INDICE

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................. 1
2. FUNDAMENTO TEORICO ............................................................... 1
2.1 Base para la identificación de la Tinción de Gram .................... 2
2.2 Tinción de Gram: Morfología Bacteriana ................................. 3
3. OBJETIVO ....................................................................................... 4
3.1 Objetivo General ...................................................................... 4
3.2 Objetivos Específicos ............................................................... 4
4. MATERIALES .................................................................................. 4
4.1 Equipo ...................................................................................... 4
4.2 Reactivos .................................................................................. 5
5. PROCEDIMIENTO ........................................................................... 6
5.1 Procedimiento práctico ............................................................ 6
6. RESULTADOS ................................................................................. 7
7. RECOMENDACIONES ..................................................................... 7
8. CONCLUSION ................................................................................. 7
 TINCIÓN DE GRAM

1. INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo se describirá los pasos a seguir para realizar una
tinción de Gram, posteriormente ante una práctica llevada a cabo en el
laboratorio fisicoquímico de la Escuela Militar de Ingeniería aplicar los
conocimientos básicos que nos brinda la teoría para identificar una
bacteria según su tipo y morfología.

2. FUNDAMENTO TEORICO
La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para buscar la
presencia de bacterias en muestras de tejidos, caracterizarlas como
Gram positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas y
físicas de sus paredes celulares.
Es una técnica diferencial comúnmente empleada en el diagnóstico
microbiológico, fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. La mayor
parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha infección
bacteriana deben ser extendidas en frotis sobre láminas de vidrio, teñidas
y examinadas en el microscopio. Los reactivos empleados en la tinción de
Gram son el cristal violeta (colorante básico), lugol (mordiente), alcohol
cetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste).
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes
a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas
está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular
externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en
la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y
determina las características tintoriales. (VER FIG. 1)

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FIGURA 1: ESQUEMA DE DIFRENCIAS ESTRUCTURALES ENTRE BACTERIAS GRAM
POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

2.1 Base para la identificación de la Tinción de Gram

Se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene
afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se
coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta
por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios
del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla
de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros
de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram
negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos,
como la mezcla de alcohol acetona. Las bacterias Gram positivas, al
contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor
fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden
retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante
secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no
pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma
muestra como Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le
llama tinción Gram variable secundaria a alteración en nutrientes,
temperatura, pH o concentración de electrolitos.
No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica, ya que carecen de
pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composición química
2
 diferente (micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos
micólicos).
El tipo de tinción finalmente logramos distinguirlo por la coloración hablamos
de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-
violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. (VER
FIG 2).

FIGURA 2: FOTOMICROBIOLOGIA

GRAM NEGATIVA GRAM POSITIVA

2.2 Tinción de Gram: Morfología Bacteriana

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una
tinción GRAM:
 Cocos
 Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular.
 Diplococos, aparecen por pares.
 Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas.
 Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran
tamaño.

forma División a lo largo del mismo División a lo División a lo largo de 3 planos

esféric plano, formando cadenas cortas largo de 2
a: se 2 cocos 4 - 20 en planos regularmente: irregularmente:
llama juntos: cadenas: diferentes: Sarcinas Estafilococos
Coco Diplococos Estreptococos Tétradas

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 Bacilos
Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de Dos bacilos juntos: Cadenas de bacilos: Empalizadas,

vara: se Diplobacilos Estreptobacilos Bacilos lado con
llaman lado o en figuras en
Bacilos X, V o Y

 Espirales (Treponemas, Borrelias, etc.)

Forma espiral rígida Si la espiral es flexible y

se llama: Espirilo ondulada se llama: Espiroqueta

3. OBJETIVO

3.1 Objetivo General

 Identificar la muestra bacteriana según el tipo de tinción (gram negativa o
gram positiva).

3.2 Objetivos Específicos

 Identificar la morfología según la teoría avanzada (coco, diplococo, bacilo,
etc.)

4. MATERIALES

4.1 Equipo
 Microscopio  Asa bacteriológica de platino
 Laminas de Vidrio  Pizeta
 Mechero Bunsen

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4.2 Reactivos
 Cristal Violeta  Alcohol acetona
 Solucion de Lugol  Aceite de inmersión
 Fucsina o Safranina  Agua Destilada

5. PROCEDIMIENTO
1º Limpiar la lamina de vidrio con alcohol.
2º Aplicar una gota de agua destilada en la lámina de vidrio.
3º Tomar una muestra de alguna colonia de bacterias con ayuda de la aza de
platino (considerar que debe ser muy pequeña) y mezclar en dicha lamina
junto con el agua destilada.
4º Luego de esparcir la muestra bacteriana, fijar con calor flameándola en el
mechero bunsen.
5º Cubrir la muestra con Cristal Violeta durante 1 minuto, luego escurrir y
enjuagar con agua.
6º Cubrir la muestra con solucion de Lugol y nuevamente esperar que transcurra
1 minuto, escurrir y enjuagar.
7º Decolorar con alcohol cetona durante 5 a 20 segundos luego escurrir y
enjuagar.

5
8º Cubrir la muestra con fucsina (colorante de contraste) durante 1 minuto.
9º Por último dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersión y
observar en el microscopio a 100x.

5.1 Procedimiento práctico

Etapas del procedimiento realizadas en el laboratorio:

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6. RESULTADOS
Con los pasos previamente ejecutados y gracias a la visión microscópica se
pudo identificar a la bacteria “Cortadura de una en el Pie”, según su
morfología como un coco y de acuerdo al tipo una Gram Positiva ya que
esta presentaba un color azul-violeta.

7. RECOMENDACIONES
 Tomar en cuenta que una proporción de muestra pequeña se podrá
visualizar mejor.
 Se recomienda seguir los pasos cuidadosamente y respetar los intervalos
de tiempo para lograr mayor efecto en la coloración.
 Para evitar alguna infección bacteriológica se recomienda utilizar la
indumentaria adecuada tomando en cuenta las normas y protocolos en el
laboratorio.
 De igual manera esterilizar los materiales de uso al concluir la práctica.

8. CONCLUSION
Con la tinción de Gram llegamos a la conclusión que la diferencia esencial
entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la
decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol acetona es un
solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula que
(también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora por lo tanto las células
gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (más
peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste
deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio
entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células gram positivas son todavía azules, pero las gram negativas son
incoloras.