.25 abc 0.42 abc 11.10 ab 13.08 bc 16.41 de 0.39 ab 0.60 bc 0.99 bc
CN52 T21 4.66 abcd 5.33 fgh 7.0 bc 0.20 ab 0.24 abc 0.31 abc 12.75 ab 13.33 bc 17.41 cde 0.40 ab 0.53 bc 1.11 bc
CN53 T22 5.0 abcd 6.0 efgh 7.50 abc 0.18 ab 0.28 abc 0.37 abc 12.00 ab 14.33 abc 21.11 abcd 0.44 ab 0.72 abc 1.51 abc
AacIII T23 4.66 abcd 6.66 cdefgh 9.0 ab 0.20 ab 0.33 abc 0.39 abc 12.16 ab 16.66 abc 20.36 abcd 0.43 ab 0.81 abc 1.24 bc
AacI T24 5.33abc 7.0 cdefgh 7.83 abc 0.20 ab 0.30 abc 0.40 abc 12.75 ab 16.00 abc 18.50 bcde 0.47 ab 0.82 abc 1.20 bc
Testigo T25 3.16 d 4.83 h 6.16 c 0.13 b 0.19 c 0.30 abc 7.68 b 11.00 c 12.33 e 0.26 b 0.42 c 0.75 c
** Diferencias altamente significativas (P< 0.01). * Diferencias significativas (P<0.05).ns no existen diferencias Promedios en una misma columna con letras iguales no difieren significativamente según la prueba de Tukey (P> 0.05)
71
Tabla 18. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Nariño
Tratamiento Peso seco foliar (g) Longitud raíz (cm) Peso seco radicular (g) Nódulos (N°)
Días 45 90 125 45 90 125 45 90 125 45 90 125
Pr >F ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * **
1
CN11 T1 0.19 ab 0.27 bc 0.79 ab 7.55 ab 8.85 abc 21.61 ab 0.16 ab 0.20 bc 0.55 cd 11.83 abc 13.83 d 20.83 cdefg
CN12 T2 0.13 ab 0.29 bc 0.70 ab 6.91 ab 10.50 abc 21.08 ab 0.20 ab 0.34 abc 0.81 abcd 14 abc 16.0 bcd 21.5 cdef
CN13 T3 0.18 ab 0.31 abc 0.79 ab 6.58 ab 10.58 abc 16.50 ab 0.24 ab 0.34 abc 0.84 abcd 11.16 abc 14.66 cd 20.83 cdefg
CN21 T4 0.17 ab 0.36 abc 0.52 b 6.68 ab 9.86 abc 20.31 ab 0.14 ab 0.37 abc 0.42 cd 17 ab 19.0 bc 20.83 cdefg
CN22 T5 0.22 ab 0.35 abc 0.53 b 7.96 ab 15.10 ab 19.83 ab 0.24 ab 0.34 abc 0.69 abcd 13.5 abc 13.33 d 23.0 c
CN23 T6 0.15 ab 0.27 bc 0.61 ab 7.05 ab 10.00 abc 20.33 ab 0.12 b 0.25 abc 0.87 abcd 8.50 bc 13.66 d 18.83 cdefgh
CN32 T7 0.22 ab 0.27 bc 0.54 b 8.65 a 12.93 abc 18.63 ab 0.26ab 0.26 abc 0.27 d 7.0 c 13.83 d 15.66 gh
CN33 T8 0.18 ab 0.28 bc 0.73 ab 7.83 ab 14.60 ab 19.16 ab 0.28 ab 0.35 abc 0.91 abcd 8.16 bc 15.0 cd 21.16 cdefg
CN34 T9 0.17 ab 0.44 abc 0.91 ab 6.16 ab 11.33 abc 19.16 ab 0.18 ab 0.44 abc 0.98 abc 11.83 abc 15.5 cd 22.83 cd
CN41 T10 0.22 ab 0.24 c 0.48 b 7.88 ab 9.50 abc 16.50 ab 0.22 ab 0.26 abc 0.51 cd 11.66 abc 15.16 cd 16.0 fgh
CN43 T11 0.16 ab 0.26 bc 0.56 b 6.83 ab 7.83 abc 18.83 ab 0.15 ab 0.21 bc 0.64 abcd 11.16 abc 12.66 d 13.83 h
CN44 T12 0.09 b 0.10 c 0.70 ab 4.58 b 5.16 c 17.73 ab 0.10 b 0.13 c 0.52 cd 7.0 c 12.33 d 16.66 efgh
CN46 T13 0.13 ab 0.32 abc 0.67 ab 7.58 ab 10.50 abc 18.63 ab 0.29 ab 0.43 abc 0.87 abcd 13.16 abc 15.0 cd 19.83 cdefg
CN47 T14 0.17 ab 0.20 c 0.65 ab 5.41 ab 10.00 abc 20.30 ab 0.15 ab 0.28 abc 0.71 abcd 9.66 abc 13.66 d 19.33 cdefgh
CN48 T15 0.25 a 0.62 ab 0.84 ab 7.83 ab 12.33 abc 16.55 ab 0.32 ab 0.61 ab 0.84 abcd 18.66 a 21.0 b 21.83 cde
CN49 T16 0.27 a 0.67 a 1.17 a 7.63 ab 15.58 a 21.95 a 0.40 a 0.69 a 1.23 ab 10.83 abc 31.83 a 37.83 a
CN410 T17 0.16 ab 0.35 abc 0.58 ab 6.75 ab 10.00 abc 17.78 ab 0.11 b 0.42 abc 0.61 bcd 10.00 abc 16.0 bcd 17.33 defgh
CN411 T18 0.14 ab 0.30 bc 0.83 ab 6.80 ab 10.00 abc 19.33 ab 0.18 ab 0.36 abc 1.28 a 11.66 abc 13.83 d 29.50 b
CN412 T19 0.17 ab 0.28 bc 0.58 ab 6.25 ab 12.16 abc 20.00 ab 0.29 ab 0.37 abc 0.60 bcd 11.00 abc 14.83 cd 16.50 efgh
CN51 T20 0.18 ab 0.27 bc 0.50 b 6.00 ab 11.66 abc 17.66 ab 0.21 ab 0.32 abc 0.48 cd 10.16 abc 12.66 d 18.66 cdefgh
CN52 T21 0.20 ab 0.28 bc 0.52 b 7.25 ab 10.35 abc 17.25 ab 0.18 ab 0.25 abc 0.59 cd 9.33 abc 12.0 d 16.16 fgh
CN53 T22 0.18 ab 0.33 abc 0.76 ab 7.08 ab 12.83 abc 20.75 ab 0.25 ab 0.39 abc 0.75 abcd 9.33 abc 12.83 d 19.00 cdefgh
AacIII T23 0.20 ab 0.32 abc 0.68 ab 7.83 ab 11.16 abc 20.58 ab 0.23 ab 0.48 abc 0.56 cd 7.5 c 13.5 d 20.00 cdefg
AacI T24 0.24 ab 0.35 abc 0.58 ab 6.80 ab 10.25 abc 20.25 ab 0.23 ab 0.47 abc 0.62 bcd 8.83 bc 15.66 cd 16.50 efgh
Testigo T25 0.18 b 0.21 c 0.39 b 5.16 ab 5.83 bc 14.41 b 0.09 b 0.20 bc 0.35 cd 6.0 c 11.33 d 14.16 h
72
Tabla 19. Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Cundinamarca
TRATAMIENTOS Número de hojas (N°) Diámetro basal (mm) Altura (cm) Materia seca total (g)
Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días
Pr >F ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **
CC12 T1 5.3 abcd 5.66 f 7.5 efgh 0.25 ab 0.28 abc 0.32 bcd 12.81 a 15.65 abcd 17.95 abcde 0.69 bcd 0.99 fghi 1.77 gh
CC13 T2 4.0 cdef 7 abcdef 7.66 efgh 0.23 abce 0.27 abcd 0.35 abc 8.83 cdefg 12.36 de 14.26 def 0.68 bcd 1.05 fghi 2.3 efgh
CC14 T3 3.7 efg 7 abcdef 7.83 efgh 0.25 ab 0.3 ab 0.35 abc 10.61 abcdef 14 bcd 16.78 abcdef 0.61 bcde 1.1 efghi 1.58 h
CC17 T4 6.5 a 8.16 abcd 10.16 bcd 0.28 a 0.29 abc 0.3 bcd 10.09 abcdefg 14.85 abcd 21 a 0.95 a 1.8 ab 5.61 a
CC18 T5 4.2 cdef 7 abcdef 9.16 cdef 0.16 abcd 0.29 abc 0.31 bcd 9.63 abcdefg 15.02 abcd 17.46 abcdef 0.51 cdef 1.56 abcd 2.79 ef
CC110 T6 3.7 efg 7.16 abcdef 8.33 cdef 0.23 abc 0.33 a 0.35 abc 8.10 efg 14.46 abcd 13.61 ef 0.31 fg 0.79 ij 3.78 cd
CC111 T7 4.5 bcdef 5.83 f 6.16 h 0.28 a 0.31 ab 0.35 abc 10.72 abcde 13.21 cd 17.65 abcdef 0.52 cdef 1 fghi 2.14 fgh
CC113 T8 3.8 def 6.83 bcdef 7.5 efgh 0.23 abcd 0.3 ab 0.35 abc 11.63 abc 14.71 abcd 18.9 abc 0.49 cdef 0.83 hij 2.19 efgh
CC21 T9 5.5 bca 7.16 abcdef 9 cdef 0.23 abc 0.33 a 0.33 ab 12.30 ab 18 a 20.75 a 0.68 bcd 1.26 cdefg 4.23 bc
CC31 T10 5.3 abcde 8.33 abc 11 bc 0.18 bcde 0.24 bcd 0.37 ab 12.91 a 14.85 abcd 17.01 abcdef 0.63 bcde 1.44 bcde 2.98 de
CC32 T11 5.0 abcdef 8.5 ab 10.66 bc 0.23 abcd 0.3 ab 0.39 ab 11.23 abcde 15.24 abcd 19.84 ab 0.67 bcd 1.18 defghi 5.55 a
CC33 T12 3.8 def 6.33 def 11.5 b 0.18 bcde 0.25 abcd 0.27 cd 8.58 cdefg 14.1 bcd 19.17 ab 0.39 efg 1 fghi 2.88 ef
CC34 T13 3.8 def 6.5 cdef 7.33 efgh 0.16 de 0.3 ab 0.3 bcd 6.90 g 15.91 abcd 16.58 abcdef 0.77 ab 1.59 abc 2.79 ef
CC41 T14 5.8 ab 8.16 abcd 9 cdef 0.21 abce 0.3 ab 0.35 abc 8.75 cdefg 14.28 bcd 16.76 abcdef 0.53 bcdef 0.92 ghi 2.12 fgh
CC42 T15 3.8 def 6.5 cdef 8.5 cdef 0.19 bcd 0.25 abcd 0.34 bc 8.08 efg 13.98 bcd 16 bcdef 0.36 fg 0.94 ghi 1.83 gh
CC43 T16 5.0 efg 6.5 cdef 8.5 cdef 0.23 abc 0.3 ab 0.34 bc 8.18 defg 16.61 abcd 20.4 ab 0.54 bcdef 1.04 fghi 2.84 ef
CC44 T17 6.2 a 6.16 ef 7.5 efgh 0.25 ab 0.26 abcd 0.32 bcd 12.35 ab 17.18 ab 14.55 cdef 0.73 abc 1.16 efghi 2.17 efgh
CC45 T18 5.5 abc 6 ef 6.83 gh 0.20 bcd 0.31 ab 0.35 abc 11.75 abc 16.83 abc 13.77 def 0.61 bcde 1.35 cdef 2.78 ef
CC46 T19 5.2 abcde 8.33 abc 12.16 ab 0.19 bcd 0.24 bcd 0.44 a 9.37 bcdefg 13.56 bcd 19.83 ab 0.73 abc 1.83 ab 4.18 bc
CC47 T20 3.5 fg 6.16 ef 7.83 efgh 0.19 cbd 0.3 ab 0.35 abc 11.45 abcd 14.98 abcd 17.48 abcdef 0.66 bcd 1.2 cdefgh 2.45 efg
CC48 T21 5.0 abcdef 6.83 bcdef 7.16 fgh 0.18 bcde 0.2 cd 0.27 cd 8.67 cdefg 15.55 abcd 16.95 abcdef 0.48 def 0.93 ghi 1.8 gh
AacIII T22 5.0 abcdef 7.83 abcde 9.33 cde 0.17 cde 0.24 bcd 0.31 bcd 8.70 cdefg 15.1 abcd 19.56 ab 0.65 bcd 1.86 a 4.61 b
AacI T23 4.5 bcdef 8.83 a 14.16 a 0.22 abcd 0.24 bcd 0.35 abc 7.42 fg 14.32 bcd 18.2 abcd 0.53 bcdef 1.1 efghi 2.28 efgh
Testigo T24 2.2 g 5.5 f 7.83 efgh 0.11 e 0.19 d 0.23 d 6.81 g 9.06 e 13.22 f 0.17 g 0.48 j 1.55 h
73
Tabla 20 Respuesta dasométrica de A. acuminata a la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Cundinamarca
TRATAMIENTOS Peso Seco foliar (g) Longitud radicular (cm) Peso seco radicular (g) Nódulos (N°)
Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días 45 Días 90 Días 125 Días
Pr >F ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **
CC12 T1 0,32 a 0,52 fg 0,63 p 7,19 fgh 8,73 hij 11,55 g 0,36bcdef 0,46 defg 1,13 ghij 18,33 abc 21,16 cde 31,66 def
CC13 T2 0,34 a 0,55 efg 0,7 nop 9,31 bcdef 11,9 bcdefgh 17,45 abcdef 0,34 bcdef 0,49 defg 1,6 efgh 14 def 24,66 bcd 42,33 bc
CC14 T3 0,31 ab 0,68 cdef 0,93 ijkl 8,93 bcdef 13,97 abcd 18,74 abcd 0,3 cdefg 0,41 defgh 0,64 j 17,33 bcd 22,5 bcde 41,5 bc
CC17 T4 0,33 a 0,91 abc 1,36 cd 10 abc 17,91 a 20,11 ab 0,61 a 0,89 a 4,25 a 22 a 33,66 a 44,33 ab
CC18 T5 0,27 abc 0,8 bcde 1,29 cde 5,35 ih 12,52 bcdefg 15,23 defg 0,23 efg 0,76 ab 1,5 efghi 20,16 ab 26,16 b 28,5 efg
CC110 T6 0,11 efg 0,3 9 gh 1,68 b 6,03 fgh 9,54 fghij 15,06 defg 0,2 efg 0,39 defgh 2,1 cdef 9,5 g 11,33 i 34,66 cde
CC111 T7 0,2 bcde 0,51 fgh 1,08 fghi 7,59 defgh 8,35 ij 20,78 a 0,31 cdefg 0,49 defg 1,05 hij 17,16 bcd 20 de f 52,66 a
CC113 T8 0,1 4 defg 0,55 efg 0,79 lmnop 7,16 fgh 10,63 efghi 14,35 efg 0,35 bcdef 0,28 gh 1,4 fghij 11,16 fg 12,66 hi 21,5 gh
CC21 T9 0,17 cdef 0,85 abcd 1,14 efgh 7,24 fgh 14,57 ab 17,63 abcde 0,5 abc 0,41 defgh 3,09 b 15,83cd 33,33 a 40,16bc
CC31 T10 0,32 a 0,89 abc 1,47 c 10,7 ab 11,54 bcdefghi 16,39 bcdef 0,3 cdefg 0,54 cde 1,5 efghi 17,33 bcd 26,66 b 28,66 efg
CC32 T11 0,28 abc 0,64 cdefg 1,2 defg 7,33 fgh 14,35 abc 18,36 abcd 0,39 bcdef 0,54 cde 4,35 a 10,33 fg 15,16 ghi 42,66 bc
CC33 T12 0,08 fg 0,49 fgh 0,69 op 5,71 fgh 10,7 defghi 16,33 bcdef 0,3 cdefg 0,51 def 2,19 cde 5,33 hi 20,33cdef 28,33 efg
CC34 T13 0,24 abcd 0,7 cdef 1,24 def 9,86 abcde 13,34 bcde 15,43 def 0,53 ab 0,88 a 1,55 efghi 10,83 fg 21,33cde 37,33 bcd
CC41 T14 0,27 abc 0,58 defg 1,01 ghij 9,18 bcdef 11,93 bcdefgh 13,68 fg 0,25 efg 0,33 efgh 1,1 hij 5,16 hi 12,66hi 22,66 gh
CC42 T15 0,07 fg 0,47 gh 0,63 p 7,55 efgh 8,25 ij 16,38 bcdef 0,28 defg 0,47 defg 1,2 ghij 20,83 ab 23,83 bcd 25,5 fgh
CC43 T16 0,11 efg 0,53 efg 0,73 mnop 7,16 fgh 11,36 bcdefghi 19,6 abc 0,43 abcde 0,5 def 2,11 cdef 19,16 abc 23,66 bcd 31,66 def
CC44 T17 0,34 a 0,65 cdefg 0,81 klmnop 12 a 12,61 bcdef 17,05 abcdef 0,39 bcdef 0,51 def 1,36 fghij 21,16 abc 34,66a 45 ab
CC45 T18 0,14 defg 0,57 efg 0,89 ijklmn 9,4 bcdef 14,13 abc 17,76 abcde 0,47 abcd 0,77 ab 1,88 defg 16 cd 18,5efg 23,5 fgh
CC46 T19 0,24 abcd 1,1 a 1,74 b 7,57 efgh 9,25 gfhij 16,76 bcdef 0,49 abc 0,73 abc 2,43 bcd 17,16 bcd 24,83bc 44,66ab
CC47 T20 0,27 abc 0,63 cdefg 0,91 ijklm 9,93 abcd 11,06 cdefghi 18,26 abcd 0,38 bcdef 0,56 bcd 1,54 efghi 8 ghi 14,66ghi 18,16 hi
CC48 T21 0,29 ab 0,63 cdefg 1 hijk 7,5 efgh 9,76 fghi 15,97 cdef 0,18 fg 0,29 fgh 0,79 ij 11,5efg 15,16ghi 21,83 gh
AacIII T22 0,29 abc 1,04 ab 1,96 a 7,88 defg 10,3 efghi 16,6 bcdef 0,35 bcdef 0,82 a 2,66 bc 15,33 cde 15,83fghi 21,16 gh
AacI T23 0,27 abc 0,6 defg 0,87 jklmno 8 bcdef 10,5 efghi 15,88 cdef 0,26 efg 0,49 defg 1,41 fghi 8,5 gh 16,33fgh 23,33 fgh
Testigo T24 0,06 g 0,24 h 0,38 q 4, 45 i 6,33 j 16,78 bcdef 0,11 g 0,24 h 1,17 ghij 4,33 i 4,46j 9,83 i
74
4.5.1. Número de hojas (No/planta)
La variable número de hojas es importante, debido a que el efecto de la inoculación sobre el

aumento en su número, afecta directamente la producción de una mayor cantidad de clorofila, y como
resultado se obtiene una mayor fijación de carbono del aire por fotosíntesis (Romero, 1999).
4.5.1.1. Nariño
En esta investigación se presentaron diferencias significativas (P<0.01) entre tratamientos,

durante los tres muestreos, los valores fluctuaron dependiendo de la edad de A. acuminata, entre 3.16 a
6.0; 4.83 a 12.16 y 6.16 a 9.66 para los muestreos a los 45, 90 y 125 días respectivamente.
A los 45 días todos los tratamientos excepto el T6, presentaron superioridad con relación al
testigo (T25). A los 90 días el tratamiento T14 (CN46) superó a todos los tratamientos y mostró un
incremento del 104.5% con relación al testigo. Al final del experimento en la variable número de hojas,
el tratamiento T14 continuó presentando mayores promedios superiores al tratamiento 21 y testigo. El
95.8% de los tratamientos con inoculación incrementaron el número de hojas en A. acuminata,
permitiendo una mayor capacidad fotosintética que se refleja en mejores indicadores dasométricos y de
composición química.
Los promedios generales en esta variable fueron de 4.86, 7.06 y 8.07, los valores presentaron un
mediano grado de relación con la producción de materia seca total, al explicarla en un 50.5% (P<0.001).
Oliveira et al. (2005), reportó mayores valores de hojas a los 6 meses en A. glutinosa, con un
promedio de 13 hojas en el tratamiento con Frankia y de 14 con la doble inoculación Frankia y Glomus
intraradices y similares a los tratamientos que fueron inoculados solamente con G. intraradices (9
hojas). Esto posiblemente está asociado con el crecimiento de las plantas experimentales.
Las hojas es el sitio donde se forman los carbohidratos durante la fotosíntesis los que luego, sé
translocan hacia los nódulos a través del floema. Por lo tanto, el hospedero proporciona carbohidratos al
simbionte, que, a su vez, lo oxida para obtener energía. La tasa de fijación de nitrógeno es máxima hacia
el medio día, cuando la translocación de los azúcares desde las hojas, hacia los nódulos se efectúa con
rapidez (Salisbury & Ross, 2000).
75
4.5.1.2. Cundinamarca
La respuesta de A. acuminata a la inoculación con diferentes cepas de Frankia en el número de

hojas de las cepas aisladas de Cundinamarca, presentó diferencias altamente significativas (P<0.01)
entre tratamientos, durante los tres muestreos (45, 90 y 125 días), los valores fluctuaron a medida que
crecieron las plantas, entre 2.2 a 6.5 de 5.5 a 8.83 y de 7.16 a 14.16 para los periodos de evaluación
respectivamente.
Es importante anotar que el 79.2% de los tratamientos superaron al testigo a los 45 días y el
tratamiento que presentó el mayor número de hojas fue el tratamiento 4 con 6.5 hojas/planta, superando
en un 195.4% al testigo (T24).
A los 90 días el tratamiento T23 cepa control AacI, obtuvo los mayores valores promedios con
8.83 hojas/planta, con un incremento del 60.5% con relación al testigo, las cepas nativas que
presentaron similar comportamiento al T23 fueron T2, T3, T4, T5, T6, T9, T10, T11, T14, T819 y T22
con valores que oscilaron entre 7 y 8.33 hojas/planta. Después de 125 días de inoculación, el tratamiento
T23 continuó con el mayor promedio, similar al del tratamiento T19 con 12.16 hojas/planta, superando
a todos los demás tratamientos (P<0.01).
Estos valores son similares a los publicados por Oliveira et al. (2005), quienes a los 6 meses
encontraron en A. glutinosa, un valor de 13 hojas cuando fue inoculada con Frankia y 14 con la doble
inoculación Frankia-G. intraradices y 9 hojas en el tratamiento inoculado sólo con G. intraradices. Los
mayores promedios de las cepa de Cundinamarca, se reflejaron en la variable productiva y de
composición química.
4.5.2. Diámetro basal (mm)
4.5.2.1. Nariño
Al analizar los resultados presentados en ésta investigación en el diámetro basal, se presentaron

diferencias (P<0.01) entre tratamientos, durante los tres muestreos, los valores fluctuaron dependiendo
del crecimiento de A. acuminata, entre 0.13 a 0.22 mm; 0.19 a 0.41 mm y 0.23 a 0.50 mm, para los
muestreos a los 45, 90 y 125 días respectivamente, con un promedio general de 0.18, 0.29 y 0.37 mm.
76
Durante todo el experimento el tratamiento T16 inoculado con la cepa CN49 procedente del
municipio de Pasto (Cubijan Alto), presentó superioridad matemática, aunque estadísticamente solo
superó al tratamiento testigo a los 45 días, a los tratamientos T12 y testigo a los 90 días y al T10 y T12 a
los 125 días (P<0.01).
La variable diámetro basal estuvo estrechamente asociada con el número de nódulos y durante
todo el experimento, se reportó un R 2=0.62 (P<0.01). De igual manera, esta variable esta íntimamente
asociada con la producción de materia seca foliar, donde el diámetro basal explica en un 69.2% la
producción de biomasa aérea en A. acuminata.
El diámetro basal es frecuentemente utilizada en el estudios forestales ya que presenta altas

relaciones con variables de producción, lo que permite continuar monitoreando esta variable en
procesos de desarrollo fenológico en campo de A. acuminata, donde los muestreos destructivos no se
puedan realizar.
Aunque esta variable es muy poco analizada en las investigaciones, es importante resaltar que
Oliveira et al. (2005), reporta diámetros a los 6 meses en A. glutinosa de 5 mm sin inoculación y de 7.3
mm al inocularla con Frankia, inferiores a los promedios encontrados en A. acuminata inoculadas con
las cepas de Nariño y con los controles Argentinos.
En la respuesta a la inoculación en esta variable se presentaron diferencias (P<0.01) entre

tratamientos, durante los tres muestreos. Los valores se incrementaron con la edad de A. acuminata y
fluctuaron entre 0.11 a 0.28 mm; 0.19 a 0.33 mm y 0.23 a 0.44 mm para los tres muestreos, con un
promedio general de 0.21; 0.27 y 0.33 mm respectivamente.
El diámetro basal a los 45 días fue superior en las plantas inoculadas con las cepas de
Cundinamarca con relación a las de Nariño, sin embargo, a la edad de 90 días y 125 días los reportados
en Nariño fueron superiores con 0.29 y 0.37 mm respectivamente, menor que Nariño.
A los 45 días de inoculación el 66% de los tratamientos superaron los diámetros obtenidos por
el testigo (P<0.01). Los tratamientos T4 y T7 presentaron los mayores promedios (0.28 mm), superando
al testigo en un 154%. A los 90 días los mejores tratamientos fueron el T6 y T9 con un diámetro de 0.33
77
mm, superando en un 127.2 % al tratamiento no inoculado (T25), y al final del experimento el 62.5% de
los tratamientos inoculados superaron al testigo, siendo el tratamiento T19 el que presentó los mejores
resultados con un valor de 0.44 mm superando al testigo en un 91.3%.
Durante todo el experimento, la variable diámetro basal estuvo asociada con el peso seco foliar,
reportándose un R2=0.51 (P<0.01). De igual manera, esta variable a los 125 días de inoculación estuvo
íntimamente asociada con la altura, donde el diámetro basal explica en un 61% la altura en A. acuminata
(P<0.01) y estuvo estrechamente asociada el número de nódulos, durante todo el experimento
reportándose un R2=0.62 (P<0.01). Adicionalmente, se pudo observa una relación con la producción de
materia seca total, donde el diámetro basal explica en un 69.2% la producción de biomasa aérea en A.
acuminata, confirmando así la importancia en la investigación de ésta variable, ya que al haber mayor
número de nódulo, la dinámica de nutrientes principalmente nitrógeno es mayor, reflejándose en mayor
desarrollo de los tejidos, principalmente en tallo, que se manifiesta en mayores diámetros (Sylvia et al.,
2005).
4.5.3. Altura (cm)
4.5.3.1. Nariño
La respuesta a la inoculación medida en la variable altura presentó diferencias (P<0.01) entre

tratamientos en los tres periodos de evaluación, los valores fluctuaron en una relación directa con la
edad de A. acuminata, entre 7.68 a 13.58 cm; 11 a 20.58 cm y 12.33 a 26.33 cm, con un promedio
general de 11.33, 14.66 y 19.99 cm a los 45, 90 y 125 días posteriores a la inoculación.
Durante todo el experimento, en esta variable el tratamiento T16 mostró los mayores promedios,
y superó al testigo en un 78% a los 45 días de la inoculación. En esta investigación se observó que a
medida que se incrementó la edad en A. acuminata se exhibieron claramente diferencias entre las cepas
evaluadas, es así como en los muestreos de los 90 y 125 días, el tratamiento T16 superó al 44% de los
tratamientos incrementado su superioridad en un 87% y 113.54% con respecto al testigo. Estos
resultados muestran claramente el efecto de la inoculación y la especificidad de algunas cepas, que
permiten al hospedero incrementar una de las variables de mayor importancia en la fase de vivero, la
cual esta asociada directamente con edad de transplante de A. acuminata al sitio definitivo.
78
La altura incidió directamente en la producción de materia seca total (aérea y raíz) y el número
de nódulos, es así como la cantidad de materia seca total esta explicada en un 84.3%, por la altura
(P<0.01) y esta variable a su vez, expresa el 61.3% del número de nódulos (P<0.01). Estos resultados
pueden estar asociados a la capacidad de algunas cepas de asociarse a A. acuminata y permitirle
expresar variables dasométricas de importancia económica.
Los resultados presentados a los 45 días de evaluación superan a lo publicado por Nickel et al.
(2001), quienes evaluaron A. glutinosa inoculada con Frankia y observaron valores menores de 10 cm,
sin embargo, son inferiores a los reportados por éstos autores a los 90 y 120 días con un promedio de
altura de 25 y 36 cm respectivamente.
El tratamiento 16 con 20.58 cm a los 90 días, fue similar en la altura a la triple inoculación con
Frankia-Glomus fasiculatus y Paxillus involutus en A. incana publicada por Chatarpaul et al. (1989)
quienes reportaron a los 71 días una altura de 20 cm. De igual manera, las mayores alturas fueron
similares a las evaluaciones con Frankia en A. glutinosa (28.8 cm), realizado por Oliveira et al. (2005),
pero inferiores a los promedios obtenidos con la doble inoculación Frankia y Glomus (34 cm).
Los valores en esta variable fluctuaron entre 6.81 a 12.91 cm; 9.06 a 18 cm y 13.22 a 21 cm
para los muestreos a los 45, 90 y 125 días respectivamente, presentando diferencias (P<0.01) entre
tratamientos durante los tres muestreos.
Los promedios generales de las cepas de Cundinamarca fueron de 9.83, 14.74 y 17.39 cm
similares a los promedios logrados por las cepas de Nariño (11.33, 14.66 y 19.99 cm) para los 45, 90 y
125 días posteriores a la inoculación con Frankia.
En esta variable los tratamientos T1, T10, T9 y T4 mostraron los mayores promedios durante
todo el experimento. Al inicio de la evaluación los tratamientos inoculados con las cepas CC12 (T1) y
CC31 (T9) presentaron las mayores alturas 12.91 y 12.81 cm, superando al testigo en un 89.5 y 77.6%.
A medida que se incrementó la edad en A. acuminata se exhibieron claramente diferencias entre las
cepas evaluadas, es así como, en los muestreos de los 90 y 125 los tratamientos inoculados con las cepas
T4 y T9 presentaron las mayores alturas y superaron al testigo en un 63.9 y 98.6% a los 90 y 58.8% y
79
56.9% a los 125 días respectivamente. Estos resultados muestran claramente el efecto de la inoculación
y la especificidad de las cepas T4 y T9 que permitieron estimular a A. acuminata, incrementar su altura.
Los resultados presentados en esta variable por el tratamiento T9 a los 90 días, fueron similares
a la doble inoculación con Frankia-Paxillus involutus en A. incana publicada por Chatarpaul et al.
(1989) quienes reportaron a los 71 días una altura de 18 cm y concluyen que la altura fue
significativamente más alta, cuando se inoculó con micorrizas y Frankia comparada con la inoculación
con Frankia.
La altura incidió directamente en la producción de materia seca total y en el peso seco de la raíz,
es así, como la cantidad de materia seca total está explicada en un 64.3%, por la altura (P<0.01), y esta
variable a su vez expresa el 56.4% el peso seco de la raíz (P<0.01). El efecto de la inoculación permite
expresar a A. acuminata variables dasométricas como la altura de importancia económica en sistemas
silvopastoriles.
Nickel et al. (2001), reportaron alturas promedios en A. glutinosa inoculada con Frankia a los
45, 90 y 120 días de 10, 25 y 36 cm, valores superiores inferiores a los obtenidos en este estudio. Sin
embargo, éstos son inferiores a los resultados presentados por Oliveira et al. (2005), quienes reportan a
los 180 días un promedio de 28.8 cm en A. glutinosa asociada con Frankia y 34 cm en la doble
inoculación con Frankia y Glomus.
4.5.4. Peso seco foliar (g/planta)
4.5.4.1. Nariño
Gran parte de la respuesta de A. acuminata a la inoculación con Frankia se debe expresar en

producción de fitomasa, el promedio general de esta variable fue de 0.18, 0.32 y 0.66 g, para los 45, 90
y 125 días de evaluación respectivamente. En esta investigación se presentaron diferencias altamente
significativas (P<0.01) entre tratamientos durante los tres muestreos, la producción fluctuó con el
tiempo del experimento y la producción de biomasa fluctuó, entre 0.18 a 0.27 g; 0.10 a 0.67 g y 0.39 a
1.17 g para las evaluaciones de 45, 90 y 125 días respectivamente.
Las mayores producciones de materia seca foliar, fueron obtenidas por el tratamiento T16, el
cual a medida que se incrementaba la edad de las plantas mostró claramente diferencias con los demás
80
tratamientos. Se observó que en el primer muestreo el tratamiento T16 superó únicamente al testigo
(0.18 g) en un 50%, en las siguientes evaluaciones, éste tratamiento superó en un 219% y 200% al
testigo a los 90 y 125 días respectivamente.
Las variables numero de hojas, diámetro basal y longitud de raíz, incidieron directamente sobre
la producción de materia seca foliar, es así como el número de hojas explica en un 50.8% (P<0.01) la
materia seca foliar y ésta a su vez está explicada en un 69.2% por el diámetro basal (P<0.01). Es
importante anotar que en esta investigación se encontró que existe una intima relación entre la
producción de biomasa aérea (g/planta) con la longitud de la raíz, la cual es explicada en un 80.5% por
la producción de materia seca foliar (P<0.01).
Durante todo el experimento, las cepas manifestaron su efecto en la producción de peso seco
foliar y superaron al testigo entre un 33.3% al 415.7%.
El promedio general de esta variable fue de 0.23, 0.65 y 1.04 g/planta, valores superiores a los
reportados por las cepas de Nariño 0.18, 0.32 y 0.66 g/planta, para los muestreos a los 45, 90 y 125 días
respectivamente.
A los 45 días de evaluación los tratamientos inoculados con las cepas T1, T2, T3, T4 y T17
presentaron los mayores pesos secos a nivel foliar, con diferencias altamente significativas entre los
tratamientos (P<0.01), y promedios que oscilaron entre 0.32 y 0.34 g/planta. A medida que avanzó el
tiempo de evaluación (90 días), el tratamiento T19 presentó los mayores valores promedios, superando a
todos los demás cepas, con excepción del T4, T9, T10 y T22 con un incremento de 358.3% con respecto
al tratamiento sin inoculación (T24). Sin embargo, a los 125 días de evaluación el resultado presentado
por el tratamiento T19 fue superado por la cepa control AacIII (1.96 g/planta), el cual superó a todos los
tratamientos.
El peso seco foliar incidió en un 81.2% con la altura (P<0.01), lo cual confirma la importancia
de la inoculación en el mayor desarrollo foliar de las plantas de A. acuminata.
81
4.5.5. Producción de materia seca total (g MS/planta)
4.5.5.1. Nariño
La producción de materia seca total de A. acuminata es una de las principales respuestas de ésta
especie a la inoculación con Frankia. Durante toda la evaluación se obtuvo un promedio de 0.39, 0.67 y
1.37 g MS/planta para las evaluaciones de 45, 90 y 125 días respectivamente.
En esta investigación se presentaron diferencias significativas (P<0.01) entre tratamientos en las

tres evaluaciones y a medida que avanzaba la edad de A. acuminata se consolidó la diferencia entre
tratamientos. Es así, como la producción de biomasa total fluctuó a los 45 días entre 0.26 g y 0.67 g
MS/planta, a los 90 días las producciones fueron entre 0.42 y 1.37 g MS/planta y al final de la
investigación la fitomasa fluctuó entre 0.75 y 2.41 g MS/planta.
Durante toda la evaluación el tratamiento T16 mostró su efectividad al superar el 16% de todos
los tratamientos a los 45 días y superó en un 157% la producción del testigo (0.26 g/MS//planta). A los
90 días la producción de MS total promedio del tratamiento T16 (1.37g MS/planta), supero al 40% de
los tratamientos e incremento su producción con respecto al testigo en un 226%.
En el muestreo de los 125 días de inoculación, el tratamiento T16 logró superar las
producciones de MS del 52% de los tratamientos, y en un 221.3% el rendimiento de biomasa del testigo
(0.75 g MS/planta). Es importante resaltar que en esta investigación, los tratamientos que superaron los
2 g MS/planta, fueron únicamente los tratamientos T16 y T18. Sellstedt & Huss-Danell (1984),
evaluaron la inoculación con Frankia en A. incana a los 122 días y obtuvieron un peso seco de 1.08 g,
valores que son inferiores a los presentados en A. acuminata con la inoculación de las cepas del
tratamiento T16 (2.41 g/MS/planta) y T18 (2.11 g/MS/planta) en este estudio.
Lo anterior permite inferir que la inoculación de A. acuminata con la cepa del tratamiento T16, puede
incrementar la producción de biomasa de la parte aérea y radicular, respuesta asociada al
comportamiento en el número de nódulos éste tratamiento, el cual superó estadísticamente (P<0.01) a
los demás tratamientos. La producción de biomasa total presentó una relación estrecha con el número de
nódulos y estos explican la producción de biomasa en un 70.1% (P<0.01). Adicionalmente, la
producción de fitomasa total está explicada en un 68% (P<0.01) y en un 84.3%(P<0.01) por el diámetro
basal y la altura de la planta, variables en las cuales el tratamiento T16 presentó los mayores promedios.
82
Estas relaciones coinciden con lo publicado por Ridgway et al. (2004), quienes encontraron una
relación positiva entre la biomasa de A. incana y la biomasa de nódulos de R2=0.77 y entre el peso seco
con la altura con un R2=0.94.
Los resultados presentados por el mejor tratamiento (T16) en esta variable, fueron inferiores a
las evaluaciones realizadas por Chatarpaul et al. (1989), quienes utilizaron la doble y triple inoculación
con Frankia-Glomus fasciculatus y Paxillus involutus en A. incana a los 71 días con valores de 1.72 y
5.11 g. De igual manera, a los 120 días Nickel et al. (2001), reportan mayores ganancias de pesos en A.
glutinosa inoculada con Frankia (4.1 a 5.6 g/planta). Adicionalmente, las mejores respuestas en
producción, son inferiores a los resultados presentados en la evaluación con Frankia en A. glutinosa a
los 180 días con un valor de 4.39 g y a la doble inoculación con Frankia y Glomus intraradices 4.95 g
realizado por Oliveira et al. (2005).
La producción de materia seca total en A. acuminata presentó promedios de 0.58, 118 y 2.88 g
MS/planta para las evaluaciones de 45, 90 y 125 días respectivamente.
Al realizar el análisis de la respuesta a la inoculación en ésta variable, se presentaron diferencias

altamente significativas (P<0.01) entre tratamientos en las tres evaluaciones. Los valores promedio
fluctuaron a los 45 días entre 0.17 g y 0.95 g MS/planta, a los 90 días, con producciones de 0.48 y 1.86
g MS/planta y al final de la investigación con 1.55 y 5.61 g MS/planta.
Al inicio de la evaluación la cepa de Frankia CC17:T4 mostró los mayores valores promedios
superando a todos los tratamientos con excepción de T13, T17 y T19 los cuales obtuvieron un promedio
de 0.77, 0.73 y 0.73 g MS/planta respectivamente, y superó en un 458.8% al testigo.
A los 90 días el tratamiento inoculado con la cepa control AacIII (T22) y las cepas nativas T4,
T14 y T19 (1.86, 1.8, 1.59 y 1.83 g MS/planta) presentaron los mayores valores promedios, la cepas
control AacIII (T22) y la nativa CC17 (T4) superaron al tratamiento sin inoculación (T24) en 287.5% y
275% respectivamente.
Al final de la evaluación los tratamientos inoculados con las cepas nativas T4 aislada en Usme y
T11 procedente de Funza, presentaron la mayor producción de materia seca, con promedios generales de
83
5.61 y 5.5. g MS/planta superando en un 261.9 y 258% al tratamiento sin inocular (T24)
respectivamente.
Los valores en producción de materia seca total observados en las plantas de A. acuminata
inoculadas con las cepas de Cundinamarca presentaron mayores pesos con relación a las cepas de
Nariño, con un incremento a los 125 días en el promedio de todos los tratamientos de 111.7% y con
respecto a los mejores tratamientos del 132.7%.
Estos valores son mayores a los reportados por Sellstedt & Huss-Danell (1984) quienes a los
122 días obtuvieron un peso seco de 1.08 g para A. incana, y similares a los publicados por Chatarpaul
et al. (1989), con la doble y triple inoculación con Frankia-Glomus fasciculatus y Paxillus involutus en
A. incana con valores de 1.72 y 2.23 g. De igual manera, son similares a los reportes de Nickel et al.
(2001), quienes evaluaron la inoculación con Frankia en A. glutinosa en suelos con niveles bajos en
materia orgánica, donde las plantas obtuvieron promedios entre 4.1 a 5.6 g/planta. Y superiores a los
resultados de Oliveira et al. (2005) quienes evaluaron la inoculación con Frankia (4.39 g) y doble doble
inoculación con Frankia y Glomus (4.95 g) en A. glutinosa a los 180 días.
La producción de biomasa total presentó una relación estrecha con la altura explicada en un
64.3% (P<0.01). Adicionalmente, la producción de fitomasa total esta explicada en un 51.2% (P<0.01)
por el diámetro basal.
Las mejores respuestas en producción de materia seca de las cepas aisladas de Cundinamarca en
este estudio, posiblemente están asociadas con el nivel de fósforo contenido en el sustrato (59 ppm),
esto concuerda con las observaciones de Russo (1989), quien encontró, que con 50 ppm de fósforo en el
sustrato, se obtiene mayores pesos secos en A. acuminata inoculadas con Frankia asociadas con y sin
Glomus. Adicionalmente, observó que con un nivel de 10 pmm de fósforo, se presentó una mayor
actividad de la nitrogenasa en la asociación Glomus y Frankia que cuando se inoculó sólo con Frankia.
84
4.5.6. Longitud de raíz (cm)
4.5.6.1. Nariño
En esta investigación se presentaron diferencias (P<0.01) entre tratamientos, durante los tres
muestreos, con promedios entre 4.58 a 8.65 cm; 5.16 a 15.58 cm y 14.41 a 21.95 cm para los tres
muestreos destructivos respectivamente, con un promedio general de 6.92, 10.75 y 19.00 cm.
A los 45 días de inoculación, las mayores longitudes de las raíces fueron obtenidas por el
tratamiento T7 con un promedio de 8.65 cm. El tratamiento T16 con 15.58 y 21.95 cm, presentó a los 90
y 125 días las mayores longitudes, aunque en la última evaluación, el mejor tratamiento únicamente
superó estadísticamente al testigo, que se reflejó en un incremento de 167.2% y 52.3% con respecto al
testigo a los 90 y 125 días respectivamente.
La longitud de la raíz estuvo directamente relacionada sobre la producción de peso seco foliar,
producción de materia seca total, así como también con el número nódulos, y es así como la materia
seca total y el peso seco foliar son explicados en un 76.6% (P<0.01) y 80.5% (P<0.01) respectivamente,
por la longitud de la raíz Adicionalmente, ésta variable expresa el número de nódulos en un 53.4%
(P<0.01).
Al comparar los resultados del tratamiento 16 que presentó las mayores longitudes radiculares a
los 90 días, con las observaciones publicadas por Chatarpaul et al. (1989) fueron similares a la
inoculación simple con Frankia en A. incana e inferiores a la doble y triple inoculación con Frankia,
Glomus fasciculatus y Paxillus involutus quienes reportaron a los 71 días un incremento del 100%, con
valores de 30 y 31 cm para la doble y triple inoculación respectivamente.
La respuesta a la inoculación en el crecimiento radicular, presentó diferencias altamente

significativas entre los tratamientos (P<0.01), durante los tres muestreos. Los valores oscilaron entre
4.45 a 12 cm; 6.33 a 17.91 cm y 11.55 a 20.78 cm para los tres periodos de evaluación, con un promedio
general de 8.04, 11.39 y 16.74 cm respectivamente.
85
Las mayores longitudes de las raíces a los 45 días de evaluación, fueron obtenidas por el
tratamiento T17 que superó a todos los demás tratamientos con excepción del T10, T4, T13 y T20, con
incremento del 169.6% con relación al testigo. A los 90 días el tratamiento T4 (17.91 cm) presentó los
mayores valores promedios superando los demás tratamientos, excluyendo los tratamientos T9 (14.57),
T11 (14.35 cm), T18 (14.13 cm) y T3 (13.97 cm). El tratamiento T4 superó en un 182.9% al tratamiento
sin inoculación.
Estos valores son similares a las observaciones publicadas por Chatarpaul et al. (1989), en la
evaluaron de la inoculación simple con Frankia en A. incana e inferiores a la evaluación de doble y
triple inoculación con Frankia, Glomus fasciculatus y Paxillus involutus con valores a los 71 días de 30
y 31 cm respectivamente.
Para la última evaluación el tratamiento 7 (20.78 cm) presentó el mayor valor promedio,
superando al testigo sin inocular en un 23.83%, y a las cepas controles AacI y AacIII en un 25.18 y
30.85% Los tratamientos que presentaron similar comportamiento fueron T2, T3, T4, T9, T11, T16,
T17, T18 y T20 con longitudes entre 17.05 y 20.11 cm
La longitud de la raíz incidió directamente sobre el peso fresco total, el peso fresco radicular así
como también con el número de hojas y es así como el peso fresco total y radicular son explicados en un
62% (P<0.01) y 57.2% (P<0.01) respectivamente, por la amplitud radicular. Adicionalmente, ésta
variable expresa el número de hojas en un 62.3% (P<0.01).
4.5.7. Peso seco radicular (g MS/planta)
Las raíces de los árboles en los sistemas silvopastoriles pueden contribuir y aportar de manera
importante nutrientes al sistema por medio de la descomposición-mineralización de raíces y nódulos y
por exudación de nutrientes.
4.5.7.1. Nariño
En esta investigación se presentaron diferencias (P<0.01) entre tratamientos durante los tres
muestreos, los promedios oscilaron dependiendo del crecimiento de las plantas entre 0.09 a 0.40 g, 0.20
a 0.69 g MS/planta y 0.27 a 1.28 g MS/planta respectivamente y un promedio general por periodo de
0.21, 0.35 y 0.70 cm, a los 45, 90, 125 días respectivamente.
86
Los mayores promedios durante los dos primeros muestreos los presentó el tratamiento T16 con
valores de 0.40 g MS/Planta y 0.69 g MS/Planta, biomasa radicular que superó en un 344% y en 245% a
los valores reportados por el testigo. Al final de esta evaluación los mayores pesos radiculares fueron
obtenidos por el T18 (1.28 g MS/Planta) y T16 (1.23 g MS/Planta), con incremento del 265% y 251%
con relación al testigo. Estos resultados superan a los publicados por Sellstedt & Huss-Danell (1984) en
A. incana a los 122 días con promedios de 1.08 g.
Al comparar el efecto en el peso seco radicular de las cepas de Frankia aisladas de

Cundinamarca con las cepas de Nariño sobre las plantas A. acuminata, se puedo observar que en ésta
variable las cepas de Frankia nativas de Cundinamarca presentaron mayores valores promedios durante
toda la evaluación.
Los valores promedios presentados en esta variable durante los tres periodos de evaluación
oscilaron entre 0.11 a 0.61 g, 0.24 a 0.89 g y 0.64 a 4.35 g, con un promedio general de 0.34, 0.54 y
1.81 g.
El tratamiento T4 durante los tres muestreos presentó los mayores pesos, con valores de 0.61,
0.89 y 4.25g. Adicionalmente, a los 90 días el T22 (0.32 g) y a los 125 días el T11 con 435 g, mostraron
similar comportamiento que el T4. Al finalizar la evaluación éstos tratamientos presentaron un
incremento de 271 y 263.2% con respecto al testigo y a las cepas control AacI (T22) y AacIII (T23) en
208.5 y 63.53% y 201.4 y 59.77% respectivamente. Estos resultados son superiores a los reportes
Sellstedt & Huss-Danell (1984) quienes evaluaron la inoculación con Frankia en A. incana a los 122
días y obtuvieron un peso seco de 1.08 g.
4.5.8. Número de nódulos (No/planta)
Las plántulas inoculadas presentaron nodulaciones en racimosidades debido a que cada lóbulo
se ramificó dicotómicamente, en conjunto los lóbulos nodulares crecieron con formas coraloides
redondeada del lóbulo. El diámetro de los nódulos a los 125 días osciló entre 0.1 mm hasta 1.1 mm. Los
lóbulos presentaron una forma ancha en el ápice y angosta en la base, la parte apical es la zona más
joven la cual presentó una coloración rojiza y naranja, lo cual esta relacionado con presencia de taninos.
87
No se observó la coloración café oscura en la base de los nódulos, posiblemente a que eran nódulos
jóvenes (Niño & Pérez, 1987; Diuf et al., 2003).
4.5.8.1. Nariño
La respuesta de A. acuminata a la inoculación con respecto al número de nódulos (P< 0.01),

presentó diferencias altamente significativas entre los tratamientos durante los tres muestreos. A los 45
días el número de nódulos oscilo entre 6 y 18.66 por planta, el tratamiento 15 superó a los tratamientos
inoculados con cepas nativas T12, T8, T7, T6 con (7, 8.16, 7 y 8.5 nódulos), a los tratamientos de cepas
controles cepas AacIII y AacI (8.83 y 7.5 nódulos respectivamente) y al tratamiento testigo (6 nódulos).
Estos resultados son similares a los reportados por Wolters (1998), quien evaluó la respuesta a
la nodulación de Frankia en Alnus glutinosa a los 42 días de inoculación en diez tipos de suelos, los
cuales presentaron comportamientos diferentes entre sí, reportando el mayor promedio de 19.5
nódulos/planta. Y son superiores a los obtenidos por Hafees et al. (1984) quienes reportaron a los 30
días de evaluación, un promedio de 6.7 nódulos en Alnus nitidia.
A los 90 y 125 días de evaluación la cepa CN49 (T16) estimuló a las plantas de A. acuminata a
producir una mayor cantidad de nódulos (31.83 y 37.83 nódulos respectivamente), superando
significativamente a todos los demás tratamientos, con incremento de 180.9 y 167.1% con relación al
testigo.
El total del número de nódulos obtenidos por A. acuminata a los 90 días son inferiores a los
mayores promedios reportados por Gentili & Huss-Danell (2003), quienes encontraron valores entre
37.5 a 137.5 nódulo en A. incana, con diferentes niveles de fósforo y nitrógeno, estos resultados los
autores los asociaron a las condiciones de luz, temperatura y humedad relativa a las que fueron
sometidas las plantas.
Los resultados obtenidos a los 125 días superan en un 22% a los reportados por Nickel et al.
(2001), quienes evaluaron a los 120 días la inoculación en A. glutinosa con la cepa AgB19. Pero
inferiores a los publicados por Ridgway et al. (2004), quienes obtuvieron un valor máximo de 50
nódulos, en plantas de A. incana sobre diferentes suelos contaminados a los 180 días.
88
Uno de los factores que están relacionados con la efectividad con que se produce la nodulación,
esta asociado con los procesos de reconocimiento controlados genéticamente, entre las especies
bacterianas y las especies leñosas (Salisbury & Ross, 2000). Por lo tanto, los resultados obtenidos por el
tratamiento 16, pueden estar asociados a la mayor compatibilidad bioquímica y molecular de la cepa
CN49 con el aliso.
La capacidad de la estimulación de las cepas de Frankia en A. acuminata a formar nódulos en

esta investigación presentó diferencias altamente significativas entre los tratamientos. El número de
nódulos promedio que se presentó a los 45 días fue de 14 a los 90 de 20.5 y a los 125 días de 31.7.
A los 45 días de evaluación el tratamiento T4 (22 nódulos) presentó los mayores valores
promedios superando a todos los demás tratamientos con excepción de las cepas T17, T15, T5, T16 y
T1 (21.16, 20.83, 20.16, 19.16 y 18.33 nódulos respectivamente). A los 90 días de evaluación los
tratamientos T17 (34.66), T4 (33.66) y T9 (33.33) presentaron los mayores valores estadísticos
superando significativamente a los demás tratamientos. En la última evaluación los mayores valores
promedios fueron presentados por los tratamientos T7, T17, T19 y T4 con valores promedios que
oscilaron entre 44.33 y 52.66 nódulos por planta.
El tratamiento T4 a los 45 y 90 días superó en producción de nódulos por planta en un 408 y

654.7% al tratamiento testigo y a las cepas control AacI y AacIII en 43.5 y 158.8% a los 45 días y a los
90 en un 112.6 y 106.1% respectivamente. El tratamiento T7 superó en un 435.7% al testigo sin inocular
y a las cepas control T22 y T23 en 148.8 y 125.7%.
Esta respuesta positiva a la nodulación, posiblemente esta asociada a la mayor producción de

pectinas por las mejores cepas de Frankia, las cuales incrementan la permeabilidad de la pared celular
de la raíz aumentando la penetración del simbionte (Niño & Pérez, 1987; Seguin & Lalonde, 1989).
Esto posiblemente, anudado a la producción del ácido-3-acético (AIA), el cual se ha demostrado esta
asociado, a la estimulación en el desarrollo del primordio del nódulo en especies de Alnus (Berry et al.,
1989).
De igual manera, la producción del AIA participa como regulador y control de la nodulación y
la nitrogenasa (Wheeler et al,. 1984; Woodward & Bartel, 2005) lo cual es corroborado por Gray &
89
Smith (2005) quienes mencionan que los microorganismos son considerados la fuente primaria de
sustancias biológicamente activas en el suelo y en microorganismos fijadores de nitrógeno, estimulan la
producción de etileno, la respuesta a la nodulación y fijación de nitrógeno.
Comparando los resultados obtenidos con los reportes de Hafeez et al. (1984) se presentó un
mayor comportamiento a los 30 días de evaluación con relación a Alnus nitidia (6.7 nódulo). El total de
nódulos obtenidos por A. acuminata a los 90 días son inferiores a los mayores promedios publicados por
Gentili & Huss-Danell (2003), quienes encontraron valores entre 37.5 a 137.5 nódulos por raíz, en A.
incana con diferentes niveles de fósforo y nitrógeno.
Ridgway et al. (2004), evaluaron la producción de nódulos en plantas de A. incana sobre

diferentes suelos contaminados y a los 180 días los autores obtuvieron un máximo de nodulación de 50,
valor similar a los presentados por las mejores cepas aisladas de Cundinamarca a los 125. Así mismo,
estos resultados superan en 69.8% a la producción de nódulos obtenidos en Alnus glutinosa publicados
por Nickel et al. (2001), a los 120 días con la cepa AgB19.
Al comprar los resultados del número de nódulos obtenidos en las dos evaluaciones realizadas
en este estudio, se pudo observar una mayor producción de nódulos en las plantas sembradas en los
suelos procedentes de Cundinamarca, esta respuesta puede estar asociada a los niveles medios de
nitrógeno del sustrato, lo cual posiblemente estimuló la actividad de la nitrogenasa. Los altos niveles de
nitrógeno en el suelo según Wall (2000), pueden inhibir en diferente estado de crecimiento de las
plantas, los procesos de nodulación y en el caso del número de nódulos, son más frecuentes en los
estados iniciales de la nodulación, reflejándose en un menor tamaño y número.
Adicionalmente, Parsons et al, (1993) y Baker & Parsons (1997) sugieren que la concentración
de compuestos nitrogenados reducidos a nivel foliar, presentan un proceso de retroalimentación con el
estatus de nitrógeno en la planta, lo cual, esta estrechamente relacionado con la estimulación de la
nodulación, retornando esto compuestos nitrogenados como los aminoácidos a los nódulos para regular
su crecimiento y actividad.
Adicionalmente, el sustrato utilizado para la evaluación de las cepas de Cundinamarca, presentó

mayor contenido de materia orgánica, esto está correlacionado con la diversidad de las poblaciones de
Frankia (Jaman et al., 1992).
90
4.6. Análisis de los resultados de la composición química de plantas de A. acuminata
En la tabla 21 y 22 se muestran los resultados obtenidos en la acumulación de nitrógeno y

fósforo de las plantas de A. acuminata en fase de vivero de las cepas aisladas de Nariño y
Cundinamarca.
4.6.1. Proteína cruda y nitrógeno total
Uno de los compuestos no proteicos que están incluidos en el análisis de PC son los ureidos
siendo la citrulina el principal compuesto ureido de síntesis del N 2 fijado por Frankia en los nódulos de
Alnus (Orozco, 1999). Estos ureiros se desplazan desde las células colonizadas, hacia las células del
periciclo adyacente a los haces vasculares que rodean el nódulo, desde aquí los compuestos se mueven
desde la raíz y el tallo degradándose en gran parte en las hojas, para formar el NH4+, y el nitrógeno se
incorpora rápidamente en aminoácidos amidas y proteínas (Salisbury & Ross, 2000). Por lo tanto, la
mayor parte de nitrógeno que se encuentra en cualquier vegetal está en forma de proteína.
La concentración de proteína cruda (PC) en la fitomasa de A. acuminata, calculada por el

porcentaje de nitrógeno total multiplicado por 6.25, es considerada como indicador indirecto de la
fijación biológica del nitrógeno, transporte y deposición de compuestos orgánicos nitrogenados
sometidos a la influencia de las cepas evaluadas. Estas variables fueron medidas al final del
experimento cuando las plantas tenían 125 días de inoculación.
91
Tabla 21. Respuesta del efecto de la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Nariño en las
variables de composición química en A. acuminata a los 125 días de edad después de la inoculación
TRATAMIENTOS PC(%) P(%) PC g/planta P g/planta

Pr>F ** ** * **
CN11 T1 13,43e 0,52c 0,22cd 0,0080bcd
CN12 T2 11,48k 0,57a 0,17cdef 0,0090abc
CN13 T3 12,92f 0,49d 0,19cde 0,0070bcde
CN21 T4 14,64ab 0,55b 0,19cde 0,0070bcde
CN22 T5 14,49b 0,26o 0,19cde 0,0030fghijk
CN23 T6 13,38b 0,32m 0,26abc 0,0060cdefghi
CN32 T7 12,21ghij 0,36k 0,09efg 0,0020ijk
CN33 T8 14,9a 0,43h 0,24bcd 0,0070bcdef
CN34 T9 12,31ghi 0,35kl 0,18cde 0,0050defghij
CN41 T10 10,95l 0,49d 0,07fg 0,0030ghijk
CN43 T11 13,72cde 0,45fg 0,18cdef 0,0060cdefghi
CN44 T12 10,85l 0,46fg 0,14defg 0,0063cdefgh
CN46 T13 11,86jk 0,26o 0,2cd 0,0040efghijk
CN47 T14 12,45g 0,09p 0,17cdef 0,0010k
CN48 T15 11,95ij 0,41i 0,2cde 0,0070bcdef
CN49 T16 13,44e 0,47ef 0,35ab 0,0120a
CN410 T17 12,4gh 0,3n 0,09efg 0,0020jk
CN411 T18 12,94f 0,36k 0,36a 0,0100ab
CN412 T19 12,05hij 0,47ef 0,17cdef 0,0070bcdef
CN51 T20 13,39e 0,48de 0,18cde 0,0070bcdef
CN52 T21 13,9c 0,48de 0,19cde 0,0066cdefg
CN53 T22 13,51de 0,46fg 0,2cde 0,0070bcdef
AacIII T23 13,88cd 0,39j 0,11efg 0,0030hijk
AacI T24 12,23ghij 0,45g 0,14defg 0,0050defghij
Testigo T25 12,4gh 0,33l 0,05g 0,0010k
** Diferencias altamente significativas (P< 0.01). * Diferencias significativas (P<0.05).ns no existen diferencias Promedios en una misma columna con letras iguales no difieren
significativamente según la prueba de Tukey (P> 0.05)
92
Tabla 22. Respuesta del efecto de la inoculación con cepas de Frankia aisladas de Cundinamarca en las
variables de composición química en A. acuminata a los 125 días de edad después de la inoculación
TRATAMIENTO PC (%) P (%) PC/g/planta P/g/planta

Pr>F ** ** ** **
CC12 T1 10,79no 0,33n 0,0683lm 0,011kl
CC13 T2 14,13b 0,42fg 0,0993ijkl 0,021ghi
CC14 T3 12,28jk 0,45d 0,1143hijk 0,026efgh
CC17 T4 14,98a 0,46c 0,2050ab 0,047a
CC18 T5 13,76bcd 0,38jk 0,1776bcd 0,034cd
CC110 T6 10,16p 0,38k 0,1706cde 0,032cde
CC111 T7 14,72a 0,49a 0,1600def 0,039bc
CC113 T8 9,25q 0,35m 0,0730l 0,013jkl
CC21 T9 11,56lm 0,40i 0,1316fghi 0,026efg
CC31 T10 9,16q 0,38k 0,1350fgh 0,026efgh
CC32 T11 12,64hij 0,40hi 0,1523defg 0,031def
CC33 T12 13,51cde 0,41h 0,0936jkl 0,019jhi
CC34 T13 12,55hij 0,45cd 0,1560def 0,035cd
CC41 T14 13,91bc 0,36l 0,1416efgh 0,026efgh
CC42 T15 12,78ghi 0,45d 0,0810kl 0,018ijk
CC43 T16 13,01fgh 0,44e 0,0950jkl 0,021ghi
CC44 T17 11,86kl 0,42g 0,0966jkl 0,02ghi
CC45 T18 11,26mn 0,48b 0,1013iijkl 0,024fghi
CC46 T19 12,48ij 0,41h 0,2170a 0,045ab
CC47 T20 13,3def 0,39j 0,1213ghij 0,024ghi
CC48 T21 11,94kl 0,43f 0,1196ghij 0,026efgh
AacIII T22 10,33op 0,35m 0,2016abc 0,035cd
AacI T23 13,21efg 0,41h 0,1146jhi 0,024ghi
Testigo T24 9,4q 0,40i 0,0363m 0,007l
** Diferencias altamente significativas (P< 0.01). * Diferencias significativas (P<0.05).ns no existen diferencias Promedios en una misma columna con letras iguales no difieren
significativamente según la prueba de Tukey (P> 0.05)
4.6.1.1. Nariño
En las cepas de procedentes de Nariño la respuesta a la inoculación, reportó un promedio de

12.9% y fluctuó entre los diferentes tratamientos valores de 10.85% a 14.91%, donde los mayores
niveles se observaron en los aislados T8 y T4 con promedios de 14.90% y 14.64%, el promedio del
tratamiento T8 superó (P<0.01) a los demás tratamientos.
93
Si se analiza este parámetro aislado de las características dasométricas, se puede cometer
omisiones en la valoración de las cepas, por lo tanto, se decidió determinar la producción de nitrógeno
total expresado en proteína cruda (g/planta), como un mejor indicador del sinergismo de Frankia y
Alnus.
La producción de proteína cruda (g/planta) a los 125 días de edad cambió por efecto de los
tratamientos (P<0.01) y los valores promedios fueron contrastantes, los cuales variaron entre 0.05
g/planta a 0.36 g/planta, donde la producción promedio de proteína fue de 0.047 g/planta. Las mayores
respuestas en cantidad de PC fueron presentadas por los tratamientos T18 (0.36 g PC/planta), T16 (0.35
g PC/planta) y T6 (0.26 g PC/planta).
Se asume que la fijación de nitrógeno se puede medir, cuantificando el nitrógeno total en las
plantas y relacionándola con las plantas no inoculadas. Es así que, los promedios de los mejores
tratamientos superaron en un 320%, 600% y 420% al promedio del tratamiento testigo sin inoculación
(0.05 g PC/planta), indicando la capacidad de la fijación del nitrógeno por cepas nativas.
Lo anterior demuestra de manera contundente la eficiencia de la aplicación de éstas cepas del

actinomiceto Frankia en plantas de Alnus acuminata para la fijación de nitrógeno y demostrando por
diferencia del nitrógeno total por planta, la mayor eficiencia de algunas cepas posiblemente asociada a
su mayor especificidad, donde las condiciones edáficas y ambientales favorecieron posiblemente la
agresividad o efectividad de las cepas de los tratamientos T18, T16 y T6 para la asociación con A.
acuminata.
La mayor cantidad de nitrógeno total en las plantas inoculadas con las cepas nativas de Frankia
en los tratamientos T16 0.056 g/N/planta y T18 0.057 g/N/planta, beneficia positivamente a las especies
de gramíneas acompañantes en sistemas silvopastoriles, al aportarles nitrógeno y contribuye a un
manejo racional de los suelos de ladera de la región alto andina Colombiana, al solucionar el principal
elemento limitante de la producción de forraje.
En esta investigación las cepas de los tratamientos T18 y T16 que generaron más de 0.35 g de
PC/planta en el follaje, presentaron a los 125 días un mayor número de nódulos, siendo así, como el T16
con 37.8 nódulos y el T18 con 29.5 nódulos, lograron superioridad (P<0.01) con respecto a los demás
tratamientos. En esta evaluación existió una estrecha relación entre el número de nódulos y la
94
producción de PC/planta, donde el número de nódulos esta explicado en un 55.1% por la cantidad de
nitrógeno total/planta (P<0.01)
Así mismo, el tratamiento T16 presentó a los 125 días la mayor altura 26.33 cm, mayor
diámetro basal 0.50 mm, y, además, fue el único tratamiento que superó al testigo en la longitud
radicular.
Por otra parte, los tratamientos T16 y T18 estuvieron dentro de los nueve tratamientos que
superaron al testigo en el número de hojas y superaron al 48% de los tratamientos en peso seco
radicular. Se presentó una estrecha relación entre las variables producción de PC/planta y el peso seco
radicular, el cual explica en un 67.5% la cantidad de nitrógeno total en A. acuminata inoculado con
Frankia (P<0.01).
Ridgway et al. (2004), evaluaron la inoculación de Frankia en A. incana sobre diferentes suelos
contaminados y encontraron que el contenido de nitrógeno en las hojas que crecieron en los mejores
suelos con altos niveles de metales pesados y contaminantes orgánicos, presentaron entre 1.5 y 2% de
nitrógeno y el control presentó niveles menores al 1%.
Los mayores porcentajes de PC observados en este estudió fueron superiores a los reportes de
Sellstedt & Huss-Danell (1984) quienes a los 122 días obtuvieron para A. incana un valor promedio de
10.43%, e inferiores que el contenido de PC en gramos (1.38 g/planta).
De igual manera, los resultados del porcentaje de proteína cruda de plantas de A. acuminata en
este estudio son superiores a los reportes de Nickel et al. (2001) con niveles de PC de 3.65 a 5.62% PC
y a los de Oliveira et al. (2005), quienes evaluaron la inoculación con Frankia y doble inoculación con
Frankia y Glomus en A. glutinosa a los 180 días, con valores de 2.06 y 2.93%. Y son similares a los
obtenidos por Gentili & Huss-Danell (2003), quienes reportan valores de 12.87 a 13.43% y 13.37 a
16%, cuando las plantas fueron sometidas a niveles medios y altos de nitrógeno y fósforo
respectivamente. Sin embargo, los reportes de ésta investigación no superan a los promedios de
nitrógeno de las plantas que fueron sometidas a altos niveles de nitrógeno y fósforo (24.62%), valor
considerado muy alto para plantas del género Alnus.
95
La concentración de proteína cruda en la fitomasa de Alnus acuminata presentada en los

tratamientos en este experimento fue de 12.20% y fluctuó entre 9.16% a 14.98%, donde los mayores
niveles se observaron en los tratamientos T4 y T7 con promedios de 14.98% y 14.72 superando
significativamente a los demás tratamientos (P<0.01) y presentando un incremento en acumulación de
proteína cruda de 45, 13.4 y 59.4% y 42.5, 11.4 y 59.6% respectivamente con relación a los tratamientos
testigo (T24) y controles (T22 y T23).
Mediante la determinación del nitrógeno total y la producción de materia seca foliar de las
plantas, se puede medir el nitrógeno absorbido por una planta fijadora y otra no fijadora como
referencia. La producción de proteína cruda (g/planta) a los 125 días de edad cambió por efecto de los
tratamientos (P<0.01). Los valores promedios fluctuaron entre 0.0363 g/planta a 0.217 g/planta. La
producción promedia de proteína fue de 0.127 g/planta. Las mayores respuestas en cantidad de proteína
cruda fueron presentadas por los tratamientos T19 (0.21 g/PC). T4 (0.20 g/PC) y T20 (0.20 g/PC)
respectivamente.
Los promedios de los mejores tratamientos superaron en un 464.7% y 497.8% al tratamiento

testigo sin inoculación (0.0363 g PC/planta), lo cual demuestra la importancia y eficiencia de la
inoculación en la acumulación de nitrógeno a nivel foliar A. acuminata.
Aunque la respuesta dasométricas en las plántulas inoculadas con las cepas aisladas de
Cundinamarca presentaron mayores promedios, en esta variable se observó una mayor capacidad de las
cepas aisladas de Nariño en la fijación y acumulación de nitrógeno en el follaje foliar con un 50% de
incremento.
Los resultados obtenidos en el porcentaje de proteína cruda son similares a los obtenidos por
Gentili & Huss-Danell (2003), en plantas de A. incana, las cuales fueron fertilizadas con niveles
normales de fósforo y nitrógeno y niveles altos de fósforo, con promedios entre 12.87 y 16%, e
inferiores a las concentraciones de nitrógeno de plantas fertilizadas con altos niveles de nitrógeno y
fósforo (24.62%). Y son superiores a los resultados del porcentaje de PC obtenidos por Sellstedt &
Huss-Danell (1984) quienes a los 122 días reportan 10.43% para A. incana¸ e inferiores en los gramos
de proteína cruda (1.38 g/planta).
96
Otros resultados presentan inferioridad en los porcentajes de PC reportados por Nickel et al.
(2001) quienes obtuvieron porcentajes de PC de 3.65 a 5.62%. De igual manera a los reportes de
Oliveira et al. (2005) con valores de 2.06 y 2.93%.
4.6.2. Concentración de fósforo
En las plantas el fósforo es un elemento estructural en los ácidos nucleicos y juega un papel
importante en la transferencia de energía y en procesos enzimáticos (Lehmann, 2003). Así mismo, el
fósforo es quizás el elemento más importante para la formación de proteínas y muchos otros compuestos
esenciales en el proceso del crecimiento y formación de los nódulos y en la fijación de nitrógeno, el cual
en las fases iniciales requiere de una alta demanda de fósforo. Adicionalmente, los niveles de fósforo
están relacionados con el número de nódulos (Gentill & Huss-Danell, 2003).
La composición mineral del suelo y su disponibilidad para las plantas y microorganismos,

pueden ser limitantes para la nodulación o el funcionamiento de la nitrogenasa. Se ha observado que los
nódulos pueden contener suficiente fósforo para fijar en plantas con deficiencia del mismo (O’Hara et
al., 1988, Lehemann, 2003).
4.6.2.1. Nariño
La concentración de fósforo en plantas de A. acuminata inoculadas con diferentes cepas de

Frankia, presentó diferencias estadísticas entre tratamientos (P<0.01), en donde la mayor cantidad de
fósforo g/planta fueron reportados por los tratamientos T16, T18 y T2 con valores de 0.0120; 0.0100 y
0.0090 g/planta respectivamente, y donde el tratamiento T16 superó a los demás tratamientos. Es
importante citar que los tres mejores tratamientos superaron al testigo en un 1100%, 900% y 800%, el
cual presentó únicamente 0.0010g de P/planta, indicación clara de la eficiencia de éstas cepas.
Esta respuesta posiblemente esta asociada, a la capacidad de A. acuminata por realizar otro tipo
de simbiosis como con micorrizas, lo que permitió facilitar la colonización de Frankia, según lo
reportado por Fraga-Baddiar (1987) quien afirma que la colonización inicial con algunos hongos
micorrizogénicos en plántulas de Alnus es una condición previa a la colonización por Frankia, lo que se
asocia con la capacidad de fijación de nitrógeno, esto concuerda con los reportes de Russo et al. (1990),
97
quienes reportan mayor reducción de acetileno en el tratamiento de la doble inoculación Frankia y G.
intrarradices.
Al comparar los resultados obtenidos en esta investigación con los reportes de Gentili & Huss-
Danell (2003), se puede observar mayores concentraciones de fósforo frente a las plantas fertilizadas
con niveles normales de fósforo y nitrógeno (0.008%) y similares a las plantas que fueron fertilizadas
con altos niveles de nitrógeno (0.6%). Aunque, no superan a la fertilización alta de fósforo y nitrógeno,
obtenida por éstos autores con un valor promedio de 1.55%.
Es importante mencionar, que según Marschner (1995) y Jones (1998) citados por Gentili &
Huss-Danell (2003), las concentraciones de fósforo en hojas que exceden el 1%, es un valor que
usualmente es considerado tóxico para el crecimiento de las plantas. Así mismo, los altos niveles de
fósforo en la raíz inhiben la actividad de la nitrogenasa, afectando la fijación biológica de nitrógeno.
Los porcentajes de fósforo (%), presentaron diferencias altamente significativas entre

tratamientos (P<0.01) y fluctuaron entre 0.33 y 0.49%. Los mayores niveles se observaron en los
tratamientos T7, T8 y T4 con valores de 0.49, 0.48 y 0.46% respectivamente.
De igual manera, los tratamientos T4 y T19 presentaron las mayores producciones de fósforo
(g/planta), con diferencias altamente significativas entre tratamientos (P<0.01), con valores de 0.0472 y
0.045 g/planta respectivamente. Es importante citar que éstos tratamientos superaron al testigo en un
574.3% y 542.8%, el cual presentó únicamente 0.0070g de P/planta.
En esta investigación, la acumulación del fósforo medida en porcentaje y en gramos, fue mayor
en el follaje de plantas de A. acuminata inoculadas con las cepas de Cundinamarca con relación a las de
Nariño.
El porcentaje de fósforo en A. acuminata con los aislados de Cundinamarca, fue superior que las
plantas fertilizadas con niveles normales de fósforo y nitrógeno (0.008%) publicados por Gentili &
Huss-Danell (2003), y similares a las plantas que fueron fertilizadas con altos niveles de nitrógeno
98
(0.6%). Aunque, no superan a las plantas con fertilización alta de fósforo y nitrógeno, con un valor
promedio de 1.55%.
Estos autores encontraron, que la concentración de fósforo fue muy alta en hojas, pero bajas en
raíces y en nódulos, esto explica que los nódulos regulan la adquisición de fósforo independientemente
de otras estructuras de las plantas, esta evidencia concuerda con algunas observaciones en acumulación
de fósforo, siendo importante su absorción para la formación de los nódulos principalmente en la
primera semana de inoculación.
Esto coincide con los mayores promedios en el número de nódulos a los 45 días, obtenidos con
las cepas de Cundinamarca, que superaron a los promedios de las cepas de Nariño en un 30.11, 31.92 y
57.98% en los tres muestreos (45, 90 y 125 días), respuesta posiblemente asociada, a los altos niveles
fósforo del sustrato (59 mg/kg), utilizado en la evaluación de los aislados de Cundinamarca.
Por lo anterior, el tiempo de experimentación es importante para describir, el efecto del fósforo
en la nodulación y en el crecimiento general de la planta, experimento, en corto tiempo, responden a la
estimulación del fósforo a la nodulación según lo descrito por Reddell et al. (1997).
4.7. Identificación molecular de los aislados de Frankia
4.7.1. Resultados de la amplificación la región variable V2-V3 del gen 16S rDNA de
Frankia por PCR
Las cepas que mostraron mayor respuesta en la fase de vivero por Departamento fueron, en
Nariño la CN49 o tratamiento T16 y de Cundinamarca la cepa CC17 o tratamiento T4. La amplificación
de las cepas de Frankia, controles: AacIII y AacI y nativas: CN49 y CC17, se muestran en la figura 46.
99
A B C D
pb
CC17 N49
pb 500
500 400 40 ng
400
Figura 46. Amplificación de productos purificados de cepas de Frankia. A: AacIII; B: AacI; C: CN49;
D: CN17
Los productos amplificados de la región de las pequeñas subunidades del rRNA por PCR tanto
de las cepas controles AacIII, AacI como de las nativas CN49 de (Nariño) y CN17 (Cundinamarca),
mostraron pesos moleculares de 450 a 500 pares de bases (pb) aproximadamente.
Estos resultados permiten evidenciar bandas con un buen marcaje de cepas del DNA genómico
de Frankia través la utilización de las SSU del rRNA.
Con el empleo de las SSU rRNA V2 y V3 se obtuvieron bandas de la misma talla que las
encontradas a partir de los rRNA, reportados por Schmalenberger et al. (2001) con una longitud de PCR
de 436pb. Benson et al. (1996) reportaron amplificaciones en nódulos de actinorrizas para las regiones
V1 y V2, con longitudes entre 28 y 419 pb.
Simonet et al. (1994), realizaron estudios para demostrar a nivel molecular la existencia de
diferencias genotípicas de aislamiento de Frankia sp+ y sp- utilizando secuencias de regiones variables
de 16 rRNA V1 y V2 con los primers FGPS6 y FGPS305´. La amplificación de los productos de PCR
presentó 299 bp, los cuales fueron clonados, secuenciados y alineados. Estos estudios demostraron que
existe una marcada diferencias entre los aislamientos que producen esporas en los nódulos (sp+) y las
que no los producen (sp-).
100
4.7.2. Alineación de nucleótidos de las secuencias parciales obtenidas para las cepas de
Frankia
Para los ensayos de secuencia se tomó los productos de PCR purificados utilizando los primers de
las SSU de rRNA V2 y V3 y se obtuvieron las cadenas directa y reversa. Las secuencias fueron
corregidas y ensambladas usando el software Chromas V2. Estas secuencias fueron comparadas en el
Genbank, EMBI (European Bionformatics Institute) y SSU rRNA Ribosomal Database Proyect (Fogel
et al. 1994).
Las alineaciones de las secuencias parciales de SSU rRNA de las cepas de Frankia AC13 y CN49
evidenciaron que éstas, pertenecen al grupo de las bacterias (100%) Gram positivas con altas
concentraciones de G+C (Actinomicetos), lo cual concuerda con los resultados de Neefs et al. (1993) y
Boyer et al. (2001) La cepa procedente de Cundinamarca (CC17), presentó un 90% de identidad con el
grupo de las proteobacterias y la de Nariño (CN49) un 25%. Ohkuma et al. (1999) reportan un 94% de
identidad entre el género Frankia y las ,  y  proteobacterias perteneciente al grupo I de las proteo-
cyano. Similares resultados fueron reportados por Zehr et al. (1998) y Reymond et al. (2004).
Hirsch et al. (1995) encontró con análisis de genes nifK que las cepas de Frankia FaC1 esta
relacionada con  proteobacteria y la cepa HFPCc13 con Thallobacterias con una cercanía de 81% con
cianobacterias. Nomand et al. reportaron en 1992b, las distancias entre F. alni y diferentes
microorganismos fijadores de nitrógeno, encontrando una relación entre F. alni con Anabaena, con los
genes nifH y nifHD y con  proteobacteria (Klebsiella pneumoniae) y Anabaena con el gen nifD.
Adicionalmente, en el alineamiento realizado en el EMBI, las cepas presentaron una identidad de

80% con dos bacterias no cultivables de comunidades microbiales de la rizósfera de bosques, el clon
B2-45BS de suelo de maíz y AY645422 de suelos con altos contenidos de As y Fe.
Las secuencias fueron alineadas y comparadas con la cepa de Frankia alni Acn14a aislada de
Alnus sp y reportada por Benson et al. (1996) (Número de acceso al Genbank M8846), con el fin de
percibir la diversidad entre los aislamientos. Los resultados se muestran en la figura 47.
101
La alineación de las secuencias mostró una homología con relación a la cepa de Frankia alni del
64% y 60% y una identidad 23% y 31% para CC17 y NC49 respectivamente y entre las cepas nativas de
41%.
Los resultados obtenidos en esta investigación, están posiblemente asociados a la gran diversidad
de las cepas de Frankia, y esto debido principalmente a su asociación con diversas plantas actinorrizas y
a la diversidad de nichos ecológicos en los que habita (Clawson et al. 1998).
102
#Acn14a TAC CGG GCA TCT GGT GGT GTG GAA AGA TTT ATC GGC TCG GGA TGG GCC CGC GGC CTA TCA GCT TGT TGG TGG GGT GAT [ 78]
#CC17 CUNDIN --. ..A .T. ..- --- --- --- --- ... ..- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --. ... A.. ... ... ... A.A [ 78]
#CN49 NARIÑO -.T ... ... ... ATA C.C A.A .T. ..G C.- ..- --- --- --- --- --- --- --- --- --. .AC ..A GAA .C. C.. .GC [ 78]
#Acn14a GGC CTA CCA AGG CGA CGA -CG GGT AGC CGG CCT GAG AGG GCG ACC GGC CAC ACT GGG ACT GAG ACA CGG CCC AGA CTC [156]
#CC17 CUNDIN ... ... ... ... ... ... T.C A.. ... T.. T.. ... ... A.. ... A.. ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... [156]
#CN49 NARIÑO .AT ..G AT. .C. ..- ..G T.- -.. ... TAC T.G A.. ... ... ..A CCT G.. T.A .A. ..C -.. .T. GC. ..A GC. .C- [156]
#Acn14a CTA CGG GAG GCA GCA --G TGG GGA ATA TTG CG- CAA TGG --- GCG AAA GCC TGA CGC --A GCG ACG CCG CGT GGG G-- [234]
#CC17 CUNDIN ... ... ... ... ... --. ... ... ... ... ..A ... ... --- ... C.. ... ... TC. --. ..C .T. ... ... .TA .AT [234]
#CN49 NARIÑO --- ..A .TA ..G A.. TGA ... A.. GC. .C. A.T T.G GA. CTC ..A C.C .A. .AT .T. TT. ... .-. .A. ... ..A AG- [234]
#Acn14a GAT GAC GGC CTT CGG GTT GTA AAC CTC TTT CAG CAG GGA CGA AGC GCA AGT GAC GGT ACC TGC AGA AGA AGC ACC GGC [312]
#CC17 CUNDIN ..A ..A ... ... ... ... ... ..- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -.. .T. --- [312]
#CN49 NARIÑO ..C ACA A.. --G .A. C.C .CG .G- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -.A .T. --- [312]
#Acn14a CAA CTA CGT GCC AGC AGC CGC GGT AAT ACG TAG GGT GCA AGC GTT GTC CGG AAT TAT TGG GCG TAA AGA GCT CGT AGG [390]
#CC17 CUNDIN --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- [390]
#CN49 NARIÑO --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- [390]
#Acn14a CGG CCT GTC GCG TCG GCT GTG AAA ACC CGG GGC TCA ACC CCG GGC CTG CAG TCG ATA CGG GCA GGC TAG AGT CCG GCA [468]
#CC17 CUNDIN --- --- --- --- .-- --. --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ... ..- --- -.. .-- --- --- --- --- [468]
#CN49 NARIÑO --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- .TT .C- --- ... .-- --- --- --- --- [468]
#Acn14a GGG GAG ACT GGA ATT CCT GGT GTA GCG GTG AAA TGC GCA GAT ATC AGG AGG AAC ACC GGT GGC GAA GGC GGG TCT CTG [546]
#CC17 CUNDIN --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ... .A. ... --- --- --- --- --- --- --- --- [546]
#NARINO --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -C. .GT .-- --- --- --- --- --- --- --- [546]
#Acn14a GGC CGG AAC TGA CGC TAA GGA GCG AAA GCG TGG GGA GCG AAC AGG ATT AGA TAC CCT GGT AGT CCA CGC CGT AAA CGT [624]
#CC17 CUNDIN --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- [624]
#CN49 NARIÑO --- --- --- --- --- --- --- --- --- -.. .C. C.. ... GC. .A. ..- --- --- --- --- --- --- --- -.- --- --- [624]
#Acn14a TGG GCG CTA GGT GTG GGG [643]

#CC17 CUNDIN --- --- --- --- --- --- [643]
#CN49 NARIÑO --- ... .-- -.. .CA .-- [643]
Figura 47. Alineamiento en nucleotidos de las secuencias parciales obtenidas para Frankia CN3 y CC17. Se presentan las secuencias
correspondientes al 16S de la cepa de Franki alini Acn14a. Los puntos indican los residuos que se conservan en el alineamiento, el color negro indica
alineamiento de las tres secuencias y color gris indica alineamiento de dos secuencias. Las líneas son gaps introducidos para optimizar el alineamiento
103
5. CONCLUSIONES
El estudio de la diversidad de cepas nativas de Frankia asociadas con Alnus acuminata H.B.K en
Colombia y la evaluación de la efectividad y la eficiencia en la simbiosis, puede contribuir a promover
el potencial del uso de este árbol en la rehabilitación y protección de suelos y praderas, conformando
en el Bosque Alto Andino sistemas silvopastoriles sostenibles y productivos.
El actinomiceto Frankia presenta altos requerimientos nutricionales y lento crecimiento lo cual

han sido las principales limitantes para su aislamiento in vitro. Sin embargo, en ésta investigación se
logró obtener 51 aislados, que precedían principalmente de los Municipios de Pasto en Nariño, y de la
localidad de Usme en Cundinamarca, asociado a las modificaciones metodologías realizadas en esta
investigación.
Morfológicamente, los aislados presentaron producción de micelio ramificado, esporangios inter

y finales y vesículas fijadoras de nitrógeno. Macroscópicamente los cultivos presentaron micelio no
aéreo, con formas y colores contrastantes que fluctuaron entre algodonosas, gomosas, aerofílicas,
microaerofílicas y oscilaron entre colores rojo, amarillo, café y blanco, características morfológicas
propias del género Frankia.
En la evaluación del crecimiento y capacidad de utilización de nutrientes por Frankia se

evidencio una mayor afinidad enzimática por el ácido pirúvico con un pH de 6.5, que permitió
clasificarlas dentro del Grupo B. Adicionalmente, se logró estimular la producción de biomasa celular
con agitación continua y la adición del 10% del extracto de raíz de A. acuminata al medio BAP.
Los aislados de Frankia mostraron en todos los muestreos la capacidad de asociarse con A.
acuminata, por lo cual, fueron clasificados como típicos y a medida que avanzaba la edad de la
actinorriza entre los 45, 90 y 125 días después de la inoculación, se consolidó la diferencia entre los
tratamientos, mostrando amplia variabilidad en las respuestas dasométricas, microbiológicas y
nutricionales
Los tratamientos que mostraron consecuentemente mayores respuestas en las variables evaluadas
fueron el T16:CN49 procedente del Municipio de Pasto Vereda Cubijan Alto y la cepa T4:CC17
aislada de la Localidad de Usme, vereda Olarte. En el Departamento de Nariño las plantas inoculadas
con la cepa CN49 se caracterizaron por superar al testigo en: producción de materia seca total en un
157, 226 y 221.3%; longitud radicular en un 47.8, 167.2 y 52.3%; peso seco radicular 344, 245 y
104
251%, en el número de nódulos en un 211, 180.9 y 167.1% y en la composición química superó con un
600% y 1100% en la producción de proteína cruda y fósforo respectivamente.
Las plantas de A. acuminata inoculadas con la cepa T4:CC17 procedente de Cundinamarca

presentaron superioridad al testigo en: altura en un 48.1, 66.9 y 58.8%; en producción de materia seca
en un 458.8, 275 y 261.9%, en longitud radicular en 182.9, 19.9 y 124.7%, en el peso seco radicular en
454.54, 270.83 y 263.2%, en el número de nódulos 408, 654.7 y 350.9%. Adicionalmente, superó al
testigo en un 464.7% y 574.3% en la producción de proteína cruda y fósforo.
Los mejores resultados de las plantas A. acuminata en las variables evaluadas se presentaron con
aislados procedentes de Cundinamarca, respuesta asociada a los niveles de nutrientes presentes en los
sustratos, principalmente a altas concentraciones de fósforo y medias de nitrógeno, que estimularon
una mayor nodulación reflejado en las variables dasométricas y de composición química, esto se
evidenció por las mejores respuestas de las cepas control en el sustrato de Cundinamarca.
La identificación molecular de los productos amplificados de la región variable V2-V3 de SSU

del 16S rRNA por PCR, mostraron pesos moleculares de 450 a 500 pb para las cepas nativas CN49,
CN17 y los, controles AacIII y AacI. La comparación de las secuencias parciales, de las cepas nativas
de Frankia con las bases de datos del Genbank y el EMBI, permitieron clasificarlas dentro del grupo
de las bacterias Gram positivas con altas concentraciones de G+C (Actinomicetos), presentando un
90% de identidad con el grupo de las proteobacterias no cultivables de comunidades microbiales de la
rizósfera de bosques.
La alineación y comparación de las secuencias parciales de los aislados nativos frente a la cepa
de Frankia alni Acn14a aislada de Alnus sp, mostraron una homología del 64% y 60% y una identidad
del 23% y 31% para CC17 y NC49 respectivamente y entre las cepas nativas del 41%, Demostrando la
gran diversidad de las cepas nativas de Frankia, influenciadas por el genotipo y la oferta ambiental del
Bosque Alto Andino Colombiano del cual fueron recolectadas.
105
6. RECOMENDACIONES
Con el propósito de obtener el medio liquido y producir el biofertilizante de Frankia, se

recomienda continuar con las evaluaciones de las mejores fuentes nutricionales obtenidas en este
estudio, adicionando niveles crecientes del extracto de raíz y cuantificando su crecimiento a través del
análisis de proteína microbial. Adicionalmente, se recomienda iniciar investigaciones en la
optimización del medio de soporte para la producción del inoculante de Frankia.
Realizar trabajos de investigación dirigidos a evaluar en campo variables dasometricas y de

composición química en A. acuminata inoculada con las mejores cepas de Frankia, y su efecto en las
propiedades fisicoquímicas y microbiológicas del suelo y en la producción y calidad nutricional de la
biomasa de las gramíneas acompañantes.
Evaluar el efecto del sinergismo entre Frankia, micorrizas y solubilizadoras de fosfato en

variables dasometricas, nutricionales en Alnus acuminata H.B.K con énfasis en la respuesta al estrés
por defoliación, heladas, deficiencias hídricas y nutricionales.
Realizar un estudio de la diversidad genética de Frankia a través de las pequeñas subunidades

del 16S rRNA en otras regiones del País, para fortalecer la identidad de los aislados y consolidar el
banco de germoplasma de Frankia Colombiano.
106
8. BIBLIOGRAFÍA
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121
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVOS
MEDIO BENZIL AMINA PURINA BAP modificado por Murry et al. (1984)
Macronutrientes g/litro/6.8 pH
MgSO4.7H2O 0.05
CaCl2.2H2O 0.01
NH4Cl 0.267
FeEDTA 0.01
BAP sólido agar 15 g
Adicionar después de autoclavar:

Solución stock de vitaminas 1 ml
Solución stock de micronutrientes 1 ml
Solución buffer 10mM
Solución stock de micronutrientes g/l

H3BO4 2.86
MnCl2.4H2O 1.81
ZnSO4. .7H2O 0.22
CuSO4. 5H2O 0.08
Na2MoO4 .2H2O 0.025
CoSO4.7H2O 0.001
Solución stock de vitaminas mg/100ml

Tiamina HCL 10
piridoxina HCL 5
ácido nicotínico 50
biotina 22.5
ácido fólico 10
riboflavina 10
Solución buffer
KH2PO4 1M
K2HPO4 1M
Extracto de Raíz
Raíz de Alnus acuminata 50 g

Agua 1 litro
Adicionar antes de autoclavar 100ml de extracto de raíz/litro de medio BAP
122
MEDIO EXTRACTO DE RAÍZ
Extracto de raíz 0.1ml/l

MnCl2.4H2O 1.81
Na2MoO4 .2H2O 0.025

Tiamina HCL 10
piridoxina HCL 5
biotina 22.5
ácido fólico 10
riboflavina 10
Solución buffer
KH2PO4 1M
K2HPO4 1M

MEDIO VINAZA
Vinaza 0.3ml/l

Na2MoO4 .2H2O 0.025

Tiamina HCL 10
piridoxina HCL 5
biotina 22.5
ácido fólico 10
riboflavina 10
Solución buffer
KH2PO4 1M
K2HPO4 1M

123
MEDIO QUINUA (Ch. quinoa)
Quinua 0.3g/l

MnCl2.4H2O 1.763
Na2MoO4 .2H2O 0.025

Tiamina HCL 10
piridoxina HCL 5
biotina 22.5
ácido fólico 10
riboflavina 10
Solución buffer
KH2PO4 1M
K2HPO4 1M

MEDIO MELAZA
Melaza 0.3ml/l

Na2MoO4 .2H2O 0.025

Tiamina HCL 10
piridoxina HCL 5
biotina 22.5
ácido fólico 10
riboflavina 10
Solución buffer
KH2PO4 1M
K2HPO4 1M

124
ANEXO 2
DETERMINACION DE PROTEÍNA CRUDA (KJELDAHL)

Harris, Lorin E. 1970. Nutrition Research Techniques for Domestic and Wild Animals.
Published by L.E. Harris
Reactivos:
Ácido Sulfúrico concentrado
Catalizador:
• Dióxido de Titanio 0.3 g
• Sulfato de Cobre 0.3 g
• Sulfato de Sodio 16.0 g
Hidróxido de sodio al 60%
Zinc en granallas
Indicador mixto:
• Bromocresol verde 0.25 g
• Rojo de metilo 0.05 g
• Etanol concentrado 100 ml
Ácido bórico al 40%
Ácido estándar 0.1 N (Puede ser ácido clorhídrico o ácido sulfúrico).
Agua destilada
Determinación
Moler la muestra seca en el molino con un tamiz de 1 mm, pesar 0.1 g de la muestra en un balón
aforado de 100 ml, adicionar 1,6 g de catalizador y 2,5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Calentar en
el aparato digestor , lentamente al principio y luego alto. Digerir durante más o menos 30 min después
de que la solución se aclare. Dejar enfriar la mezcla y agregar 30 ml de agua destilada.
Para efectuar la destilación, agregar 5 ml de ácido bórico con indicador en un erlenmeyer de 50 ml,
asegurándose que el tubo de salida del destilador quede totalmente sumergido en el ácido bórico.
Añadir al balón aforado 1 o 2 granallas de zinc y 8 ml de hidróxido de sodio. Conectar el balón al
aparato de destilación y agitar el contenido. Destilar 30 ml de solución aproximadamente.
Para realizar la titulación, colocar el erlenmeyer en el agitador magnético y titular con ácido clorhídrico
o ácido sulfúrico de normalidad conocida, hasta un cambio de coloración azul o rosado.
Blanco Cálculos:
(V1 − V2 ) Nx0.014
% Nitrogeno = x100
P. Muestra
% Proteína = % Nitrógeno x Factor de Proteína
V1 = Volumen del ácido gastado en la titulación de la muestra problema
V2 = Volumen del ácido gastado en la elaboración del blanco de reactivos
N = Normalidad del ácido usado en la titulación
P= Peso
125
ANEXO 3
DETERMINACIÓN DE FÓSFORO TOTAL EN TEJIDO

Hanson J. Sci Food Agric, 1950, 1, 172.
Reactivos
Molibdato de amonio solución acuosa al 5% w/v (calentar entre 45-50°C).
Vanadato de amonio solución al 0.25% w/v, disolver 2.5 gramos de vanadato de amonio en 500 ml de
H2O desionizada (caliente). Dejar enfriar y adicionar 350 ml de (HNO 3) y completar hasta 1000 ml con
H2O desionizada. Agitar.
Procedimiento
• Medir alícuotas de 3 ml de los estándares y del filtrado que se usó para minerales, adicionar 2
ml de mezcla 1:1 de solución de molibdato de amonio y solución de vanadato de amonio.
• Mezclar (agitar), dejar 5 minutos en estabilidad y medir en espectrofotómetro (colorímetro) a
425 nm.
Blanco: 3 ml de H2O desionizada + 1.2 ml de mezcla de molibdato-vanadato de amonio.
• Calibrar el instrumento con el blanco y hacer las medidas. Interpolar los valores de absorbancia
en la curva patrón.
• Curva patrón: Preparar soluciones estándar de P (fosfamolibdo de vanadato) de 4, 8, 12, 16,
20, 24 y 28 ppm y seguir el procedimiento como en la muestra.
126

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE CEPAS NATIVAS DE Frankia EN Alnus Acuminata H.B.K.

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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE CEPAS NATIVAS DE Frankia

EN Alnus acuminata H.B.K.

PRESENTADO POR: ANA MARIA REY OBANDO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

BOGOTÁ, D.C. ENERO DE 2006

Este trabajo está dedicado especialmente a mi amado esposo, Diego,

La búsqueda de la verdad y el bienestar no debe ser

Ana María Rey Obando

El amor, la perseverancia y el esfuerzo por generar conocimiento en

Diego Chamorro Viveros

Doy mis agradecimientos:

Al Doctor Rolando Barahona, por sus contribuciones, consejos científicos y personales

A Gina Marcela Amado, Mi Ingeniera!, por su apoyo y demostración de la verdadera amistad

A Graciela Lancheros, por ser ejemplo de honestidad y lealtad

A José Gordillo, por sus enseñanzas y apoyo, producto de la experiencia de la vida

A Andrómeda Celeste, su valiosos apoyo y por compartir sus conocimientos y tiempo

A Jorge Rodríguez, por su colaboración incondicional y desinteresada en la ejecución de este trabajo

A Kelly y Santiago, mis queridos estudiantes, gracias por su colaboración

A Colciencias, por el financiamiento de esta investigación

A la Facultad de Ciencias y Posgrado de Microbiología Interfacultades de la Universidad Nacional de

(Artículo 217, estatutos de la Universidad Nacional de Colombia)

2.1. Los Sistemas ganaderos del trópico alto Colombiano 3

2.3. Fijación biológica del nitrógeno (FBN) 8

4.1. Caracterización ambiental, edáfica y microbiológica de los sitios experimentales 48

Figura 1. Sistemas silvopastoriles con Alnus acuminata. Chiquinquirá 4

Esta investigación estuvo enfocada en la evaluación integral de cepas nativas de Frankia

Microscópicamente las cepas presentaron un micelio ramificado, esporangios inter y finales y

Las plantas de A. acuminata inoculadas con la cepa T4:CC17 procedente de Cundinamarca

Frankia es un actinomiceto perteneciente a la familia Frankiaceae que establece asociación

Entidades de investigación como CORPOICA, vienen generando información e impulsando la

Las cepas de Frankia poseen características morfológicas de infectividad y efectividad que

Investigaciones realizadas en Colombia enfocadas al estudio de la inoculación de Frankia

2.1. Los Sistemas ganaderos del trópico alto Colombiano

En el trópico alto de Cundinamarca y Nariño, la producción ganadera bovina de leche

En la búsqueda de sistemas de producción más sostenibles, tanto biológica como

2.2.Alnus acuminata H.B.K.

NOMBRE COMÚN: Aliso, chaquiro, fresno, cerezo, abedul, aile.

Figura 1. Sistemas silvopastoriles con Alnus acuminata. Chiquinquirá

Según Holdridge (1951), A. acuminata se ubica en formaciones ecológicas de bosque húmedo

Figura 3. Detalle de hojas y ramas de Alnus acuminata H.B.K.

Figura 4. Frutos femeninos (a) y masculinos (b) de Alnus acuminata H.B.K.

Figura 5. Frutos femeninas y semillas de A. acuminata

El sistema radicular de A. acuminata es poco profundo, amplio, extendido y es inducido a la

2.3.Fijación biológica del nitrógeno (FBN)

El nitrógeno es un elemento clave en la fertilidad de los suelos y en el desarrollo sostenible de los

Algunos microorganismos solos o asociados realizan la tarea de extraer el N2 del aire y lo

El proceso de FBN se lleva gracias a la acción de la nitrogenasa, la cual es un complejo

La actividad de la nitrogenasa se ve incrementada con un pH cercano a la neutralidad, un nivel

2.3.1. Genética de la fijación biológica del nitrógeno

La asociación simbiótica para la FBN es el resultado de la expresión de un grupo de genes en la

Denarie et al. (1993), mencionan la importancia de la producción del lipo-oligosacárido PBH

La disponibilidad del nitrógeno y el oxígeno en el medio ambiente regulan la actividad de los

Phylum BXIV: Actinobacteria Phy. nov.

Suborden XIII: Frankineae

Genero : Frankia (Lechevalier & Lechevalier, 1989)

Frankia es un actinomiceto perteneciente a la familia Frankiaceae que presenta asociación

1. Morfología: Presencia de esporangios y vesículas en medio de cultivo líquido con formación de

3. Composición en su ADN: Contiene un porcentaje de GC de 66-71% el cual está también presente en

5. Demostración de infectividad y/o efectividad en plantas hospederas: Parámetro que permiten

2.4.1. Morfología y fisiología

Morfológicamente Frankia es un organismo complejo debido a que presenta un crecimiento

Figura 6. Estructuras especializadas de aislamientos de Frankia crecidas en medio BAP libre de

Figura 7. Formas y tamaños de nódulos de Frankia en Alnus acuminata